CN116590458B

CN116590458B - 一种与大豆甘氨酸相关的kasp标记及其应用

Info

Publication number: CN116590458B
Application number: CN202310652145.9A
Authority: CN
Inventors: 陈华涛; 张红梅; 熊雅文; 张威; 刘晓庆; 王琼; 陈新
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2023-06-02
Filing date: 2023-06-02
Publication date: 2023-12-22
Anticipated expiration: 2043-06-02
Also published as: CN116590458A

Abstract

本发明公开了一种与大豆甘氨酸相关的KASP标记及其应用，属于分子遗传育种领域。所述KASP标记为S16_36782739和S12_11366121中的一种或多种；所述S16_36782739的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述S12_11366121的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。本发明开发大豆水解甘氨酸和游离甘氨酸相应的KASP标记并进行基因分型，样品基因分型效果明显，可以灵敏、高效、低成本的预测大豆甘氨酸含量，利于筛选培育高氨基酸含量的大豆品种，辅助大豆功能性分子育种，进一步缩短育种进程。

Description

一种与大豆甘氨酸相关的KASP标记及其应用

技术领域

本发明涉及分子遗传育种领域，特别是涉及一种与大豆甘氨酸相关的KASP标记及其应用。

背景技术

大豆蛋白质含量40％左右，是人类植物蛋白质重要来源之一，所提供的蛋白质约占全世界蛋白质消费总量的68％，含有人体自身不能合成的八种必需氨基酸，因此具有很高的营养价值。随着人们膳食水平的提高，对大豆蛋白的消费需求持续增加，大豆供需矛盾更加凸出。因此，研究快速、有效的大豆蛋白性状分子育种技术，对于分子辅助大豆蛋白质性状的遗传改良具有十分重要的生产意义。

在大豆蛋白的组成中，谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和甘氨酸等含量相对较低。通过生物技术手段(如转化)增加这些氨基酸的效果有限(Altenbach et al.，1987；Kortt etal.，1991)。因此，人们正在利用植物育种方法以提高大豆中这些氨基酸的含量(Warrington，2011)。由于上述问题，一段时间以来，大豆育种界一直把培育高浓度必需氨基酸的大豆品种作为目标。

单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)在植物基因组水平广泛存在，可以通过高通量技术进行检测，因此这些标记被广泛用于遗传变异分析、基因连锁图谱构建、关联作图和数量性状QTL定位等方面。竞争性等位基因特异性PCR(KompetitiveAllele Specific PCR，KASP)可在广泛的基因组DNA样品中(甚至是一些复杂基因组的DNA样品)，对SNPs进行精准的双等位基因判断。KASP位点特异性扩增强，标记转化率高，可以快速、准确、灵敏的特定的突变位点，可大大缩短育种的周期提高育种效率。因此，本发明提供一种与大豆甘氨酸相关的KASP标记，以满足大豆育种需求。

发明内容

本发明的目的是提供一种与大豆甘氨酸相关的KASP标记及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明开发的大豆水解甘氨酸和游离甘氨酸相应的KASP标记，可以灵敏、高效、低成本的预测大豆甘氨酸含量，利于筛选培育高氨基酸含量的大豆品种，辅助大豆功能性分子育种，进一步缩短育种进程。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种与大豆甘氨酸相关的KASP标记，所述KASP标记为S16_36782739和S12_11366121中的一种或多种；所述S16_36782739的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述S12_11366121的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

进一步地，所述S16_36782739的第21bp处有一个T/A碱基突变；所述S12_11366121的第21bp处有一个A/G碱基突变。

本发明还提供一种检测所述KASP标记的引物组，检测所述S16_36782739的引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示的正向引物F1、核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示的正向引物F2和核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示的反向引物R；

检测所述S12_11366121的引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO：18所示的正向引物F1、核苷酸序列如SEQ ID NO：19所示的正向引物F2和核苷酸序列如SEQ ID NO：20所示的反向引物R。

