CN118048470A - 甘蓝型油菜调控含油量积累基因BnLEC1分子标记的开发与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及甘蓝型油菜基因育种技术领域，尤其涉及甘蓝型油菜调控含油量积累基因BnLEC1分子标记的开发与应用。本发明发现BnLEC1‑A07启动子区域16626069位碱基处出现265bp的插入片段，该位点的变异导致1.3‑2.0百分点的含油量差异。这种基于重测序挖掘的InDel可以在分子水平准确的鉴定品种间的含油量差异。针对此处变异，申请人设计一对适用于选育高含油量性状的甘蓝型油菜InDel分子标记，可直接通过PCR技术对材料进行分型，加快育种进度。通过我们开发的分子标记辅助选择，可以在前期迅速、便捷、定向、省力的筛选出高含油量油菜材料，加快高含油品种选育进程。
Description
技术领域
本发明涉及甘蓝型油菜基因育种技术领域，尤其涉及甘蓝型油菜调控含油量积累基因BnLEC1分子标记的开发与应用。
背景技术
含油量是油菜主要的农艺性状，也是产量构成的主要因素，含油量每增加1％，相当于油菜增产2.3％至2.5％，所以提高种子含油量是增加油菜单产的有效方法之一。
植物油脂的合成过程复杂，涉及到多种酶的催化作用。编码这些酶类物质的基因表达或调控发生变化都有可能会使油脂合成受到影响。目前，越来越多的油脂代谢相关基因被鉴定和验证,对油脂合成过程的分子机制也逐渐明晰，这对筛选和培育高含油量品系油菜具有重大意义。LEC1(Leafy cotyledon 1)是胚胎发生发育过程关键的调控因子，对脂肪酸的合成起着重要调控作用，其编码一个与HAP3亚基同源的模序(motif)，可以同相关基因启动子CCAAT-box特异性结合，激活或增强该基因的表达。LEC1通过调控参与糖酵解和脂肪酸合成途径的关键酶编码基因表达，增加参与油脂合成途径的碳源，促进植物油脂的积累。Tan等的研究表明过表达BnLEC1可以提高2％-20％的种子含油量(Tan et al.,2011)，LEC1是调控油菜甘油酯合成的关键基因。
DNA分子标记是建立在DNA分子多态性基础上的遗传标记，直接反映了生物体DNA水平的遗传多态性，具有不受环境条件和生长阶段影响及快速、准确等优点，可作为作物遗传育种中辅助选择的重要方法。相比于传统育种方法，分子标记辅助选择育种能极大的节省劳动力和减少育种年限，但相对于水稻、玉米、大豆、小麦等作物，分子标记在油菜研究中的应用起步较晚，目前主要集中在遗传多样性方面，针对油菜基因序列开发的功能标记数量有限，限制了分子标记辅助育种在油菜中的应用。
InDel作为高通量分子标记,兼具各类遗传标记的优点。传统分子标记开发一般只基于一份序列,而InDel标记开发完全基于序列差异,所以开发过程中无多型位点较少。与其他分子标记相比,InDel标记准确性高、变异稳定,避免了由于特异性和复杂性导致的后续分析模糊。InDel标记本质上仍属于长度多态性遗传标记,可基于PCR扩增技术对InDel进行分型。与分型系统复杂的SNP标记相比,InDel检测简单便捷,对仪器设备和技术要求较低,在电泳技术平台上即可进行同时InDel标记的扩增产物带型清晰简单,其稳定性和产物分离效果明显，一些扩增产物较短的InDel标记对DNA质量要求较低,且对样品量要求较少,能扩增高度降解的DNA。
InDel标记开发方法一般是先获取相关DNA序列,通过BLAST比对分析筛选InDel位点,进而根据InDel位点两端的序列设计引物来扩增这些插入/缺失位点。但对于非模式植物或基因组测序深度不够的植物来说，开发InDel标记的精确度就有失偏颇。
发明内容
为了解决上述的技术问题，本发明的目的是提供一种与甘蓝型油菜调控含油量积累相关的InDel位点基因，该InDel位点基因为BnLEC1-A07启动子区域16626069位碱基处出现的265bp插入片段，所述插入片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。该位点的变异导致1.3-2.0百分点的含油量差异。这种基于重测序挖掘的InDel可以在分子水平准确的鉴定品种间的含油量差异。
