CN106967831A - 齐口裂腹鱼细菌性败血症关联的snp标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种齐口裂腹鱼细菌性败血症关联的SNP标记及其应用，所述SNP标记核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，序列自5’端起第779位碱基为C或T。在本发明所述SNP位点处，基因型为CT的齐口裂腹鱼感染细菌性败血症的概率显著高于纯合CC型个体。因此，通过检测齐口裂腹鱼上述SNP，能够有效地确定其是否易患染细菌性败血症。在亲本选育中淘汰CT基因型个体利于提高后代抗细菌性败血症感染的能力，利用本发明标记进行辅助育种，进而加快齐口裂腹鱼抗病优良品种培养进程。

Description

齐口裂腹鱼细菌性败血症关联的SNP标记及其应用

技术领域

本发明涉及齐口裂腹鱼细菌性败血症关联的SNP标记及其应用，具体涉及齐口裂腹鱼细菌性败血症关联的SNP标记，用于检测前述SNP标记的引物对和试剂盒，以及前述SNP标记、引物对及试剂盒在齐口裂腹鱼选育中的用途，以及检测齐口裂腹鱼患有细菌性败血症的方法。

背景技术

齐口裂腹鱼（Schizothorax prenanti）是我国重要的冷水鱼类之一，其肉质细嫩、味鲜美、营养价值高，深受消费者青睐，目前已成为我国长江上游名贵经济鱼类。我国曾有丰富的齐口裂腹鱼野生资源，然而近年来，由于过度捕捞、修建电站、水体污染等导致齐口裂腹鱼野生资源遭到严重破坏，种群数量急剧下降，自然资源将近枯竭。为有效保护齐口裂腹鱼的野生资源，多位研究者先后攻克了齐口裂腹鱼的人工繁殖和人工养殖技术，目前，已在重庆、四川、云南等地进行了规模化的养殖。但由于近年来养殖规模的扩大、集约化程度的提高、养殖密度的增加、饲养管理操作不当及水质污染等原因，导致了养殖的齐口裂腹鱼抗病力下降，疾病频发，如败血症、肌肉溃疡病，以及由小瓜虫、斜管虫、绦虫等引起的寄生虫性疾病，其中细菌性败血症危害最大。养殖者为控制病害而大量使用药物，不仅导致水产品药物残留等食品安全问题，还造成了病原微生物耐药性增加、养殖环境恶化等一系列问题。因此，筛选与抗病性状相关联的分子标记，利用标记辅助育种，培育齐口裂腹鱼抗病优良品种成为控制病害发生的有效途径之一。

分子标记辅助育种（marker-assisted selection, MAS）是依据与某一基因或性状紧密连锁的标记的出现来推断该基因或性状而进行选育，它是在DNA水平上而不是根据表型进行选择，因此可以提高选择的准确性，并可在早期鉴定出具有优良性状的个体，筛选优良亲本，从而加快育种进程缩短育种周期。

SNP标记是继微卫星标记之后最为高效的标记，由于其是双等位型标记，具有在全基因组多态性高、含量丰富、遗传稳定、分析简单等优点，广泛用于多种动物及少数鱼类的选择育种中。然而，齐口裂腹鱼抗病相关SNP未见报道，能有效用于齐口裂腹鱼抗病相关性状选育的SNP标记有待挖掘。

发明内容

本发明的目的在于提供一种齐口裂腹鱼细菌性败血症关联的SNP标记及其应用，通过该SNP标记能够快速检测齐口裂腹鱼对细菌性败血症的抗病能力，能够有效用于齐口裂腹鱼抗病性状的选育。

本发明采取的技术方案如下：

1.齐口裂腹鱼细菌性败血症关联的SNP标记，所述SNP标记核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，序列自5’端起第779位碱基为C或T。

