CN117737257A - 一组草鱼c3.1基因snp分子标记及其在鉴定草鱼出血病抗性中的应用 - Google Patents
一组草鱼c3.1基因snp分子标记及其在鉴定草鱼出血病抗性中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117737257A CN117737257A CN202410044990.2A CN202410044990A CN117737257A CN 117737257 A CN117737257 A CN 117737257A CN 202410044990 A CN202410044990 A CN 202410044990A CN 117737257 A CN117737257 A CN 117737257A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- grass carp
- seq
- gcrv
- chromosome
- locus
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 241000252230 Ctenopharyngodon idella Species 0.000 title claims abstract description 70
- 101000739162 Rattus norvegicus Secretoglobin family 2A member 2 Proteins 0.000 title claims abstract description 42
- 208000031169 hemorrhagic disease Diseases 0.000 title claims description 15
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 title claims description 9
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims abstract description 24
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 23
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 23
- 101100236128 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) LSM2 gene Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 238000009395 breeding Methods 0.000 claims abstract description 15
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 claims abstract description 15
- 101100029173 Phaeosphaeria nodorum (strain SN15 / ATCC MYA-4574 / FGSC 10173) SNP2 gene Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 101100094821 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) SMX2 gene Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 101000690100 Homo sapiens U1 small nuclear ribonucleoprotein 70 kDa Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 102100024121 U1 small nuclear ribonucleoprotein 70 kDa Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 208000035240 Disease Resistance Diseases 0.000 claims abstract description 9
- 241000609060 Grass carp reovirus Species 0.000 claims description 34
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 claims description 28
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 4
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 claims 1
- 208000034158 bleeding Diseases 0.000 claims 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 claims 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 abstract description 11
- 230000003321 amplification Effects 0.000 abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 abstract description 6
- 230000036039 immunity Effects 0.000 abstract description 4