进一步，本申请还公开了所述的InDel位点基因在制备筛选提高甘蓝型油菜含油量积累的检测试剂中的应用。
进一步，本申请还公开了一种检测所述的InDel位点基因的引物对。
作为优选，所述的引物对的上游引物的核苷酸序列为：5’-TGCATCGGTTTTACAGATTATC-3’，下游引物的核苷酸序列为5’-AGGCACTTATTATTTGATTACCA-3’。
进一步，本申请还公开了所述的引物对扩增的扩增片段，扩增片段的长度为640bp，核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
进一步，本申请还公开了一种包含所述的引物对的试剂盒。
进一步，本申请还公开了所述的InDel位点基因、所述的引物对或所述的试剂盒在提高甘蓝型油菜含油量积累遗传育种中应用。
进一步，本申请还公开了一种筛选提高甘蓝型油菜含油量积累的方法，该方法包括以下的步骤：
1)提取甘蓝型油菜DNA；
2)利用所述的引物对进行PCR扩增，对扩增产物中所述的InDel位点基因进行检测，从而筛选筛选甘蓝型油菜含油量积累性状。
作为优选，所述的引物对的上游引物的核苷酸序列为：5’-TGCATCGGTTTTACAGATTATC-3’，下游引物的核苷酸序列为5’-AGGCACTTATTATTTGATTACCA-3’。
作为优选，PCR扩增体系如下：
PCR程序如下:
本申请由于采用了上述的技术方案，发现BnLEC1-A07启动子区域16626069位碱基处出现265bp的插入片段，该位点的变异导致1.3-2.0百分点的含油量差异。这种基于重测序挖掘的InDel可以在分子水平准确的鉴定品种间的含油量差异。针对此处变异，申请人设计一对适用于选育高含油量性状的甘蓝型油菜InDel分子标记，可直接通过PCR技术对材料进行分型，加快育种进度。通过我们开发的分子标记辅助选择，可以在前期迅速、便捷、定向、省力的筛选出高含油量油菜材料，加快高含油品种选育进程。
附图说明
图1.分子标记在两种不同类型油菜中PCR扩增情况。其中H2O表示空白对照，各品种编号与表1相同。
具体实施方式
下面结合本发明实施例，将实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护范围。
1.关联群体的含油量表型的测定
(1)对505份核心种质材料(来自湖南省湖南农业大学农学院)的农艺和品质性状进行田间考种分析，在恩施市，南京市和武昌市油菜基地完成表型鉴定。
(2)采用直播定苗,行距40cm,株距25cm，行长3.5m，每个小区4行。试验材料田块四周种植保护行2行。
(3)含油量：在植株正常成熟后，每个小区取10株甘蓝型油菜，使用近红外扫描仪测定各成熟干净种子的含油量，单位为％。删除缺失值，删除含有杂合位点的材料后共得到465份材料的含油量数据，将465份材料的在3个环境下的表型值取平均，结果汇总如下：
表1 465份材料的在3个环境下的含油量表型
注：REF表示参考基因组，Insert表示有265bp碱基序列插入。
关联群体的含油量分布结果表明含油量性状表现分布呈连续性分布，呈正态分布，证明含油量性状属于数量性状且存在主效基因位点。
2.关联群体高质量SNP数据集的获得
采用CTAB方法提取叶片总DNA，提取关联群体的每份材料的叶片总DNA，具体方法为：
2％CTAB缓冲液配制方法如下：
| CTAB缓冲液 | 1000mL | 终浓度 |
| Tris-HCI(Imol/L PH8.0) | 100mL | 100m mol/L |
| EDTA(0.5mol/L PH8.0) | 40mL | 20m mol/L |
| Nacl | 81.82g | 1.4mol/L |
| CTAB | 20g | 2％(W/V) |
加超纯水将溶液定容至L。高温高压灭南后，室温保存。
步骤：
