CN101906470B

CN101906470B - 一种检测黄牛fto基因单核苷酸多态性的方法

Info

Publication number: CN101906470B
Application number: CN2010102233493A
Authority: CN
Inventors: 陈宏�; 张宝; 张良志; 胡沈荣; 雷初朝
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2010-07-09
Filing date: 2010-07-09
Publication date: 2012-08-29
Anticipated expiration: 2030-07-09
Also published as: CN101906470A

Abstract

本发明公开了一种检测黄牛FTO基因单核苷酸多态性的方法，以包含FTO基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增黄牛FTO基因；对PCR产物进行高温变性后，再进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果鉴定黄牛FTO基因编码区第783位(+1为翻译起始位点)的单核苷酸多态性；由于FTO基因功能涉及体长和体高性状，本发明提供的检测方法为FTO基因的SNP与生长性状关系的建立奠定了基础，以便用于中国黄牛肉用生长性状的标记辅助选择(MAS)，快速建立遗传资源优良的黄牛种群。

Description

一种检测黄牛FTO基因单核苷酸多态性的方法

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，涉及基因单核苷酸多态性(SNP)的检测，特别涉及一种检测黄牛FTO基因单核苷酸多态性的方法。

背景技术

单核苷酸多态性(SNP)，是指在基因组上单个核苷酸的变异，形成的遗传标记，其数量很多。包括置换、颠换、缺失和插入。理论上讲，SNP既可能是二等位多态性，也可能是3个或4个等位多态性，但实际上，后两者非常少见，几乎可以忽略。因此，通常所说的SNP都是二等位多态性的。这种变异可能是转换(C、T，在其互补链上则为G、A)，也可能是颠换(C-A，G-T，C-G，A-T)。转换的发生率总是明显高于其它几种变异，具有转换型变异的SNP约占2/3，其它几种变异的发生机率相似。转换的机率之所以高，可能是因为CpG二核苷酸上的胞嘧啶残基是人类基因组中最易发生突变的位点，其中大多数是甲基化的，可自发地脱去氨基而形成胸腺嘧啶。

SNP在动物基因组中分布很广泛，每一个核苷酸发生突变的概率大约为10-9。在人类基因组中大概每1000个碱基就有一个SNP，人类基因组上的SNP总量大概是3×10⁶个。在基因组中，任何碱基均有可能发生变异，因此SNP既有可能在基因序列内，也有可能在基因以外的非编码序列上。总的来说，位于编码区内的SNP比较少，因为在外显子内，其变异率仅及周围序列的1/5。多项研究同时发现不同种族间SNPs的数目也是不同的，非洲人群及非裔种族中SNPs数量最多，而其他种群的SNPs要少得多，因此通过比较亚群间等位基因的频率将有助于阐明种族的结构和进化。由于SNPs是二等位基因分子标记，所以，理论上在一个二倍体生物群体中，SNPs可能是由2个、3个或4个等位基因构成，但实际上3个或4个等位基因的SNPs很罕见，故SNPs通常被简单地称为二等位基因分子标记。

目前，主要采用几种方法来检测SNPs，即DNA序列测定方法、PCR-RFLP法、PCR-SSCP与DNA测序结合法、AS-PCR方法、引物延伸法和寡核苷酸连接反应等。在这些SNP检测技术中，DNA序列测定法是最为准确的SNP检测方法，但是，其检测费用极其昂贵。同时，在测序过程中需要大型测序仪器和非常熟练的技术经验，所以，DNA序列测定法不是一种应用于生产实际的理想SNP检测方法；AS-PCR方法作为一种新型的SNP检测方法，在未来的应用领域中具有非常广阔的前景，但是，该方法需要设计特别的引物，且只能针对特定的基因位点，同时，检测过程中还存在误检的概率，因此，目前不具有普遍应用的特点；而引物延伸法和寡核苷酸连接反应技术检测SNP位点，需要平板读数仪、基因芯片、微球阵列技术和质谱仪等检测平台，对于一般的分子实验室来说可实施性不强。PCR-SSCP法原理是：单链DNA片段呈现复杂的空间折叠构象，当有一个碱基发生改变时，会或多或少地影响其空间构象，使构象发生改变，空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶中受到的阻力大小不同。因此，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，可以非常敏锐地将构象上有差异的分子分离开。PCR-SSCP技术，提高了检测突变方法的简便性和灵敏性。快捷、安全，无需探针制备、杂交、酶切等步骤，同时与测序方法相结合，增加了准确性，也降低了单纯测序方法的成本，已得到广泛的研究和应用。