本发明还提供一种所述KASP标记的检测试剂或检测试剂盒，包含所述的引物组。

本发明还提供一种所述的KASP标记、所述的引物组或所述的检测试剂或检测试剂盒的应用，用于如下任一项应用中：

(1)鉴定大豆甘氨酸含量；

(2)筛选高低甘氨酸含量的大豆品种或品系；

(3)大豆分子标记辅助育种；

(4)改良大豆种质资源。

本发明还提供一种鉴定大豆甘氨酸含量高低的方法，包括如下步骤：

以待测大豆样品的基因组DNA作为模板，利用所述的引物组或所述的检测试剂或检测试剂盒对模板进行荧光定量PCR扩增，利用扩增结果判断大豆甘氨酸含量高低。

进一步地，若扩增结果显示所述S16_36782739的碱基突变为A时，则判断待测大豆样品水解甘氨酸含量高；若扩增结果显示所述S12_11366121的碱基突变为G时，则判断待测大豆样品游离甘氨酸含量高。

进一步地，所述荧光定量PCR扩增的程序为：94℃预变性15min；94℃变性20s，61-55℃梯度复性/延伸1min，每个循环降低0.6℃，10个循环；94℃变性20s，55℃复性/延伸1min，26个循环。

进一步地，所述荧光定量PCR扩增的体系为：DNA模板5μL，2×KASP Master mix 5μL，引物混合物KASP Assay Mix 0.14μL，总体积为10μL。

本发明公开了以下技术效果：

KASP分子标记具有成本低、数量多、基因分型明显等优点，广泛应用于作物育种，缩短育种进程，本发明开发大豆水解甘氨酸和游离甘氨酸相应的KASP标记并进行基因分型，样品基因分型效果明显。可以灵敏、高效、低成本的预测大豆甘氨酸含量，利于筛选培育高氨基酸含量的大豆品种，辅助大豆功能性分子育种，进一步缩短育种进程。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为大豆籽粒中4种水解氨基酸含量全基因组关联分析结果的曼哈顿图和QQ图；A、B、C、D依次是水解精氨酸、甘氨酸、谷氨酸和赖氨酸的GWAS结果；

图2为大豆籽粒中4种游离氨基酸含量全基因组关联分析结果的曼哈顿图和QQ图；A、B、C、D依次是游离精氨酸、甘氨酸、谷氨酸和赖氨酸的GWAS结果；

图3为KASP标记对不同大豆种质SNP基因分型；A是水解精氨酸基因分型图；B是水解甘氨酸基因分型图；C是水解谷氨酸基因分型图；D是水解赖氨酸基因分型图；E是游离甘氨酸、谷氨酸、赖氨酸共定位基因分型图。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1

本发明提供一种与大豆水解精氨酸、甘氨酸、谷氨酸和赖氨酸4种水解氨基酸显著关联的SNP位点，S16_32280240(A/T)、S16_36782739(T/A)、S07_6898548(G/A)和S06_15229665(A/G)，游离甘氨酸、谷氨酸、赖氨酸共定位S12_11366121(A/G)，进而开发相应的KASP标记，发现S16_32280240位点，基因型为T的大豆品种水解精氨酸含量均值显著高于基因型为A的大豆品种；所述S16_32280240位点在如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的第21位碱基；

SEQ ID NO：1：

S16_36782739基因型为A的大豆品种水解甘氨酸高于基因型为T的大豆品种；所述S16_36782739位点在如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的第21位碱基；

SEQ ID NO：2：

S07_6898548位点基因型为A的大豆品种水解谷氨酸含量均值都各自高于基因型为G的大豆品种；所述S07_6898548位点在如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列的第21位碱基；

SEQ ID NO：3：

S06_15229665位点，基因型为G的大豆品种水解赖氨酸含量均值高于基因型为A的大豆品种；所述S06_15229665位点在如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列的第21位碱基；

SEQ ID NO：4：

S12_11366121位点，基因型为G大豆品种游离甘氨酸、谷氨酸、赖氨酸含量均值高于基因型为A的大豆品种；所述S12_11366121位点在如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的第21位碱基；

SEQ ID NO：5：

注：上述各序列的阴影标记为突变碱基位点。

上述分子标记具体按照以下方法获得：

1 材料与方法

1.1 植物材料

本课题组收集、评估鉴定1084份大豆种质。选出来自全国具有代表性的264份大豆(52份地方种和212份栽培种)，另外收集了19份野生种，组成了微核心种质资源，共283份(表1)。

表1283份大豆种质资源的编号和名称

1.2主要试剂与实验仪器

1.2.1主要试剂

CTAB(上海吉至)；核酸提取液(24:1)；2×KASP Master mix(英国LGC)；Tris(上海吉至)；EDTA(上海源叶)；β-巯基乙醇(上海吉至)；异丙醇；PCR特异引物(北京擎科)。

1.2.2实验仪器

实时荧光定量PCR仪(南京赛默飞)；植物组织研磨仪(南京百思禾)；离心机(德国Eppendorf)；超微量核酸蛋白检测仪(北京百奥曼)。

1.3试验方法

1.3.1大豆DNA的提取

分别取283份大豆的R6期新鲜大豆嫩叶，放入2mL离心管中，加入钢珠，用液氮保存。离心管放于研磨仪(40Hz 30s)上研磨粉碎备用。

利用CTAB法提取大豆叶片DNA。100mL 2×CTAB buffer的配置体系如表2：

表2100mL 2×CTAB buffer的配置体系

利用CTAB法提取大豆DNA步骤如下：

(1)将100mL 2×CTAB buffer放入通风橱中，加入2％的β-巯基乙醇。

(2)在液氮冷冻研磨后大豆样品离心管中，加入800μL 65℃预热后的2×CTABbuffer(2％β-巯基乙醇)，震荡混匀。

(3)将样品放于65℃的水浴锅中，水浴30min，期间震荡多次。

(4)水浴后加入等体积800μL的核酸提取液(24:1)，震荡1min。

(5)将样品放于离心机中，10000r/min离心15min，取600μL上清液，放于新的1.5mL离心管中。

(6)在新离心管中加入等体积600μL核酸提取液(24：1)，震荡1min。

(7)将样品放于离心机中，12000r/min，取400μL上清液，放于新的1.5mL离心管中。

(8)在离心管中加入200μL 5M Nacl和400μL异丙醇(-20℃预冷)，轻混匀，放于-20℃冰箱，冷冻30min。

(9)取预冷后的样品，放于离心机中，12000r/min离心10min，弃上清液，加入600μL70％乙醇，将沉淀轻轻弹起。

(10)再放入离心机中，12000r/min离心10min，弃上清液，加入600μL 70％乙醇，将沉淀弹起。

(11)放于离心机中，12000r/min离心10min，开盖放于37℃保温箱中

(12)样品完全干后，加入50μL ddH₂O溶解，室温静置一晚，放于-20℃冰箱保存。

用核酸蛋白检测仪测定DNA浓度，加入ddH₂O使DNA浓度稀释至50ng/L。

1.3.2大豆4种氨基酸全基因组关联分析

本研究中，用于GWAS分析的自然群体的SNP标记来自课题组前期的重测序工作，共包含2,597,425个SNP在该高密度物理图谱中(Zhang W,Xu W,Zhang H,et al.Comparativeselective signature analysis and high-resolution GWAS reveal a new candidategene controlling seed weight in soybean[J].Theoretical and Applied Genetics,2021,134(5):1329-1341.)。全基因组关联分析利用混合线性模型(mLM)和R软件的GAPIT包进行关联分析来减少假阳性SNP位点。同时，选择P≤1/2,597,425＝3.85×10^-7，-Log₁₀P≥5为显著阈值，当SNP的-Log₁₀P≥5时，可以被认为是显著关联位点。由此鉴定出分别与大豆水解精氨酸、甘氨酸、谷氨酸和赖氨酸4种水解氨基酸显著关联的SNP位点，S16_32280240(A/T)、S16_36782739(T/A)、S07_6898548(G/A)和S06_15229665(A/G)，游离甘氨酸、谷氨酸、赖氨酸共定位S12_11366121(A/G)。

1.3.3KASP标记的开发

使用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的Primer-BLAST功能，依据与大豆4种氨基酸显著关联SNP位点S16_32280240(A/T)、S16_36782739(T/A)、S07_6898548(G/A)、S06_15229665(A/G)分别设计引物，每个位点有三个引物，分别是两个正向引物F1、F2、一个反向引物R，其中F1和F2分别包括6-羧基荧光素(FAM)、六氯-6-甲基荧光素(HEX)荧光接头序列(下划线)，序列如表3所示：

表3KASP标记的特异性引物

1.3.4KASP标记的扩增体系

KASP标记的10μL扩增体系包括：大豆样品DNA模板5μL(50ng/μL)，2×KASP Mastermix 5μL，引物混合物KASP Assay Mix(F1：F2：R＝2：2：5)0.14μL，用H₂O补足至10μL。KASP-PCR反应条件如表4，反应完成后，产物用实时荧光定量PCR仪读取荧光数据。

表4KASP-PCR反应条件

2 结果与分析

2.1 关联作图群体重测序

本课题组前期对283份大豆种质进行重测序，平均测序深度为12.4×，获得10,210,329个SNP标记。

2.2大豆4种氨基酸的GWAS分析

大豆籽粒中4种水解氨基酸含量表型数据进行全基因组关联分析共关联到343个SNP位点(表5、表7)，大豆精氨酸含量显著相关的SNPs共有21个(-log10(P)≥5)，主要分布在4、5、16号染色体上，极显著SNP位置位于第5号染色体12555523bp，-log10(P)值极大值是5.78；大豆甘氨酸含量显著关联SNPs有184个，主要分布在2、6、8、10、16号染色体上，极显著SNP位置位于第6号染色体上12552302bp，-log10(P)值极大值是12.29；大豆谷氨酸含量显著关联SNPs有130个，主要分布在2、4、7、9、18号染色体上，极显著SNP位置位于第7号染色体上6735298bp，-log10(P)值极大值是9.18；大豆赖氨酸含量显著关联SNPs有8个，主要分布在6、9号染色体上，极显著SNP位置位于第9号染色体上24573334bp，-log10(P)值极大值是6.17。大豆籽粒中4种水解氨基酸GWAS结果可视化如图1。

大豆籽粒中4种游离氨基酸共关联到共904个SNP位点(表5、表6)，大豆游离精氨酸含量显著相关的SNPs共有222个(-log10(P)≥5)，主要分布在1、4、9、11、18号染色体上，极显著SNP位置位于第1号染色体上11721470bp，-log10(P)值极大值是6.81；大豆游离甘氨酸含量显著关联SNPs有491个，主要分布在1、8、11、12、13号染色体上，极显著SNP位置位于第12号染色体上20760427bp，-log10(P)值极大值是10.87；大豆游离谷氨酸含量显著关联SNPs有133个，主要分布在10、11、12、18号染色体上，极显著SNP位置位于第18号染色体上53291599bp，-log10(P)值极大值是6.44；大豆游离赖氨酸含量显著关联SNPs有58个，主要分布在8、12、17、18、19号染色体上，极显著SNP位置位于第8号染色体上18610062bp，-log10(P)值极大值是6.09。大豆籽粒中4种游离氨基酸GWAS结果可视化如图2所示。

由表8可知，大豆游离甘氨酸、谷氨酸和赖氨酸共定位到3个SNP位点，分别为S12_11366121、S12_11442535、S12_11445996，游离精氨酸和甘氨酸共定位到5个SNP位点，分别为S01_53974257、S01_11721458、S01_11721461、S01_11721464、S01_11721470，其中S12_11366121位点关联效果显著，可进一步开发KASP标记，进行群体基因分型。

表5大豆4种水解氨基酸含量显著相关的主要SNPs

表6大豆籽粒4种游离氨基酸含量显著相关主要的SNPs

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表7大豆4种氨基酸含量关联的SNP位点数量

表8大豆籽粒4种游离氨基酸共定位SNPs

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2.3不同基因型单倍型分析

由表9可知，与大豆籽粒水解精氨酸、甘氨酸、谷氨酸、赖氨酸显著关联SNP位点为S16_32280240(A/T)、S16_36782739(T/A)、S07_6898548(G/A)和S06_15229665(A/G)，将这些位点和游离甘氨酸、谷氨酸、赖氨酸共定位S12_11366121(A/G)进行不同基因型单倍型分析，发现水解精氨酸含量显著相关位点S16_32280240，大豆品种中基因型为TT的含量均值为56.20mg/g，基因型为AA的含量均值为31.42mg/g，含量平均提高了78.86％；水解甘氨酸含量显著相关位点S16_36782739，大豆品种中基因型为AA的含量均值为45.63mg/g，基因型为TT的含量均值为16.11mg/g，含量平均提高了183.24％；水解谷氨酸含量显著相关位点S07_6898548，大豆品种中基因型为AA的含量均值为125.54mg/g，基因型为GG的含量均值为46.89mg/g，含量平均提高了167.73％；水解赖氨酸含量显著相关位点S06_15229665，大豆品种中基因型为GG的含量均值为65.26mg/g，基因型为AA的含量均值为39.43mg/g，含量平均提高了65.50％；游离甘氨酸、谷氨酸、赖氨酸三种氨基酸共定位S06_15229665，大豆品种中基因型为GG的含量均值分别是0.20mg/g、0.93mg/g、0.17mg/g，基因型为AA的含量均值分别是0.07mg/g、0.52mg/g、0.11mg/g，含量平均分别提高了185.71％、78.84％、54.55％。

表9不同基因型大豆种质的氨基酸含量

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2.3大豆4种氨基酸KASP标记应用

针对与大豆籽粒水解精氨酸、甘氨酸、谷氨酸、赖氨酸显著关联SNP位点S16_32280240(A/T)、S16_36782739(T/A)、S07_6898548(G/A)和S06_15229665(A/G)和游离甘氨酸、谷氨酸、赖氨酸共定位S12_11366121(A/G)开发相应的KASP标记，标记引物序列如表2所示。KASP标记的应用过程：首先提取大豆基因组的DNA为模板，加入各位点相应引物F1、F2、R，在实时荧光定量PCR仪中进行PCR扩增，最后反应结束后读取荧光数据。本研究利用KASP标记在实时荧光定量PCR仪对25份大豆种质(大豆种质已知的各氨基酸含量品质如表10-11)进行扩增并基因分型，结果如图3所示，4种分子标记引物可以明确区分两种基因型。

表1025份大豆种质的氨基酸含量及基因分型结果

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表11

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大豆水解精氨酸含量显著关联SNP位点S16_32280240(A/T)设计的KASP标记，可以清楚区分两种基因型，蓝色圆点是携带T等位变异位点的高精氨酸含量的大豆品种，红色圆点为携带A等位变异位点含量一般的大豆种质(图3中A)；水解甘氨酸含量显著关联SNP位点S16_36782739(T/A)设计的KASP标记，蓝色圆点是携带A等位变异位点的高甘氨酸含量的大豆品种，红色圆点是携带T等位变异位点含量一般的大豆种质(图3中B)；水解谷氨酸含量显著关联SNP位点S07_6898548(G/A)设计的KASP标记，蓝色圆点是携带A等位变异位点的高谷氨酸含量的大豆品种，红色圆点是携带G等位变异位点含量一般的大豆种质(图3中C)；水解赖氨酸含量显著关联SNP位点S06_15229665(A/G)设计的KASP标记，蓝色圆点是携带G等位变异位点的高赖氨酸含量的大豆品种，红色圆点是携带A等位变异位点含量一般的大豆种质(图3中D)；游离甘氨酸、谷氨酸和赖氨酸共定位SNP位点，S12_11366121(A/G)设计KASP标记，蓝色圆点是携带G等位变异位点的高游离甘氨酸、谷氨酸和赖氨酸含量的大豆品种，红色圆点是携带A等位变异位点含量一般的大豆种质(图3中E)。

3结果分析

本研究对大豆自然群体进行全基因组关联分析，鉴定出分别与大豆水解精氨酸、甘氨酸、谷氨酸和赖氨酸4种水解氨基酸显著关联的SNP位点，S16_32280240(A/T)、S16_36782739(T/A)、S07_6898548(G/A)和S06_15229665(A/G)，游离甘氨酸、谷氨酸、赖氨酸共定位S12_11366121(A/G)，进而开发相应的KASP标记，发现S16_32280240位点，基因型为T的大豆品种水解精氨酸含量均值显著高于基因型为A的大豆品种；S16_36782739基因型为A的大豆品种水解甘氨酸高于基因型为T的大豆品种；S07_6898548位点基因型为A的大豆品种水解谷氨酸含量均值都各自高于基因型为G的大豆品种；S06_15229665位点，基因型为G的大豆品种水解赖氨酸含量均值高于基因型为A的大豆品种；S12_11366121位点，基因型为G大豆品种游离甘氨酸、谷氨酸、赖氨酸含量均值高于基因型为A的大豆品种。

昝光敏(2020)对中国南方大豆试验群体进行水解氨基酸含量测定和全基因组关联分析，2018年测定结果表明，在-LOG₁₀P>3为显著水平时，赖氨酸在6号染色体显著SNP标记有20个，最显著位点为S6_51390910，本研究的赖氨酸最显著SNP位点同样位于6号染色体，由于显著阈值不同，本研究-LOG₁₀P>5，6号染色体上定位SNP位点较少。基于赖氨酸6号染色体上的SNP位点，可以进一步探究大豆赖氨酸含量相关候选基因，为后续功能性大豆分子育种奠定基础。

KASP分子标记具有成本低、数量多、基因分型明显等优点，广泛应用于作物育种，缩短育种进程，本研究开发大豆精氨酸、甘氨酸、谷氨酸和赖氨酸4种氨基酸相应的KASP标记并进行基因分型，样品基因分型效果明显。可以灵敏、高效、低成本的预测大豆氨基酸含量，推动大豆分子育种进程。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims

1.一种与大豆甘氨酸相关的KASP标记的引物组的应用，其特征在于，用于如下任一项应用中：

（1）鉴定大豆甘氨酸含量；

（2）筛选高低甘氨酸含量的大豆品种或品系；

所述KASP标记为S16_36782739和/或S12_11366121；所述S16_36782739的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，且第21位碱基为T或A；所述S12_11366121的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，且第21位碱基为A或G；

S16_36782739基因型为AA的大豆品种的水解甘氨酸含量高于基因型为TT的大豆品种，S12_11366121基因型为GG的大豆品种的游离甘氨酸含量高于基因型为AA的大豆品种；

检测所述S16_36782739的引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示的正向引物F1、核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示的正向引物F2和核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示的反向引物R；

2.一种与大豆甘氨酸相关的KASP标记的检测试剂盒的应用，其特征在于，用于如下任一项应用中：

（1）鉴定大豆甘氨酸含量；

（2）筛选高低甘氨酸含量的大豆品种或品系；

所述检测试剂盒包含权利要求1中所述的引物组。

3.一种鉴定大豆甘氨酸含量高低的方法，其特征在于，包括如下步骤：

以待测大豆样品的基因组DNA作为模板，利用权利要求1中所述的引物组或权利要求2中所述的检测试剂盒对模板进行荧光定量PCR扩增，利用扩增结果判断大豆甘氨酸含量高低；

S16_36782739基因型为AA的大豆品种的水解甘氨酸含量高于基因型为TT的大豆品种，S12_11366121基因型为GG的大豆品种的游离甘氨酸含量高于基因型为AA的大豆品种。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述荧光定量PCR扩增的程序为：94℃预变性15min；94℃变性20s，61-55℃梯度复性/延伸1min，每个循环降低0.6℃，10个循环；94℃变性20s，55℃复性/延伸 1min，26个循环。