ES2586616T3

ES2586616T3 - Bebidas derivadas de cebada y malta con bajo nivel de dimetil sulfuro

Info

Publication number: ES2586616T3
Application number: ES09771493.5T
Authority: ES
Inventors: Søren Knudsen; Gustav Hambraeus; Lene Mølskov Bech; Steen Bech Sørensen; Birgitte Skadhauge; Klaus Breddam; Ole Olsen
Original assignee: Carlsberg Breweries AS; Heineken Supply Chain BV
Current assignee: Carlsberg Breweries AS; Heineken Supply Chain BV
Priority date: 2008-12-03
Filing date: 2009-12-01
Publication date: 2016-10-17
Anticipated expiration: 2029-12-01
Also published as: ZA201104844B; CA2744836C; EP2373154A2; EA201170739A1; HK1162852A1; LT2373154T; US9834760B2; EA029777B1; KR20110094111A; SA109300713B1; CN102291982A; BRPI0922349B1; NZ593605A; KR101769525B1; PT2373154T; AR074430A1; WO2010063288A2; IL213324A0; AP3392A; UA105197C2

Abstract

Una bebida preparada a partir de una planta de cebada o una parte de la misma en la que dicha bebida contiene un nivel de dimetil sulfuro (DMS) por debajo de 20 ppmm y un nivel de S-metil-I-metionina (SMM) de menos de 20 ppmm y en la que dicha planta de cebada o parte de la misma porta una mutación en el gen que codifica la metionina S-metiltransferasa (MMT), causando una pérdida total de MMT funcional.

Description

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en bruto”. Además, aún en referencia a la FIG. 7 en el presente documento, “línea de fitomejoramiento” se refiere a granos de la generación M4 y cualquier generación posterior, incluyendo las plantas de la misma, que pueden ser el resultado del cruce con una planta de cultivo o el resultado del cruce con otra línea de fitomejoramiento con un rasgo específico separado.

5 Tal como se usa en el presente documento, la expresión “con MMT nula” se refiere a una pérdida total de enzima funcional metionina S-metil transferasa. Por lo tanto, una “planta de cebada con MMT nula” es una planta de cebada que comprende una mutación en el gen codificante de la MMT que da como resultado una pérdida total de la MMT funcional. De manera similar, los “granos con MMT nula” son granos que comprenden una mutación en el gen

10 codificante de la MMT, que da como resultado una pérdida total de la MMT funcional y así sucesivamente.

La expresión “partes de la planta de cebada”, por ejemplo, comprendida dentro del significado de la frase “planta de cebada o una parte de la misma”, incluye las células de la planta de cebada, los protoplastos de la planta de cebada, cultivo de tejido celular vegetal a partir del cual se pueden regenerar plantas de cebada, callos de la planta de

15 cebada y células de la planta de cebada que están intactas en las plantas o partes más grandes de las plantas de cebada, tales como embrión, polen, óvulos, flores, granos, hojas, raíces, puntas de la raíz, anteras o cualquier parte de una planta.

La “PCR” o “reacción en cadena de la polimerasa” es muy conocida por aquellos expertos en la técnica como una 20 técnica empleada para la amplificación de segmentos específicos de ADN (Patentes de Estados Unidos n.º

4.683.195 y 4.800.159 de Mullis, K.B. et al.,). También la reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (RT)-PCR es muy conocida para aquellos entendidos en la técnica. El llevar a cabo una RT-PCR en una muestra biológica tiene por objeto detectar los ARNm expresados para un gen particular. En relación a la MMT, la RT-PCR en general incluye obtener una muestra que se sospecha que contiene ARNm para MMT, mediante la

25 realización de una RT-PCR en la muestra con una transcriptasa inversa, una polimerasa y un par de cebadores específicos, para amplificar el ARN, si está presente y detectar el producto de la amplificación como una indicación de la presencia del ARN codificante de la MMT en la muestra. Los cebadores trabajan por parejas: “cebador directo” (o “cebador de hebra superior”) y “cebador inverso” (o “cebador de hebra inferior”). En el presente documento, las secuencias del cebador se proporcionan en dirección 5´ a 3´.

30 Por la expresión “producto vegetal” se entiende un producto resultante del procesamiento de una planta o porción de una planta. Por ejemplo, dicho producto vegetal puede ser malta, mosto, una bebida fermentada o no fermentada, un alimento o un producto alimenticio.

35 Un “panel de especialistas catadores de cerveza” dentro del significado de la presente solicitud es un panel de especialistas extensamente entrenados en la cata y descripción de sabores de la cerveza, con especial atención en ésteres, alcoholes superiores, ácidos grasos, componentes de azufre y el cuerpo. A pesar de que existe una serie de herramientas analíticas para evaluar los componentes del sabor, es difícil de evaluar analíticamente el significado relativo de los componentes activos del sabor. Sin embargo, dichas propiedades del complejo pueden evaluarse por

40 los especialistas catadores. Su continuo entrenamiento incluye la cata y evaluación de muestras de cerveza estándar a las que se le adicionaron concentraciones específicas de componentes de la cerveza, por ejemplo, acetato de isoamilo, acetato de etilo, hexanoato de etilo e alcohol isoamílico.

Con la expresión “sitio de corte y empalme” se hace referencia a los límites entre exones e intrones de un gen. Por lo

45 tanto, un sitio de corte y empalme puede ser el borde que va de exón a intrón, también denominado “sitio dador”, o el borde que separa intrón de exón, también llamado “sitio aceptor”. Normalmente, un sitio de corte y empalme en las plantas comprende secuencias consenso. El extremo 5´ de un intrón, en general, consiste en un dinucleótido GT conservado (GU en el ARNm) y el extremo 3´ de un intrón, usualmente consiste en un dinucleótido AG conservado. El sitio de corte y empalme 5´ de un intrón comprende, de ese modo, el extremo 5´ de un intrón y el sitio de corte y

50 empalme 3´ comprende el extremo 3´ de un intrón. Preferentemente, dentro del contexto de la presente invención, el sitio de corte y empalme de un intrón es cualquiera de estos dos:

(i) el sitio de corte y empalme 5´ que consiste en el dinucleótido más próximo al 5´ del intrón, el cual en general es GT; o

55 (ii) el sitio de corte y empalme 3´ que consiste en el dinucleótido más próximo al 3´ del intrón, el cual —en general— es AG.

Los “sitios de corte y empalme ocultos” no se reconocen en condiciones normales y en consecuencia normalmente no causan corte y empalme. Sin embargo, en las transcripciones que portan mutaciones puntuales dentro de

60 elementos naturales, dichos sitios pueden activarse para eventos de corte y empalme.

El “cultivo de tejido” indica una composición que comprende células aisladas del mismo o diferente tipo o una colección de dichas células organizadas en partes de una planta, por ejemplo, protoplastos, callos, embrión, polen, anteras y similares.

