WO2011083777A1 - 大麦の選別方法、麦芽及び麦芽発酵飲料 - Google Patents

大麦の選別方法、麦芽及び麦芽発酵飲料 Download PDF

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WO2011083777A1
WO2011083777A1 PCT/JP2011/050003 JP2011050003W WO2011083777A1 WO 2011083777 A1 WO2011083777 A1 WO 2011083777A1 JP 2011050003 W JP2011050003 W JP 2011050003W WO 2011083777 A1 WO2011083777 A1 WO 2011083777A1
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barley
seq
malt
base sequence
genotype
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PCT/JP2011/050003
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健宏 保木
隆 飯牟礼
誠 木原
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サッポロビール株式会社
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12C—BEER; PREPARATION OF BEER BY FERMENTATION; PREPARATION OF MALT FOR MAKING BEER; PREPARATION OF HOPS FOR MAKING BEER
    • C12C1/00—Preparation of malt
    • C12C1/18—Preparation of malt extract or of special kinds of malt, e.g. caramel, black malt
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/13—Plant traits

Definitions

  • the present invention relates to a method for sorting barley, malt, and a malt fermented beverage.
  • Barley may germinate in the state of spikes due to the effects of low temperature and rainfall before harvesting, and this phenomenon is called spike germination.
  • ear germination occurs, starch and proteins, which are seed storage substances, are decomposed, and the germination rate is further reduced (Non-patent Document 1).
  • Non-patent Document 1 barley that has undergone ear germination may not be used for barley making, and ear germination is one of the most important problems for farmers.
  • Panicle germination is closely related to seed dormancy. Seed dormancy is a property that seeds do not germinate even under conditions suitable for germination, and it is known that there are differences between barley varieties.
  • Non-Patent Document 2 Various genetic analyzes have been conducted on seed dormancy so far, and analysis of Hokkaido genealogical lines suggests a relationship between the Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) marker ABG314 and the seed dormancy at the end of the 5H chromosome long arm.
  • RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism
  • the Kolbach Index (KI) of malt is a value indicating the proportion of soluble nitrogen in the total nitrogen content of the malt, and how much nitrogen components and sugars in the malt are decomposed, solubilized and reduced in molecular weight. It is one of the most important indicators for evaluating whether or not If the value of KI is too low, the nitrogen content of wort is insufficient, which greatly affects fermentation. On the other hand, if KI is too high, it affects the balance of taste when brewing beer. For this reason, the KI of the malt must be within a suitable range.
  • the KI of malt is controlled by the malting conditions such as the degree of soaking and germination time at the time of malting, but it is known that the KI value varies depending on the barley variety even if the malting is performed under the same conditions. .
  • Non-patent Document 8 It was reported that statistically significant QTL was detected in the aforementioned RFLP marker ABG314 by QTL analysis of malt KI using a doubled haploid line of Mikamo Golden-Harrington (Non-patent Document 8). Further, QTL was detected on the 5H chromosome by QTL analysis of malt KI using Harrington / TR306 and Harrington / Molex populations (Non-patent Documents 9 and 10).
  • the molecular selection technology using DNA polymorphism and protein content as indicators is progressing not only in barley but in various crops.
  • selection using DNA markers enables selection in the early generation of breeding, excellent operability, and analysis of seed traits in leaves without using seeds that are advanced to breeding generations. For this reason, research and development is actively underway.
  • various methods such as RFLP method, Cleared Amplified Polymorphic Sequence method (CAPS method) and the like are known.
  • ABG314 described in Non-Patent Documents 2 and 8 has been converted into an RFLP marker as a DNA marker that can be used in the RFLP method so far.
  • this RFLP marker is a detection method based on genomic DNA restriction enzyme digestion and Southern hybridization, which is cumbersome and takes a lot of time to determine the genotype and further process multiple samples. It was an unsuitable way to do. For this reason, there is a limit to the number of sample processing points, and it took a lot of time for processing, so it was difficult to use at the breeding site.
  • a method for obtaining an amplified DNA fragment by polymerase chain reaction (PCR) using genomic DNA as a template and detecting a DNA marker contained in the amplified DNA fragment can increase the number of samples that can be processed at the same time, and is a simple operation. And can be detected in a short time, which is advantageous for use in barley breeding.
  • the CAPS method is excellent in that the genotype can be determined only by PCR using DNA extracted from leaves as a template, restriction enzyme cleavage of the PCR product, and electrophoresis, and the construction of a CAPS marker is desired.
  • the present invention can select test barley based on ear germinability, seed dormancy and malt KI, is easy to work, can process multiple samples in a short time, and goes to the barley breeding site.
  • the purpose is to provide a method for selecting test barley suitable for the application of the above.
  • Another object of the present invention is to provide malt using barley selected based on ear germination, seed dormancy and malt KI, a method for producing the same, a malt fermented beverage and a method for producing the same.
  • the present invention is a method for selecting test barley based on a polymorphic marker identified by multiple alignment of the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7,
  • a base sequence site where the base sequence described in SEQ ID NO: 7 is different from the corresponding base sequences described in SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 as polymorphic marker A A base sequence site where the base sequence described in SEQ ID NO: 6 is different from the corresponding base sequences described in SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 7 as polymorphic marker B, A base sequence portion where the base sequence described in SEQ ID NO: 5 is different from the corresponding base sequences described in SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7 as polymorphic marker C
  • PCR polymerase chain reaction
  • the test barley of (i) by screening the test barley of (i), it is possible to obtain the test barley having a high ear germination property, a low seed dormancy, and a higher malt KI value.
  • the test barley of (ii) by selecting the test barley of (ii), it is possible to obtain the test barley having a low ear germinability, a strong seed dormancy, and a lower malt KI. Since the above selection method is based on detecting polymorphisms using genomic DNA amplified by the PCR method, the labor required for selection can be greatly reduced. In addition, the work is easy, and multiple specimens can be processed in a short time. Moreover, according to the screening method of the test barley of this invention, the test barley can be selected reliably at the initial stage of barley breeding based on ear germination, seed dormancy and malt KI.
  • ABG314 has a genomic DNA region with very similar nucleotide sequences, it was difficult to obtain amplified DNA fragments by PCR using oligonucleotide primers constructed based on known nucleotide sequence information.
  • the present invention designed an oligonucleotide primer pair that can specifically amplify only ABG314 by PCR without substantially amplifying the similar genomic DNA region, and by using this oligonucleotide primer pair, This is because the polymorphism between barley varieties in the internal sequence was clarified, and it was found that there was a statistically significant relationship between the polymorphism between the barley varieties and ear germination, seed dormancy, and malt KI. .
  • the genotype it is preferable to determine the genotype by detecting the number or size of the cleaved fragments obtained by digesting the amplified DNA fragment with the restriction enzyme ClaI.
  • the polymorphic marker A that forms a recognition sequence by the restriction enzyme ClaI exists only in the base sequence described in SEQ ID NO: 7, the digestion of the amplified DNA fragment with the restriction enzyme ClaI
  • the genotype of the polymorphic marker A can be determined by the difference in the number or size of the cleaved fragments.
  • the present invention also provides a progeny line of barley that can be obtained by crossing the barley selected as (i) in the method for selecting test barley or by crossing the barley selected as (ii). I will provide a.
  • the barley selected as (i) in the method for selecting test barley By crossing the barley selected as (i) in the method for selecting test barley, barley of a progeny of the cross in which the genotype of the polymorphic marker matches the genotype of the base sequence described in SEQ ID NO: 7 Can be obtained. Therefore, the barley of the progeny line obtained in this way has characteristics of high ear germination, low seed dormancy, and high malt KI value.
  • the genotype of the polymorphic marker is the genotype of the base sequence described in SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6. Matching progeny lines of barley can be obtained.
  • the barley of the progeny line obtained in this way has the characteristics of low ear germination, strong seed dormancy, and low malt KI. In addition, it is difficult to germinate in the state of ears due to the low temperature before harvesting, rainfall, etc., and it is difficult to cause degradation of starch and proteins, which are seed storage materials, so it is possible to improve the cultivation efficiency as barley for barley making .
  • the present invention is a barley of a progeny line of crosses that can be obtained by crossing barley selected as (i) or barley selected as (i) in the above selection method (hereinafter collectively referred to as “(i) type”. It is also referred to as “barley”.) And a malt production method comprising a malting process for obtaining malt. Since (i) type barley has low seed dormancy and a high malt KI value, a constant quality can be maintained even if the soaking time and the number of germination days are shortened. Accordingly, it is possible to reduce malt production costs and CO 2 emissions.
  • the present invention relates to a barley of a progeny line of crosses that can be obtained by crossing barley selected as (ii) or barley selected as (ii) in the above-described selection method (hereinafter collectively referred to as “(ii) type”). It is also referred to as “barley”.) And a malt production method comprising a malting process for obtaining malt.
  • the present invention also provides malt that can be obtained by any one of the above malt production methods.
  • Type barley tends to have high malt KI
  • type barley tends to have low malt KI.
  • Malt KI is one of the indicators of how much protein, sugar, etc. have been solubilized and reduced in molecular weight during the malting process, and malt fermented beverages made from malt with different malt KI have different flavors. Presents. Therefore, the flavor of the malt fermented beverage can be controlled by appropriately using the malt.
  • the present invention is a method for producing a malt fermented beverage comprising at least a preparation step and a fermentation step, wherein the barley raw material used in the preparation step can be obtained from (i) type barley or (i) type barley.
  • a method for producing a malt fermented beverage is provided. Since (i) type barley has a high malt KI value, components necessary for alcoholic fermentation can be extracted even if the charging time is shortened. Therefore, the preparation time can be shortened, and the production cost of the malt fermented beverage can be reduced and the CO 2 emission amount can be reduced.
  • the present invention is a method for producing a malt fermented beverage comprising at least a preparation step and a fermentation step, wherein the barley raw material used in the preparation step can be obtained from (ii) type barley or (ii) type barley.
