CN101701262B - 一种猪肉质性状相关的分子标记及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于动物分子标记制备技术领域，具体涉及猪BTG2基因片段的克隆及作为分子标记的应用。所述的分子标记的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所述，在序列表的第191位有1个C191-T191碱基突变，导致Mval-RFLP多态性。本发明还公开了制备该分子标记的方法。

Description

一种猪肉质性状相关的分子标记及应用

技术领域

本发明属于动物分子标记制备技术领域，具体涉及一种与猪肉质相关基因BTG2基因的克隆，分子标记的制备及在标记辅助选择上的应用。

背景技术

猪肉作为中国人民的传统肉食品，与人民生活品质的提高息息相关。长期以来，猪的育种以提高生长速度、减少饲料消耗、增加瘦肉率为主要目标，并已取得显著成绩。但伴随着生产水平的提高，猪肉品质却大幅降低了。随着我国社会经济的发展，人们饮食观念发生从“吃饱”到“吃好”的变化，消费者对猪肉品质的要求越来越高。因此，在提高猪的瘦肉率时如何兼顾肌肉品质成为当今猪育种工作的重点。

20世纪80年代以来，随着分子生物学及遗传学的发展，猪的定向育种工作效率大为提高。目前，标记辅助选择(MAS)、影响猪重要数量性状的基因组区域定位(QTL)、用基因组扫描(genome scanning)法和候选基因法(Candidate gene approach)研究影响猪重要经济性状的主效基因(Economic traits loci，ETLs)已经成功地应用到国内外的猪育种实践当中。其中，通过对氟烷(Hal)基因的基因型进行直接选择以降低猪只的应激敏感性、提高猪肉品质，已经在世界范围内得到了成功的应用(彭中镇等，猪数量性状基因及其标记研究进展.国外畜牧科技，1999，26(1)：28-32)。Le Roy等(Le Roy等，Evidence for anew majorgene influencing meat quality in pigs.Genet Res，1990，55(1)：33-40)在汉普夏猪及其杂种中发现不利等位基因RN^-可使肌肉中肌糖原含量升高，终端pH值降低，造成酸肉和烹调损失，猪肉工艺学品质下降，影响火腿的产量。Milan等(Milan等，A mutation in PRKAG3 associated with excess glycogen content in pig skeletalmuscle.Science，2000，288(5469)：1248-51)通过对候选区域进行大规模的测序分析，发现单磷酸腺苷活化酶γ3亚基基因(AMP-activated protein kinase(AMPK)，γ-subunit 3，PRKAG3)编码第200位氨基酸的密码子的错义突变与汉普夏猪的酸肉表型直接相关，RN^-猪的该位点均为不利的等位基因Q(即谷氨酰胺)。Ciobanu等(Ciobanu等，Evidence for new alleles in the protein kinase adenosine monophosphate-activatedgamma(3)-subunit gene associated with low glycogen content in pig skeletal muscle and improved meat quality.Genetics，2001，159(3)：1151-62)在1800个商品猪群中对该基因进行分型，结果发现了新的等位基因与肌糖原含量相关并进一步影响肉质性状。与Milan等发现的位点不同的是，这个位点的不同等位基因不仅仅在汉普夏猪中分离，它在典型的商品猪群中多态性也比较丰富，对育种具有更广泛的适用价值。

我们通过SAGE文库技术发现，BTG2基因在中外两猪种的骨骼肌中表达差异十分显著。BTG2基因是抗增殖基因家族BTG/TOB家族成员之一，该家族成员蛋白质N端110个氨基酸具有高度同源性，这个同源区包括两个短的、高度保守的同源区A-box和B-box，A-box具有抗增殖作用，B-box具有同许多靶分子结合的功能。越来越多的研究表明，该基因家族成员抑制多种细胞的增殖并刺激它们的分化(Matsuda等，Insearch of a function for the TIS21/PC3/BTG2/TOB family.FEBS Lett，2001，497：67-72)。其中BTG1基因更多次被报道直接刺激成肌细胞分化，BTG2基因的过表达能减小动物身体体积(Matsuda等，In search of a functionfor the TIS21/PC3/BTG1/TOB family.FEBS Lett，2001，497：67-72；Busson等，Coactivation of nuclear receptorsand myogenic factors induces the major BTG1 influence on muscle differentiation.Oncogene，2005，24(10)：1698-710)。因此，我们推测BTG2基因有可能在肌纤维的早期发育过程中起重要作用。而肌纤维的早期发育会直接影响猪瘦肉产量和质量(Nissen等，Within-litter variation in muscle fiber characteristics，pigperformance，and meat quality traits.J Anim Sci，2004，82，414-21)，Rehfeld认为肌纤维的数量和体积的遗传变异与遗传力很高(Rehfeld等，Myogenesis and postnatal skeletal muscle cell growth as influenced by selection.Livestock Production Science，2000，66：177-188)，因而利用影响肌纤维早期发育的基因进行育种选择能定向改造猪的肉质和生长性状。

到目前为止，除申请人之外，仍没见到研究猪BTG2基因功能的报道。研究突变位点在群体中的多态性，并进行性状关联分析是研究基因功能的有力手段。所以申请人对这个基因进行了多态研究和关联分析，以期能够发现它对猪肉质性状的影响。

发明内容

本发明的目的在于克隆猪肉质相关基因BTG2，寻找BTG2基因的突变位点以及作为猪肉质基因的多态性检测方法，为标记辅助育种提供一种有用的分子标记。

本发明是这样实现的：

一种猪肉质性状基因BTG2作为分子标记的应用，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所述，PCR扩增的BTG2基因的目的片段全长为229bp。在序列表的第191位有1个C191-T191碱基突变(或参见附图5所示的C191-T191处碱基突变，即括号内所显示的碱基突变)，导致Mva1-RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)多态性。

一种适用于猪生产性状的分子标记的制备方法，按照以下步骤制备：

用人BTG2基因的mRNA序列为信息探针，利用NCBI中的BLAST工具在GenBank猪EST数据库中做同源序列筛选，获得一系列同源性为90％以上的猪ESTs(片段长度大于100bp)序列，然后拼接猪EST-重叠群，获得猪BTG2基因的cDNA序列，在内含子两端设计上下游引物扩增内含子并测序，最后获得如序列表SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。设计扩增引物，从猪血液基因组提取DNA，PCR扩增、PCR产物纯化和克隆测序，应用PCR产物直接测序的方法检测猪BTG2基因扩增目的片段第191位的多态性，并进行其基因型与猪的部分生产性状之间的关联分析。本发明为猪的分子育种提供了一个新的遗传标记。

扩增猪肉质性状基因BTG2基因的引物，它的核苷酸序列如下所示：

正向引物：5’-GAGCCTCTCACTGATTCCC-3’

反向引物：5’-AGGACCCTCTTCAAGTGCT-3’

依照本发明，本发明克隆与猪肉质相关基因BTG2可以用于猪标记辅助选择中。

本发明的效果是：

1、猪BTG2基因部分DNA序列的克隆

PCR扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测结果显示均为特异的PCR产物。将PCR产物回收纯化后克隆测序，测序结果显示PCR产物的长度为229bp，为BTG2基因DNA 5‘UTR到内含子间序列(主要是第一外显子部分，如序列表SEQ ID NO：1中所示)。

测序结果表明在该片段的191bp处存在C、T两个等位基因突变(见附图5)，测序峰图见图3。

2、PCR-RFLP诊断方法建立

用B2POLF和B2POLR扩增猪基因组DNA得到229bp特异扩增片段(详见图2)。测序的结果发现在该229bp片段中存在MvaI限制性内切酶的酶切位点(5′CC↓A/TGG3′)，其中第192-193bp间为MvaI酶的多态性切点，在该片段60bp处还存在一个该酶的固定切点。扩增的PCR产物经MvaI酶切产生三种基因型，CC基因型有60bp，132bp和37bp三条带，杂合子CT型有60bp，169bp，132bp和37bp四条带，TT型只有60bp和169bp两条带，用2.5％的琼脂糖凝胶电泳检测能明显的判别带型(见图4)。

更详细的技术方案见《具体实施方式》所。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明克隆的猪生长性状相关基因BTG2的部分核苷酸序列。

图1：是本发明的技术流程图。

图2：是本发明中猪BTG2基因第一外显子和内含子区扩增序列的电泳图谱，片段大小为229bp(琼脂糖胶浓度为2.5％)。图中：M：DNA分子量标记(DL2000 ladder)。

图3：是本发明中猪BTG2基因测序发现的191bp处存在C、T两个等位基因的突变。

图4：是本发明中猪BTG2基因第一外显子和内含子区的MvaI-RFLP三种基因型电泳图谱。图中：M：DNA分子量标准(DL2000 ladder).

图5：是本发明所扩增得到的猪BTG2基因第一外显子和内含子区序列，片段大小为229bp，图中下划线分别为正、反向引物序列。括号内所显示的是碱基突变。

具体实施方式

实施例1(制备实施例)

1、BTG2基因的cDNA3’UTR部分序列的克隆

(1)引物设计：

用人BTG2基因的mRNA序列(GenBank登录号：NM_005310)为信息探针，利用NCBI中的BLAST工具在GenBank猪EST数据库中做同源序列筛选，获得一系列同源性为90％以上的猪ESTs(片段长度大于100bp)序列，然后用DNAstar中的SeqMan程序构建猪EST-重叠群，并获得由重叠群拼接构成的一致序列(consensus)，将获得的一致序列与人的mRNA作同源性比对以确认序列的正确性。对该序列进行结构分析后，分别在第一外显子和第二外显子中设计上下游引物扩增内含子并测序，再将一致序列与内含子序列按顺序拼接得到BTG2基因的DNA序列，如序列表SEQ ID NO：1所示。然后用Primer Premier 5.0软件设计引物扩增BTG2基因第一外显子到内含子间长度为229bp的片段。引物序列如下：

B2POLF：5’-GAGCCTCTCACTGATTCCC-3’(正向)，

B2POLR：5’-AGGACCCTCTTCAAGTGCT-3’(反向)

(2)PCR产物的纯化、克隆和测序：

PCR产物的纯化：在紫外灯下从低熔点琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5mL Ependorff管中，然后用PCR产物纯化试剂盒(购自Promega公司)纯化PCR产物，按照试剂盒说明书操作，具体步骤是每100mg的凝胶中300μL的S1液，于65℃温育10min至凝胶完全融化，将S1/DNA混合物转入回收柱，9200g离心30s，使浆液通过Minicolumn挤出。将下面管子中的废液倒掉，再加入500μL的W1液至管中，9200g离心15s，倒掉管中的废液。再加入500μL的W1液，静置1min，9200g离心30s，取下Minicolumn装入1.5mlEpendorff管中，加入25μL的灭菌水或者TE液，静置1min之后，9200g离心1min，以洗脱DNA存于Ependorff管中。

连接反应：将纯化的PCR产物与pMD18-T载体(购自TAKARA公司)连接，连接反应总体积是5μl，其中包括2.5μl2×ligation buffer，0.5μl载体，1μl纯化PCR产物，最后加入1μl灭菌水置4℃水浴过夜。

感受态细胞的制备：从37℃培养了16～20h的新鲜平板上挑取一个DH5α单菌落接种于2ml LB中，于37℃振荡培养3h，转接1ml菌液于含有30ml LB的盐水瓶中，继续在37℃振荡培养约4h，待OD600达到0.3～0.4时将盐水瓶从摇床取出置冰浴冷却10～15min，然后将菌液转入离心管中于4℃4,000g离心10min以收集细胞，将离心管倒置以弃净培养液，用10ml冰预冷的0.1mol/L的CaCl2重悬沉淀，冰浴30min，重复4℃4,000g离心10min一次，用4ml冰预冷的0.1mol/L的CaCl2重悬沉淀，置4℃保存备用。

转化：无菌状态下取100～120μl感受态细胞于1.5ml Ependorff管中，将5μl的连接产物加入混匀，在冰上放置30min后42℃热激90s，其间不要摇动Ependorff管，取出后冰浴3～4min，加入400μl无抗生素的LB液体养基，37℃振荡培养45min。取100μl涂布于已提前4h涂布了IPTG(Isopropylthio-β-D-galactoside，异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)和X-gal的含Amp的琼脂平板上，37℃平放1h后倒置培养。

克隆子通过PCR鉴定为阳性的用于送上海英骏生物技术有限公司测序。将大白、杜洛克和梅山三个品种的各一个克隆子分别测序或混合测序，测序结果用Seqman^TM软件比对寻找可能的SNP。