- 230000008303 genetic mechanism Effects 0.000 abstract description 2
- 230000036438 mutation frequency Effects 0.000 description 20
- 235000019688 fish Nutrition 0.000 description 19
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 16
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 13
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 11
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 11
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 9
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 9
- 238000011160 research Methods 0.000 description 9
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 7
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 7
- 101710131943 40S ribosomal protein S3a Proteins 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 5
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000252233 Cyprinus carpio Species 0.000 description 4
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 4
- 241000158928 Scolochloa festucacea Species 0.000 description 4
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 4
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 3
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 3
- 206010071602 Genetic polymorphism Diseases 0.000 description 3
- 241000702247 Reoviridae Species 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000000546 chi-square test Methods 0.000 description 3
- 230000024203 complement activation Effects 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 239000013505 freshwater Substances 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 3
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 2
- 241000269979 Paralichthys olivaceus Species 0.000 description 2
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 2
- 238000012214 genetic breeding Methods 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 241001223854 teleost fish Species 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 101150044182 8 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000338116 Amyda Species 0.000 description 1
- 241000702652 Aquareovirus Species 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 101150071258 C3 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000252231 Cyprinus Species 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 241000277263 Salmo Species 0.000 description 1
- 102000002689 Toll-like receptor Human genes 0.000 description 1
- 108020000411 Toll-like receptor Proteins 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000004721 adaptive immunity Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 1