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La “cebada de tipo silvestre”, Hordeum vulgare ssp. spontaneum, es considerada la madre de las formas cultivadas de cebada de la actualidad. Se piensa que la transición de la cebada de un estado de tipo silvestre a un estado cultivado ha coincidido con la domesticación de la planta en “variedades locales de la cebada”. Estas están genéticamente más estrechamente relacionadas con las modernas variedades cultivadas que la cebada de tipo

5 silvestre.

La expresión cebada de “tipo de tipo silvestre” se refiere a una planta de cebada generada convencionalmente; preferentemente, la expresión se refiere a la planta de cebada a partir de la cual han derivado las plantas de cebada de la presente invención, es decir, las plantas madres. Los granos de cebada de tipo de tipo silvestre en general están disponibles a través de, por ejemplo, empresas de semillas en forma de “variedades de cultivo” (frecuentemente abreviado “vc.”), es decir, aquellos granos genéticamente similares que aparecen en las listas de las organizaciones nacionales de fitomejoramiento. Los términos “variedad cultivada” y “variedad” se emplean de manera indistinta en el presente documento.

15 Con el término “mosto” se denomina a un extracto líquido de malta, por ejemplo, malta molida o malta verde o malta verde molida. Además de dicha malta, el extracto líquido puede prepararse a partir de malta y componentes adicionales, tal como material que contiene almidón adicional convertido en parte en azúcares fermentables. El mosto, en general, se obtiene por maceración, opcionalmente seguida de “lavado de bagazo”, es decir, el proceso de extracción de azúcares residuales y otros compuestos del grano de desecho después de mezclar los granos molidos con agua caliente. El lavado de bagazo, normalmente, se lleva a cabo en un tanque de filtrado, un filtro para mezcla de granos molidos u otro aparato que permita la separación del líquido extraído del grano de desecho. El mosto obtenido después de la maceración, en general, se denomina “primer mosto”, mientras que el mosto obtenido después del lavado de bagazo, en general, se denomina “segundo mosto”. En caso de no especificarse, el término mosto puede referirse al primer mosto, al segundo mosto o a una combinación de ambos. Durante la producción de

25 cerveza, el mosto en general se somete a ebullición junto con el lúpulo. El mosto que no se somete a ebullición con lúpulo también puede denominarse “mosto dulce”, mientras que el mosto que se somete a ebullición con o sin lúpulo, puede denominarse “mosto hervido”.

Planta de cebada

La cebada es una familia de plantas. La cebada de tipo silvestre, Hordeum vulgare ssp. spontaneum, se considera la madre de las formas cultivadas de la cebada en la actualidad. La transición de la cebada de un estado de tipo silvestre a un estado cultivada se cree que ha coincidido con un cambio radical de frecuencia de alelo en numerosos locus. Los granjeros seleccionaron positivamente alelos raros y nuevos eventos mutacionales, quienes rápidamente 35 establecieron los nuevos atributos de las poblaciones de la planta domesticada, denominada “variedades locales de la cebada”. Estas están genéticamente más estrechamente relacionadas con las modernas variedades cultivadas que la cebada de tipo silvestre. Hasta fines del siglo XIX, las variedades locales de la cebada existieron como mezclas altamente heterogéneas de líneas endogámicas y segregados híbridos, inclusive pocas plantas derivadas de cruzamiento aleatorio en generaciones anteriores. La mayoría de las variedades locales han sido desplazadas en agriculturas avanzadas por variedades cultivadas de línea pura. Niveles intermedios o altos de diversidad genética caracterizan las variedades locales restantes. Inicialmente, las variedades cultivadas de “cebada moderna” representaron selecciones de variedades locales. Estas luego se derivaron de sucesivos ciclos de cruzas entre líneas puras establecidas, tales como aquellas de orígenes geográficos diversos. Eventualmente, el resultado fue un marcado estrechamiento de la base genética en muchas, probablemente todas, las agriculturas avanzadas.

45 Comparadas con las variedades locales, las variedades cultivadas de cebada moderna tienen numerosas propiedades mejoradas (Nevo, 1992; von Bothmer, 1992), por ejemplo, pero sin limitación:

(i): granos cubiertos y desnudos;

(ii): latencia de la semilla;

(iii) resistencia a enfermedades;

(iv): tolerancia medioambiental (por ejemplo, a las sequías o al pH del suelo);

(v): proporciones de lisina y otros aminoácidos;

(vi): contenido de proteína;

(vii) contenido de nitrógeno; 55 (viii) composición de carbohidratos;

(ix) composición de hordeínas.

Dentro de la presente invención, el término “cebada” comprende cualquier planta de cebada. Por lo tanto, la invención se refiere a cualquier planta de cebada que porta una mutación en el gen codificante de la MMT, que da como resultado una pérdida total de la MMT funcional.

Sin embargo, las plantas de cebada preferidas para su uso con la presente invención son las modernas variedades cultivadas de cebada o las líneas puras. La variedad cultivada de cebada que se utilizará con la presente invención puede seleccionarse, por ejemplo, entre el grupo que consiste en Sebastian, Celeste, Tangent, Lux, Prestige, 65 Saloon, Neruda, Harrington, Klages, Manley, Schooner, Stirling, Clipper, Franklin, Alexis, Blenheim, Ariel, Lenka, Maresi, Steffi, Gimpel, Cheri, Krona, Camargue, Chariot, Derkado, Prisma, Union, Beka, Kym, Asahi 5, KOU A, Swan

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Hals, Kanto Nakate Gold, Hakata Núm. 2, Kirin-choku Núm. 1, Kanto variedad tardía Gold, Fuji Nijo, New Golden, Satukio Nijo, Seijo Núm. 17, Akagi Nijo, Azuma Golden, Amagi Nijpo, Nishino Gold, Misato golden, Haruna Nijo, Scarlett, Quench, NFC Tipple y Jersey preferentemente del grupo que consiste en Haruna Nijo, Sebastian, Tangent, Lux, Prestige, Saloon, Neruda, Power, Quench y NFC Tipple.

5 Por consiguiente, en una realización, dicha planta es una variedad cultivada de cebada moderna que porta una mutación en el gen codificante de la MMT, que da como resultado una pérdida total de la MMT funcional, preferentemente una variedad cultivada seleccionada del grupo de variedades cultivadas de cebada descrito anteriormente en el presente documento. En esta realización, por lo tanto, se prefiere que la planta de cebada no sea una variedad local de cebada.

La planta de cebada puede estar en cualquier forma adecuada. Por ejemplo, la planta de cebada, de acuerdo con la invención puede ser una planta de cebada viable, una planta seca, una planta homogeneizada o un grano de cebada molido. La planta puede ser una planta madura, un embrión, un grano germinado, un grano malteado, un

15 grano malteado molido o similar.