2.用于检测权利要求1所述的SNP标记的引物对，所述SNP标记的引物对核苷酸序列为：

F：tccttaaacc tctggtgtct ct，（SEQ ID NO.2）；

R：gctgtttcca gataggtcca a，（SEQ ID NO.3）。

3. 用于检测上述SNP标记的试剂盒，包含上述的引物对。

4. 一种检测齐口裂腹鱼对细菌性败血症易感性的方法，通过对待测齐口裂腹鱼进行SNP标记的检测，确定所述待测齐口裂腹鱼对细菌性败血症是否易感。

优选的，包括以下步骤：

（1）提取待测齐口裂腹鱼的基因组DNA；

（2）利用所述的引物对，将步骤（1）获取的DNA进行PCR扩增，以获得PCR扩增产物；

（3）对步骤（2）获得的PCR扩增产物进行测序，获得测序结果后根据结果确定待测齐口裂腹鱼的SNP标记的基因型；

（4）根据步骤（3）确定的SNP标记的基因型确定待测齐口裂腹鱼对细菌性败血症是否易感。

所述SNP标记的个体基因型为CT的齐口裂腹鱼对细菌性败血症更易感，即所述SNP位点的基因型为CT的齐口裂腹鱼感染细菌性败血症的概率显著高于其他基因型个体。

本发明提供的检测齐口裂腹鱼细菌性败血症关联SNP的检测方法中，基因组提取不受特别限制，可以采用传统酚氯仿法提取，也可采用试剂盒提取，本发明中的具体实施例是采用试剂盒提取，试剂盒操作简便、快速、提取的DNA质量高。另外，待测齐口裂腹鱼个体基因型检测方法不受特别限制，飞行时间质谱、测序、芯片、单链构象多态性聚合酶链式反应、限制性片段长度多态性聚合酶链式反应等技术均可用于SNP的检测。其中，飞行时间质谱准确性高、灵活性强、通量大、检测周期短，因此，本发明采用飞行时间质谱检测SNP标记。

本发明的有益效果在于：本发明经研究发现，在本发明所述SNP位点处，基因型为CT的齐口裂腹鱼感染细菌性败血症的概率显著高于纯合CC型个体。因此，通过检测齐口裂腹鱼上述SNP，能够有效地确定其是否易患染细菌性败血症。具体讲，该位点基因型为杂合CT时齐口裂腹鱼容易患细菌性败血症，则说明该位点C突变为T后，齐口裂腹鱼易患细菌性败血症，该位点为编码非同义SNP位点，是亮氨酸（Leu，CUC）和苯丙氨酸（Phe，UUC）的多态位点。因此，本发明的SNP标记与齐口裂腹鱼细菌性败血症紧密相关，在亲本选育中淘汰CT基因型个体利于提高后代抗细菌性败血症感染的能力，利用本发明标记进行辅助育种，进而加快齐口裂腹鱼抗病优良品种培养进程。

利用上述SNP位点的引物对可以有效的检测待测齐口裂腹鱼的基因型，其结果一方面可以判断待测齐口裂腹鱼是否易感染细菌性败血症，另一方面可以为亲本选择提供参考，例如，选择在该位点处基因型都为CC的个体为亲本，淘汰基因型为CT的个体，则后代个体在该位点处基因型都为纯合CC，后代个体不会出现易患细菌性败血症的CT基因型个体。因此，利用本发明的SNP位点引物可检测齐口裂腹鱼基因型，判断该个体是否易患细菌性败血症，能够有效用于齐口裂腹鱼分子标记辅助选择育种，加快齐口裂腹鱼抗病优良品种培育进程。

本发明还提供了一种用于检测所述的SNP标记的试剂盒，该试剂盒可以有效检测齐口裂腹鱼抗细菌性败血症感染，用于齐口裂腹鱼分子标记辅助育种。

附图说明

图1为96个SNPs PCR扩增电泳图。

具体实施方式

下面将对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。

1.1齐口裂腹鱼群体样本来源

待测鱼取自于峨眉山冷水鱼养殖场同一批次人工繁殖的13月龄的齐口裂腹鱼，随机挑选健康齐口裂腹鱼178尾，体重在100g/尾左右，采用胸腔注射法向齐口裂腹鱼注射半致死浓度嗜水气单胞菌菌液，7天内死亡个体和有典型症状个体为易感个体，无感染症状的个体为抗病个体。其中易感组有109个个体，抗病组有69个个体，剪取其鳍条，保存于无水乙醇中，用于基因组DNA提取。

1.2待测齐口裂腹鱼基因组DNA提取

基因组DNA提取采用苯酚-氯仿抽提方法提取，具体方法如下：取鳍条约50 mg，加入650μL 消化液（1L消化液含2 ml 5mol/L NaCl，10 ml 1mol/L Tris-Cl，50 ml SDS(10%) 和200 ml 0.5mol/L EDTA，pH=8.0），10 μL 20 mg/mL的蛋白酶K，55℃水浴锅内消化过夜；加入4 μL终浓度40 μg/mL的RNase A（4 mg/mL），37℃水浴1小时；加650 μL（pH值8.0）平衡酚，温和颠倒混匀，离心（12000 g, 4℃）10 min，吸取上清；等体积酚重复抽提一次；加等体积的苯酚-氯仿-异戊醇的混合物（苯酚：氯仿：异戊醇体积比25：24：1），颠倒混匀10min，同上条件离心，小心吸取上清液，并重复一次；加等体积氯仿-异戊醇混合物（氯仿和异戊醇的体积比24：1）洗一次，记录上清的体积；加2.5倍体积的无水乙醇，离心（12000 g, 4℃, 5min），轻柔倒去乙醇保留沉淀；加入200 μL体积分数 75%的乙醇，缓慢颠倒，离心（12000 g,4℃, 5 min）去乙醇；体积分数75%的乙醇重复洗涤；风干15 min，加入100 μL超纯水溶解，将抽提的DNA采用琼脂凝胶电泳和紫外分光光度计检测其浓度和体积分数，并将其稀释成40ng/uL的浓度，保存在4℃备用。

1.3测序及SNP标记开发

随机选择108尾人工养殖的健康齐口裂腹鱼平均分成两组，一组注射生理盐水，另一组注射嗜水气单胞菌，并在注射后4h，24h和48h分别在对应重复组中随机取18尾鱼，用300mg/L的MS222麻醉，迅速解剖并取其脾脏，记录每尾鱼感染表现情况。每时间点的18尾鱼分成3个重复，每个重复6尾鱼的脾脏组织混合成一个样本池，用Illumina HisSeq2500测序平台进行双末端测序，每个样品的产生不低于4 Gb数据。通过GO富集和KEGG富集分析，选择免疫相关基因用于开发SNP标记，采用SAMTools 1.19和GATK 2.8.1软件开发假定的SNPs，最终选择3个免疫相关基因上的96个SNPs进行PCR扩增（电泳图见图1）和选择性测序，并利用SPSS18.0进行关联分析，获得了1个与细菌性败血症相关的SNP位点，该SNP位于SEQ IDNO.1所示核苷酸序列（全长1875 bp）自5’端起第779 bp处，该位点碱基以Y表示，Y代表C或T。SEQ ID NO.1所示核苷酸序列来自发明人前期研究获得的齐口裂腹鱼脾脏转录组序列。

1.4 PCR扩增及检测

以齐口裂腹鱼基因组DNA为模板，采用下述引物进行PCR扩增，引物序列如下：

F：tccttaaacc tctggtgtct ct，（SEQ ID NO.2）；

R：gctgtttcca gataggtcca a，（SEQ ID NO.3）。

在经PCR扩增后的产物中加入SNP序列特异性延伸引物（EXT），在SNP位点上延伸一个碱基。

SNP延伸引物序列为：

EXT ：accctgaaag ctgagga，（SEQ ID NO.4）。

PCR 反应条件为：94 ℃ 15分钟；94 ℃ 20秒，56 ℃ 30 秒，72 ℃ 1 分钟，45个循环；72 ℃延伸3分钟。反应体系以5μL计为：0.5 μM 引物1 μL，2.5 mM dNTP 0.1μL，10 mMMgCl₂ 0.3μL，0.5μL 10×PCR buffer，5 U Taq polymerase (Qiagen) 0.2 μL，和10 ng基因组DNA 1 μL，灭菌双蒸水1.9 μL。延伸产物经纯化后与表面覆盖基质的MassARRAYSpectroCHIP芯片共结晶。将该晶体放入质谱仪的真空管中即可自动分析SNP的位点信息。

1.5 SNP位点与细菌性败血症的关联分析

采用SPSS18.0的一般线性模型中的多元方差分析和独立样本T检验对SNP位点的基因型和等位基因与抗病性关联进行分析，等位基因及基因型在两组间的差异分析结果见表1和表2。

表1 等位基因在两组间的分布差异统计表

表2 基因型在两组间的分布差异均具有统计显著性

基因型	抗病组（%）	易感组（%）	卡方值	P值
					CC	68(1.000)	98(0.899)
CT	0(0.000)	11(0.101)	7.3171	0.0068

由表1可知，在该位点处，等位基因和基因型频率在抗病和易感群体中都存在极显著差异（P<0.01），在抗病群体中，等位基因T和C的频率分别为0和100%，基因型CT和CC基因型频率分别为0和100%；在易感群体中，等位基因T和C的频率分别为5%和95%，基因型CT和CC基因型频率分别为10.1%和89.9%。进而证明SEQ ID NO.1所示核苷酸序列（全长1875 bp）自5’端起第779位碱基C或T与齐口裂腹鱼细菌性败血症显著相关，为齐口裂腹鱼疾病关联SNP标记，本发明的SNP标记可用于齐口裂腹鱼抗病性状选育。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。

〈110〉西南大学

〈120〉齐口裂腹鱼细菌性败血症关联的SNP标记及其应用

〈160〉4

〈210〉1

〈211〉1875

〈212〉DNA

〈213〉齐口裂腹鱼（Schizothorax prenanti）

〈220〉

〈223〉SNP序列

〈400〉1

gaaagttatt tcctatttca gaagtgttgg gaaacacaaa tgaaacgaag agagagaacg 60

gaggaagaac tcattatcac cgtgaggaac tcaagcgaga ggacggatag ttgtttattt 120

gacgctgtac gactcttaat attgcgttat tgaaactctc tcattatttc acgccaaaac 180

gctgcatagt gaacgagcca gagctctcag aatggaatat atatttatac tgatcctttt 240

tggatggtgc atcaacactg aagttgtgaa gtgcacggtg tgttcagtta atggctatgc 300

cgccttctgc atagatagag gtcttcatca tgtgccagag ctgcccacgc atgtcaatta 360

tgtggatctg agtttaaaca gcattgctga actcaacgaa acatcctttt ctcatctcga 420

aggtctacaa gtccttaaag tggagcaaca aacaccaggt cttgtgatca gaaacaacac 480

atttagaaga ctctccaaac taatattact taaactagac tacaaccgct tcctgcaaat 540

agaaacagga gcttttaacg gattatccaa ccttgagatt ctcactctca ctcagtgcag 600

tttagatggt tctgttttgt ctggtgacgt ccttaaacct ctggtgtctc tagagatgct 660

tgtcttacga gataacaaca ttcacagaat ccagccggca tcgttctttt taagtatgag 720

gagattccat gtgctggatc tctcttacaa caaagtgaag agcatctgtg aagaagacyt 780

cctcagcttt cagggtaaac atttcacgct tctgaccctt gcctctgtga cactgcaaga 840

catgaatgag tactggttac gatgggacaa gtgtggaaac ccatttaaga acatgtccgt 900

aactgtattg gacctatctg gaaacagctt taatgttaac aatgcaaagc aattttttaa 960

tgcaatcacc ggcaccaaaa tccaaagtct cattctaagt aagagttaca gcatgggcag 1020

ttcttttggt cataataatt tcccagatcc agacaaattc acattcaagg gtcttgaggc 1080

gagtggtatt aaaacttttg atctgtccaa ttcaagtatt ttttctctgt catattcagt 1140

atttagttat ttgccagatc tagaacaaat tacattagca caaagtcaga tcaacaagat 1200

tgaaagcaat gcatttttgg gtatgacaaa tttacaaaag ctaaacttgt ccgtaaactt 1260

cctgggtaat attaattcag aaacttttaa aaatctacag aaacttgagg tgcttgattt 1320

atcatataat catatatgga tgcttgaaat tcagtcattt caaggacttc caaatctact 1380

catcctaaat ttaacaggaa attctatcct ttatgcacac agatttgcaa ccctaccaag 1440

cctagagaaa ctctacttgg gtgacaacaa aattatacat gcgtccgatt tactcaacat 1500

tgccacaaac ctcaaaaccc tttacctgga gtttaacaaa atattttcca tgtcagagct 1560

ctacacgata ctagagaaat ttcctcaaat tgaggaaatc gtttttcgag gtaacggact 1620

tgtttgttgc cctgacgaca aacataaagt gctttcgcaa aaaatacaaa tccttgatct 1680

tgcaattgca ggtttggaag ttatctggtt agaaggaaaa tgtttaaatg tatttaatga 1740

ccttcaccag ttagaagtgc tttatctgag ttacaacaga ctgcagtcgc ttcccaaaga 1800

cgttttcaaa gacctcacct ctttgatctt tttggatttg tccttcaatt ctttgaagta 1860

ccttcctaat ggtat 1875

〈210〉2

〈211〉22

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈220〉

〈223〉克隆SNP序列上游引物

〈400〉2

tccttaaacc tctggtgtct ct 22

〈210〉3

〈211〉

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈220〉

〈223〉克隆SNP序列下游引物

〈400〉3

gctgtttcca gataggtcca a 21

〈210〉4

〈211〉17

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈220〉

〈223〉EXT序列（SNP延伸引物序列）

〈400〉4

accctgaaag ctgagga 17

Claims (6)

1.齐口裂腹鱼细菌性败血症关联的SNP标记，其特征在于，所述SNP标记核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，序列自5’端起第779位碱基为C或T。

2.用于检测权利要求1所述的SNP标记的引物对，其特征在于，所述SNP标记的引物对核苷酸序列为：

F：tccttaaacc tctggtgtct ct，（SEQ ID NO.2）；

R：gctgtttcca gataggtcca a，（SEQ ID NO.3）。

3.用于检测权利要求1所述的SNP标记的试剂盒，其特征在于，包含权利要求2所述的引物对。

4.一种检测齐口裂腹鱼对细菌性败血症易感性的方法，其特征在于，通过对待测齐口裂腹鱼进行权利要求1所述的SNP标记的检测，确定所述待测齐口裂腹鱼对细菌性败血症是否易感。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）提取待测齐口裂腹鱼的基因组DNA；

（2）利用权利要求2所述的引物对，将步骤（1）获取的DNA进行PCR扩增，以获得PCR扩增产物；

（3）对步骤（2）获得的PCR扩增产物进行测序，获得测序结果后根据结果确定待测齐口裂腹鱼的SNP标记的基因型；

（4）根据步骤（3）确定的SNP标记的基因型确定待测齐口裂腹鱼对细菌性败血症是否易感。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述SNP标记的个体基因型为CT的齐口裂腹鱼对细菌性败血症更易感。