- 238000012098 association analyses Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 102000006834 complement receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010047295 complement receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 238000010219 correlation analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 208000022602 disease susceptibility Diseases 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 230000007124 immune defense Effects 0.000 description 1
- 230000003832 immune regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 101150044508 key gene Proteins 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 210000005084 renal tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000011222 transcriptome analysis Methods 0.000 description 1
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/80—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in fisheries management
- Y02A40/81—Aquaculture, e.g. of fish
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一组草鱼C3.1基因SNP分子标记，其特征在于，所述分子标记包含SNP1、SNP2、SNP3、SNP4、SNP5、SNP6、SNP7、SNP8、SNP9和SNP10；所述SNP1‑SNP10位点为依次位于1号染色体上的第7065、第42128位、第42188位、第42452位、第48268位、第76714位、第76773位、第76945位、第77153位和第77252位核苷酸；所述SNP1‑SNP10位点在染色体上的位置是基于草鱼参考基因组序列比对确定的，草鱼参考基因组序列的版本号为HZGC01(GCA_019924925.1)。测序扩增确定C3.1基因内含子上存在一些抗GCRV相关单核苷酸多态性位点，其中具有显著差异性位点有SNP3(g.42188A/G)的AA基因型，SNP7(g.76773C/T)的CT基因型，SNP8(g.76945T/C)的CT基因型。本发明揭示了C3.1在草鱼免疫抗病方面的作用，为开展草鱼抗GCRV分子育种提供了相关有效标记，并为解析其抗病性状的遗传机制提供理论基础。
Description
技术领域
本发明涉及分子标记技术，具体而言，涉及一组草鱼C3.1基因SNP分子标记及其在草鱼出血病抗性中的应用。
背景技术
草鱼(Ctenopharyngodon idella)隶属于鲤科、雅罗鱼亚科、草鱼属，是我国淡水养殖中重要的养殖鱼类之一，2022年年产量达590.4万吨，居淡水养殖产量首位，较2021年增幅2.6％，在我国淡水鱼类养殖产量中占比21.79％。近些年来我国草鱼养殖产量增长迅速，养殖规模逐渐扩大，养殖方式也逐渐增多。草鱼出血病属呼肠孤病毒科(Reoviridae)水生呼肠孤病毒属成员(Aquareovirus)，因此也称之为草鱼呼肠孤病毒(Grass carpreovirus，GCRV)，是一种传染快、发病急、死亡率高的危害鱼类最严重的流行病，主要危害一、二龄鱼种，流行季节(6－9)月发病率高，死亡率高达80％以上。电镜观察结果显示，GCRV能在草鱼肠道、脾网状细胞、血管内皮细胞、肾等组织中进行复制，无外衣壳的未成熟GCRV粒子存在于肾脏组织，而成熟的GCRV粒子则主要分布于肠道内，在草鱼其他组织中没有观察到相应的病毒颗粒。目前草鱼出血病的防控大致可分为疫苗预防免疫、抗病毒药物防治和生态防控三类，以疫苗免疫为主。
补体系统(Complement System)是由30多种可溶性蛋白、膜结合性蛋白和补体受体组成的多分子系统，在先天性免疫和适应性免疫中均起着重要的作用。种质资源是遗传育种的物质基础，经过多年的工作，为草鱼种质资源保护和遗传改良提供了坚实保障，其中分子遗传学、基因组学研究在其中占据重要地位。其中分子标记已经在畜禽和水产抗病育种中已经起到了非常重要的作用，且研究表明，某些基因的多态性与抗病性状是有关联的，如TLRs、MBL等，也越来越多的学者将防治草鱼出血病的目光投向了草鱼群体中的抗性群体，欲通过育种改良解决这一难题。陈松林团队通过对MHCⅡB基因的多态性研究，筛选出牙鲆抗病等位基因，并将其用于抗病品系的选育中，培育了具有抗病力强的“鲆优2号”；等筛选出了大西洋鲑中抗病性强和易感病的MHC基因型，选出了2个抗病基因型家系和1个易感家系；