2.标记性状关联分析

利用申请人与中国湖北省通城县畜牧局种畜场合作组建的试验群体(含纯种通城猪、长白猪、大白猪、大白×长白×通城、长白×大白×通城)为实验对象进行性状关联分析。所分析的性状有部分生长性状，部分胴体性状和部分肉质性状。对基因型资料用如下模型进行性状关联分析：

Y_ijkl＝μ+G_i+B_j+S_k+ε_iijkl

Y_ijkl表示 观测值，μ表示均值，G_i表示基因型效应，B_j表示组合效应，S_k表示性别效应，ε_ijkl表示残差，假定服从N(0，Iσ²)分布。

标记性状关联分析的结果

对猪BTG2基因第一外显子MvaI-RFLP多态性位点与部分生产性状进行关联分析，基因型检测结果表明在通城试验猪群131个个体中，CC基因型有105个，CT基因型有21个，TT基因型有5个。不同基因型与性状之间显著差异的结果(最小二乘均数和标准误分析)见表1，其它性状在不同的基因型之间没有显著的差异。

分析结果表明，该位点的基因型与肩部膘厚、肉色评分及肌肉剪切力存在显著关联，TT基因型的肩部膘厚及肌肉剪切力显著高于CC和CT基因型，TT基因型的肉色评分显著高于CC基因型。TT基因型是有利于提高膘厚、肌肉剪切力和肉色的选择标记。C等位基因是肉质性状的有利标记。见表1所示。

表1猪BTG2基因MvaI-酶切基因型与几个生产性状的关联分析

^*表示差异显著(p＜0.05)，^**表示差异极显著(p＜0.01)。

实施例2(应用实施例1)

(1)PCR-RFLP-MvaI多态性在各猪品种中的分布情况

在BTG2基因扩增片段利用PCR-MvaI-RFLP检测了大白、长白、杜洛克、通城、二花脸、清平和江西玉山七个猪品种。该酶切基因型在各猪品种的基因频率分布如表2所示，发现各猪品种中都是C等位基因占优势，其中三个国外猪品种C等位基因占绝对优势。

表2猪BTG2基因在七个猪品种中的基因型频率与等位基因频率

几个品种间基因型频率的卡方检验结果如表3。x²检验表明，大白和杜洛克与四个国内品种猪之间存在显著或极显著差异，清平猪长白之间差异不显著，与其它猪品种之间差异显著或及显著。

表3猪BTG2基因PCR-RFLP-MvaI基因型分布x²验结果

肩注^*表示P＜0.05；肩注^**表示P＜0.01；df＝2，x² _0.05(2)＝5.99，x² _0.01(2)＝9.21

实施例3(应用实施例2)

猪标记-性状关联分析：用BTG2基因检测了通城试验猪群131头猪，对BTG2基因的该位点MvaI-RFLP多态检测的三种基因型与通城试验猪群部分生产性能进行了初步相关分析。基因型检测结果表明在131个个体中CC基因型有105个，CT基因型有21个，TT基因型有5个。分析结果表明，该位点的基因型与肩部膘厚、肉色评分及肌肉剪切力存在显著关联，TT基因型的肩部膘厚及肌肉剪切力显著高于CC和CT基因型，TT基因型的肉色评分显著高于CC基因型。检测效果见表4所示。

表4猪BTG2基因MvaI-酶切基因型与几个生产性状的关联分析

^*表示差异显著(p＜0.05)，^**表示差异极显著(p＜0.01)。

序列表

<110>华中农业大学

<120>一种猪肉质性状相关的分子标记及应用

<130>

<141>2009-11-17

<160>1

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>229

<212>DNA

<213>猪(Sus scrofa)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(229)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(191)..(191)

<223>

<400>1

gagcctctca ctgattcccc gccgccacca ccgttccctg agccgcgaaa gacatgagcc  60

aggcccgctg gaccgggaag agaacagata tgctcccgga gatcgctgcc gctgtaggtt  120

tcctctccag cctcctcagg acccggggct gcgtgagcga gcagcgactc aaggttttca  180

gcggggctct ccaggaggca ctgacaggtg agcacttgaa gagggtcct              229

Claims (2)

1.一种作为猪标记辅助选择应用的与猪肉质性状相关的分子标记，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所述，在序列表的第191位有1个C191-T191碱基突变，导致Mval-RFLP多态性。

2.权利要求1所述的分子标记在猪标记辅助选择中的应用。

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