FTO基因是一种与肥胖相关的基因，也称肥胖基因。近年来，研究报道，半数的欧洲白人携带FTO基因风险等位基因，能使肥胖风险增加30％。大约有16％的人携带纯合风险等位基因型，这种纯合子使肥胖风险增加67％。研究人员怀疑其他人群携带FTO风险等位基因的比例也与之相似。可能由于FTO基因会抑制新陈代谢，降低能量消耗效率，因而导致肥胖。FTO基因使肥胖者“胃口大开”，难有饱腹感，从而过量进食，导致肥胖。因此，研究FTO基因遗传变异和分子遗传特征对动物生长发育的影响具有重要理论和实践意义。

目前，动物研究显示FTO基因可以通过对成脂功能的调节，来影响肥胖的发生。研究报道FTO基因与人的肥胖相关。小鼠和牛中也证明FTO可导致动物的肥胖。迄今为止，国内外未见关于牛FTO基因遗传变异的研究，由于中国黄牛FTO基因遗传变异领域的研究匮乏，该基因位点的功能研究及其遗传变异与经济性状(如：体重、体高、体长等性状)关联的研究仍是空白。

发明内容

本发明解决的问题在于利用PCR-SSCP的方法检测黄牛FTO基因的多态性，并将其与生长性状进行关联分析，验证表明其可以作为黄牛分子育种中辅助选择的分子标记，从而加快良种选育速度。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种检测黄牛FTO基因单核苷酸多态性的方法，以包含FTO基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增黄牛FTO基因；对PCR扩增产物94～98℃变性5～10min，再对变性后的扩增片段进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；根据电泳结果鉴定黄牛FTO基因编码区第783位的单核苷酸多态性；

所述的引物对P为：

上游引物：gatgaaacattcctgac 17；

下游引物：gctttgatccttgcattacc 20。

所述的PCR扩增反应程序为：

94℃预变性5min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min。

所述的聚丙烯酰胺凝胶电泳为质量浓度为10％的聚丙烯酰胺凝胶。

所述根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果鉴定黄牛FTO基因第783位的单核苷酸多态性为：GG基因型表现为3条电泳条带，GC基因型的表现为5条电泳条带。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明根据FTO基因的序列设计引物，分别以3种黄牛品种的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，并对PCR产物进行测序，测序后得到黄牛的FTO基因的部分序列与NCBI公布的序列进行比较发现在编码区第783位存在SNP多态性。

针对上述第783位的SNP多态性，本发明还公开了其筛查和检测方法，通过设计特定的引物PCR扩增包含SNP位点的基因片段，然后进行高温变性再进行聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定，能够简单、快速、成本低、精确的检测其单核苷酸的多态性。

本发明对3个黄牛品种的SNP基因型进行了检测和基因频率分析，对上述SNP位点与黄牛部分生长性状(体长、体重和体高)进行关联分析，该SNP位点的GG基因型可以做为一个提高黄牛体长的候选分子遗传标记。

附图说明

图1为黄牛FTO基因部分编码区PCR扩增产物的电泳结果图；

图2为黄牛FTO基因包含编码区第783位的多态位点的201bp PCR产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果图；

图3为黄牛FTO基因SNP的不同基因型测序图。

具体实施方式

本发明利用PCR-SSCP的方法对黄牛FTO基因编码区第783位点错义密码子突变可能产生编码蛋白组成发生变化的单核苷酸多态性进行检测，下面结合对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

a、黄牛FTO基因含第四外显子区域PCR引物的设计

以NCBI所公布的牛(NC_007316.3)序列为参考，利用Primer 5.0设计能够扩增包含黄牛FTO基因第四外显子区域的PCR引物，其引物序列P为：

上游引物：gatgaaacattcctgac 17；

下游引物：gctttgatccttgcattacc 20；

以引物P对不同种群来源的黄牛基因组扩增，能够扩增包含黄牛FTO基因(NC_007316.3序列)第四外显子区域第21470892bp～21471092bp的201bp的基因片段，扩增后片段的电泳检测如图1所示，其中，泳道1～6为扩增获得的基因片段，泳道M为Marker；对扩增的片段进行测序鉴定后，与NCBI公布的序列进行比较发现在第70位核苷酸(也即FTO基因编码区第783位)存在G/C多态性；

当FTO基因编码区第783bp由G突变为C时，PCR扩增FTO基因的该位置的三联密码子从CAG改变为CAC，导致编码第261位的氨基酸由GLN突变为HIS，从而形成错义密码子突变。而当有一个碱基发生改变时，会对其空间构象产生影响，使构象发生改变，空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶中受到的阻力大小不同，这样就可以通过聚丙烯酰胺凝胶电泳对该位点SNP多态性进行检测。

b、以引物P进行PCR扩增待测黄牛的FTO基因片段

1、黄牛样本的采集

本发明具体以3个中国地方黄牛品种作为检测对象，具体采集样本见表1：河南南阳牛(240)，陕西秦川牛(144)，河南平顶山市郏县红牛(151)。

表1黄牛样本的采集

品种	样品数	样品名称	样品来源	采样方式
					南阳牛(NY cattle)	240	血样	采自河南省南阳市南阳黄牛良种繁育场(国家级黄牛保种场)	静脉采血16号针头

秦川牛(QC cattle)	144	血样	采自陕西省秦川牛场、陕西省秦川牛良种繁育中心和陕西省大荔县	静脉采血16号针头
					郏县红牛(JX cattle)	151	血样	采自河南省平顶山市郏县红牛育种中心及各村镇	静脉采血16号针头

2、血样基因组DNA的提取、纯化

1)冷冻血样(主要为血细胞)室温解冻，转移500μL至1.5mL Eppendorf离心管，加入等体积PBS液，充分混匀，12000r/min离心10min(4℃)，弃去上清液，重复上述步骤至上清液透明、沉淀呈淡黄色；

2)在离心管中加入DNA抽提缓冲液500μL，摇动，使血细胞沉淀脱离离心管管壁，37℃水浴1h；

3)加蛋白酶K至3μL(20mg/mL)并混匀，55℃过夜至澄清，尚未澄清者，可补加1μL蛋白酶K混匀继续消化直至澄清；

4)将反应液冷却至室温，加Tris-饱和酚500μL，温和摇动离心管20min，使其充分混匀；4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中，重复一次；

5)加氯仿500μL，充分混匀20min，4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中；

6)加氯仿、异戊醇混合液(24∶1)500μL，充分混匀20min，4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中；

7)加0.1倍体积的NaAc缓冲液及2倍体积的冰冷的无水乙醇，混合转动离心管，直至白色的絮状沉淀析出，-20℃保存30～60min；

8)4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，用70％冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次；

9)4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，室温下使乙醇挥发干净；

10)干燥后的DNA溶于80～100μL的TE液，4℃保存直至DNA完全溶解，0.8％琼脂糖凝胶电泳检测其质量，-80℃保存。

3.PCR扩增

PCR反应体系采用混合加样法，即根据每一个反应体系所需的各种组分的数量和1次反应所需的PCR反应的个数，算出各种反应组分的总量，加入到1个1.5mL离心管中，充分混匀后瞬时离心，再分装到每个0.2mLEppendorfPCR管中，然后加入模板DNA，再瞬时离心后进行PCR扩增；