在补体各成分中，C3的血清含量最高；在功能上，C3亦居于中心地位，它既是几条激活途径的交汇，又是C3b依赖性阳性反馈环路的基础；同时，C3裂解片段及其结合蛋白复杂而多样，在免疫防御、免疫调控以及免疫病理中发挥着重要作用。C3(186kDa)裂解为C3b(177kDa)和C3a(9kDa)是补体激活级联的中心步骤，可通过三种不同的途径启动-经典途径，凝集素途径和替代途径。补体系统有多种成分介导三种激活途径，在清除外来病原体方面具有很高的效率，但其不适当和过度激活会引发宿主自身免疫性疾病。与具有单个C3的四足动物不同，所有硬骨鱼都具有多个C3，这使得硬骨鱼可以产生多个具有功能活性的C3a。从草鱼(Ctenopharyngodon idella)基因组中鉴定出9个C3基因，命名为C3.1-C3.9。
基于C.idella的转录组分析，补体通路在草鱼感染GCRV过程中变化显著，C3基因为补体通路中关键基因，基于草鱼中具有多个C3拷贝数，本发明的研究目的为，对草鱼C3.1-C3.9进行进化及结构特征分析，判断多个C3拷贝基因中主效因子，并研究该基因SNP位点研究其与草鱼出血病抗性关联，为开发草鱼抗GCRV分子育种提供基础依据。
发明内容
本发明首先提供了一组草鱼C3.1基因SNP分子标记，所述分子标记包含SNP1、SNP2、SNP3、SNP4、SNP5、SNP6、SNP7、SNP8、SNP9和SNP10；
所述SNP1位点为1号染色体上的第7065位核苷酸；
所述SNP2位点为1号染色体上的第42128位核苷酸；
所述SNP3位点为1号染色体上的第42188位核苷酸；
所述SNP4位点为1号染色体上的第42452位核苷酸；
所述SNP5位点为1号染色体上的第48268位核苷酸；
所述SNP6位点为x号染色体上的第76714位核苷酸；
所述SNP7位点为1号染色体上的第76773位核苷酸；
所述SNP8位点为1号染色体上的第76945位核苷酸；
所述SNP9位点为1号染色体上的第77153位核苷酸；
所述SNP10位点为1号染色体上的第77252位核苷酸；
所述SNP1、SNP2、SNP3、SNP4、SNP5、SNP6、SNP7、SNP8、SNP9和SNP10位点在染色体上的位置是基于草鱼参考基因组序列比对确定的，草鱼参考基因组序列的版本号为HZGC01(GCA_019924925.1)。
本发明还提供了上述分子标记作为检测靶标在开发产品中的应用；所述产品的功能为如下(a)或(b)或(c)或(d)：
(a)筛查GCRV抗性群体；
(b)筛查GCRV易感群体
(c)评价鱼类患出血病抗性的风险；
(d)鱼类抗GCRV分子育种；
任选地，所述鱼类为草鱼。
本发明还提供了用于检测上述分子标记的物质在制备产品中的应用；所述产品的功能为如下(a)或(b)或(c)或(d)：
(a)筛查GCRV抗性群体；
(b)筛查GCRV易感群体；
(c)评价鱼类患出血病抗性的风险；
(d)鱼类抗GCRV分子育种；
任选地，所述鱼类为草鱼。
优选地，所述物质为引物。
优选地，所述引物包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8。
本发明还提供了一种产品，包括上述分子标记的物质；所述产品的功能为如下(a)或(b)或(c)或(d)：
(a)筛查GCRV抗性群体；
(b)筛查GCRV易感群体；
(c)鉴定鱼类出血病抗性；
(d)鱼类抗GCRV分子育种；
任选地，所述鱼类为草鱼。
优选地，所述物质为引物。
优选地，所述引物包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8。
本发明还提供了一种鉴定草鱼出血病抗性的方法，其包括如下步骤：检测上述的SNP，然后判断基因型。
优选地，所述方法用于非诊断目的。
本发明与现有技术相比，至少具有如下有益效果：
本发明以草鱼(Ctenopharyngodon idella)的C3.1。表达分析表明，C3.1是草鱼中的优势C3分子，它在C3主效表达组织肝脏中的表达在mRNA水平上都显著高于其他C3分子。本发明对分组家系后代攻毒后进行qPCR，C3.1在肝和头肾中的相对表达量较高，随攻毒进程两次上升下降，其中在12h具有显著差异，子代抗性和易感群体C3.1的表达具有显著差异。测序扩增确定C3.1基因内含子上存在一些抗GCRV相关单核苷酸多态性位点，其中具有显著差异性位点有SNP3(g.42188A/G)的AA基因型，SNP7(g.76773C/T)的CT基因型，SNP8(g.76945T/C)的CT基因型。本发明揭示了C3.1在草鱼免疫抗病方面的作用，为开展草鱼抗GCRV分子育种提供了相关有效标记，并为解析其抗病性状的遗传机制提供理论基础。
附图说明
图1草鱼C3蛋白活性遗传水平，(a)草鱼亲本血液ELISA检测蛋白活性表达；(b)根据亲本蛋白表达活性按照20％、60％、20％分为高、中、低群体进行繁育，检测子代鳍条C3.1-C3.9mRNA表达含量。
图2草鱼C3.1-C3.9全长筛选位点信息统计，顺序分别为，C3.1-C3.9SNP基因组位置分布信息图，C3.1-C3.9SNP转换颠换数据统计图，C3.1-C3.9SNP转换颠换类型统计图，C3.1-C3.9SNP编码信息统计图。
图3验证草鱼C3.1基因内10个SNP信息，(a)草鱼C3.1基因结构及SNP位点(方块为外显子，折线为内含子)；(b)C3.1随机筛选4个SNP位点峰图验证，顺序分别为，SNP1第7065位点T/C型测序峰图，SNP2第42128位点T/C型测序峰图，SNP3第42188位点A/G型测序峰图，SNP4第42452位点A/G型测序峰图。
图4草鱼C3.1基因SNP位点单倍型分析，(a)抗性群体C3.1中SNP1-SNP10连锁不平衡分析；(b)易感群体C3.1中SNP1-SNP10连锁不平衡分析。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。
实施例1材料与方法
1.1试验材料
普通草鱼，体长10-15cm，体质量15-25g，从湘阴渔场获得，在28-31℃水温的实验室暂养系统中驯化并饲养一周，每天以3％的体质量作为喂食量，更换四分之一的水，密切监测水温、溶氧及氨浓度。