  • a method for producing a malt fermented beverage is provided.
  • the present invention also provides a malt fermented beverage that can be obtained by any one of the above methods for producing a malt fermented beverage. Since (i) type barley has a high malt KI, while (ii) type barley has a low malt KI, (i) a malt fermented beverage made from type barley and (ii) a malt fermented beverage made from type barley Can be made into malt fermented beverages with different flavors, and it is possible to provide malt fermented beverages that meet the needs of consumers.
  • the present invention provides an oligonucleotide primer pair comprising the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4.
  • the oligonucleotide primer pair can specifically amplify a target region in PCR using genomic DNA of test barley as a template. Thereby, the genotype of the polymorphic marker using the amplified DNA fragment can be detected.
  • the conventional DNA marker for malt KI is based on the RFLP method, and it takes a complicated operation and a lot of time to determine the genotype.
  • simple DNA extraction, PCR, restriction enzyme Genotypes can be determined only by basic and relatively easy operations such as processing and electrophoresis, and multiple points can be processed in a short time.
  • test barley based on the ear germinability, seed dormancy and malt KI, and it is easy to work and can process multiple samples in a short time. It is possible to select the test barley species with reliability in the early stage of barley breeding. Therefore, it is suitable for application to the barley breeding site.
  • the present invention provides a sorting method for sorting barley based on ear germination characteristics, seed dormancy characteristics and malt KI characteristics.
  • a polymorphic marker is identified by multiple alignment of the base sequences described in SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7, and the test barley is selected based on the genotype of the polymorphic marker.
  • the base sequences described in SEQ ID NO: 7 are different from the corresponding base sequences described in SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6.
  • the sequence region is a polymorphic marker A
  • the base sequence site different from the base sequence described in SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 7 corresponding to the base sequence described in SEQ ID NO: 6 is the base sequence described in polymorphic marker B
  • a base sequence site different from the base sequences described in SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7 corresponding to the sequence is obtained as the polymorphic marker C.
  • the base sequences described in SEQ ID NOs: 5, 6 and 7 are genomic DNA sequences derived from barley micamo golden species, Gairdner species and Harrington species, respectively.
  • multiple alignment means that a plurality of base sequences can be compared with each other so that the base sequences are aligned with appropriate blanks (gaps) so that corresponding base sequence portions are aligned.
  • the case where there are two base sequences is also called multiple alignment.
  • a known multiple alignment creation program can be used. For example, Clustal W, Clustal X, etc. can be suitably used.
  • the identified nucleotide sequence site can be used as a polymorphic marker.
  • transduced in order to optimize multiple alignment in this invention, it specifies as a base sequence site
  • the base corresponding to the 588th base of SEQ ID NO: 5 is aligned or aligned with the 588th base sequence of SEQ ID NO: 5 when multiple alignment is performed.
  • Determination of the genotype of the polymorphic marker in test barley is obtained by PCR using the test barley genomic DNA as a template and an oligonucleotide primer pair consisting of the base sequences described in SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4. This is performed using the amplified DNA fragment.
  • the DNA extraction method from the test barley can be suitably used as long as it is a method commonly used for DNA extraction from plant tissues such as CTAB method. Moreover, commercially available DNA extraction kits can also be suitably used.
  • DNA may be extracted from parts such as leaves, stems, roots, and seeds of test barley, but it is preferable to extract from leaves in consideration of selection at the breeding stage. By extracting from the leaves, barley having desirable traits can be selected at an early stage.
  • thermostable polymerase used for PCR, a commercially available thermostable polymerase can be appropriately selected and used.
  • Premix Taq, Ex Taq version 2.0 (TAKARA Bio) can be preferably used.
  • the annealing temperature is preferably 60.0 to 65.0 ° C., for example, 62.5 ° C. By setting the annealing range to this range, amplification of the non-target region can be suppressed more efficiently.
  • the genotype is determined based on at least one polymorphic marker A using the amplified DNA fragment amplified by the PCR. Alternatively, the genotype may be determined based on at least one of polymorphic marker B and polymorphic marker C. According to the determined genotype, the test barley can be selected by ear germination characteristics, seed dormancy characteristics and malt KI characteristics.
  • Determination of the genotype based on the polymorphic marker in the test barley can be performed, for example, by discriminating the base sequence of the base sequence site to be the polymorphic marker. For example, it is performed by decoding and discriminating the base sequence by sequence analysis, discriminating the base sequence based on the presence or absence of a restriction enzyme recognition sequence, or discriminating the base sequence by hybridization using a perfect match probe or mismatch probe. be able to.
  • the genotype is determined by digesting the amplified DNA fragment with one or more restriction enzymes containing the polymorphic marker in the recognition sequence and detecting the number or size of the resulting cleaved fragments. You can also.
  • the genotype can be identified by whether or not the polynucleotide is cleaved by the restriction enzyme. Whether or not a polynucleotide is cleaved by a restriction enzyme can be determined from the number or size of fragments by fractionating the polynucleotide digested with the restriction enzyme.
  • the digestion reaction with restriction enzymes can be performed at an optimal reaction temperature using a buffer solution optimal for each restriction enzyme.
  • a method for detecting a fragment after restriction enzyme digestion by size fractionation agarose gel electrophoresis commonly used by those skilled in the art can be suitably employed.
  • fragments can be detected by size fractionation by HPLC using a known appropriate column.
  • test barley Based on the determined genotype, (i) by selecting test barley whose determined genotype matches the genotype of the base sequence described in SEQ ID NO: 7, it has high ear germination and seed dormancy Test barley having a weakness and a higher malt KI value can be obtained. On the other hand, (ii) by selecting test barley whose determined genotype matches the genotype of the base sequence described in SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6, it has low ear germination and strong seed dormancy And test barley with a lower malt KI can be obtained. Note that only one or both of (i) and (ii) may be performed.
  • a progeny line of barley that can be obtained by crossing selected barley as (i) is mentioned.
  • the barley of the progeny line obtained in this way does not require further selection because the genotype of the polymorphic marker matches the genotype of the base sequence described in SEQ ID NO: 7. That is, the barley of the progeny line obtained in this way is a barley variety having high ear germination, low seed dormancy, and higher malt KI value.
  • a progeny line of barley that can be obtained by crossing barley selected as (ii) is provided.
  • the barley of the progeny line obtained in this way does not require further selection because the genotype of the polymorphic marker matches the genotype of the base sequence described in SEQ ID NO: 5 or 6. That is, the barley of the progeny line obtained in this way is a barley variety having low ear germination, strong seed dormancy, and a lower malt KI value.
  • Other embodiment of this invention is a malt manufacturing method provided with the malting process of obtaining malt using (i) type barley or (ii) type barley.
  • the malting step is a step of obtaining malt characterized by using (i) type barley or (ii) type barley, and a known method of barley making can be used. Specifically, for example, after malting until the degree of soaking reaches 40% to 45%, germination can be performed at 10 to 20 ° C. for 3 to 6 days and dried to obtain malt.
  • type (i) barley has low seed dormancy and a high malt KI value, so that the time for soaking and the number of germination days can be shortened, and the cost of malt production and the reduction of CO 2 emissions can be achieved.
  • type barley or (ii) type barley can be used as a barley raw material in a method for producing a malt fermented beverage comprising at least a preparation step and a fermentation step.
  • type barley used here includes both barley itself and malt obtained by the above-described malt production method. The same applies to (ii) type barley.
  • the above charging step is a step of saccharifying malt to obtain wort. Specifically, a raw material containing malt and water for charging are mixed, and the resulting mixture is heated to saccharify the malt, and wort is collected from the saccharified malt.
  • the malt used in this step is one obtained by germinating barley with moisture and air and drying to remove radicles.
  • Malt is an enzyme source necessary for wort production and at the same time, a major starch source as a raw material for saccharification.
  • auxiliary raw materials such as barley, corn starch, corn grits, rice and sugars may be added.
  • malt extract prepared from (i) type barley, (ii) type barley or general barley, a barley decomposition product, and a barley processed product can also be used as a part of raw material.
  • the water for charging is not particularly limited, and water suitable for the malt alcoholic beverage to be produced may be used.
  • the saccharification conditions are not particularly limited, and may be performed under general conditions. After filtering the malted saccharified solution thus obtained, a raw material that can impart aroma, bitterness, etc., such as hops or herbs, is added and boiled, and cooled to obtain cold wort.
  • the above fermentation process is a process of adding yeast to the cold wort obtained in the preparation process and fermenting it to obtain a malt fermented beverage.
  • yeast used here include Saccharomyces patrianus, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces ubalum and the like.
  • the malt fermented beverage is not particularly limited in the proportion of malt used in its production, and may be any beverage that is produced by fermentation using malt as a part of the raw material. Specifically, for example, beer and sparkling liquor, so-called non-alcohol beer can be mentioned.
  • kits of the present invention include an oligonucleotide primer pair consisting of the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 and a kit containing this oligonucleotide primer pair.
  • the kit may further contain a restriction enzyme.
  • you may further include the kit for extracting DNA from the structure
  • Example 1 Seed dormancy, ear germination and malt KI
  • 42 varieties and lines of barley seeds produced by Sapporo Beer Kizaki field were used (seeding in 2008, harvested in 2009).
  • Seed dormancy was evaluated based on the dormancy index determined by the following method.
  • Ear germination was evaluated by the method described below. Similar to seed dormancy, 5 ears were sampled as a set in the field and dried at 35 ° C. for 24 hours using a seed dryer. The dried ears were immersed in running water filled in a plastic container in that state and allowed to absorb water for 14 hours, and then held in an artificial weather chamber at 18 ° C. and 100% humidification for 3 days. The total number of grains and the number of germinated grains were counted for each ear to determine the germination rate, and the average value of 5 ears was calculated. Based on the average germination rate, scoring was performed according to the criteria shown in Table 1. The larger the ear germination score (0 to 6), the higher the ear germination.
  • the malt KI was obtained from the malting data of Sapporo Beer Kizaki field (2004, 2005, 2006, 2008).
  • the micro malting was performed under conditions of 43.5% degree of soaking, germination temperature of 15 ° C., and germination days of 6 days.
  • the malt KI was analyzed by an analysis method based on the European Brewing Convention (EBC) standard method (European Brewing Convention, Analytica, 1987).
  • EBC European Brewing Convention
  • Table 2 shows the malt KI for four years from 2004 to 2008 (excluding 2007).
  • the varieties and lines with weak seed dormancy described above tended to show a relatively high KI, although there were variations depending on the year of production.
  • PCR was performed by setting the annealing temperature to 50 ° C. using primer A1 (SEQ ID NO: 1) and primer A2 (SEQ ID NO: 2) designed based on the 5 ′ end and 3 ′ end base sequence information of RFLP marker ABG314. It was.
  • primer A1 SEQ ID NO: 1
  • primer A2 SEQ ID NO: 2
  • FIG. 2 PCR products 1 to 5 lanes.
  • this PCR product was treated with various restriction enzymes, when it was treated with the restriction enzyme AluI, a band pattern of about 400 bp (lane 4 and lane 5 only in the band pattern of 1 to 5 lanes after Alu treatment in FIG. 2 ( In FIG.
  • ABG314 a band surrounded by a square was detected, and polymorphism was observed between Mikamo Golden and Harrington (FIG. 2). This suggests that the genotype of ABG314 can be determined by PCR using primers A1 and A2 and treatment of the PCR product with the restriction enzyme AluI.
  • the DNA size is the same as that of ABG314, but another similar DNA fragment other than ABG314 is amplified, and the intensity of the band It was suggested that the non-target DNA fragment was preferentially amplified. This necessitated the design of an appropriate primer that only ABG314 amplifies. Therefore, the base sequence of the non-target DNA fragment amplified by PCR at the high annealing temperature using primers A1 and A2 is compared with the base sequence of the ABG314 clone, and a place where polymorphism is found between these two base sequences. It was decided to design as a primer.
  • Fig. 3 Since the purpose was only to design useful primers, only partial sequences on the 5 'side and 3' side were analyzed (Fig. 3). In FIG. 3, the portion indicated by the wavy line has not been analyzed for the base sequence. Further, the sequences of the primers A1 and A2 are not shown. “ABG” indicates the base sequence of ABG314, and “4 kb” indicates the base sequence of another similar DNA fragment other than ABG314. The base sequence surrounded by a square corresponds to the base sequence that the primers B1 and B2 anneal.
  • agarose gel electrophoresis of the PCR product was performed, the appeared band was excised, the DNA fragment was purified with QIAquick Gel Extraction kit (QIAGEN, cat. No. 28706), and the base of this DNA fragment was then obtained. The sequence was determined. Base sequence analysis was performed by consignment analysis to Sigma.
  • a base sequence of about 20 bp at each of the 5 'and 3' ends of ABG314 is published in the database of Grain Genes (http://wheat.pw.usda.gov/GG2/index.shtml).
  • Primers A1 and A2 were designed based on this nucleotide sequence information.
  • Primers B1 (SEQ ID NO: 3) and B2 (SEQ ID NO: 4) were designed based on ABG314 internal nucleotide sequence information revealed for the first time in the present invention. These primer sequences are as shown below.
  • Primer A1 5′-TGCCCTTTACTCTTGTGATT-3 ′ (SEQ ID NO: 1)
  • Primer A2 5′-CATCGAAAAGGTTATTCTTAT-3 ′
  • Primer B1 5′-GGAGCATAAAGGAAAATTATTATCCTCA-3 ′
  • Primer B2 5′-CACAACCCTTCCTTATTTGACC-3 ′ (SEQ ID NO: 4)
  • the PCR reaction using primers B1 and B2 is a cycle consisting of a denaturation step at 94 ° C. for 1 minute, an annealing step at 62.5 ° C. for 1 minute, and an extension step at 72 ° C. for 5 minutes. After repeating, it was performed under the condition that an extension step was performed at 70 ° C. for 5 minutes.
  • Example 3 Variety polymorphism analysis of ABG314 internal sequence and CAPS marker construction
  • group 1 cultivars and lines with low seed dormancy and high malt KI have Harlington
  • Mikamo Golden and Girdner were selected, the DNA of ABG314 was amplified with primers B1 and B2, and the respective base sequences were analyzed (FIG. 4).
  • the determined nucleotide sequences are shown in SEQ ID NO: 5 for Mikamo Golden, SEQ ID NO: 6 for Gaidner, and SEQ ID NO: 7 for Harrington.
  • base sequence polymorphisms were confirmed at 72 locations among the three varieties within the analyzed 2520 bp sequence (FIG. 4).
  • the 110th position of SEQ ID NO: 5 is the nucleotide polymorphism (polymorphic marker A) in which the base sequence of Harrington (Group 1) is different from the base sequence of Mikamo Golden and Gairdner (Group 2) , 962nd, 1027th, 1374th, 1415th, 1971st, 2348-2349th, and 2483-2485th bases were confirmed.
  • the base sequence of Harrington (Group 1), the base sequence of Gairdner (Group 2), and the base sequence of Mikamo Golden (Group 2) are all different (polymorphic marker A ) Corresponding to the 877th base of SEQ ID NO: 5 was confirmed.
  • the base sequence of Harrington (Group 1) and the base sequence of Mikamo Golden (Group 2) are identical, and the base sequence polymorphism is different from the base sequence of Gairdner (Group 2) ( Polymorphic marker B) corresponding to nucleotides 588, 639, 675, 826, 927, 1025, 1265, 1269, 1611, 1943, 2150 of SEQ ID NO: 5 was confirmed.
  • the base sequence of Harrington (Group 1) and the base sequence of Gairdner (Group 2) are identical, and the base polymorphism is different from the base sequence of Mikamo Golden (Group 2) ( As polymorphic markers C), 54th, 106-109th, 197th, 205th, 253rd, 256-263th, 309th, 383th, 559th, 611th, 715th, 800 of SEQ ID NO: 5 815, 865, 897, 905, 929, 935, 976, 982, 988, 990, 995, 1023, 1032, 1041, 1065, 1067-1068 , 1285th, 1409th, 1430th, 1452th, 15th 3rd, 1538th, 1552th, 1573th, 1631st, 1637th, 1700th, 1729th, 1742th, 1842th, 1911th, 1959th, 1992th, 2011th, 2020th, 2050th, 2068th , 2080
  • polymorphic markers A there are nine polymorphic markers A, and by using at least one of them, it can be classified into groups 1 and 2 in one step. Further, the polymorphic marker B and the polymorphic marker C are present at 11 places and 52 places, respectively, using at least one of the polymorphic markers B and using at least one of the polymorphic markers C. Thus, it can be classified into groups 1 and 2.
  • the recognition sequence for the restriction enzyme ClaI was included in the one corresponding to the 1027th base of SEQ ID NO: 5.
  • a total of three ClaI recognition sequences (ATCGAT) were present in the base sequence of FIG. 4 (ClaI (1), ClaI (2), ClaI (3)).
  • base polymorphism exists in ClaI (2) (the 1027th and the 1032nd in SEQ ID NO: 5). Due to this nucleotide polymorphism, the base sequence of Gairdner was GTCGAT, the base sequence of Mikamo Golden was GTCGAC, and both lacked the recognition sequence of ClaI (Table 3).
  • the above base polymorphism did not exist in two places (ClaI (1), ClaI (3)).
  • the ClaI-treated DNA fragment is expected to detect a band at about 1300 and 900 bp in group 1, while a single band is detected at about 2200 bp in group 2 and may be used as a CAPS marker. It was.
  • PCR was performed on the seven varieties of barley using primers B1 and B2, the PCR product was treated with ClaI, and electrophoresis was performed. As a result, an expected band pattern was obtained and barley showing a Harrington type electrophoresis pattern. It was possible to classify the genotype of ABG314 into varieties and barley varieties exhibiting the Migamo Golden type (FIG. 5).
  • Example 4 Relationship between ABG314 genotype and seed dormancy, ear germination and malt KI
  • the genotypes of ABG314 of 42 varieties / lines in FIG. 1 were discriminated using the above-mentioned CAPS markers, and classified into Harrington type and Mikamo golden type (Gairdner type).
  • seed dormancy germination rate after 72 hours, dormancy index
  • ear germination ear germination score
  • average value of malt KI were compared.
  • the results of comparing the average values of malt KI of barley produced in 2004, 2005, 2006 and 2008 are shown in FIGS. 6 (a), (b), (c) and (d), respectively.
  • FIG. 7 (a) the result of comparing the germination rate after 72 hours is shown in FIG. 7 (a)
  • the result of comparing the dormancy index is shown in FIG. 7 (b)
  • the result of comparing the ear germination score is shown in FIG. 7 (c). .
  • this CAPS marker is very important in estimating the degree of seed dormancy, that is, whether or not it has a certain ear germination resistance, and the degree of malt KI.
  • ear germination due to rainfall during the harvest season has become a problem in recent years. For this reason, it is important to introduce the ear germination resistance gene into a new variety and improve the added value of the variety.
  • the examination of ear germination takes time, and it is not realistic to check a large amount of breeding materials in detail.
  • the use of this marker in the barley breeding selection process is expected to reduce costs, improve certainty for testing at the DNA level, and increase the added value of developed varieties.

