CN118256632A - 南美白对虾胞质分裂作用因子3基因分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种南美白对虾胞质分裂作用因子3基因分子标记，其包括位于南美白对虾dedicator of cytokinesis protein 3基因序列上的分子标记A、分子标记B、分子标记C、分子标记D、分子标记E、分子标记F和分子标记G；本发明利用所述分子标记作为南美白对虾抗副溶血性弧菌性状的功能标记，提高南美白对虾的抗病育种，具体是通过提取待测南美白对虾肌肉组织的基因组DNA，再将其作为模板DNA进行PCR扩增以及PCR扩增产物纯化，然后对得到的产物进行测序，确定所述的分子标记A、分子标记B、分子标记C、分子标记D、分子标记E、分子标记F和分子标记G的基因型，从而选择具有优势的基因型个体进行南美白对虾育种，促进了南美白对虾抗病养殖的研究和应用。
Description
技术领域
本发明属于南美白对虾育种技术领域，具体涉及一种南美白对虾胞质分裂作用因子3基因分子标记及其应用。
背景技术
随着南美白对虾（也称凡纳滨对虾）养殖业高密度、集约化的快速发展以及海洋生态环境的恶化，对虾养殖经常面临细菌、病毒和寄生虫等疾病威胁，严重阻碍了对虾养殖业的健康发展。尤其是由副溶血弧菌引起的细菌性疾病，给对虾养殖造成了巨大的经济损失。为了预防副溶血弧菌疾病的爆发，已经使用了包括中草药、益生菌、抗菌肽等在内的多种措施，遗憾的是，至今仍旧没有找到有效的防治方法。因此，为应对副溶血弧菌引起的细菌性疾病一种切实可行的策略是选育出对副溶血性弧菌感染具有抗性的凡纳滨对虾品种。
胞质分裂作用因子3（dedicator of cytokinesis protein 3，DOCK3）是鸟嘌呤核苷酸交换因子家族成员，可通过激活小G蛋白影响下游相关信号通路，与肌营养不良、肺纤维化、癫痫、肿瘤等疾病的发生发展密切相关。最近的研究发现DOCK3在保护视网膜神经节细胞免受神经毒素和氧化应激损伤方面也发挥重要作用，但未有DOCK3与对虾抗副溶血弧菌相关的报道。
单核苷酸多态性（SNPs）是最常见的遗传变异类型，随着DNA测序技术的快速发展，单核苷酸多态性越来越多地用于甲壳动物生物性状和遗传变异之间的关联分析以加快育种进程。近年来，许多免疫相关基因中的SNPs已被证实与宿主对病原体感染的抗性相关。例如，文蛤MITF基因中SNP位点A/T在与副溶血弧菌抗病性状的关联分析显示，携带AA基因型和等位基因A的个体对副溶血弧菌感染的抗性更强。桃拉综合征病毒（TSV）攻毒后，在凡纳滨对虾Hsp70基因中发现了5个SNP，其中892 C/T SNP基因型频率在TSV抗性虾和易感虾之间存在显著差异。在泥蚶AP-1基因中发现18个SNP，其中6个与哈维氏弧菌抗性显著相关。然而，在凡纳滨对虾中关于免疫相关基因SNP分子标记的开发及其与抗副溶血弧菌性状的关联分析却很少报道。
发明内容
针对上述不足，本发明公开了一种南美白对虾胞质分裂作用因子3基因分子标记，其基于南美白对虾的dedicator of cytokinesis protein 3 基因筛选得到与抗副溶血性弧菌性状相关的SNP分子标记，将所述SNP分子标记用于南美白对虾的选育，有利于得到具有优良抗副溶血性弧菌能力的南美白对虾新品种。
本发明是采用如下技术方案实现的：
一种南美白对虾胞质分裂作用因子3基因分子标记，其包括分子标记A、分子标记B、分子标记C、分子标记D、分子标记E、分子标记F和分子标记G中的任意一种或多种；
所述分子标记A位于序列表中序列1所示的核苷酸序列的14552 bp位点处，记为D.14552 T>A，该位点的碱基为A或T，突变类型为A/T杂合型、T/T纯合型；
所述分子标记B位于序列表中序列1所示的核苷酸序列的14572 bp位点处，记为D.14572 A>G，该位点的碱基为A或G，突变类型为A/A纯合型、A/G杂合型、G/G纯合型；
所述分子标记C位于序列表中序列1所示的核苷酸序列的14592 bp位点处，记为D.14592 A>T，该位点的碱基为A或T，突变类型为A/A纯合型、A/T杂合型；
所述分子标记D位于序列表中序列1所示的核苷酸序列的14688 bp位点处，记为D.14688 G>A，该位点的碱基为A或G，突变类型为A/A纯合型、A/G杂合型、G/G纯合型；
所述分子标记E位于序列表中序列1所示的核苷酸序列的14697 bp位点处，记为D.14697 G>A，该位点的碱基为A或G，突变类型为A/G杂合型、G/G纯合型；
所述分子标记F位于序列表中序列1所示的核苷酸序列的14704 bp位点处，记为D.14704 G>A，该位点的碱基为A或G，突变类型为A/G杂合型、G/G纯合型；
所述分子标记G位于序列表中序列1所示的核苷酸序列的14720 bp位点处，记为D.14720 G>T，该位点的碱基为G或T，突变类型为G/G纯合型、G/T杂合型、T/T纯合型。
序列表中序列表1所述的核苷酸序列为dedicator of cytokinesis protein 3基因的核苷酸序列，所述dedicator of cytokinesis protein 3 基因为NCBI的GenBank数据库中编号为LOC113808196所示的基因。
所述南美白对虾胞质分裂作用因子3基因分子标记的应用是将所述基因分子标记用于南美白对虾的选择育种，具体是先提取待测南美白对虾肌肉组织的基因组DNA，再将其作为模板DNA进行PCR扩增以及PCR扩增产物纯化，然后对得到的PCR扩增产物进行测序，确定所述的分子标记A、分子标记B、分子标记C、分子标记D、分子标记E、分子标记F和分子标记G的基因型；
当分子标记A的基因型为优势基因型的TT基因型时，选择该个体作为后备亲本进行南美白对虾品种育种；当分子标记B的基因型为优势基因型的AA基因型时，选择该个体作为后备亲本进行南美白对虾品种育种；当分子标记C的基因型为优势基因型的AT基因型时，选择该个体作为后备亲本进行南美白对虾品种育种；当分子标记D的基因型为优势基因型的GG基因型时，选择该个体作为后备亲本进行南美白对虾品种育种；当分子标记E的基因型为优势基因型的AG基因型时，选择该个体作为后备亲本进行南美白对虾品种育种；当分子标记F的基因型为优势基因型的AG基因型时，选择该个体作为后备亲本进行南美白对虾品种育种；当分子标记G的基因型为优势基因型的GG基因型时，选择该个体作为后备亲本进行南美白对虾品种育种。
本发明是取南美白对虾的附肢肌肉组织来提取DNA，这不会对对虾肌体造成太大影响。育种可采用分子辅助育种的方法进行育种，例如利用基因敲除或者基因编辑的方法处理分子标记后获得的品种。
所述PCR扩增过程中，用于检测所述南美白对虾胞质分裂作用因子3基因分子标记的引物组，其包括引物F和引物R，所述引物F的序列为GTCTCTATAATTAGCCTTCTTGAAGACAG（序列表中序列2），所述引物R的序列为ATACCTGAGAAGCTTGGATGT（序列表中序列3）。
所述PCR扩增体系由以下组分组成：2.0μL的10×Taq缓冲液、0.4μL的dNTP(10mmol/L each)、0.2μL的浓度为5U/μL的Taq DNA聚合酶、0.5μL的引物F、0.5μL的引物R、14.4μL的ddH2O、2.0μL的模板DNA。
所述PCR扩增的反应程序包括以下步骤：
S1、在95℃下预变性5min；
S2、在95℃下变性30s，60℃下退火30s，72℃下延伸30s，进行34个循环；
S3、在72℃下延伸5min。
本技术方案与现有技术相比较具有以下有益效果：
本发明提供了与南美白对虾抗副溶血弧菌性状紧密相关的SNP分子标记，可应用于南美白对虾抗副溶血弧菌新品种的选育，有利于促进南美白对虾抗病养殖的研究和应用。利用本发明方法选育抗副溶血弧菌的南美白对虾，所选育的个体基因型稳定且不发生遗传分化，而且育种的效率和准确性高，为南美白对虾品种养殖和改良研究提供良好的基础。
附图说明
图1是实施例中扩增dedicator of cytokinesis protein 3 基因得到的产物的部分片段序列，a表示第151位～155位，其中显示了D. 14552 T>A位点的AT、TT峰值图；表示b是第171位～175位，其中显示了D. 14572 A>G位点的AA、AG、GG峰值图；c表示第191位～195位，其中显示了D. 14592 A>T位点的AA、AT峰值图。
图2是实施例中扩增dedicator of cytokinesis protein 3 基因得到的产物的部分片段序列，d表示第287位～291位，其中显示了D. 14688 G>A位点的AA、AG、GG峰值图；e表示第296位～300位，其中显示了D. 14697 G>A位点的AG、GG峰值图；f 表示第303位～307位，其中显示了D. 14704 G>A位点的AG、GG峰值图；g表示第319位～323位，其中显示了D.14552 G>A位点的GG、GT、TT峰值图。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。下列实施例中未注明的具体实验条件和方法，所采用的技术手段通常为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例：本发明所述南美白对虾胞质分裂作用因子3基因分子标记的筛选过程如下：
（1）选取245尾体重约为20克的南美白对虾进行5天暂养后，为南美白对虾个体注射浓度为7×106cfu/mL的副溶血弧菌100μL；为了排除注射因素造成的死亡，在攻毒6小时后开始记录死亡个体，并分别选取最先死亡与96小时后仍存活的南美白对虾各60尾，作为南美白对虾副溶血弧菌敏感组和副溶血弧菌耐受组的样本；
（2）在敏感组和耐受组里分别随机选取5尾南美白对虾，提取肌肉组织并采用常规的酚仿抽提方法提取基因组DNA，将所得到的基因组DNA于-20 °C下保存备用；
（3）根据南美白对虾dedicator of cytokinesis protein 3 基因序列设计得到引物F和引物R，接着扩增筛选位于dedicator of cytokinesis protein 3 基因的SNP位点；
所述引物F的序列为：GTCTCTATAATTAGCCTTCTTGAAGACAG；
所述引物R的序列为：ATACCTGAGAAGCTTGGATGT。
所述PCR扩增体系由以下组分组成：2.0μL的10×Taq缓冲液、0.4μL的dNTP(10mmol/L each)、0.2μL的浓度为5U/μL的Taq DNA聚合酶、0.5μL的引物F、0.5μL的引物R、14.4μL的ddH2O、2.0μL的模板DNA；
所述PCR扩增的反应程序包括以下步骤：
S1、在95℃下预变性5min；
S2、在95℃下变性30s，60℃下退火30s，72℃下延伸30s，进行34个循环；
S3、在72℃下延伸5min；
（4）将PCR扩增产物经过1%琼脂糖凝胶电泳检测后纯化测序，在采用DNAstar软件对测序结果进行比对分析，包括核苷酸序列比对及峰图分析，筛选出相关的SNPs位点；其中一个样本的PCR扩增产物序列如下所示：
GTCTCTATAATTAGCCTTCTTGAAGACAGTAAGTTCGAGCATTTTAAGCCAGTAATGGATGCTTACATCACTGGCCACTTTGCTGCTGCACTTGTATACAAGTAAGTGTCTTGTTATGAATTTAACAGCCCATTTTATTGCATTGGTTAATATATTTATGCATTGTTTTATAATGTATGCTAAAGGCACAAAAATAATGCGTAGTTTTATAATGTAGGTCAAAGGCACTAATTAAGACAAAATAAAATCTTGGTTAAAGATGATCCTTACATATTTTTTTTTCAACTAGTCTTTATAGATTAAAGAAAAAGTTGTCTTTTGCATTTTCACCAGGGGCCTTATCAGTTGTGTGAAGCACCTGTCGGACCTCTGCCCTCAGACCGAGAAGCAGGAACCAATTATGAAATGTTTTCGTTCGCTGGAATATATCTTCAAATTCATCATCCAGTCTCGGCTTCTGTTTGCGAGAGCCACAGGGGGACAGAATGAAGATTCCTTTAGAGTTGATGTGGATAGTTTATTTGAATCTTTTGCTCATATGCTCAATATGCATCTGGACAACATCCAAGCTTCTCAGGTAT；
其中第153位为D. 14552 T>A，第173位为D. 14572 A>G，第193位为D. 14592 A>T，第289位为D. 14688 G>A, 第298位为D. 14697 G>A，第305位为D. 14704 G>A，第321位为D. 14720 G>T；
（5）根据所筛选出的SNPs位点，对敏感组和耐受组中的南美白对虾分别按照上述方法进行检测及基因分型，统计不同SNP位点在敏感组与耐受组的样本，计算基因型频率和等位基因频率，卡方分析进行独立性检验，具体结果见表1。
根据表1进行分析，各分子标记位点的基因型多态性对南美白对虾抗副溶血性弧菌性状有极显著的影响：分子标记A的优势型为TT基因型，分子标记B的优势型为AA基因型，分子标记C的优势型为AT基因型，分子标记D的优势型为GG基因型，分子标记E的优势型为AG基因型，分子标记F的优势型为AG基因型，分子标记G的优势型为GG基因型。
表1 所述位点卡方分析结果
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (5)
1.一种南美白对虾胞质分裂作用因子3基因分子标记，其特征在于：所述基因分子标记包括分子标记A、分子标记B、分子标记C、分子标记D、分子标记E、分子标记F和分子标记G中的任意一种或多种；
所述分子标记A位于序列表中序列1所示的核苷酸序列的14552 bp位点处，记为D.14552 T>A，该位点的碱基为A或T，突变类型为A/T杂合型、T/T纯合型；
所述分子标记B位于序列表中序列1所示的核苷酸序列的14572 bp位点处，记为D.14572 A>G，该位点的碱基为A或G，突变类型为A/A纯合型、A/G杂合型、G/G纯合型；
所述分子标记C位于序列表中序列1所示的核苷酸序列的14592 bp位点处，记为D.14592 A>T，该位点的碱基为A或T，突变类型为A/A纯合型、A/T杂合型；
所述分子标记D位于序列表中序列1所示的核苷酸序列的14688 bp位点处，记为D.14688 G>A，该位点的碱基为A或G，突变类型为A/A纯合型、A/G杂合型、G/G纯合型；
所述分子标记E位于序列表中序列1所示的核苷酸序列的14697 bp位点处，记为D.14697 G>A，该位点的碱基为A或G，突变类型为A/G杂合型、G/G纯合型；
所述分子标记F位于序列表中序列1所示的核苷酸序列的14704 bp位点处，记为D.14704 G>A，该位点的碱基为A或G，突变类型为A/G杂合型、G/G纯合型；
所述分子标记G位于序列表中序列1所示的核苷酸序列的14720 bp位点处，记为D.14720 G>T，该位点的碱基为G或T，突变类型为G/G纯合型、G/T杂合型、T/T纯合型。
2.如权利要求1所述南美白对虾胞质分裂作用因子3基因分子标记的应用，其特征在于：将所述基因分子标记用于南美白对虾的选择育种，具体是先提取待测南美白对虾肌肉组织的基因组DNA，再将其作为模板DNA进行PCR扩增以及PCR扩增产物纯化，然后对得到的PCR扩增产物进行测序，确定所述的分子标记A、分子标记B、分子标记C、分子标记D、分子标记E、分子标记F和分子标记G的基因型；
当分子标记A的基因型为优势基因型的TT基因型时，选择该个体作为后备亲本进行南美白对虾品种育种；当分子标记B的基因型为优势基因型的AA基因型时，选择该个体作为后备亲本进行南美白对虾品种育种；当分子标记C的基因型为优势基因型的AT基因型时，选择该个体作为后备亲本进行南美白对虾品种育种；当分子标记D的基因型为优势基因型的GG基因型时，选择该个体作为后备亲本进行南美白对虾品种育种；当分子标记E的基因型为优势基因型的AG基因型时，选择该个体作为后备亲本进行南美白对虾品种育种；当分子标记F的基因型为优势基因型的AG基因型时，选择该个体作为后备亲本进行南美白对虾品种育种；当分子标记G的基因型为优势基因型的GG基因型时，选择该个体作为后备亲本进行南美白对虾品种育种。
3.根据权利要求2所述南美白对虾胞质分裂作用因子3基因分子标记的应用，其特征在于：所述PCR扩增过程中，用于检测所述南美白对虾胞质分裂作用因子3基因分子标记的引物组，其包括引物F和引物R，所述引物F的序列为GTCTCTATAATTAGCCTTCTTGAAGACAG，所述引物R的序列为ATACCTGAGAAGCTTGGATGT。
4. 根据权利要求2所述南美白对虾胞质分裂作用因子3基因分子标记的应用，其特征在于：所述PCR扩增体系由以下组分组成：2.0μL的10×Taq缓冲液、0.4μL的dNTP、0.2μL的浓度为5U/μL的Taq DNA聚合酶、0.5μL的引物F、0.5μL的引物R、14.4μL的ddH2O、2.0μL的模板DNA。
5.根据权利要求2所述南美白对虾胞质分裂作用因子3基因分子标记的应用，其特征在于：所述PCR扩增的反应程序包括以下步骤：
S1、在95℃下预变性5min；
S2、在95℃下变性30s，60℃下退火30s，72℃下延伸30s，进行34个循环；
S3、在72℃下延伸5min。
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