攻毒用GCRV从珠江所提供病鱼分离提毒获得，后利用普通草鱼注射分离毒株扩繁制备。
1.2草鱼抗感和易感群体的采集
随机选取普通鱼苗进行攻毒感染试验，各分为5组重复，对照组40尾鱼不作处理放置在系统内养殖，中组GCRV感染组200尾鱼浸泡10ml稀释500倍病毒滴度为1×107TCID50/mL的GCRV溶液，普通组GCRV感染组200尾鱼浸泡10ml稀释500倍病毒滴度为1×107TCID50/mL的GCRV溶液，感染后每隔6h观察1次鱼苗死亡情况，参考前期研究中评判抗感和易感样品的标准，将感染后5d内死亡的个体作为易感个体，感染后14d后还存活的个体作为抗感个体，采集易感、抗感个体的尾鳍样品，于样品稳定剂(TaKaRa)中，-20℃保存备用。
1.3DNA提取
抗性-易感草鱼鳍条的基因组DNA按照omega试剂盒提取。
1.4引物、PCR扩增和测序
根据草鱼补体系统C3.1序列及SNP位点设计SNP特异性扩增引物，20μLPCR扩增体系：7μL的水，10×PCR缓冲液10μL，正反引物各1μL(10μmol·L-1)，和1μL的模板DNA。进行PCR反应的条件如下：在94℃预变性5min，94℃变性30s，58～65℃复性30s，和72℃延伸30s，共35个循环，72℃10min。
表1草鱼C3.1扩增多态性引物
1.5C3.1中SNP的鉴定与数据分析
以草鱼基因组DNA为模板进行PCR得到的产物在2％琼脂糖凝胶上电泳分离，用PCR凝胶纯化试剂盒纯化。随后生工公司对纯化的PCR产物进行双向测序。用DNAMAN软件对扩增片段进行拼接。利用测序手段获得抗性、易感样本对照参考基因组筛选验证SNP，采用SPSS23.0软件进行统计分析。用卡方检验计算等位基因频率和基因型频率在抗性组和易感群组中的差异。P<0.05和0.01分别代表有统计学意义和差异极显著。
2结果与讨论
2.5C3蛋白及遗传性
采集攻毒后抗性、易感两个群体的鳍条提取RNA检测C3.1-C3.9表达量，采集草鱼血液进行ELISA检测，结果如图1，在173尾长江草鱼、92尾湘江草鱼亲本发现血液中C3的散点分布图呈现一种中间宽、两头尖的分布，符合正态分布特征。长江草鱼C3蛋白含量平均值为130.7，分布偏右，分布平缓，偏度为0.326，峰度为0.140，湘江草鱼C3蛋白含量平均值为146.6，分布偏左，分布陡峭，偏度为0.065，峰度为-0.416。湘江流域亲本平均C3蛋白浓度高于长江亲本，说明C3蛋白在不同个体中存在多态性，且根据养殖水域不同蛋白活性水平也有差异，也会影响草鱼对抗病毒效应。C3根据蛋白表达含量20％、60％、20％、分为高、中、低三组，分别进行繁育，检测子代鳍条中C3.1-C3.9mRNA表达含量，结果见图1，可知C3.1、C3.2、C3.4、C3.5、C3.6、C3.8、C3.9趋势相同，都是中组大于高组大于低组，说明C3遗传层面特性，中等蛋白水平亲本繁育的子代一龄有较高mRNA水平。
2.6草鱼C3.1的SNPs鉴定及其抗GCRV的关系
采集子代抗性、易感群体进行C3.1-C3.9mRNA表达水平分析见图2，结果表明其中C3.4、C3.7表达水平在易感群体中低于抗性群体，其他7个基因都是抗性群体表达低于易感群体，C3.1、C3.4相较于其他7个基因属于高表达，且在抗性、易感两个群体中具有显著性差异，其中C3.1差异表达在两倍以上，更符合本研究后续SNP分析的表性差异选择，采集肌肉送生工公司进行测序用于筛选SNP位点。
测序所得C3.1-C3.9的SNP信息进行统计，结果见图2，C3.2的SNP位点数远高于其他8个C3基因，C3.1、C3.8、C3.9的SNP位点数量接近，C3.3最少。其中9个C3基因中处于内含子的SNP位点约占74.95％，其中C3.6内含子SNP位点占所有位点数的89.67％，C3.4、C3.1、C3.9其次，C3.2最少，占56.38％；处于外显子的SNP位点约占22.85％，其中C3.2外显子SNP位点占所有位点数的42.42％最高，其次是C3.7、C3.8、C3.3，C3.6处于外显子数量最少，占总数的0.098％；剩下SNP位点基本处于3’UTR和5’UTR，占0.01％，且基本3’UTR数量大于5’UTR。
在所有外显子SNP中，非同义转换占46.2％，其中C3.7占比最高，达到68.99％，C3.5最少仅有27.78％，C3.7有一个外显子SNP为终止突变，处于第1385位。此外C3.1-C3.9还具有不少indel突变，其中C3.8的indel突变数目最高，为51个，C3.3最少仅有4个且全在内含子区域，其余8个基因indel位置在内含子的数量在88.23％以上，其余还处在外显子、3’UTR、5’UTR位置上。
对SNP的类型分析发现，C3.1-C3.9的转换类型占65.96％-56.14％，其中C3.3、C3.7、C3.8、C3.9中C/T类转换类型占比最多，其他都是A/G占比最高，其中发现[G→A]出现的次数高于[A→G]；同样[C→T]出现的频次明显高于[T→C]，C3.1-C3.9的ts/tv值分别为1.94、1.37、1.27、1.89、1.39、1.66、1.86、1.52、1.67。
利用攻毒后抗性、易感群体进行重测序筛选SNP位点，其中选择C3.1表达效应较高的基因进行后续分析，部分可能性位点进行验证见图3，从所选抗性、易感子代草鱼群体中，C3.1筛选位点，C3.1中第7065位C/T型，抗性群体突变频率为0.821，易感群体突变频率为0.591；第42128位T/C型，抗性突变频率为0.571，易感群体突变频率为0.875；第42188位A/G型，抗性群体突变频率为0.286，易感群体突变频率为0.5；第42452位A/G型，抗性群体突变频率为0.285，易感群体突变频率为0.875；第48268位C/T型，抗性群体突变频率为0.875，易感群体突变频率为0.684；第76714位G/A型，抗性群体突变频率为0.345，易感群体突变频率为0.611；第76773位C/T型，抗性群体突变频率为0.25，易感群体突变频率为0.11；第76945位T/C型，抗性群体突变频率为0.379，易感群体突变频率为0.11；第77153位A/C型，抗性群体突变频率为0.273，易感群体突变频率为0.667；第77252位T/C型，抗性群体突变频率为0.182，易感群体突变频率为0.467；将C3.1上筛选到的SNP位点按照位置信息排序，分别命名为SNP1、SNP2、SNP3、SNP4、SNP5、SNP6、SNP7、SNP8、SNP9、SNP10。