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Abstract

本発明は、多型マーカーＡ（多重整列した際に、配列番号７の塩基と、対応する配列番号５／６の塩基とが異なる部位）、多型マーカーＢ（配列番号６の塩基と、対応する配列番号５／７の塩基配列とが異なる部位）、多型マーカーＣ（配列番号５の塩基と、対応する配列番号６／７の塩基配列とが異なる部位）に基づく被検大麦の選別方法であって、前記被検大麦のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号３／４の塩基配列からなるプライマー対を用いたポリメラーゼ連鎖反応によって得られる増幅ＤＮＡ断片を用いて、前記多型マーカーＡに基づいて遺伝子型を決定するか、前記多型マーカーＢ／Ｃに基づいて遺伝子型を決定し、（ｉ）該決定した遺伝子型が配列番号７に記載の塩基配列の遺伝子型と一致する被検大麦、又は、（ｉｉ）該決定した遺伝子型が配列番号５又は配列番号６に記載の塩基配列の遺伝子型と一致する被検大麦、を選別する被検大麦の選別方法を提供する。

Description

大麦の選別方法、麦芽及び麦芽発酵飲料
　本発明は、大麦の選別方法、麦芽及び麦芽発酵飲料に関する。
　大麦は収穫前の低温、降雨などの影響により、穂の状態で発芽することがあり、この現象は穂発芽と呼ばれている。穂発芽が起こると、種子貯蔵物質であるでんぷんやタンパク質が分解され、更に発芽率が低下する（非特許文献１）。このため穂発芽が起きた大麦は、製麦用として採用されないことがあり、穂発芽は農家にとって最も重要な問題の一つである。穂発芽性は種子休眠性と密接な関係がある。種子休眠性は、発芽に好適な条件下でも、種子が発芽しない性質であり、大麦品種間差が存在することが知られている。
　これまでに種子休眠性に関しては様々な遺伝解析が行われており、北海道系譜系統の分析では、５Ｈ染色体長腕部末端のＲｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　Ｆｒａｇｍｅｎｔ　Ｌｅｎｇｔｈ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ（ＲＦＬＰ）マーカーＡＢＧ３１４と種子休眠性との関係が示唆されている（非特許文献２）。また、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ／Ｍｏｒｅｘ、Ｃｈｅｖｒｏｎ／Ｓｔａｎｄｅｒ、Ｓｔｅｐｔｏｅ／Ｍｏｒｅｘ、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ／ＴＲ３０６、Ｔｒｉｕｍｐｈ／Ｍｏｒｅｘ、Ｃｈｅｖｅｃ／Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎの各集団を用いた種子休眠性の量的形質遺伝子座（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　Ｔｒａｉｔ　Ｌｏｃｕｓ；ＱＴＬ）解析により、解析に用いた集団により差はあるものの、いずれの集団の場合でも５Ｈ長腕末端付近に高い寄与率（１５－７１％）で統計的に有意なＱＴＬが検出されている（非特許文献３－７）。さらに、５Ｈ長腕末端付近以外にも集団によっては５Ｈセントロメア付近、４Ｈ、７Ｈ、１Ｈ、２ＨにもＱＴＬが検出されている（非特許文献３－７）。
　一方、麦芽のＫｏｌｂａｃｈ　Ｉｎｄｅｘ（ＫＩ）は、麦芽全窒素含有量に占める可溶性窒素分の割合を示す値であり、麦芽中の窒素成分や糖がどの程度分解され、可溶化、低分子化されているかを評価する上で最も重要な指標の一つである。ＫＩの値が低すぎると麦汁の窒素分が不足し、発酵に大きく影響する。一方、ＫＩが高すぎるとビールを醸造したときの味のバランス等に影響する。このため麦芽のＫＩは適当な値の範囲内でなければならない。麦芽のＫＩは製麦時の浸麦度や発芽時間等の製麦条件で制御されるが、同一の条件で製麦しても、大麦品種間によってＫＩの値が異なることが知られている。
　ミカモゴールデン－Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎの倍化半数体系統を用いた麦芽ＫＩのＱＴＬ解析により、前述のＲＦＬＰマーカーＡＢＧ３１４に統計的に有意なＱＴＬが検出されたことが報告されている（非特許文献８）。さらに、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ／ＴＲ３０６、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ／Ｍｏｒｅｘの集団を用いた麦芽ＫＩのＱＴＬ解析により５Ｈ染色体にＱＴＬが検出されている（非特許文献９、１０）。
　大麦に限らず様々な作物においてＤＮＡ多型やタンパク質含量を指標とした分子選抜技術が進歩している。分子選抜技術の中でもＤＮＡマーカーによる選抜は、育種初期世代での選抜が可能であること、操作性に優れること、育種後代に進める種子を使用せず葉で種子の形質の解析が可能なことなどの理由から盛んに研究開発が進められている。ＤＮＡマーカーを利用した選抜方法として、ＲＦＬＰ法、Ｃｌｅａｖｅｄ　Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ法（ＣＡＰＳ法）など、様々な方法が知られている。
Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｂｒｅｗ．Ｃｈｅｍ．，（１９９４）５２：７６－８３頁． 育種学研究（２００７）９（別冊１号）１８７頁． Ｃｒｏｐ　Ｓｃｉ．，（２００９）４９：８４１－８４９頁． Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｔ．，（１９９６）９２：８７－９１頁． Ｉｎ：Ｋ．Ｎｏｄａ　ａｎｄ　Ｄ．Ｊ．Ｍａｒｅｓ（ｅｄ．）Ｐｒｏｃ．Ｏｆ　ｔｈｅ　７ｔｈ　Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．Ｏｎ　Ｐｒｅ－ｈａｒｖｅｓｔ　Ｓｐｒｏｕｔｉｎｇ　ｉｎ　Ｃｅｒｅａｌｓ．Ｃｅｎｔ．Ａｃａｄ．Ｓｏｃ．　Ｊａｐａｎ，Ｏｓａｋａ．，（１９９６）２０５－２１２頁． Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｔ．，（２００４）１０９：６２－７０頁． Ａｕｓｔ．Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｒｅｓ．，（２００３）５４：１３０３－１３１３頁． Ｍａｔｅｒ　Ｂｒｅｗ．Ａｓｓｏｃ．Ａｍｅｒ．Ｔｅｃｈ．Ｑ．，（２００６）４３：９－１４頁． Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｔ．，（２０００）１０１：１７３－１８４頁． Ｃｒｏｐ　Ｓｃｉ．，（１９９７）３７：５４４－５５４頁．
　種子休眠性及び麦芽ＫＩに関して、これまでにＲＦＬＰ法で利用可能なＤＮＡマーカーとして、非特許文献２及び８に記載されたＡＢＧ３１４がＲＦＬＰマーカー化されている。しかしながら、このＲＦＬＰマーカーはゲノムＤＮＡの制限酵素切断とサザンハイブリダイゼーションをもとにした検出法であり、作業が煩雑で、遺伝子型を判別するのに多大な時間を要し、更に多検体を処理するには不向きな方法であった。このため、サンプル処理点数に制限があり、処理に多大な時間を要していたため、育種の現場で用いることは困難であった。
　ゲノムＤＮＡを鋳型としたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅ＤＮＡ断片を得て、その増幅ＤＮＡ断片に含まれるＤＮＡマーカーを検出する方法は、同時に処理できる検体数を増やすことができ、かつ簡易な操作で短時間に検出が可能であるため、大麦育種の現場で用いるには有利である。特に、ＣＡＰＳ法は葉から抽出したＤＮＡを鋳型としたＰＣＲとそのＰＣＲ産物の制限酵素切断、及び電気泳動のみで遺伝子型を判定できる点で優れており、ＣＡＰＳマーカーの構築が望まれる。
　上述のＲＦＬＰマーカーＡＢＧ３１４領域は、公知の塩基配列情報に基づいて構築したオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲによって増幅した増幅ＤＮＡ断片をＤＮＡマーカーの検出に用いることが困難であった。これは、ＡＢＧ３１４と塩基配列が非常に類似したゲノムＤＮＡ領域が存在するため、標的領域とともに非標的領域もＰＣＲにより増幅されてしまうことが原因であった。また、穂発芽性、種子休眠性及び麦芽ＫＩについて大麦育種現場への応用に有効なＤＮＡマーカーはこれまでに報告されていない。
　そこで本発明は、穂発芽性、種子休眠性及び麦芽ＫＩに基づいて被検大麦を選別することができ、かつ作業が容易で、多検体を短時間で処理することができ、大麦育種現場への応用に適した被検大麦の選別方法の提供を目的とする。
　本発明は更に、穂発芽性、種子休眠性及び麦芽ＫＩに基づいて選別した大麦を用いた麦芽及びその製造方法並びに麦芽発酵飲料及びその製造方法の提供を目的とする。
　本発明は、配列番号５、配列番号６及び配列番号７に記載の塩基配列を多重整列（マルチプルアラインメント）することによって特定される多型マーカーに基づく被検大麦の選別方法であって、
　多重整列した際に、
　配列番号７に記載の塩基配列と、対応する配列番号５及び配列番号６に記載の塩基配列とが異なる塩基配列部位を多型マーカーＡ、
　配列番号６に記載の塩基配列と、対応する配列番号５及び配列番号７に記載の塩基配列とが異なる塩基配列部位を多型マーカーＢ、
　配列番号５に記載の塩基配列と、対応する配列番号６及び配列番号７に記載の塩基配列とが異なる塩基配列部位を多型マーカーＣとし、
　上記被検大麦のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号３及び配列番号４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー対を用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって得られる増幅ＤＮＡ断片を用いて、少なくとも１つの上記多型マーカーＡに基づいて遺伝子型を決定するか、又は少なくとも１つの上記多型マーカーＢ及び少なくとも１つの上記多型マーカーＣに基づいて遺伝子型を決定し、
　（ｉ）決定した遺伝子型が、配列番号７に記載の塩基配列の遺伝子型と一致する被検大麦、又は、
　（ｉｉ）決定した遺伝子型が、配列番号５又は配列番号６に記載の塩基配列の遺伝子型と一致する被検大麦、を選別する被検大麦の選別方法を提供する。
　上述の選別方法において、（ｉ）の被検大麦を選別することによって、穂発芽性が高く、種子休眠性が弱く、かつ麦芽ＫＩ値がより高い被検大麦を得ることができる。一方、（ｉｉ）の被検大麦を選別することにより、穂発芽性が低く、種子休眠性が強く、かつ麦芽ＫＩがより低い被検大麦を得ることができる。上記選別方法は、ＰＣＲ法により増幅したゲノムＤＮＡを用いて多型を検出することに基づくため、選別にかかる労力が大幅に低減できる。また、作業が容易で、多検体を短時間で処理することができる。また、本発明の被検大麦の選別方法によれば、大麦育種の初期段階で穂発芽性、種子休眠性及び麦芽ＫＩに基づいて被検大麦を信頼性よく選別することができる。
　ＡＢＧ３１４には、塩基配列が非常に類似したゲノムＤＮＡ領域が存在しているため、公知の塩基配列情報に基づいて構築したオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲにより増幅ＤＮＡ断片を得ることが困難であった。本発明は、その類似したゲノムＤＮＡ領域を実質的に増幅することなく、ＡＢＧ３１４のみを特異的にＰＣＲで増幅可能なオリゴヌクレオチドプライマー対を設計し、このオリゴヌクレオチドプライマー対を用いることで、ＡＢＧ３１４の内部配列における大麦品種間多型を明らかにし、その大麦品種間多型と穂発芽性、種子休眠性及び麦芽ＫＩとの間に統計的に有意な関係があることを見出したことによるものである。
　上記被検大麦の選別方法においては、上記増幅ＤＮＡ断片を制限酵素ＣｌａＩにより消化して得られる切断断片の数又はサイズを検出することにより遺伝子型を決定することが好ましい。
　上記増幅ＤＮＡ断片中には、配列番号７に記載の塩基配列のみに制限酵素ＣｌａＩによる認識配列を形成する多型マーカーＡが存在するため、上記増幅ＤＮＡ断片を制限酵素ＣｌａＩによって消化することにより、切断断片の数又はサイズの違いによって、その多型マーカーＡの遺伝子型を決定することができる。これにより、ＰＣＲ増幅、ＰＣＲ産物の制限酵素消化、切断断片の数やサイズの検出といった本技術分野において汎用されている手法のみによって上記選別が可能となるため、選別にかかる労力が更に低減できる。また、作業がより容易で、より多検体をより短時間で処理することができる。
　本発明はまた、上記被検大麦の選別方法において（ｉ）として選別された大麦同士を交配すること又は（ｉｉ）として選別された大麦同士を交配することにより得ることのできる交配後代系統の大麦を提供する。
　上記被検大麦の選別方法において（ｉ）として選別された大麦同士を交配することにより、上記多型マーカーの遺伝子型が配列番号７に記載の塩基配列の遺伝子型と一致する交配後代系統の大麦を得ることができる。したがって、このようにして得られた交配後代系統の大麦は、穂発芽性が高く、種子休眠性が弱く、かつ麦芽ＫＩ値が高いという特性を有する。同様に、上記被検大麦の選別方法において（ｉｉ）として選別された大麦同士を交配することにより、上記多型マーカーの遺伝子型が配列番号５又は配列番号６に記載の塩基配列の遺伝子型と一致する交配後代系統の大麦を得ることができる。このようにして得られた交配後代系統の大麦は、穂発芽性が低く、種子休眠性が強く、かつ麦芽ＫＩが低いという特性を有する。また、収穫前の低温、降雨などの影響により、穂の状態で発芽しにくく、種子貯蔵物質であるでんぷんやタンパク質の分解が生じにくいため、製麦用大麦としての栽培効率を向上させることができる。
　本発明は、上記選別方法において（ｉ）として選別された大麦又は（ｉ）として選別された大麦同士を交配することにより得ることのできる交配後代系統の大麦（以下、まとめて「（ｉ）型大麦」ともいう。）を用いて麦芽を得る製麦工程を備える麦芽製造方法を提供する。（ｉ）型大麦は、種子休眠性が弱く、かつ麦芽ＫＩ値が高いため、浸麦時間や発芽日数を短縮しても一定の品質を維持できる。したがって、麦芽製造コストの低減及びＣＯ２排出量の削減が可能である。
　本発明は、上記選別方法において（ｉｉ）として選別された大麦又は（ｉｉ）として選別された大麦同士を交配することにより得ることのできる交配後代系統の大麦（以下、まとめて「（ｉｉ）型大麦」ともいう。）を用いて麦芽を得る製麦工程を備える麦芽製造方法を提供する。
　本発明はまた、上記いずれかの麦芽製造方法により得ることのできる麦芽を提供する。（ｉ）型大麦は麦芽ＫＩが高い傾向にあり、一方、（ｉｉ）型大麦は麦芽ＫＩが低い傾向にある。麦芽ＫＩは、製麦工程中にタンパク質や糖などがどの程度可溶化、低分子化されたかを示す指標の一つであり、麦芽ＫＩの異なる麦芽を原料とする麦芽発酵飲料は、それぞれ異なる風味を呈する。したがって、上記麦芽を適切に用いることにより、麦芽発酵飲料の風味を制御することができる。
　本発明は、仕込工程と、発酵工程とを少なくとも備える麦芽発酵飲料の製造方法であって、上記仕込工程で用いる大麦原料が、（ｉ）型大麦又は（ｉ）型大麦から得ることのできる麦芽である、麦芽発酵飲料の製造方法を提供する。（ｉ）型大麦は麦芽ＫＩ値が高いため、仕込時間を短くしてもアルコール発酵に必要な成分を抽出できる。したがって、仕込時間を短縮することができ、麦芽発酵飲料の製造コストの低減及びＣＯ２排出量の削減が可能である。
　本発明は、仕込工程と、発酵工程とを少なくとも備える麦芽発酵飲料の製造方法であって、上記仕込工程で用いる大麦原料が、（ｉｉ）型大麦又は（ｉｉ）型大麦から得ることのできる麦芽である、麦芽発酵飲料の製造方法を提供する。
　本発明はまた、上記いずれかの麦芽発酵飲料の製造方法で得ることのできる麦芽発酵飲料を提供する。（ｉ）型大麦は麦芽ＫＩが高く、一方、（ｉｉ）型大麦は麦芽ＫＩが低いため、（ｉ）型大麦を原料とした麦芽発酵飲料及び（ｉｉ）型大麦を原料とした麦芽発酵飲料はそれぞれ異なる風味の麦芽発酵飲料とすることができ、消費者のニーズに合わせた麦芽発酵飲料の提供が可能となる。
　本発明は、配列番号３及び配列番号４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー対を提供する。上記オリゴヌクレオチドプライマー対は、被検大麦のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにおいて、標的領域を特異的に増幅することができる。これにより、増幅ＤＮＡ断片を用いた多型マーカーの遺伝子型の検出が可能となる。
　従来の麦芽ＫＩに関するＤＮＡマーカーはＲＦＬＰ法によるものであり、遺伝子型を判定するのに煩雑な操作と多大な時間を要していたが、本発明の選別方法では簡易ＤＮＡ抽出、ＰＣＲ、制限酵素処理、電気泳動といった基本的かつ比較的容易な操作のみで遺伝子型を判別することができ、多点数を短時間で処理することが可能である。
　また、本発明の選別方法によれば、穂発芽性、種子休眠性及び麦芽ＫＩに基づいて被検大麦を選別することができ、かつ作業が容易で、多検体を短時間で処理することができ、大麦育種の初期段階で信頼性よく被検大麦種の選別ができる。したがって、大麦育種現場への応用に適している。
大麦品種の休眠指数（％）、７２時間後発芽率（％）、穂発芽性スコアを示すグラフである。 制限酵素ＡｌｕＩによる多型検出例を示す写真である。 ＡＢＧ３１４領域の塩基配列（ＡＢＧ）とＡＢＧ３１４領域と類似した非標的ゲノムＤＮＡ塩基配列の多重整列結果を示す図である。 Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ、ミカモゴールデン、ＧａｉｒｄｎｅｒのＡＢＧ３１４領域の塩基配列を多重整列した結果を示す図である。 制限酵素ＣｌａＩによる多型検出例を示す写真である。 本発明の選別方法により選別した大麦の（ａ）２００４年度産の麦芽ＫＩ、（ｂ）２００５年度産の麦芽ＫＩ、（ｃ）２００６年度産の麦芽ＫＩ、（ｄ）２００８年度産の麦芽ＫＩの平均値を比較した結果を示すグラフである。 本発明の選別方法により選別した大麦の（ａ）７２時間後発芽率、（ｂ）休眠指数、（ｃ）穂発芽性スコアの平均値を比較した結果を示すグラフである。
　本発明は、穂発芽特性、種子休眠特性及び麦芽ＫＩ特性により大麦を選別するための選別方法を提供する。上記選別方法では、配列番号５、配列番号６及び配列番号７に記載の塩基配列を多重整列することによって多型マーカーを特定し、多型マーカーの遺伝子型に基づいて被検大麦を選別する。
　配列番号５、配列番号６及び配列番号７に記載の塩基配列を多重整列した際に、配列番号７に記載の塩基配列と対応する配列番号５及び配列番号６に記載の塩基配列とが異なる塩基配列部位を多型マーカーＡ、配列番号６に記載の塩基配列と対応する配列番号５及び配列番号７に記載の塩基配列とが異なる塩基配列部位を多型マーカーＢ、配列番号５に記載の塩基配列と対応する配列番号６及び配列番号７に記載の塩基配列とが異なる塩基配列部位を多型マーカーＣとして得る。配列番号５、６及び７に記載の塩基配列は、それぞれ大麦ミカモゴールデン種、Ｇａｉｒｄｎｅｒ種及びＨａｒｒｉｎｇｔｏｎ種に由来するゲノムＤＮＡ配列である。
　本明細書において多重整列（マルチプルアラインメント）とは、複数の塩基配列を相互に比較可能なものにするため、対応する塩基配列部分が並ぶよう、適宜空白（ギャップ）を入れて塩基配列を整列したものをいう。塩基配列が２つの場合にも、多重整列という。多重整列にあたっては、公知の多重整列作成プログラムを利用することができる。例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ　Ｗ、Ｃｌｕｓｔａｌ　Ｘなどを好適に利用可能である。
　多重整列により、複数の塩基配列相互に塩基配列が一致しない塩基配列部位を特定することができる。特定された塩基配列部位を、多型マーカーとして利用することができる。なお、多重整列を最適化するために導入されるギャップ部分については、本発明においては塩基配列が一致しない塩基配列部位、すなわち多型マーカーとして特定する。なお、本明細書において、例えば、配列番号５の第５８８番目の塩基に対応する塩基とは、多重整列した際に、配列番号５の第５８８番目の塩基の列に整列される又は整列できることをいう。
　被検大麦における上記多型マーカーの遺伝子型の決定は、被検大麦のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号３及び配列番号４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー対を用いたＰＣＲによって得られる増幅ＤＮＡ断片を用いて行う。
　被検大麦からのＤＮＡの抽出方法は、ＣＴＡＢ法など、植物の組織からのＤＮＡ抽出に常用される方法であれば好適に利用可能である。また、市販されているＤＮＡ抽出用キット類も好適に使用可能である。一方、ＤＮＡは被検大麦の葉、茎、根、種子等の部位から抽出されてもよいが、育種段階での選別を考慮すれば、葉から抽出するのが好ましい。葉から抽出することにより、早い段階で望ましい形質を有する大麦を選別することができる。
　配列番号３及び配列番号４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー対を用いた被検大麦のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲには、大麦から上述のとおり抽出されたＤＮＡを鋳型として用いることができる。ＰＣＲに用いる耐熱性ポリメラーゼとしては、市販の耐熱性ポリメラーゼを適宜選択して使用することができる。例えば、Ｐｒｅｍｉｘ　Ｔａｑ、Ｅｘ　Ｔａｑ　ｖｅｒｓｉｏｎ　２．０（ＴＡＫＡＲＡバイオ）を好ましく用いることができる。また、アニーリング温度は６０．０～６５．０℃とするのが好ましく、例えば、６２．５℃とすることができる。アニーリング範囲をこの範囲に設定することにより、非標的領域の増幅をより効率よく抑えることができる。
　上記ＰＣＲにより増幅された増幅ＤＮＡ断片を用いて、少なくとも１つの多型マーカーＡに基づいて遺伝子型を決定する。あるいは、多型マーカーＢ及び多型マーカーＣのそれぞれ少なくとも１つに基づいて遺伝子型を決定してもよい。決定した遺伝子型により、被検大麦を穂発芽特性、種子休眠特性及び麦芽ＫＩ特性により選別することができる。
　被検大麦における上記多型マーカーに基づく遺伝子型の決定は、例えば、多型マーカーとなる塩基配列部位の塩基配列を判別することにより行うことができる。例えば、シークエンス解析により塩基配列を解読して判別すること、制限酵素認識配列の有無によって塩基配列を判別すること、完全マッチプローブやミスマッチプローブを利用したハイブリダイゼーションにより塩基配列を判別することなどにより行うことができる。
　上記遺伝子型の決定を、認識配列中に上記多型マーカーを含む１種又は２種以上の制限酵素で、上記増幅ＤＮＡ断片を消化し、得られる切断断片の数又はサイズを検出することによって行うこともできる。
　制限酵素の認識配列中に上記多型マーカーが含まれる場合、制限酵素によるポリヌクレオチドの切断が生じるか否かで遺伝子型を同定することができる。制限酵素によるポリヌクレオチドの切断が生じるか否かは、制限酵素で消化したポリヌクレオチドをサイズ分画することにより、断片の数又はサイズから判断することができる。
　制限酵素による消化反応は、各制限酵素に至適な緩衝液を用い、至適な反応温度において実施することができる。また、制限酵素消化後の断片をサイズ分画して検出する方法としては、当業者に常用されるアガロースゲル電気泳動を好適に採用することができる。また、公知の適切なカラムを用いたＨＰＬＣ法により、断片をサイズ分画して検出することもできる。
　配列番号３及び配列番号４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー対を用いたＰＣＲにより増幅される増幅ＤＮＡ断片においては、認識配列中に上記多型マーカーが含まれる制限酵素の具体例として、ＣｌａＩ、ＡｖａＩ等が挙げられる。
　決定した遺伝子型をもとに、（ｉ）決定した遺伝子型が、配列番号７に記載の塩基配列の遺伝子型と一致する被検大麦、を選別することにより、穂発芽性が高く、種子休眠性が弱く、かつ麦芽ＫＩ値がより高い被検大麦を得ることができる。一方、（ｉｉ）決定した遺伝子型が、配列番号５又は配列番号６に記載の塩基配列の遺伝子型と一致する被検大麦、を選別することにより、穂発芽性が低く、種子休眠性が強く、かつ麦芽ＫＩがより低い被検大麦を得ることができる。なお、上記（ｉ）の選別と（ｉｉ）の選別は、いずれか一方のみを実施してもよいし、両方を実施してもよい。
　本発明の一実施形態として、（ｉ）として選別した大麦同士を交配して得ることのできる交配後代系統の大麦が挙げられる。このようにして得られる交配後代系統の大麦は、多型マーカーの遺伝子型が配列番号７に記載の塩基配列の遺伝子型と一致するため、更なる選別を必要としない。すなわち、このようにして得られる交配後代系統の大麦は、穂発芽性が高く、種子休眠性が弱く、かつ麦芽ＫＩ値がより高い大麦種である。
　同様に、（ｉｉ）として選別した大麦同士を交配して得ることのできる交配後代系統の大麦を提供する。このようにして得られる交配後代系統の大麦は、多型マーカーの遺伝子型が配列番号５又は６に記載の塩基配列の遺伝子型と一致するため、更なる選別を必要としない。すなわち、このようにして得られる交配後代系統の大麦は、穂発芽性が低く、種子休眠性が強く、かつ麦芽ＫＩ値がより低い大麦種である。
　本発明の他の実施形態は、（ｉ）型大麦又は（ｉｉ）型大麦を用いて麦芽を得る製麦工程を備える麦芽製造方法である。製麦工程は、（ｉ）型大麦又は（ｉｉ）型大麦を用いることを特徴とした麦芽を得る工程であり、公知の製麦の方法を利用することができる。具体的には、例えば、浸麦度が４０％～４５％に達するまで浸麦後、１０～２０℃で３～６日間発芽させ、焙燥して麦芽を得ることができる。
　一方、（ｉ）型大麦は、種子休眠性が弱く、麦芽ＫＩ値が高いため、浸麦時間、発芽日数を短縮することができ、麦芽製造コストの低減、ＣＯ２排出量の削減が図れる。
　上述した（ｉ）型大麦又は（ｉｉ）型大麦を、仕込工程及び発酵工程を少なくとも備える麦芽発酵飲料の製造方法において、大麦原料として使用することができる。ここで使用する（ｉ）型大麦とは、大麦そのもの及び上述の麦芽製造方法により得られた麦芽のいずれをも含む。（ｉｉ）型大麦についても同様である。
　上記仕込工程は、麦芽を糖化させて麦汁を得る工程である。具体的には、麦芽を含む原料と仕込用水とを混合し、得られた混合物を加温することにより麦芽を糖化させ、糖化された麦芽から麦汁を採取する。
　本工程において用いられる麦芽は、大麦に水分と空気を与えて発芽させ、乾燥して幼根を取り除いたものであることが望ましい。麦芽は麦汁製造に必要な酵素源であると同時に糖化の原料として主要なデンプン源となる。また、麦芽発酵飲料特有の香味と色素を与えるため発芽させた麦芽を焙燥したものを麦汁製造に用いる。また、更に原料の一部として、麦芽以外に、大麦、コーンスターチ、コーングリッツ、米、糖類等の副原料を添加しても良い。また、原料の一部として、（ｉ）型大麦、（ｉｉ）型大麦又は一般大麦より調製されたモルトエキスあるいは大麦分解物、大麦加工物を用いることもできる。
　上記仕込用水は特に制限されず、製造する麦芽アルコール飲料に応じて好適な水を用いればよい。また、糖化条件は特に限られず、一般的な条件で行えばよい。こうして得られた麦芽糖化液をろ過した後、ホップあるいはハーブなど、香り、苦味などを付与できる原料を添加して煮沸を行い、それを冷却することにより冷麦汁が得られる。
　上記発酵工程は、仕込工程で得られた冷麦汁に酵母を添加して発酵させ麦芽発酵飲料を得る工程である。ここで用いられる酵母は、例えば、サッカロミセス・パトリアヌス、サッカロミセス・セレビシェ、サッカロミセス・ウバルム等が挙げられる。
　麦芽発酵飲料は、その製造に用いられる麦芽の使用比率の多少は特に制限されず、麦芽を原料の一部として発酵により製造される飲料であればよい。具体的には、例えば、ビールや発泡酒、いわゆるノンアルコールビールが挙げられる。
　本発明の更なる実施形態として、配列番号３及び配列番号４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー対、並びにこのオリゴヌクレオチドプライマー対を含むキットが挙げられる。上記キットは、更に制限酵素を含むものであってよい。また、大麦の組織からＤＮＡを抽出するためのキットを更に包含していてもよい。
　以下、実施例をもとに本発明を具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
（実施例１：種子休眠性、穂発芽性及び麦芽ＫＩ）
　種子休眠性及び穂発芽性の評価には、サッポロビール社木崎圃場産の４２品種・系統の大麦種子を用いた（２００８年播種、２００９年収穫）。
　種子休眠性は、以下の方法によって求められる休眠指数に基づいて評価した。各品種の成熟期の穂を圃場でサンプリングし、種子乾燥器を用い、３５℃で乾燥させた（休眠打破処理）。産年度の生育条件により休眠の程度が異なるため、休眠打破処理時間は２４時間、１２０時間の２水準とした。乾燥後、休眠を保持するために－８０℃で冷凍保存し、全てのサンプルが揃った段階で評価試験を実施した。まず、シャーレにＮｏ．２ろ紙を２枚敷き、各品種の種子１００粒（ｎ＝２）をシャーレに取り、水道水４ｍｌを与え、２０℃暗所で保持した。７日間にわたり、２４時間ごとに各品種の発芽粒数を計数し、以下の計算式に従い休眠指数を算出した。休眠指数の値が大きいほど、種子休眠性が強いことを示す。
（休眠指数）（％）＝｛（２４時間後の未発芽率）＋（４８時間後の未発芽率）＋（７２時間後の未発芽率）＋（９６時間後の未発芽率）＋（１２０時間後の未発芽率）＋（１４４時間後の未発芽率）＋（１６８時間後の未発芽率）｝／７（測定回数）
　穂発芽性を、以下に記載する方法により評価した。種子休眠性と同様に成熟期の穂を圃場で５穂を一組としてサンプリングし、種子乾燥器を用い、３５℃で２４時間乾燥させた。乾燥させた穂を、その状態のまま、プラスチックコンテナ内に満たした流水中に浸漬し１４時間吸水させた後、人工気象庫内で１８℃、１００％加湿条件で３日間保持した。穂ごとに全粒数及び発芽粒数を計数して発芽率を求め、５穂の平均値を算出した。この発芽率平均値に基づいて、表１に示した基準にしたがってスコアリングした。穂発芽性スコア（０～６）が大きいほど、穂発芽性が高いことを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　麦芽ＫＩは、サッポロビール社木崎圃場産（２００４年、２００５年、２００６年、２００８年）の製麦データから求めた。マイクロモルティングは、浸麦度４３．５％、発芽温度１５℃、発芽日数６日の条件の下、実施した。麦芽ＫＩは、Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｂｒｅｗｉｎｇ　Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ（ＥＢＣ）の標準法に準拠した分析法により分析した（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｂｒｅｗｉｎｇ　Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ，Ａｎａｌｙｔｉｃａ，　１９８７）。
　図１に、種子休眠性評価において、発芽の速い品種・系統群と遅い品種・系統群との間で最も顕著な差が見られた７２時間後発芽率、休眠指数（休眠打破処理時間は２４時間）及び穂発芽性スコアを示した。
　図１に示した結果から、北米の一部を除く品種・系統（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＡＣ　Ｍｅｔｃａｌｆｅ，ＣＤＣ　Ｋｅｎｄａｌｌ，ＣＤＣ　ＰｏｌａｒＳｔａｒ，ＣＤＣ　Ｃｏｐｅｌａｎｄ，ＴＲ０７９２１，ＣＤＣ　Ａｕｒｏｒａ　Ｎｉｊｏ，ＣＤＣ　Ｍｅｒｅｄｉｔｈ，ＣＤＣ　Ｓｅｌｅｃｔ，Ｎｅｗｄａｌｅ）において、顕著に種子休眠性が弱いことが明らかとなった（図１及び表２参照）。同時に、穂発芽性スコアも、これらの品種・系統は、他の品種・系統と比較して高いことが分かった。上記以外の日本、北米の一部（Ｂｅｔｚｅｓ、ＣＤＣ　Ｒｅｓｅｒｖｅ）、豪州、欧州の品種については、穂発芽性スコアにはややばらつきがあるものの、上記の品種群と明らかに異なり、種子休眠性が強いことが分かった。
　また、２００４年から２００８年までの４ヵ年（２００７年を除く）の麦芽ＫＩを表２に示す。産年度によってばらつきはあるものの、上述した種子休眠性が弱い品種・系統は、比較的高いＫＩを示す傾向が見られた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
（実施例２：ＡＢＧ３１４配列のプライマー設計）
　ＲＦＬＰマーカーＡＢＧ３１４の５’端及び３’端の塩基配列情報に基づいて設計したプライマーＡ１（配列番号１）及びプライマーＡ２（配列番号２）を用いてアニーリング温度を５０℃に設定し、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物の電気泳動を行ったところ、約４ｋｂｐに単一のバンドが見られた（図２、ＰＣＲ産物１～５レーン）。このＰＣＲ産物を様々な制限酵素を用いて処理したところ、制限酵素ＡｌｕＩで処理した場合に、図２のＡｌｕ処理後１～５レーンのバンドパターン中、レーン４及びレーン５のみ約４００ｂｐのバンド（図２中、四角で囲まれたバンド）が検出され、ミカモゴールデン、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ間で多型が見られた（図２）。このことから、プライマーＡ１、Ａ２を用いたＰＣＲと制限酵素ＡｌｕＩでのＰＣＲ産物の処理により、ＡＢＧ３１４の遺伝子型の判別が行えることが示唆された。
　しかしながら、上記条件において、アニーリング温度を５０℃以上にすると多型が見られず、アニーリング温度５０℃の条件では電気泳動のバンドの有無が判別しづらいという問題があった（図２）。さらに、高アニーリング温度の条件ではミカモゴールデン－Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎの倍化半数体系統のＡＢＧ３１４分離パターンと異なる分離パターンを示すバンドが見られた。これらのことから、プライマーＡ１、Ａ２のセットを用いたＰＣＲでは、ＤＮＡの大きさはＡＢＧ３１４と同じであるが、ＡＢＧ３１４以外の別の類似したＤＮＡ断片が増幅されており、しかもバンドの濃さから目的でないＤＮＡ断片の方が優先的に増幅されていることが示唆された。このことから再度ＡＢＧ３１４のみが増幅する適当なプライマーを設計する必要が生じた。そこで、プライマーＡ１、Ａ２を用いた高アニーリング温度でのＰＣＲで増幅される目的でないＤＮＡ断片の塩基配列とＡＢＧ３１４クローンの塩基配列を比較し、この２つの塩基配列間で多型が見られる箇所をプライマーとして設計することとした。有用なプライマーを設計することのみを目的としたため、５’側、３’側の一部配列のみを解析した（図３）。図３中波線で示した部分は塩基配列の解析を行っていない。また、プライマーＡ１及びＡ２の配列は、図示していない。「ＡＢＧ」はＡＢＧ３１４の塩基配列、「４ｋｂ」はＡＢＧ３１４以外の別の類似したＤＮＡ断片の塩基配列であることを示す。四角で囲った塩基配列は、プライマーＢ１及びＢ２がアニーリングする塩基配列に相当する。多型が見られた箇所を中心に複数のプライマーセットを調整し、ＰＣＲを行った結果、プライマーＢ１とＢ２の組み合わせのときに、６２．５℃までアニーリング温度を上昇させてもＡｌｕＩ処理後に多型が見られ、かつ判別もしやすかったことから、このプライマーセットを以降の解析に用いることにした。しかし本条件による解析では、ＰＣＲ産物のＡｌｕＩ処理後に見られた多型はヘテロ型（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ型とミカモゴールデン型の両方の遺伝子を一つずつ持っている状態）が判別できない。育種上、ヘテロ型を判定できることは非常に重要である。このためＡＢＧ３１４内部塩基配列を解析し、ヘテロ型を判別可能なマーカーを構築することを目指した。
　なお、塩基配列の解析は、ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動を行い、出現したバンドを切り出しＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社、ｃａｔ．Ｎｏ．２８７０６）でＤＮＡ断片を精製した後、このＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。塩基配列解析はＳｉｇｍａ社への委託解析により行った。
　ＡＢＧ３１４の５’端と３’端のそれぞれ約２０ｂｐの塩基配列はＧｒａｉｎ　Ｇｅｎｅｓのデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｈｅａｔ．ｐｗ．ｕｓｄａ．ｇｏｖ／ＧＧ２／ｉｎｄｅｘ．ｓｈｔｍｌ）に公開されている。この塩基配列情報をもとにプライマーＡ１、Ａ２を設計した。また本発明において初めて明らかにしたＡＢＧ３１４内部塩基配列情報に基づいてプライマーＢ１（配列番号３）、Ｂ２（配列番号４）を設計した。これらのプライマー配列は次に示すとおりである。
　プライマーＡ１：
５’－ＴＧＣＣＣＴＴＴＡＣＴＣＴＴＧＴＧＡＴＴ－３’（配列番号１）
　プライマーＡ２：
５’－ＣＡＴＣＧＡＡＡＡＧＧＴＴＡＴＣＴＴＡＴ－３’（配列番号２）
　プライマーＢ１：
５’－ＧＧＡＧＣＡＴＡＡＧＧＡＡＡＴＴＡＴＧＴＡＴＣＣＴＣＡ－３’（配列番号３）
　プライマーＢ２：
５’－ＣＡＣＡＡＣＣＣＴＴＣＣＴＴＡＴＴＴＧＡＣＣ－３’（配列番号４）
　なお、プライマーＢ１、Ｂ２を用いたＰＣＲ反応は、９４℃で１分間の変性ステップ、６２．５℃で１分間のアニーリングステップ、７２℃で５分間の伸長ステップを１サイクルとし、これを３５サイクル繰り返した後、７０℃で５分間伸長ステップを行うという条件下で行った。
（実施例３：ＡＢＧ３１４内部配列の品種間多型解析とＣＡＰＳマーカー構築）
　図１、表２の結果から種子休眠性が弱く、麦芽ＫＩが高い品種・系統（グループ１）からＨａｒｒｉｎｇｔｏｎを、種子休眠性が強く、麦芽ＫＩがグループ１と比較し低い品種・系統（グループ２）からミカモゴールデン、Ｇａｉｒｄｎｅｒを選定し、プライマーＢ１、Ｂ２でＡＢＧ３１４のＤＮＡを増幅後、それぞれの塩基配列を解析した（図４）。決定した塩基配列を、ミカモゴールデンについては配列番号５、Ｇａｉｒｄｎｅｒについては配列番号６、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎについては配列番号７に示した。これらの塩基配列をマルチプルアラインメントにより解析した結果、解析した２５２０ｂｐの配列内に３つの品種間で塩基配列多型が７２箇所で確認された（図４）。
　７２箇所の塩基多型のうち、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ（グループ１）の塩基配列とミカモゴールデン、Ｇａｉｒｄｎｅｒ（グループ２）の塩基配列とが異なる塩基多型（多型マーカーＡ）として、配列番号５の第１１０番目、９６２番目、１０２７番目、１３７４番目、１４１５番目、１９７１番目、２３４８－２３４９番目、２４８３－２４８５番目の塩基に対応するものが確認された。
　また、７２箇所の塩基多型のうち、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ（グループ１）の塩基配列、Ｇａｉｒｄｎｅｒ（グループ２）の塩基配列、ミカモゴールデン（グループ２）の塩基配列がいずれも異なる塩基多型（多型マーカーＡ）として、配列番号５の第８７７番目の塩基に対応するものが確認された。
　一方、７２箇所の塩基多型のうち、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ（グループ１）の塩基配列とミカモゴールデン（グループ２）の塩基配列とが一致し、かつＧａｉｒｄｎｅｒ（グループ２）の塩基配列とは異なる塩基多型（多型マーカーＢ）として、配列番号５の第５８８番目、６３９番目、６７５番目、８２６番目、９２７番目、１０２５番目、１２６５番目、１２６９番目、１６１１番目、１９４３番目、２１５０番目の塩基に対応するものが確認された。
　さらに、７２箇所の塩基多型のうち、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ（グループ１）の塩基配列とＧａｉｒｄｎｅｒ（グループ２）の塩基配列とが一致し、かつミカモゴールデン（グループ２）の塩基配列とは異なる塩基多型（多型マーカーＣ）として、配列番号５の第５４番目、１０６－１０９番目、１９７番目、２０５番目、２５３番目、２５６－２６３番目、３０９番目、３８３番目、５５９番目、６１１番目、７１５番目、８００番目、８１５番目、８６５番目、８９７番目、９０５番目、９２９番目、９３５番目、９７６番目、９８２番目、９８８番目、９９０番目、９９５番目、１０２３番目、１０３２番目、１０４１番目、１０６５番目、１０６７－１０６８番目、１２８５番目、１４０９番目、１４３０番目、１４５２番目、１５０３番目、１５３８番目、１５５２番目、１５７３番目、１６３１番目、１６３７番目、１７００番目、１７２９番目、１７４２番目、１８４２番目、１９１１番目、１９５９番目、１９９２番目、２０１１番目、２０２０番目、２０５０番目、２０６８番目、２０８０番目、２１４３番目、２２２７番目の塩基に対応するものが確認された。
　上記多型マーカーＡは９箇所存在しており、このうち少なくとも１つを利用することにより、１ステップでグループ１と２に分類することができる。また、上記多型マーカーＢ、多型マーカーＣはそれぞれ１１箇所、５２箇所存在しており、多型マーカーＢのうち少なくとも１つを利用し、かつ多型マーカーＣのうち少なくとも１つを利用することにより、グループ１と２に分類することができる。
　上記多型マーカーＡのうち、配列番号５の第１０２７番目の塩基に対応するものに制限酵素ＣｌａＩの認識配列が含まれていた。ＣｌａＩの認識配列（ＡＴＣＧＡＴ）は図４の塩基配列内に合計３箇所存在した（ＣｌａＩ（１）、ＣｌａＩ（２）、ＣｌａＩ（３））。このうち、ＣｌａＩ（２）には塩基多型が存在する（配列番号５の第１０２７番目、第１０３２番目）。この塩基多型により、Ｇａｉｒｄｎｅｒの塩基配列はＧＴＣＧＡＴ、ミカモゴールデンの塩基配列はＧＴＣＧＡＣとなり、いずれもＣｌａＩの認識配列を欠損していた（表３）。一方、２箇所（ＣｌａＩ（１）、ＣｌａＩ（３））には上記塩基多型は存在していなかった。そのため、ＣｌａＩ処理後のＤＮＡ断片はグループ１では約１３００、９００ｂｐにバンドが検出され、一方グループ２では約２２００ｂｐに一本のバンドが検出されると予想され、ＣＡＰＳマーカーとして利用できる可能性があった。そこで、大麦７品種について、プライマーＢ１及びＢ２によるＰＣＲ増幅を行い、ＰＣＲ産物をＣｌａＩで処理し、電気泳動を行った結果、予想どおりのバンドパターンが得られ、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ型の電気泳動パターンを示す大麦品種と、ミカモゴールデン（Ｇａｉｒｄｎｅｒ）型を示す大麦品種とにＡＢＧ３１４の遺伝子型を分類することが可能であった（図５）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
（実施例４：ＡＢＧ３１４の遺伝子型と種子休眠性、穂発芽性及び麦芽ＫＩの関係）
　図１の４２品種・系統のＡＢＧ３１４の遺伝子型を上記ＣＡＰＳマーカーを用いて判別し、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ型、ミカモゴールデン型（Ｇａｉｒｄｎｅｒ型）に分類した。その遺伝子型ごとの種子休眠性（７２時間後発芽率、休眠指数）、穂発芽性（穂発芽性スコア）及び麦芽ＫＩの平均値を比較した。２００４、２００５、２００６、２００８年度産大麦の麦芽ＫＩの平均値を比較した結果を、図６（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）にそれぞれ示した。また、７２時間後発芽率を比較した結果を図７（ａ）に、休眠指数を比較した結果を図７（ｂ）に、穂発芽性スコアを比較した結果を図７（ｃ）に示した。
　その結果、種子休眠性（７２時間後発芽率、休眠指数）、穂発芽性（穂発芽性スコア）について、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ型とミカモゴールデン型（Ｇａｉｒｄｎｅｒ型）は、危険率０．１％で有意差が認められ、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ型を示す品種・系統はミカモゴールデン型（Ｇａｉｒｄｎｅｒ型）を示す品種・系統と比較し、種子休眠性が弱く、穂発芽抵抗性が低いことが分かった。また、ＫＩについては、各年度においてＨａｒｒｉｎｇｔｏｎ型がミカモゴールデン型（Ｇａｉｒｄｎｅｒ型）と比較し、危険率０．１％～１％で有意に高かった。
　以上の結果より、本ＣＡＰＳマーカーは種子休眠性の程度、つまり一定の穂発芽抵抗性を有するかどうか、及び麦芽ＫＩの程度を推定する上で非常に重要であることが示唆された。北米や豪州では近年、収穫期の降雨による穂発芽が問題になってきている。このため穂発芽抵抗性遺伝子を新品種に導入し、品種の付加価値を向上させることは重要である。穂発芽の検定は手間がかかり、大量にある育種材料を細かくチェックするのは現実的ではない。本マーカーを大麦育種の選別過程で利用することにより、コスト削減、ＤＮＡレベルで検定するため確実性の向上、開発品種の高付加価値化などが期待される。
　配列番号１～４；合成プライマー

Claims (10)

  1. 　配列番号５、配列番号６及び配列番号７に記載の塩基配列を多重整列することによって特定される多型マーカーに基づく被検大麦の選別方法であって、
    　多重整列した際に、
    　配列番号７に記載の塩基配列と、対応する配列番号５及び配列番号６に記載の塩基配列とが異なる塩基配列部位を多型マーカーＡ、
    　配列番号６に記載の塩基配列と、対応する配列番号５及び配列番号７に記載の塩基配列とが異なる塩基配列部位を多型マーカーＢ、
    　配列番号５に記載の塩基配列と、対応する配列番号６及び配列番号７に記載の塩基配列とが異なる塩基配列部位を多型マーカーＣとし、
    　前記被検大麦のゲノムＤＮＡを鋳型とし配列番号３及び配列番号４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー対を用いたポリメラーゼ連鎖反応によって得られる増幅ＤＮＡ断片を用いて、前記多型マーカーＡに基づいて遺伝子型を決定するか、前記多型マーカーＢ及び前記多型マーカーＣに基づいて遺伝子型を決定し、
    　（ｉ）該決定した遺伝子型が配列番号７に記載の塩基配列の遺伝子型と一致する被検大麦、又は、
    　（ｉｉ）該決定した遺伝子型が配列番号５又は配列番号６に記載の塩基配列の遺伝子型と一致する被検大麦、
    を選別する被検大麦の選別方法。
  2. 　前記増幅ＤＮＡ断片を用いた遺伝子型の決定が、前記増幅ＤＮＡ断片を制限酵素ＣｌａＩにより消化して得られる切断断片の数又はサイズを検出することによるものである、請求項１に記載の選別方法。
  3. 　請求項１又は２に記載の選別方法において選別された大麦同士を交配することにより得ることのできる交配後代系統の大麦。
  4. 　請求項１又は２に記載の選別方法において、
    　（ｉ）として選別された大麦又は（ｉ）として選別された大麦同士を交配することにより得ることのできる交配後代系統の大麦から麦芽を得る製麦工程を備える麦芽製造方法。
  5. 　請求項１又は２に記載の選別方法において、
    　（ｉｉ）として選別された大麦又は（ｉｉ）として選別された大麦同士を交配することにより得ることのできる交配後代系統の大麦から麦芽を得る製麦工程を備える麦芽製造方法。
  6. 　請求項４又は５に記載の麦芽製造方法により得ることのできる麦芽。
  7. 　仕込工程と、発酵工程とを少なくとも備える麦芽発酵飲料の製造方法であって、
    　前記仕込工程で用いる大麦原料が、請求項１又は２に記載の選別方法において（ｉ）として選別された大麦、当該大麦同士を交配することにより得ることのできる交配後代系統の大麦、又はこれらから得ることのできる麦芽である、麦芽発酵飲料の製造方法。
  8. 　仕込工程と、発酵工程とを少なくとも備える麦芽発酵飲料の製造方法であって、
    　前記仕込工程で用いる大麦原料が、請求項１又は２に記載の選別方法において（ｉｉ）として選別された大麦、当該大麦同士を交配することにより得ることのできる交配後代系統の大麦、又はこれらから得ることのできる麦芽である、麦芽発酵飲料の製造方法。
  9. 　請求項７又は８に記載の製造方法により得ることのできる麦芽発酵飲料。
  10. 　配列番号３及び配列番号４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー対。
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