Las partes de las plantas de cebada pueden ser cualquier parte adecuada de la planta, tal como granos, embriones, hojas, tallos, raíces, flores o fracciones de los mismos. Una fracción puede ser, por ejemplo, una sección de un grano, embrión, hoja, tallo, raíz o flor. Una parte de una planta de cebada puede también ser una fracción de un homogenato, una fracción de un extracto o una fracción de una planta o grano de cebada molido.

En una realización, las partes de plantas de cebada pueden ser células de dicha planta de cebada, preferentemente células viables que pueden propagarse in vitro, por ejemplo, en cultivos de célula o tejido. En particular, en una realización, dichas células pueden ser células que no son capaces de madurar en una planta de cebada completa,

25 es decir, células que no son un material reproductivo.

Pérdida de la enzima MMT funcional

La presente memoria descriptiva se refiere a productos vegetales, tales como bebidas preparadas a partir de plantas de cebada o partes de las mismas, donde dichas plantas de cebada portan una mutación en el gen de la MMT, lo que da como resultado la pérdida de la enzima MMT funcional, por ejemplo pérdida de al menos 90 % de actividad de la MMT, preferentemente al menos 97 %, más preferentemente al menos 99 %, aún más preferentemente al menos 99,5 % de actividad de la MMT comparada con el correspondiente nivel en la cebada de tipo de tipo silvestre, preferentemente comparada con cualquiera de las variedades cultivadas de cebada del tipo de tipo silvestre

35 descritas en el presente documento con anterioridad, más preferentemente comparada con cebada de tipo de tipo silvestre vc. Prestige. Lo más preferentemente, dicha planta de cebada porta una mutación en el gen codificante de la MMT, lo que da como resultado una pérdida total de la función de la MMT.

La pérdida total de una enzima MMT funcional puede basarse en diferentes mecanismos. Por ejemplo, la pérdida total de la enzima MMT funcional puede ser el resultado de una proteína con función anormal en dicha planta, es decir, una enzima MMT con función anormal, tal como una proteína de MMT mutante sin actividad detectable. Por ejemplo, la proteína de MMT del mutante puede ser una proteína truncada. La pérdida de actividad de la MMT puede basarse, de manera similar, en diferentes mecanismos, por ejemplo, en la proteína de MMT con función anormal.

45 Preferentemente, la actividad de una proteína de MMT mutada se determina por su capacidad de catalizar la transferencia de un grupo metilo de SAM en Met, formando, en consecuencia, SMM. Esto, por ejemplo, puede abordarse de acuerdo con lo descrito en el ejemplo 4 que se encuentra a continuación. Preferentemente, la secuencia de aminoácido de una MMT mutada se obtiene al determinar la secuencia traducida del correspondiente ADNc de la cebada aislada. Esto puede llevarse a cabo, en esencia, de acuerdo con lo descrito en el ejemplo 8 que se encuentra a continuación. Como alternativa, la MMT mutada de una planta de cebada de la invención se obtiene por expresión heteróloga en un cultivo de células bacterianas, de acuerdo con lo descrito en el ejemplo 11 y en el ejemplo 12 que se encuentran a continuación, para luego verificar que la proteína recombinante es inactiva como enzima MMT.

55 La pérdida total de la MMT funcional puede materializarse por la falta de proteína de MMT. La falta de proteína de MMT conducirá a la pérdida de la función de MMT. Por lo tanto, la planta de cebada puede comprender nada o solamente muy poco de la proteína de MMT, preferentemente una cantidad no detectable de proteína de MMT. La presencia o ausencia de proteína de MMT puede detectarse por cualquier medio adecuado conocido para una persona experta en la técnica. Sin embargo, la/s proteína/s preferentemente se analiza/n mediante técnicas en las cuales se detecta la proteína de MMT con anticuerpos específicos que reconocen la MMT. Dichas técnicas pueden ser, por ejemplo, método de transferencia de Western o ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas y dichos anticuerpos específicos pueden ser monoclonales o policlonales. Preferentemente, sin embargo, dichos anticuerpos son policlonales que reconocen diferentes epítopes dentro de la proteína de MMT. Esto también puede detectarse de manera indirecta, por ejemplo, con métodos para la determinación de actividad de MMT. De este modo, en una

65 realización preferida de la invención, se dice que una planta de cebada porta una mutación en el gen codificante de la MMT lo que en consecuencia causa una pérdida total de actividad de la MMT, cuando en dicha planta no es

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detectable la proteína de MMT. En particular, este es el caso cuando en dicha planta de cebada no es detectable proteína de MMT con una masa aproximada de 120 kD, ±10 %, preferentemente en pepitas de dicha planta de cebada, de acuerdo con lo analizado por el método de transferencia de Western.

5 La pérdida total de MMT funcional también puede ser un resultado de nada o muy poca transcripción de un ARNm de la MMT, preferentemente nada de transcripción de un ARNm de la MMT. El experto reconocerá que la ausencia de un transcrito de la MMT también dará como resultado la ausencia de la proteína MMT.

Preferentemente, sin embargo, la pérdida total de MMT funcional es un resultado de expresión de un transcrito de

10 MMT aberrante. Dicho transcrito puede estar causado, preferentemente, por un evento de corte y empalme aberrante del transcrito primario, por ejemplo, debido a una mutación en un sitio de corte y empalme. La expresión de transcritos codificantes de MMT pueden detectarse, por ejemplo, con el método de transferencia de Northern o con métodos de RT-PCR.

15 La pérdida total de MMT funcional en las plantas de cebada de la presente invención está causada por una o más mutaciones. De este modo, las plantas de cebada de la presente invención, en general, portan al menos una mutación en el gen de la MMT. Dicha/s mutación/es puede/n estar en regiones regulatorias, por ejemplo, dentro del promotor o intrones o dicha/s mutación/es puede/n estar en la región codificante de la proteína. De este modo, la pérdida de MMT funcional también puede detectarse al analizar las mutaciones en el gen codificante de la MMT. Las

20 mutaciones en el gen codificante de la MMT pueden detectarse, por ejemplo, mediante secuenciación de dicho gen, para luego compararlo con la secuencia de tipo de tipo silvestre, preferentemente la secuencia de tipo de tipo silvestre de vc. Prestige proporcionada en el presente documento como SEC ID NO: 3 o la de la vc. Sebastian (SEC ID NO: 16). Preferentemente, después de identificar una mutación, la pérdida de función se confirma mediante pruebas para conocer la actividad de la MMT, por ejemplo, de acuerdo con lo descrito en el ejemplo 2 o el ejemplo 4.