我们在启动子板块同样进行分析，假定C3.1在基因组中查找序列前2k为启动子区，扩增启动子片段，暂未发现SNP突变位点，根据研究基因组中SNP出现频次约为1330bp长度出现1个SNP，所以启动子区可能存在SNP的几率较少。
C3.1基因在GCRV抗性组和乙肝组的SNP统计分析结果如下，利用SPSS19.0软件进行卡方检验发现，C3.1基因的SNP3、SNP4、SNP7、SNP8这4个位点的基因型频率在抗性群体和易感群体中存在极显著差异(P＜0.01)，C3.1基因的SNP6的基因型频率在抗性群体和易感群体中存在显著差异(P＜0.05)但这5个位点的等位基因频率在易感群体和抗性群体中差异均不显著，而SNP1、SNP9这2个位点，在易感群体和抗性群体中等位基因频率差异极显著，SNP2、SNP10等位基因频率差异显著，但这4个位点基因型频率差异不显著。
表2抗性组和敏感组C3.1中个SNP位点的基因型和等位基因的频率
2.7草鱼C3.1SNP的连锁不平衡分析及与病毒抗性的关联分析；
使用Popgen32和PIC软件对10个SNP位点在抗性组和易感组中的遗传多态性进行分析，结果显示，在抗性群体中，PIC的范围处于0.1948-0.3739之间，SNP5属于低度多态(PIC<0.25)，其余SNP属于中度多态(0.25≤PIC<0.50)；在易感群体中，PIC的范围处于0.1778-0.375之间，其中SNP2、SNP4、SNP7、SNP8属于低度多态(PIC<0.25)，其余SNP属于中度多态(0.25≤PIC<0.50)。当PIC>0.50时群体处于高度多态性水平。经χ2检验结果表明，两组群体得到10个位点均处于哈迪–温伯格平衡状态(P>0.05)，SNP4位点理论基因型频率和观测基因型频率之间的差异显著(P<0.05)。
表3草鱼C3.1基因GCRV抗性易感组遗传多态性分析
使用Popgen32和PIC软件对10个SNP位点在抗性组和易感组中的遗传多态性进行分析，结果图4显示，使用Haploview 4.2软件中的Four Gamete Rule计算方法对C3.1的10个SNP位点进行连锁不平衡分析，在抗性群体中结果显示：SNP2、SNP3这2个位点高度连锁，构成单倍块1，可形成CG、TA、CA、TG共4个单倍型；SNP5、SNP6这2个位点高度连锁，构成单倍块2，可形成TG、CG、CA共3个单倍型。在易感群体中结果显示：SNP2、SNP3、SNP4这3个位点高度连锁，构成单倍块1，可形成CGA、CAG、TAG、TAA、CAA共5个单倍型；SNP5、SNP6这2个位点高度连锁，构成单倍块2，可形成TG、CG、CA、TA共4个单倍型；SNP7、SNP8、SNP9这3个位点高度连锁，构成单倍块3，可形成CTA、CTC、CCC、TCC、CCA共5个单倍型。
通过对筛选到的SNP位点进行分型并开展GCRV抗性关联分析发现，草鱼C3.1基因SNP3、SNP4、SNP7、SNP8位点的基因型频率在易感群体和抗病群体中存在极显著差(P<0.01)，其中SNP3位点的AG基因型在易感群体中为优势基因型(75％)，AA基因型在抗病群体中为优势基因型(42.86％)；SNP4位点的AG基因型在易感群体中为优势基因型(87.5％)；SNP7位点的CC基因型在易感群体中为优势基因型(94.4％)，CT基因型在抗病群体中为优势基因型(75％)；SNP8位点的TT基因型在易感群体中为优势基因型(72.2％)，CT基因型在抗病群体中为优势基因型(58.6％)；这些结果表明，C3.1基因的SNP3(g.42188A/G)的AA基因型，SNP7(g.76773C/T)的CT基因型，SNP8(g.76945T/C)的CT基因型基因型与草鱼抗GCRV呈显著相关性。分别对抗性和易感群体的对C3.1基因SNP位点进行连锁不平衡发现，群体间C3.1的10个SNP位点之间存在不同程度的连锁不平衡。本研究筛选到的抗性SNP位点可作为草鱼分子育种的候选分子标记，为抗GCRV草鱼品系的遗传育种提供理论基础。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一组草鱼C3.1基因SNP分子标记，其特征在于，所述分子标记包含SNP1、SNP2、SNP3、SNP4、SNP5、SNP6、SNP7、SNP8、SNP9和SNP10；
所述SNP1位点为1号染色体上的第7065位核苷酸；
所述SNP2位点为1号染色体上的第42128位核苷酸；
所述SNP3位点为1号染色体上的第42188位核苷酸；
所述SNP4位点为1号染色体上的第42452位核苷酸；
所述SNP5位点为1号染色体上的第48268位核苷酸；
所述SNP6位点为x号染色体上的第76714位核苷酸；
所述SNP7位点为1号染色体上的第76773位核苷酸；
所述SNP8位点为1号染色体上的第76945位核苷酸；
所述SNP9位点为1号染色体上的第77153位核苷酸；
所述SNP10位点为1号染色体上的第77252位核苷酸；
所述SNP1、SNP2、SNP3、SNP4、SNP5、SNP6、SNP7、SNP8、SNP9和SNP10位点在染色体上的位置是基于草鱼参考基因组序列比对确定的，草鱼参考基因组序列的版本号为HZGC01(GCA_019924925.1)。
2.权利要求1所述分子标记作为检测靶标在开发产品中的应用；所述产品的功能为如下(a)或(b)或(c)或(d)：
(a)筛查GCRV抗性群体；
(b)筛查GCRV易感群体
(c)评价鱼类患出血病抗性的风险；