(1)、将植物组织叶片和研磨珠置于2mL离心管中，加入600μL CTAB,65℃水浴1h(每20min反转摇匀一次)；
(2)、加600μL的氯伤-异戊醇(体积比24：1)，顾倒混匀，12000pm离心1530min,取上清于新管中(可以用剪去演部约0.8cm的1mL枪头小心将上层液相转移至一干净的离心管中)；
(3)、向上清中加入2倍体积的无水乙醇(或2/3体积的异丙醇)沉淀DNA,-20℃放置20min或过夜，12000pm离心5min,去上清(若有较多DNA析出，或提前预冷无水乙醇，4℃离心DNA,则不用长时间沉淀)；
4)、加入1000μL 75％无水乙醇，涡旋震荡5s,12000pm离心5mn,去上清，开盖2h晾干残余乙醇；
(5)、加入40μL TE援冲液或ddH20,可65℃水箔10-60min溶解DNA,DNA提取物于-20C保存，取2.5μL电泳检测。
然后将DNA样品干冰运输至测序公司(天津极智基因科技有限公司)，每个材料测序深度大约为50×。
3.基因组结构性变异(SV)检测
对原始illumina read，我们使用Trimmomatic(版本0.36，各项参数为：LEADING:3TRAILING:3SLIDINGWINDOW:4:15MINLEN:120)进行质量检查和修剪两端的低质量区域，得到clean reads。利用Sentieon DNASeq软件中的BWA将clean reads定位到甘蓝型油菜品种中双11(ZS11)参考基因组。使用四种工具Delly(版本0.8.3)，Lumpy(版本0.2.13)，Manta(版本1.6.0)和Pindel(版本0.25b9)来分析SVs(>10bp，<1M)。
为得到SVs(>10bp，<1M)，我们使用了四种工具:Delly(版本0.8.3)，Lumpy(版本0.2.13)，Manta(版本1.6.0)和Pindel(版本0.25b9)。为了去除假变异体，我们使用delly和manta，只保留了匹配默认过滤标准的‘PASS’SVs。将Lumpy检测到的SVs用SR>0进行筛选，然后用SVTyper在群体中进行基因分型。我们还纳入了由Sentieon检测到的插入和缺失。使用SURVIVOR(版本1.0.7)将由不同工具和样本调用的SV进行合并，并带有以下参数:“SURVIVOR合并文件50(用于indel)/500(用于for duplication,inversion和translocation1)。对于indels and duplications，由在删除和重复类别中被评估为更好算法的Lumpy或Manta获得“SUPP＝1”突变。
为了评估我们的SV检测方法的效率和准确性，我们比较了两个来自illuminareads的SV数据集与我们上面所得到的数据和来自pacbio reads的SV数据集。首先，我们从公开数据库中获取了一株名为Wester的油菜品种的illumina测序reads和PacBio测序reads。对于illumina配对端reads，我们采用多软件联合方法检测SV。使用minimap2(版本2.24)将pacbio reads定位到ZS11参考基因组，使用Sniffles(版本1.0.12)调用SV。我们使用SURVIVOR检测两个SV数据集之间的存在高度重叠。
利用上述方法，我们发现位于发现BnLEC1-A07启动子区域16626069位碱基处出现265bp的插入片段，该片段的具体序列如表2。
表2
该位点变异导致1.3-2.0百分点的含油量变异，如表3：
表3
针对此处InDel，我们设计一对能够特异性扩增的引物对，并将其取名为：LEC1-177其具体信息如表4所示。
表4
PCR扩增序列信息如下如表5所示。
表5
注：以上序列信息来源于ZS11参考基因组(Brassica napus pan-genomeInformation Resource(BnPIR))(hzau.edu.cn)。
4.分子标记可行性检测
为验证此分子标记的可行性，我们从两个不同分型的油菜品种中各随机选取了9个品种进行种植，油菜品种统计信息如表6。
表6
注：0|0表示没有碱基序列插入，1|1表示有265bp碱基序列插入，含油量单位为％且都保留两位有效数字，*代表两种基因型具有含油量差异，其中**p≤0.01,***p≤0.001
对上述材料的油菜幼苗用CTAB法(详见第二步)提取DNA并进行PCR扩增。使用的是从南京诺唯赞生物科技有限公司购买的高纯度耐热DNA聚合酶：2×Taq Plus Master MixⅡ(Dye Plus)，PCR扩增体系如下：
PCR程序如下:
对PCR产物进行凝胶电泳，1％琼脂糖凝胶制备方法如下：
在天平上放入称量纸用，称取1.2g琼脂糖，并用量简倒120ml 1XTAE溶液。将120ml
1XTAE溶液和1.2g琼脂糖加入锥形瓶中，放入微波炉中加热溶解，配置成1％琼脂糖凝胶，稍凉后加入4核酸染液，振荡混匀。将电泳模板两端密封放好，倒入琼脂糖凝胶溶液，插入梳子，等待凝胶冷却。
凝胶凝胶电泳图(图1)可以很明显的将两种类型油菜区分开来，且在图中可以看出两种类型的油菜的bp数差异约为265bp。
本发明基于甘蓝型油菜基因组中碱基序列的插入和缺失，定位到一个可以影响油菜含油量的InDel位点，并以此设计InDel标记，此标记的PCR扩增结果表明此标记的可行性。通过我们开发的分子标记辅助选择，可以在前期迅速、便捷、定向、省力的筛选出高含油量油菜材料，加快高含油品种选育进程。
以上为对本发明实施例的描述，通过对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的。本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施列，而是要符合与本文所公开的原理和新颖点相一致的最宽的范围。
Claims (10)
1.一种与甘蓝型油菜调控含油量积累相关的InDel位点基因，该InDel位点基因为BnLEC1-A07启动子区域16626069位碱基处出现的265bp插入片段，所述插入片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.权利要求1所述的InDel位点基因在制备筛选提高甘蓝型油菜含油量积累的检测试剂中的应用。
3.一种检测权利要求1所述的InDel位点基因的引物对。
4.根据权利要求3所述的引物对，其特征在于，所述的引物对的上游引物的核苷酸序列为：5’-TGCATCGGTTTTACAGATTATC-3’，下游引物的核苷酸序列为5’-AGGCACTTATTATTTGATTACCA-3’。
5.权利要求3所述的引物对扩增的扩增片段，其特征在于，扩增片段的长度为640bp，核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
6.一种包含权利要求3或4所述的引物对的试剂盒。
7.权利要求1所述的InDel位点基因、权利要求3或4所述的引物对或权利要求6所述的试剂盒在提高甘蓝型油菜含油量积累遗传育种中应用。
8.一种筛选提高甘蓝型油菜含油量积累的方法，其特征在于，该方法包括以下的步骤：
1）提取甘蓝型油菜DNA；
2）利用权利要求3或4所述的引物对进行PCR扩增，对扩增产物中的如权利要求1所述的InDel位点基因进行检测，从而筛选筛选甘蓝型油菜含油量积累性状。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的引物对的上游引物的核苷酸序列为：5’-TGCATCGGTTTTACAGATTATC-3’，下游引物的核苷酸序列为5’-AGGCACTTATTATTTGATTACCA-3’。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，PCR扩增体系如下：
；
PCR程序如下:
。
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