25 La expresión proteína de MMT, tiene la intención de cubrir la proteína de MMT de extensión completa de la cebada de acuerdo con lo expresado en la SEC ID NO: 6 o un homólogo funcional de la misma. En este contexto, un homólogo funcional es una proteína de MMT con el mismo nivel de actividad de la MMT, ±25 %, que la proteína de MMT de la cebada, de acuerdo con lo expresado en la SEC ID NO: 6, en la que la actividad de la MMT se determina

30 de acuerdo con lo descrito en el ejemplo 2 o el ejemplo 4 mencionado a continuación.

La planta de cebada con pérdida de al menos 90 %, tal como 95 %, por ejemplo 99 %, tal como 99,5 % de actividad de la MMT o con pérdida total de actividad de la MMT puede comprender una forma en parte funcional o preferentemente una forma no funcional, una forma truncada de MMT, tal como una forma truncada N-terminal o una 35 forma truncada C-terminal. Una planta de cebada puede comprender más de uno forma truncada de MMT, tal como 2 o por ejemplo 3 o tal como más de 3 formas truncadas diferentes de MMT, las cuales pueden resultar de las transcripciones ensambladas de manera aberrante. Dichas formas truncadas comprenden solamente un fragmento N-terminal de la MMT. Además del fragmento N-terminal de la MMT de tipo de tipo silvestre, dichas formas truncadas de la MMT pueden comprender secuencias C-terminal adicionales que no se encuentran en la MMT del 40 tipo de tipo silvestre. Dichas secuencias C-terminales adicionales pueden traducirse, por ejemplo, en secuencias, tales como aquellas comprendidas en el ARNm mutante debido a corte y empalme aberrante. Preferentemente, dichas formas truncadas de MMT comprenden a lo sumo los 500, más preferentemente a lo sumo los 450, incluso más preferentemente a lo sumo los 400, todavía más preferentemente a lo sumo los 350, incluso más preferentemente a lo sumo los 320, todavía más preferentemente a lo sumo 311 o como máximo, 288 restos de

45 aminoácido N-terminal de la SEC ID NO: 6. Esto se da en particular en el caso cuando dicha planta de cebada tiene una pérdida total de actividad de la MMT. Sin embargo, la MMT también puede comprender menos, tal como no más de 300, por ejemplo no más de 250, tal como no más de 200, por ejemplo a lo sumo los 150, por ejemplo no más de 147 o no más de 133 aminoácidos N-terminal de SEC ID NO: 6.

50 En una realización muy preferida, la forma truncada de la MMT puede consistir en 1 a 311 aminoácidos o 1 a 288 aminoácidos de SEC ID NO: 6 y opcionalmente secuencias adicionales C-terminal no presentes en la MMT de tipo de tipo silvestre. Preferentemente, dichas secuencias adicionales C-terminales consisten en a lo sumo 50, más preferentemente a lo sumo en 30, incluso más preferentemente a lo sumo en 10, todavía más preferentemente a lo sumo en 4 o como máximo, en 1 aminoácido. En una realización muy preferida, la forma truncada de la MMT puede

55 ser la proteína de acuerdo con la SEC ID NO: 11 o la SEC ID NO: 13 o la SEC ID NO: 15. Ninguna de las proteínas de la SEC ID NO: 11 o de la SEC ID NO: 13 o de la SEC ID NO: 15 son enzimas de la MMT funcional.

En otra realización muy preferida, la forma truncada de la MMT puede consistir en 1 a 147 aminoácidos o en 1 a 133 aminoácidos, de la SEC ID NO: 18 y opcionalmente de secuencias adicionales C-terminal que no están presentes en

60 la MMT del tipo de tipo silvestre. Preferentemente, dichas secuencias adicionales C-terminal consisten en a lo sumo 50, más preferentemente a lo sumo 40, incluso más preferentemente a lo sumo 39 o a lo sumo 33 o como máximo, 30 aminoácidos. En una realización muy preferida, la forma truncada de la MMT puede ser la proteína de acuerdo con la SEC ID NO: 22 o la SEC ID NO: 24 o la SEC ID NO: 26. Ninguna de las proteínas de la SEC ID NO: 22 o de la SEC ID NO: 24 o de la SEC ID NO: 26 son enzimas de MMT funcionales.

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Las formas truncadas anteriormente mencionadas de la MMT pueden estar presentes, por ejemplo, en una planta de cebada portadora de una mutación en el gen codificante de la MMT, en la cual dicha mutación introduce un codón de terminación prematura, lo que da como resultado un gen codificante de las formas truncadas anteriormente mencionadas de la MMT.

5 En una realización preferida de la invención, la planta de cebada comprende un gen que está transcrito en el ARNm, el cual comprende algunos, aunque no todos, los genes de la MMT del tipo de tipo silvestre ensamblados entre sí sin intervención (la estructura intrón-exón del gen de la MMT del tipo de tipo silvestre de la cebada aparece en la FIG. 9). En una realización, en consecuencia, se prefiere que el ARNm de la MMT de la planta de cebada, de acuerdo

10 con la invención comprenda, a lo sumo los exones 1, 2, 3, 4 y 5 ensamblados juntos sin intervención o, por ejemplo, a lo sumo los exones 1 y 2 ensamblados entre sí sin intervención. Además de dichos exones ensamblados entre sí, el ARNm de la MMT de la planta de cebada de acuerdo con la invención, comprende secuencias adicionales terminal 3´ derivadas a partir de intrones y/o exones de tipo de tipo silvestre, en los cuales los intrones separen secuencias de exones. En la FIG. 12 y la FIG. 16 se ilustran ejemplos preferidos de ARNm de la MMT aberrante de

15 plantas de cebada de acuerdo con la invención y según queda determinado por la RT-PCR y de conformidad con las longitudes del fragmento en pb. Más preferentemente, los ARNm aberrantes de las plantas de cebada, de acuerdo con la invención, son aquellos ilustrados en la FIG. 12, que comprenden, además los exones 1 y 2 en el extremo 5´ o los ARNm ilustrados en la FIG. 16, que comprenden, además al exón 1 en el extremo 5´.

20 En una realización muy preferida de la presente invención, la planta de cebada portadora de una mutación en el gen para la MMT comprende una mutación en un sitio de corte y empalme dentro del gen de la MMT, el cual da como resultado ARNm cortado y empalmado de manera aberrante. Más preferentemente, dicha mutación se posiciona en un intrón del gen de la MMT, incluso más preferentemente en el sitio de corte y empalme 5´ de un intrón, tal como en el sitio de corte y empalme 5´ en el intrón 1 (el intrón que separa los exones 1 y 2), tal como en el sitio de corte y

25 empalme 5´ en el intrón 2 (el intrón que separa los exones 2 y 3), tal como en el sitio de corte y empalme 5´ en el intrón 3 (el intrón que separa los exones 3 y 4), tal como en el sitio de corte y empalme 5´ en el intrón 4 (el intrón que separa los exones 4 y 5), tal como en el sitio de corte y empalme 5´ en el intrón 5 (el intrón que separa los exones 5 y 6), tal como en el sitio de corte y empalme 5´ en el intrón 6 (el intrón que separa los exones 6 y 7), lo más preferentemente en el sitio de corte y empalme 5´ en el intrón 2 o en el intrón 5.

30 Se prefiere que dicha mutación sea una mutación G→A de la base terminal 5´ de los intrones anteriormente mencionados. De este modo, una mutación muy preferida es una mutación G→A de la base terminal 5´ del intrón 2 o una mutación G→A de la base más próxima al 5´ del intrón 5.

35 La planta de cebada, de acuerdo con la invención, puede prepararse con cualquier método adecuado conocido para la persona entendida en la técnica, preferentemente con el método señalado en el presente documento a continuación en la sección “Preparación de las plantas de cebada con una pérdida total de MMT funcional”.

En una realización, se prefiere que las plantas de cebada con pérdida total de actividad de la MMT, de acuerdo con

40 la presente invención, tengan características fisiológicas y de desarrollo del grano y de la planta comparables a la cebada del tipo de tipo silvestre. Entonces, por lo tanto se prefiere que la planta de cebada con MMT nula sea similar a la cebada de tipo de tipo silvestre con respecto a las características importantes a nivel agrícola, tales como la altura de la planta, el número de macollos por planta, comienzo de la floración y/o número de granos por espiga.

45 En una realización muy preferida, el gen codificante de la MMT de la planta de cebada de acuerdo con la invención tiene la secuencia tal como se expone en la SEC ID NO: 8. De este modo, se prefiere que la planta de cebada de acuerdo con la invención porte una mutación G→A de la base núm. 3076 de la SEC ID NO: 3 (en la que la SEC ID NO: 3 es la secuencia genómica del tipo de tipo silvestre para la MMT de la cebada, vc. Prestige).

50 Un ejemplo preferido de una planta de cebada que tiene una pérdida total de actividad de la MMT, es la planta de cebada depositada el 13 de octubre de 2008 en la Colección norteamericana de cultivos tipo (ATCC, American Type Culture Collection), Depositario de patentes, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110, Estados Unidos y denominadas “Cebada, Hordeum vulgare; Línea 8063”. De este modo, la planta de cebada de la invención puede ser línea 8063 de cebada depositada en la ATCC el 13 de octubre de 2008 (Designación de depósito de patente de la

55 ATCC: PTA-9543) o cualquier otra planta de cebada de la progenie de la misma, en la que el gen codificante de la MMT de la planta de cebada de acuerdo con la invención, tiene la secuencia tal como se expone en la SEC ID NO:

8.

En una realización muy preferida, el gen codificante de la MMT de la planta de cebada de acuerdo con la invención

60 tiene la secuencia tal como se expone en la SEC ID NO: 19. De este modo, se prefiere que la planta de cebada de acuerdo con la invención porte un mutación G→A en la base núm. 1462 de la SEC ID NO: 16 (en la que la SEC ID NO: 16 es la secuencia genómica del tipo de tipo silvestre para la MMT de la cebada, vc. Sebastian).

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Preparación de las plantas de cebada con una pérdida total de MMT funcional

La planta de cebada con pérdida total de MMT funcional puede prepararse mediante cualquier método adecuado conocido para el experto en la técnica. Preferentemente, la planta de cebada de la invención se prepara mediante un

5 método que comprende las etapas de mutagenizar plantas de cebada, partes de las mismas, por ejemplo, granos de cebada, para luego detectar y seleccionar plantas de cebada de individuos con pérdida total de actividad de la MMT. De manera interesante, la presente invención se refiere, en un aspecto, a un nuevo y muy eficiente método de detección que permite la identificación de dichas plantas de cebada.

Por consiguiente, la presente memoria descriptiva proporciona métodos de preparación de una planta de cebada que porte una mutación en el gen de la MMT, el cual causa una pérdida total de actividad de la MMT. Dichos métodos comprenden las etapas de:

(i) mutagenizar plantas de cebada y/o células de cebada y/o tejido de cebada y/o granos de cebada y/o 15 embriones de cebada, para obtener de este modo, la cebada de generación M0; y

(ii) propagar (por ejemplo, por fitomejoramiento) dichas plantas de cebada, granos y/o embriones mutagenizados durante ≥ 2 generaciones, para obtener de este modo plantas de cebada de la generación Mx, en la que x es un número entero ≥ 2; y

(iii) obtener una muestra de dichas plantas de cebada de Mx; y

(iv): determinar el nivel de SMM en dicha muestra; y

(v): seleccionar plantas en las cuales la muestra comprende menos de 10 ppmm de SMM, preferentemente menos de 5 ppmm de SMM, más preferentemente SMM no detectable; y

(vi): secuenciar al menos parte del gen de la MMT; y

(vii) seleccionar plantas que porten una mutación en el gen de la MMT;

25 obteniendo de este modo una planta de cebada que porte una mutación en el gen de la MMT que cause una pérdida total de la MMT funcional.

El paso (i) enumerado anteriormente puede implicar mutagenizar el material vivo de la cebada seleccionado del grupo que consisten en plantas de cebada, células de cebada, tejido de cebada, pepitas de cebada y embriones de cebada, preferentemente seleccionados del grupo que consiste en plantas de cebada, pepitas de cebada y embriones de cebada, más preferentemente pepitas de cebada. La mutagénesis puede llevarse a cabo mediante cualquier método adecuado. En una realización, la mutagénesis se lleva a cabo al incubar una planta de cebada o una parte de ella, por ejemplo, granos de cebada o células individuales de cebada, con un agente mutagenizante.

35 Dichos agentes son conocidos para la persona entendida en la técnica y puede seleccionarse, por ejemplo, del grupo que consiste en azida sódica (NaN3), etil-metano-sulfonato (EMS), azidaglicerol (AG), metilnitrosourea (MNU) y hidrazida maleica (MH).

En otra realización, la mutagénesis se lleva a cabo mediante irradiación, por ejemplo, con luz ultravioleta, una planta de cebada o una parte de ella, tal como el grano. En realizaciones preferidas de la invención, la mutagénesis se lleva a cabo de acuerdo con cualquiera de los métodos señalados en el presente documento a continuación en la sección “Mutagénesis química”. Un ejemplo no limitante de un protocolo adecuado de mutagénesis se proporciona en el ejemplo 1 de la patente de Estados Unidos n.º 7.420.105 de Breddam, K. et al., así como también en el ejemplo 2 a continuación en el presente documento.

45 Se prefiere que la mutagénesis se lleve a cabo de una manera tal que la frecuencia esperada de los mutantes deseados sea al menos de 0,5, tal como en el intervalo comprendido entre 0,5 y 5, por ejemplo en el intervalo que varía entre 0,9 y 2,3 por 10.000 granos, cuando se detecta cebada de generación M3.

En una realización preferida, los granos de cebada están mutagenizados. Estos se denominan la generación M0 (véase también la FIG. 7).

Después de la mutagénesis, se seleccionan plantas de cebada o partes de ellas, sin actividad detectable de la MMT. Preferentemente, la selección comprende obtener una muestra de una planta de cebada, preferentemente de una

55 planta de cebada germinada, incluso más preferentemente de una planta de cebada, la cual ha germinado durante 4 días. Se prefiere que la muestra sea de un coleóptilo y/o de una hoja primaria, preferentemente de una hoja. De este modo, la muestra puede, por ejemplo, estar comprendida en el intervalo que varía entre 1 cm y 3 cm de tejido foliar.

La muestra puede extraerse y analizarse siguiendo un protocolo de múltiples pasos recientemente desarrollado, de acuerdo con su descripción en el presente documento, que involucra el sucesivo uso de diferentes disolventes y materiales aglutinantes. En general, la muestra puede extraerse, por ejemplo con un disolvente o una mezcla de disolventes, preferentemente agua y/o disolventes orgánicos. El disolvente orgánico puede ser, por ejemplo, un alcohol, preferentemente metanol o el disolvente orgánico puede ser, por ejemplo, un haluro de alquilo, preferentemente cloroformo. En una realización preferida, el disolvente es una mezcla de agua, metanol y 65 cloroformo. Dicha extracción puede llevarse a cabo de manera favorable mientras se mezcla, por ejemplo, usando una agitadora o una mezcladora. Puede agregarse un soporte sólido al disolvente/mezcla de muestra, por ejemplo,

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una perla, tal como una perla de vidrio.

En una realización preferida, la hoja de muestra anteriormente mencionada se obtiene de los granos de la generación Mx, en la que x es un número entero ≥ 2, preferentemente en el intervalo que varía entre 2 y 10, más

5 preferentemente en el intervalo que oscila entre 3 y 8. En una realización muy preferida, el nivel de SMM se determina en las plantas germinadas del grupo M3 o en muestras de las mismas (tales como hojas). En dicha realización, se prefiere que los granos de cebada mutagenizados de la generación M0 crezcan para obtener plantas de cebada, las cuales posteriormente se cruzan para obtener granos de la generación M1. Se repite el procedimiento hasta que estén disponibles los granos de la generación M3 (véase la FIG. 7).

La determinación del nivel de SMM está preferentemente basada en el procedimiento novedoso descrito a continuación. De manera interesante este método permite detecciones de alto rendimiento, lo que hace posible la identificación de las plantas de cebada caracterizadas por una pérdida total de la MMT funcional.

15 En términos generales, el método preferentemente abarca que hacer reaccionar la muestra o preferentemente un extracto de dicha muestra, preparada de acuerdo con lo descrito anteriormente, con un compuesto capaz de ligar SMM. Se descubrió que el reactivo OPA (Sigma, número de catálogo P7914; véase la FIG. 2), que se encuentra a continuación denominado OPA, es particularmente útil para determinar los niveles de SMM. OPA reacciona, entre otros, con SMM para formar la molécula denominada SMM-OPA (véase la FIG. 2). La reacción (preferentemente) incluye incubar OPA con un extracto de la muestra preparada de acuerdo con lo descrito anteriormente. Además, se prefiere que el ácido 3-mercapto-propiónico se agregue a la mezcla de la reacción. Preferentemente, la mezcla se mantiene a un pH alcalino, preferentemente en el intervalo de pH 8 a pH 11, más preferentemente en el intervalo de pH 9 a pH 11, incluso más preferentemente en el intervalo de pH 9,5 a pH 10,5, tal como a pH 10. La incubación (preferentemente) se lleva a cabo a una temperatura en el intervalo de 0 °C a 10 °C, preferentemente en el intervalo

25 comprendido entre 1 °C y 8 °C, incluso más preferentemente en el intervalo entre 2 °C y 6 °C, aún más preferentemente en el intervalo entre 3 °C y 5 °C, tal como a 4 °C. El tiempo de incubación es preferentemente ≥10 min.

Basándose en la observación de que SMM-OPA absorbe y emite luz de 340 nm y 450 nm, respectivamente, su detección fue posible gracias al uso de espectroscopía de fluorescencia. El proceso inicial de detección involucra preferentemente la separación del extracto en una columna, preferentemente en una columna de 3μ C18 Gemini, de 30 x 2 mm (Phenomenex, número de catálogo 00A-4439-80; Phenomenex, 2006), seguida de detección de fluorescencia con uso de un sistema de cromatografía líquida de alto rendimiento, preferentemente una cromatografía líquida de muy alto rendimiento (sistema de UPLC, Waters), diseñada para identificar y medir el nivel

35 de fluorescencia de las moléculas que tienen excitación a 340 nm y emisión a 450 nm. Cuando se utiliza este método, “SMM no detectable” significa la ausencia de compuestos detectables que se eluyen conjuntamente con SMM. En este contexto, un pequeño “margen” en un pico del cromatograma se considera un pico artificial. Un pequeño margen sobre el lado derecho del pico Asn/Ser, véase FIG. 3, no se considera, por lo tanto, que represente un pico de SMM. De esta manera y a modo de ejemplo, los dos cromatogramas superiores, de acuerdo con lo que aparece en la FIG. 3B se considera que representan “SMM no detectable”, mientras que el cromatograma inferior en dicha figura representa la separación de una muestra que comprende SMM.

La detección de SMM puede realizarse preferentemente tal como se describe en el ejemplo 2. Un método preferido para seleccionar plantas de cebada de acuerdo con la invención se describe a continuación en el ejemplo 2 entre

45 una planta de cebada en germinación, incluso más preferentemente entre una planta de cebada, la cual ha germinado durante 4 d. Es destacable que el método de detección anteriormente mencionado es particularmente útil. Ante todo, el método analítico es novedoso. Asimismo, es una ventaja significativa del método anteriormente mencionado que se establece para la determinación de niveles de SMM en plantas de cebada en germinación, tales como hojas de plantas de cebada en germinación. El momento de la recogida de muestras de cebada en germinación hace de la preparación una operación inesperadamente limpia para la detección de SMM basándose en la UPLC. Otras muestras, por ejemplo, las muestras de mosto de granos similares, de acuerdo con lo descrito anteriormente, son muy complejas en su composición y pueden, en general, no ser utilizadas en el método de cromatografía mencionado para la determinación de niveles de SMM.

55 Después de la identificación de una planta de cebada que tiene menos de 10 ppmm de SMM, preferentemente SMM no detectable, el gen correspondiente de la MMT o parte del mismo, normalmente se somete a secuenciación para determinar si la planta de cebada en cuestión puede clasificarse como poseedora de una mutación en el gen de la MMT. Luego se seleccionan las plantas de cebada caracterizadas por tener SMM no detectable y en las cuales una

o más bases del gen codificante de la MMT son diferentes en comparación con la secuencia del tipo de tipo silvestre. En este contexto, la secuencia del tipo de tipo silvestre es preferentemente la secuencia encontrada en la correspondiente variedad cultivada de cebada del tipo de tipo silvestre, preferentemente la secuencia proporcionada en el presente documento como la SEC ID NO: 3. Las mutaciones preferidas se han descrito anteriormente en el presente documento.

65 También pueden propagarse los mutantes de cebada seleccionados y puede volver a detectarse el contenido de SMM en las plantas de las generaciones posteriores. Después de la selección de plantas de cebada útiles, éstas

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Tabla 2. Cebadores para amplificación de la secuencia genómica codificante de la MMT de cebada.

Núm. del conjunto del cebador: Extremos del producto de la PCR* Cebador directo (secuencia de ADN 5’→3’)** Cebador inverso (secuencia de ADN 5’→3’)***

1: 1-1462 ATGGCTGCGGCGGCGGGG GACGTGG (SEC ID NO: 37) CCTTCGAAGGGCACCACTTTTC TGC (SEC ID NO: 43)

2: 1268-2214 AGGATTCCAGCAAAGAAAG AAGC (SEC ID NO: 38) CTGGAGAGCACAGTAGTTGCT CAAG (SEC ID NO: 44)

3: 2118-3075 GATTCTTAACCCCAATCCAG AGGC (SEC ID NO: 39) CTGCATAATTTTTGTTTGCCAG AGC (SEC ID NO: 45)

4: 2886-4409 GGGTTTTGTTGAGGACCAA TTTGGC (SEC ID NO: 40) TACACCATTTGAGCTTGGCAGA CT (SEC ID NO: 46)

5: 4301-5188 TGCTGCTTTCGTGAACTTAT T (SEC ID NO: 41) AAAATGGAGGCGTTTACTGCA GAA (SEC ID NO: 47}

6: 5130-6459 CATATGGATCTGGACCGCA GCTTCTT (SEC ID NO: 42) CTAGTTGCTACCATTCACCTTA GCACC (SEC ID NO: 48)

*) Numeración de pares de bases como la de la secuencia genómica para la MMT (SEC ID NO: 3; véase también la FIG. 9). **) Secuencia en el extremo 5’ del fragmento listado en la columna rotulada “extremos del producto de la PCR”. **) Secuencia complementaria en el extremo 3' del fragmento indicado en la columna rotulada “extremos del producto de la PCR”.

Tabla 3. Cebadores para la amplificación de la secuencia de ADNc codificante de la MMT de la cebada.

Núm. del conjunto del cebador: Extremos del producto de RT-PCR* Cebador directo (secuencia de ADN 5’→3’)** Cebador inverso (secuencia de ADN 5’→3’)***

7: 1-69 ATGGCTGCGGCGGCGGGG GACGTGG (SEC ID NO: 49) GTACGCCGCGTCGCCCGACG (SEC ID NO: 57)

8: 1-170 ATGGCTGCGGCGGCGGGG GACGTGG (SEC ID NO: 50) CCGCCGGCGGCGAAGCGCCG (SEC ID NO: 58)

9: 1-200 ATGGCTGCGGCGGCGGGG GACGTGG (SEC ID NO: 51) GTGCGGAAGCACTCGAGCCC (SEC ID NO: 59)

10: 1-221 ATGGCTGCGGCGGCGGGG GACGTGG (SEC ID NO: 52) CGTGGATGCGGAAGTGGAAG (SEC ID NO: 60)

11: 1-247 ATGGCTGCGGCGGCGGGG GACGTGG (SEC ID NO: 53) CTTGGAGGTGGGGGTCGAGGA CGACG (SEC ID NO: 61)

12: 131-200 GGCTCCTCGGCGCCGTGC GACGGCG (SEC ID NO: 54) GTGCGGAAGCACTCGAGCCC (SEC ID NO: 62)

13: 131-221 GGCTCCTCGGCGCCGTGC GACGGCG (SEC ID NO: 55) CGTGGATGCGGAAGTGGAAG (SEC ID NO: 63)

14: 131-247 GGCTCCTCGGCGCCGTGC GACGGCG (SEC ID NO: 56) CTTGGAGGTGGGGGTCGAGGA CGACG (SEC ID NO: 64)

*) Numeración de pares de bases como la de la secuencia genómica para la MMT (SEC ID NO: 3). **) Secuencia en el extremo 5’ del fragmento indicado en la columna rotulada “extremos del producto de la PCR”. **) Secuencia complementaria en el extremo 3' del fragmento indicado en la columna rotulada “extremos del producto de la RT-PCR”.

5 Ejemplo 9

El gen codificante de la MMT del Mutante 8063 de cebada muta en el sitio de corte y empalme 5' del intrón 5

El contenido de SMM en las plántulas de cebada del Mutante 8063 es extremadamente bajo o está ausente (ejemplo

10 3), en línea con la ausencia de la actividad de la MMT (ejemplo 4). Sobre la base de este hallazgo, se investigó si las sustituciones de base en el gen codificante de la MMT fueron causadas por el tratamiento con mutagen de NaN3 original de las pepitas de cebada. En consecuencia, se intentó amplificar, clonar y secuenciar dicho gen del Mutante 8063 a fin de establecer la base molecular para su fenotipo con MMT nula.

15 Una vez que se amplificó con 6 conjuntos de cebadores la secuencia de nucleótidos del gen de tipo silvestre para la MMT de la vc. Prestige (Tabla 2; detallada en el ejemplo 8), se condujo una metodología similar para el Mutante 8063 de cebada. En resumen, se extrajo el ADN genómico del mutante y se insertaron fragmentos amplificados y específicos del gen de la MMT del mismo en el vector pCR2.1-TOPO (Invitrogen, número de catálogo K4500-01), se clonaron, se secuenciaron, se unieron (SEC ID NO: 8) y finalmente se compararon con el de la cebada de tipo

20 silvestre. No se identificó mutación en la parte codificante de la proteína del gen para la MMT. No obstante, len comparación con las secuencias de intrones de los genes mutantes y de tipo silvestre reveló una transición de base G→A en la primera base del intrón 5 (nucleótido núm. 3076 de la SEC ID NO: 8). Dicha base es parte del sitio de corte y empalme 5' del intrón 5 y afecta el procesamiento del ARN primario del gen, es decir, el corte y empalme del ARN (Sinibaldi y Mettler, 1992; véase también la FIG. 12).

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Tabla 7. Cebadores para la detección de SNP del Mutante 8063

Num. delconjunto delcebador: Extremos delproducto de laPCR* Producto final(SEC ID NO:) Cebador directo(secuencia de ADN 5’→3’)**** Cebador inverso(secuencia de ADN 5’→3’)*****

20: 2831-3101 * 33 CGATTCCAGCTTCCGGTTG (SEC ID NO: 77) CATCTAGTCACTCAAAGAATTGCTAC (SEC ID NO: 81)

21: 2831-3101 ** 34 CGATTCCAGCTTCCGGTTG (SEC ID NO: 78) CATCTAGTCACTCAAAGAATTGCTAT (SEC ID NO: 82)

22: 2831-3101** 1361-1483 *** 3436 CGATTCCAGCTTCCGGTTG (SEC ID NO: 79)GGCATCCAGATTCCATCTTCAG (SEC ID NO: 80) CATCTAGTCACTCAAAGAATTGCTAT (SEC ID NO: 83)CTACGGAACAAGAGGTGCCAAT (SEC ID NO: 84)

*) Numeración de pares de base como el de la secuencia de tipo silvestre genómica para la MMT (SEC ID NO: 3).**) Numeración de pares de base como el de la secuencia genómica para la MMT del Mutante 8063 (SEC ID NO: 8).***) Numeración de pares de base como el de la secuencia genómica para la MMT del Mutante 14018 (SEC ID NO: 19).****) Secuencia en el extremo 5' del fragmento indicado en la columna rotulada “extremos del producto de la PCR”.*****) Secuencia complementaria en el extremo 3' del fragmento indicada en la columna rotulada “extremos del producto de la PCR”

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El hecho de emplear el plásmido pET19b-MMT (véase el ejemplo 10) como molde en tres PCR estándares consecutivas con los conjuntos de cebadores núm. 23, 24 y 25 (Tabla 8), generó un fragmento amplificado de 394 pb (SEC ID NO: 30). El mismo se digirió con SacII-BamHI y se ligó con el fragmento grande SacII-BamHI del pET19b-MMT (FIG. 17A), lo que originó el plásmido de expresión pET19b-line14086-Prod6 (FIG. 17B), diseñado

5 para la síntesis de una MMT truncada correspondiente al Producto 6, tal como se ilustró en la FIG. 16B.

Al utilizar el mismo procedimiento que se describió con anterioridad en el presente documento para el fragmento de 394 pb —pero ahora con los conjuntos de cebadores con los números 23, 24 y 26 en tres amplificaciones por PCR consecutivas (Tabla 8)— se generó un fragmento de 376 pb (SEC ID NO: 31), que, ante la digestión con SacII

10 BamHI, se ligó con el fragmento grande SacII-BamHI del pET19b-MMT (FIG. 17A), lo que originó el plásmido de expresión pET19b-line14086-Prod7 (FIG. 17C). Este plásmido de expresión se diseñó para la síntesis de una MMT truncada correspondiente a la que originó el Producto 7, tal como se ilustra en la FIG. 16B.

En un experimento en paralelo —realizado de manera similar al descrito con anterioridad para el pET19b-MMT, pero

15 con los conjuntos de cebadores núm. 27 y 28 (Tabla 8)— se amplificó un fragmento de 325 pb (SEC ID NO: 32) que, ante la digestión con SacII-BamHI, se ligó con el fragmento grande SacII-BamHI del pET19b-MMT (FIG. 17A), lo que originó el plásmido de expresión pET19b-line14086-Prod8 (FIG. 17D) para la síntesis de una MMT truncada correspondiente al Producto 8 (véase FIG. 16B).

20 Tabla 8. Cebadores para la amplificación de los fragmentos de ADN del Mutante 14018 (para construcciones plasmídicas)

Num. del conjunto del cebador: Secuencia del cebador** (secuencia de ADN 5’→3’) Extremos del producto de la PCR** Producto final (SEC ID NO:)

23: Directo: GGCCGCGGGGCTCGAGTGCTTCCGCAC (SEC ID NO: 85) Inverso: CGAGATAAGATAAATATCTACGGAACAAGAGG TGCCAATCTTCGAAGGGCACCACTTTTCTGC (SEC ID NO: 86) 1-27 245-307 30

24: Directo: GGCCGCGGGGCTCGAGTGCTTCCGCAC (SEC ID NO: 87) Inverso: AACCTGAGTAAATGTCTAACTTCTGCAGGTCC CATGTTTGCAACAAACGAGATAAGATAATATCT ACGG (SEC ID NO: 88) 1-27 285-354 30

25: Directo: GGCCGCGGGGCTCGAGTGCTTCCGCAC (SEC ID NO: 89) Inverso: GGATCCCTACTGGCAGACACCTAAAAGTTTCA TATAAAGTAACCTGAGTAAATGTCTAACTTCTG (SEC ID NO: 90) 1-27 329-394 30

26: Directo: GGCCGCGGGGCTCGAGTGCTTCCGCAC (SEC ID NO: 91) Inverso: GGATCCTTATATCCAGACCATAAACCTGAGTAA ATGTCTAACTTCTGC (SEC ID NO: 92) 1-27 329-376 31

27: Directo: GGCCGCGGGGCTCGAGTGCTTCCGCAC (SEC ID NO: 93) Inverso: AGGTTTATCCATGCAATCTTGATAQCTCTTGGG TTTATATCCAGACCATAAACCATTGCCACATCC CAGCTCTGCTACTG (SEC ID NO: 94) 1-27 198-277 32

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Tabla 9. Cebadores para la detección SNP del Mutante 14018.

Num. del conjunto del cebador: Extremos del producto de la PCR Producto final(SEC ID NO:) Cebador directo(secuencia de ADN 5’→3’)**** Cebador inverso(secuencia de ADN 5’→3’)*****

29: 1361-1481 * 35 GGCATCCAGATTCCATCTTCAG (SEC ID NO: 97) CTACGGAACAAGAGGTGCCAAC (SEC ID NO: 101)

30: 1361-1483 ** 36 GGCATCCAGATTCCATCTTCAG (SEC ID NO: 98) CTACGGAACAAGAGGTGCCAAT (SEC ID NO: 102)

31: 1361-1483 ** 2831-3101 *** 3634 GGCATCCAGATTCCATCTTCAG (SEC ID NO: 99)CGATTCCAGCTTCCGGTTG (SEC ID NO: 100) CTACGGAACAAGAGGTGCCAAT (SEC ID NO: 103)CATCTAGTCACTCAAAGAATTGCTAT (SEC ID NO: 104)

*) Numeración de pares de base como el de la secuencia de tipo silvestre genómica para la MMT (SEC ID NO: 16).**) Numeración de pares de base como el de la secuencia genómica para la MMT del Mutante 14018 (SEC ID NO: 19).***) Numeración de pares de base como el de la secuencia genómica para la MMT del Mutante 8063 (SEC ID NO: 8).****) Secuencia en el extremo 5' del fragmento indicado en la columna rotulada “extremos del producto de la PCR”.*****) Secuencia complementaria en el extremo 3' del fragmento indicada en la columna rotulada “extremos del producto de la PCR”

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Claims

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