(d)鱼类抗GCRV分子育种；
任选地，所述鱼类为草鱼。
3.用于检测权利要求1所述分子标记的物质在制备产品中的应用；所述产品的功能为如下(a)或(b)或(c)或(d)：
(a)筛查GCRV抗性群体；
(b)筛查GCRV易感群体；
(c)评价鱼类患出血病抗性的风险；
(d)鱼类抗GCRV分子育种；
任选地，所述鱼类为草鱼。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述物质为引物。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述引物包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8。
6.一种产品，包括权利要求1所述分子标记的物质；所述产品的功能为如下(a)或(b)或(c)或(d)：
(a)筛查GCRV抗性群体；
(b)筛查GCRV易感群体；
(c)鉴定鱼类出血病抗性；
(d)鱼类抗GCRV分子育种；
任选地，所述鱼类为草鱼。
7.根据权利要求2所述的产品，其特征在于，所述物质为引物。
8.根据权利要求3所述的产品，其特征在于，所述引物包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8。
9.一种鉴定草鱼出血病抗性的方法，其特征在于，其包括如下步骤：检测权利要求1所述的SNP，然后判断基因型。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法用于非诊断目的。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410044990.2A CN117737257B (zh) | 2024-01-12 | 2024-01-12 | 一组草鱼c3.1基因snp分子标记及其在鉴定草鱼出血病抗性中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410044990.2A CN117737257B (zh) | 2024-01-12 | 2024-01-12 | 一组草鱼c3.1基因snp分子标记及其在鉴定草鱼出血病抗性中的应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117737257A true CN117737257A (zh) | 2024-03-22 |
| CN117737257B CN117737257B (zh) | 2024-05-28 |
Family
ID=90277821
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202410044990.2A Active CN117737257B (zh) | 2024-01-12 | 2024-01-12 | 一组草鱼c3.1基因snp分子标记及其在鉴定草鱼出血病抗性中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117737257B (zh) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2864258A1 (en) * | 2013-09-16 | 2015-03-16 | Universidad De Santiago De Chile | Use of grb2, gata3, igm, and mavs genes to determine susceptible phenotypes and resistance to infectious salmon anemia (isa) in atlantic salmon (salmo salar) |
| CN114262741A (zh) * | 2021-11-01 | 2022-04-01 | 华南农业大学 | 苏氏圆腹鲶抗病性状相关的snp分子标记及其应用 |
-
2024
- 2024-01-12 CN CN202410044990.2A patent/CN117737257B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2864258A1 (en) * | 2013-09-16 | 2015-03-16 | Universidad De Santiago De Chile | Use of grb2, gata3, igm, and mavs genes to determine susceptible phenotypes and resistance to infectious salmon anemia (isa) in atlantic salmon (salmo salar) |
| CN114262741A (zh) * | 2021-11-01 | 2022-04-01 | 华南农业大学 | 苏氏圆腹鲶抗病性状相关的snp分子标记及其应用 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| HUANG, J.Y. 等: "Characterization of multi-copy C3 genes and association analysis of C3.1 polymorphism with GCRV resistance traits in Ctenopharyngodon idella", AQUACULTURE, vol. 583, 30 March 2024 (2024-03-30), pages 740567 * |