PCR反应体系见表2：

表2PCR反应体系

灭菌超纯水(H₂O)	10.8μL
		2×buffer(内含Mg²⁺、dNTPs等)	12.5μL
引物P上游引物(10pmol/L)	0.5μL
		引物P下游引物(10pmol/L)	0.5μL
Taq DNA聚合酶(2.5U/μL)	0.25μL
		DNA模板(50ng/μL)	0.45μL
总体积	25μL

25μL反应体系包括0.625U Taq DNA聚合酶(北京天根科技有限公司)，2×Buffer 12.5μL(内含Mg²⁺、dNTPs等)(北京天根科技有限公司Mix)，50ng/μL含FTO基因的黄牛基因组DNA 0.45μL，10pmol/μL上、下游引物各0.5μL；

PCR反应程序：

94℃预变性5min；

72℃延伸10min；

对3个黄牛品种的535个样本的基因组DNA进行PCR扩增，获得535个个体的黄牛FTO基因中包含该SNP位点的201bp的DNA片段。

c、PCR产物经过高温变性后聚丙烯酰胺凝胶电泳分析

1、扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳

1)10％的聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)的前期溶液的准备：蒸馏水5.5mL、30％丙烯酰胺3.25mL、10×TBE 1mL、10％的APS 55μL、TEMED 10μL。

2)配好上述溶液后，轻轻搅动，使其充分混匀。立即缓慢倒入已准备好的玻璃板之间，注意不要产生气泡；倒好凝胶后，立即轻轻插入梳子，切勿在梳子齿下留有气泡。

3)待胶凝固后，拔掉梳子，将玻璃板转到电泳槽上(Mini-PROTEAN 3)，倒入1×TBE缓冲液。

4)取5μL PCR产物，加入5μL变性缓冲液(包含质量分数95％的甲酰胺、0.5mol/L的EDTA、质量分数0.05％的溴酚兰和质量分数0.05％的二甲苯青)，瞬时离心后在PCR仪中94～98℃变性5～10min，取出后立即插入碎冰中，5min后全部上样。

5)用Mini-PROTEAN 3型电泳槽电泳时，在4℃条件下，先用300V电压电泳10分钟，然后用200V电压在4℃条件下电泳1h。

6)从电泳槽中吸出缓冲液，然后取出凝胶，用蒸馏水漂洗2～3次。

7)用蒸馏水漂洗后，加入0.1％硝酸银脱色摇床上避光轻摇染色15min。

8)加入少量显色液(2％的碳酸钠，每500mL溶液加1mL甲醛)预染30s，倒掉，然后再倒入显色液至浸没凝胶，边摇边观察，直到凝胶上显现电泳带。

9)待条带清晰后，倒掉显色液，用自来水冲洗凝胶终止显色。

2、聚丙烯酰胺凝胶分析

银染后聚丙烯酰胺凝胶利用BIO-RAD Gel Doc 2000凝胶成像系统照相分析，判断SNP的多态性：

FTO基因的第783bp由G突变为C时，PCR扩增的FTO基因产物产生不同的带型。由于黄牛为二倍体，所以黄牛基因组的FTO基因的第783位的SNP多态性的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果如图2所示：783位为GG型表现为3条电泳条带，GC型的表现为5条电泳条带。图2所示的检测样本当中，泳道1-6为GG基因型条带，泳道7为GC基因型。

3、不同基因型个体PCR产物的测序验证

对不同基因型个体PCR产物分别进行正反双向测序；同时，进行SNP位置分析，结果表明GC基因型的个体在FTO基因编码区第783位的测序图表示为G和C，如图3a所示，自左向右第4个峰为两个峰；而GG基因型为G如图3b所示自左向右第4个峰为单峰；CC基因型在待测的群体样本中没有检测到。

d、黄牛FTO基因SNP位点的频率统计分析

1)基因和基因型频率

基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率。P_AA＝N_AA/N，其中P_AA代表某一位点的AA基因型频率；N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数；N为检测群体的总数量。

基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的公式可以写成：P_A＝(2N_AA+N_Aa1+N_Aa2+N_Aa3+N_Aa4+......+N_Aan)/2N

式中，P_A表示等位基因A频率，N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数量，N_Aai表示群体中具有Aai基因型个体数量，a1-an为等位基因A的n个互不相同的复等位基因。

本研究所涉及的等位基因为G和C，所以具体的基因频率计算公式为：

P_G＝(2N_GG+N_GC)/2N

P_C＝(2N_CC+N_TC)/2N

式中，P_G，P_C分别表示等位基因G和C等位基因的频率，N_GG、N_GC和N_CC分别表示GG、GC和CC基因型的个体数量，N表示总群体数目。

在不同黄牛品种FTO基因SNP中的G等位基因频率变化幅度在97.7％～99.4％，C等位基因频率变化幅度在0.6％～2.3％之间，具体如表3所示。

表3黄牛FTO基因第783位SNP基因频率分布表

e、黄牛FTO基因SNP位点基因效应的关联分析

基因型数据：基因型(GG和GC)

生产数据：南阳牛初生重，以及6月、12月、18月和24月的生长相关数据。

关联分析模型：

先对数据进行描述分析，确定是否存在离群值，再利用最小二乘分析对数据进行校正；根据数据特征，应用SPSS(13.0)软件的GLM过程分析基因型和对各性状的效应。在对基因型效应进行分析时采用了固定模型：

Y_ijkl＝μ+BF_i+Month_j+G_k+e_ijkl

其中：Y_ijkl为性状观察值，μ为总体均值，BF_i为第i个品种的固定效应，Month_j为第j个月观测的固定效应，G_k为第k个单SNP标记基因型的固定效应，e_ijkl为随机误差。

结果表明(如表4所示)：在FTO基因编码区的第783位点，在6月龄和24月龄GG基因型的个体体长均高于GC基因型个体且差异显著(P＜0.05)；说明GG基因型可以做为一个提高黄牛体长的候选分子遗传标记，及时排除GC基因型个体将有利于优质种质资源的建立。

表4FTO基因编码区第783位SNP与南阳牛各月龄指标之间的方差分析

注：标有不同的大写字母表示差异极显著(P＜0.01)、标有不同的小写字母表示差异显著(P＜0.05)；Mean±SE，表示均值±标准误。

核苷酸序列表

<110>西北农林科技大学

<120>一种检测黄牛FTO基因单核苷酸多态性的方法

<160>1

<210>1

<211>201

<212>DNA

<213>黄牛

<220>

<221>s

<222>(70)

<400>1

gatgaaacat tcctgacaac tctcttttct tttgacaggc cctgaagagg aaagtgagga 60

cgaccctcas cttgaaggca gagatcctga tatttggcac gttggtttta agatctcgtg 120

ggacatagag acacctggtt tggcgatacc ccttcaccaa ggagactgct attttatgct 180

tggtaatgca aggatcaaag c 201

Claims

1.一种检测黄牛FTO基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，以包含FTO基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增黄牛FTO基因；对PCR扩增产物94～98℃变性5～10min，再对变性后的扩增片段进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；根据电泳结果鉴定黄牛FTO基因编码区第783位的单核苷酸多态性；

根据电泳结果鉴定黄牛FTO基因编码区第783位的单核苷酸多态性为：GG基因型表现为3条电泳条带，GC基因型的表现为5条电泳条带；

所述的引物对P为：

上游引物：gatgaaacattcctgac；

下游引物：gctttgatccttgcattacc。

2.如权利要求1所述的检测黄牛FTO基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，所述的PCR扩增反应程序为：

94℃预变性5min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，30～35个循环；72℃延伸10min。

3.如权利要求1所述的检测黄牛FTO基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，所述的PCR扩增产物的变性为：将PCR扩增产物与等体积的变性缓冲液混合，瞬时离心后再94～98℃变性5～10min；

所述的变性缓冲液包含质量分数95％的甲酰胺、0.5mol/L的EDTA、质量分数0.05％的溴酚兰和质量分数0.05％的二甲苯青。

4.如权利要求1所述的检测黄牛FTO基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，所述的聚丙烯酰胺凝胶电泳为质量浓度为10％的聚丙烯酰胺凝胶。