| LIAO, Z. 等: "Large-scale SNP screenings identify markers linker with GCRV resistant traits through transcriptomes of individuals and cell lines in Ctenopharyngodon idella", SCIENTIFIC REPORTS, vol. 7, 26 April 2017 (2017-04-26), pages 1 - 12 * |
| 曹建萌;胡欣欣;卢迈新;陈琼;刘志刚;陈昆平;: "尼罗罗非鱼补体C9基因单核苷酸多态性及其与抗无乳链球菌感染的关联分析", 农业生物技术学报, no. 03 * |
| 曹建萌;胡欣欣;卢迈新;陈琼;刘志刚;陈昆平;: "尼罗罗非鱼补体C9基因单核苷酸多态性及其与抗无乳链球菌感染的关联分析", 农业生物技术学报, vol. 25, no. 03, 31 December 2017 (2017-12-31), pages 354 - 365 * |
| 翟瑞燕;王长法;仲跻峰;安利国;: "补体C3基因多态性与相关疾病研究进展", 家畜生态学报, no. 06, 15 November 2010 (2010-11-15), pages 92 - 95 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117737257B (zh) | 2024-05-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108531615B (zh) | 一种鸡HS6ST3基因43bp indel多态性标记及其应用、检测引物、试剂盒 | |
| CN110129456A (zh) | 一种对虾抗弧菌分子标记组合及其在育种中的应用 | |
| DK180777B1 (en) | Hsmi disease resistance in salmonids | |
| CN116121397A (zh) | 检测石斑鱼抗神经坏死病毒性状相关的snp分子标记组合的试剂 | |
| Wei et al. | A high-density genetic linkage map and QTL mapping for sex and growth-related traits of large-scale loach (Paramisgurnus dabryanus) | |
| AU2004204182A1 (en) | Selecting animals for desired genotypic or potential phenotypic properties based on a single nucleotide polymorphism (SNP) in intron 3 of the IGF2 gene | |
| CN106256904A (zh) | 一种草鱼出血病免疫性状相关的遗传标记 | |
| CN117737257B (zh) | 一组草鱼c3.1基因snp分子标记及其在鉴定草鱼出血病抗性中的应用 | |
| CN111979332B (zh) | 用于选择母鸡储精能力期间受精率的snp分子标记及其应用 | |
| CN108570508B (zh) | 一种与鸡喙畸形性状相关的分子标记及其应用 | |
| CN115896297A (zh) | 赤点石斑鱼抗神经坏死病病毒育种的snp标记及应用 | |
| CN114540511A (zh) | 一种与凡纳滨对虾抗病性状相关的snp标记、检测引物及其应用 | |
| CN113604587A (zh) | 一种快速鉴定日本对虾低温耐受品种的分子标记t5198及其应用 | |
| Mustafa | The complete mitogenome of the Iraqi Awassi sheep breed and the maternal lineage utilizing high throughput sequencing raw reads | |
| CN113186299A (zh) | 卵形鲳鲹刺激隐核虫病关联的snp分子标记及其引物和应用 | |
| Curole et al. | Bivalve genomics: complications, challenges, and future perspectives | |
| un Nissa et al. | Selection of functional EPHB2 genotype in ENU mutated grass carp response to GCRV by the method of BSA Sequence Analysis | |
| KR102654409B1 (ko) | 전복 친자 감별용 유전자 마커 및 그를 이용한 방법 | |
| KR102527604B1 (ko) | 황어 친자 식별용 유전자 마커 및 이를 이용한 친자확인방법 | |
| CN110172516B (zh) | 检测黄牛lncFAM200B基因5’侧翼区单核苷酸多态性的方法及其应用 | |
| Peng | Mapping QTL for resistance to VNN disease and analysis of transcriptome in response to NNV infection in Asian seabass | |
| CN110724750B (zh) | 一种三疣梭子蟹耐副溶血弧菌的分子标记c242及其应用 | |
| CN118291649A (zh) | 南美白对虾抗弧菌病性状相关的abcf1基因分子标记及应用 | |
| CN108165640B (zh) | 一种与哺乳仔猪腹泻抗性或易感性相关的snp位点及分子标记检测和应用 | |
| CN118256632A (zh) | 南美白对虾胞质分裂作用因子3基因分子标记及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |