CN115058533B - 用于燕麦茎中基因表达分析的内参基因及应用 - Google Patents

用于燕麦茎中基因表达分析的内参基因及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了用于燕麦茎中基因表达分析的内参基因及应用。属于分子生物学技术领域。本发明提供了一组燕麦茎内参基因，所述内参基因为AsFPGS‑1D1RF和AsTUA5‑2C3RF。本发明解决了现有燕麦荧光定量PCR实验中没有可靠内参基因的现状；筛选出的内参基因适用于分析功能基因在燕麦茎中的表达水平，能够提高检测结果的可靠性、稳定性和重复性。

Description

用于燕麦茎中基因表达分析的内参基因及应用
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，更具体的说是涉及用于燕麦茎中基因表达分析的内参基因及应用。
背景技术
尽管近几年来燕麦基因组数据已有所发表，但总的来说，我们对燕麦植物的基因信息知之甚少，这不利于燕麦优良基因的发掘，也制约了该物种生物学过程的分子机制的研究。
研究燕麦基因功能需要对基因表达进行分析，而研究相关基因的表达需要良好的内参基因进行数据校正和归一化。现如今，随着分子生物学的发展，植物中内参基因的研究越来越多，而有关燕麦单拷贝内参基因的研究鲜有报道，导致燕麦基因表达研究无单拷贝内源参考基因作为参考定量。
目前国内外对于燕麦内参基因的研究还很少，这对燕麦功能基因的挖掘造成很大的阻碍。究其原因可能由于燕麦基因组数据近几年来才逐渐完善，之前我们只能依据一组种子中的转录组数据，并且前人研究认为，内参基因的选择应尽量为拷贝数少的基因，原因是多拷贝内参基因各拷贝常表现为组织特异性，在植物的同一组织或不同组织中表达量会出现差异，导致整体多拷贝内参基因的准确性极具风险，但这对于多倍体植物燕麦来说选择合适的单拷贝内参基因十分不易。
综上，如何提供一种燕麦单拷贝内参基因是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了用于燕麦茎中基因表达分析的内参基因及应用。
理想的内参基因是在不同胁迫条件、不同组织、不同时期均能恒定表达。但研究证明，传统内参基因存在一些弊端，这些内参基因不能在各种状态下表达量始终保持稳定，换句话说，没有通用的内参基因适合于所有研究对象。目前，很多研究都对以上观点做了证实，比如赵小龙等分析了RPL4、RPB2、18SRNA、GAPDH、EF1α等10个内参基因，在茯苓不同生长时期中，28SRNA基因表达最稳定；在茯苓的不同组织中，28SRNA和α-TUB作为组合结果更为精准；在不同逆境环境中，GAPDH和ACT作为内参组合更好；在所有的样品中，α-TUB基因最为稳定。唐枝娟等人分析了18SRNA、GAPDH、EF1α等6个在水稻中常用的内参基因，在白叶枯病菌侵染下的水稻叶片中，EF1α、ACT、TUB三个内参基因表达量最稳定。陈贤等人分析了25SRNA、UBC、UBQ-5、等10个常见的内参基因，在水稻叶片用褪黑素处理的不同天数中，e1F-4a和UBQ-5组合最适合作为内参。安红强等人筛选了26个表达稳定的基因以及5个传统内参基因，在铁皮石斛原球茎的发育时期中，ASS和APH1L两个基因作为内参组合最好；在所有实验样品中，传统内参基因稳定性比新型内参基因稳定性差。付媛媛等人分析了β-actin、Actin2、MSC27等8个内参基因，在紫花苜蓿不同组织和不同胁迫处理下，MSC27、Actin2、18SRNA、EF1α四个内参基因是表达量最稳定的基因。类似情况也存在于蚕豆和萱草中。
燕麦茎的特性直接关系着燕麦抗倒伏及生物量，因此研究茎发育基因对改良燕麦有重要意义。但由于同一物种不同胁迫条件、不同组织、不同时期的内参基因不同，因此为了研究燕麦茎中基因的表达，我们需要筛选燕麦茎部不同时期适合的内参基因。
本发明基于燕麦基因组数据，通过基因克隆的方法获得候选内参基因，分别提取燕麦苗期、分蘖期和成熟期三个时期的茎，共计三份材料，设计合适的特异引物，结合内参基因稳定性评估软件geNorm、NormFinder和BestKeeper，筛选出在燕麦茎中的最适内参基因组合，为后续研究燕麦基因表达分析提供合适的内参基因作为参照。
由于燕麦是典型的异源六倍体植物，亚基因组中的直系同源基因在序列上有很高的相似性，本发明对这些直系同源基因进行了表达分析，揭示了多拷贝内参基因在多倍体植物燕麦中存在的风险性，为今后燕麦基因表达分析提供更加准确的内参基因。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
用于燕麦茎中基因表达分析的内参基因，所述内参基因为AsFPGS-1D1RF和AsTUA5-2C3RF；其中，
AsFPGS-1D1RF的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
TTAACCGTACTGATCCCTTACCAGACGAGTTCATTAAAGGGCTCTCAAGTGCTTCTTTGCAAGGCCGAGCACAAATTGTTCCAGATTCACAAGTAAATTCTGAAGAGAAGGACCGAGATTGTTCTTTA；SEQ ID NO:1；
AsTUA5-2C3RF的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
GGCCACTACACTGTTGGAAAGGAGATCGTAGATCTATGTCTGGATCGTGTACGCAAGTTGGCGGACAATTGCACCGGGCTGCAGGGATTCTTGGTGCTCAATGCTGTTGGTGGTGGAACT；SEQ ID NO:2。
所述内参基因AsFPGS-1D1RF和AsTUA5-2C3RF在分析燕麦茎中基因表达模式中作为内参基因。
传统内参基因通常为单一内参基因，但张艳君通过研究人肝癌细胞时发现，将两个内参基因RPL13A和UBC共同用于荧光定量PCR对目的基因表达量进行归一化分析，比使用单一的传统内参基因结果更为准确。现如今，很多学者认为，在基因表达分析过程中，引入两个或者三个内参基因作为组合会使实验结果准确性更高，尤其是对于差异很小的目的基因来说尤为关键。因此，本发明结合GeNorm、NormFinder和Bestkeeper评估候选内参基因表达的稳定性，筛选出了合适的内参基因组合。
进一步的，AsFPGS-1D1RF的实时荧光定量PCR引物序列见SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4；
TTAACCGTACTGATCCCTTA；SEQ ID NO:3；
TAAAGAACAATCTCGGTCCT；SEQ ID NO:4；
AsTUA5-2C3RF的实时荧光定量PCR引物序列见SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6；
GGCCACTACACTGTTGGAAA；SEQ ID NO:5；
AGTTCCACCACCAACAGCAT；SEQ ID NO:6。
上述内参基因在燕麦茎中基因表达分析中的应用。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明取得的有益效果为：本发明从多达10个候选内参基因中筛选出表达最稳定的燕麦内参基因，以及基于内参基因序列设计的实时荧光定量PCR引物，解决了现有燕麦荧光定量PCR实验中没有可靠内参基因的现状。筛选出的内参基因适用于分析功能基因在燕麦茎中的表达水平，能够提高检测数据的可靠性、稳定性和重复性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明实施例1燕麦部分组织RNA提取的电泳图，其中，M：DL2000 DNAMarker；1：28S rRNA；2：18S rRNA；
图2附图为本发明实施例1燕麦PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测图，其中，M：DL2000DNA Marker；1：AsEF1A-4C1RF；2：AsACT11-5D1RF；3：AsACT11-5D2RF；4：AsTUA5-2C1RF；5：AsTUA5-2C3RF；6：AsGAPDH-7C1RF；7：AsGAPDH-7C2RF；8：AsEEF1A-5D1RF；9：AsFPGS-1D2RF；10：AsTUB6-3D1RF；11：AsUCH-4D2RF；12：AsFPGS-1D1RF；13：AsWDR-3C1RF；14：AsTUA5-6ARF；15：AsTUA5-7CRF；
图3附图为本发明实施例1所有基因的溶解曲线；
图4附图为本发明实施例1geNorm分析茎组结果，其中，a：geNorm程序分析候选内参基因稳定性；b：geNorm程序分析确定最适内参基因数目；
图5附图为本发明实施例1NormFinder分析茎组结果；
图6为本发明实施例1核苷酸序列比对结果，其中，黄色框为AsTUA5-2C1RF基因的左右引物；红色框为AsTUA5-6ARF基因的左右引物；绿色框为AsTUA5-7CRF基因的左右引物。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
植物材料：
试验材料为六倍体裸燕麦“白燕2号”。
将燕麦“白燕2号”的种子放在铺有湿润滤纸的培养皿中，置于培养箱中萌发，待株高五厘米移入培养土中，于20℃培养箱中培养。待幼苗生长7天，取燕麦幼苗的茎，经液氮速冻后于-80℃保存备用；待燕麦植株分蘖出节间和腋芽时，取燕麦植株的茎，经液氮速冻后于-80℃保存备用；待燕麦植株拔节抽穗、开花授粉后，取燕麦植株的茎，经液氮速冻后于-80℃保存备用；共计3份材料。
主要试剂：
2×Taq PCRMix购于博迈德生物公司；
琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购于江苏康为世纪公司；
DNA Marker、6×Loading Buffer、M13通用引物均购于北京全式金生物技术有限公司；
反转录试剂盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect RealTime)RR047A、PmdTM 18-T Vector Cloning Kit 6011、TB GreenTM Premix Ex TaqTMⅡ(TliRNaseH Plus)RR820A、1～2×109Bacteria/ml感受态细胞(E.coli JM109)均购于Takara公司。
实施例1
燕麦组织RNA质量检测
将三份植物材料(燕麦的苗期、分蘖期和成熟期的茎)按照Trizol法提取总RNA，使用分光光度计和琼脂糖电泳检测RNA浓度、纯度和完整度。
将提取的燕麦RNA进行电泳检测(图1)，28S、18S条带清晰，表明RNA完整性较好。
使用分光光度计检测显示，A260/280介于1.9～2.1之间，A260/230介于2.0～2.2之间，表明RNA纯度较好。
待RNA质量合格后，按照反转录试剂盒PrimeScriptTMRT reagentKit with gDNAEraser(Perfect Real Time)RR047A的说明书，将总量为1μg的总RNA反转录为cDNA。最终获得的cDNA于-20℃下保存备用。
引物设计
选择已测序的拟南芥(Arabidopsis thaliana)、玉米(Zea mays)、水稻(Oryzasativa)常见的内参基因EF1A、ACT11、TUB6、TUA5、UCH、FPGS、WDR、GAPDH，依据相应的基因编号在NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中获取它们的CDS序列。将这些基因的编码区序列通过本地blast与燕麦基因组OT3098数据库(https://wheat.pw.usda.gov/)进行比对，选择匹配度高的燕麦基因，在高度相似的基因拷贝中特异扩增一个拷贝作为候选内参基因。遵循GC含量在45％～55％之间、引物长度为20bp、扩增长度在100～300bp、特异扩增单一基因来设计引物，引物的相关信息见表1。其中AsUCH-4ARF、AsUCH-4CRF这两个基因是同AsUCH-4D2RF高度相似的基因；AsTUA5-7CRF、AsTUA5-6ARF这两个基因是同AsTUA5-2C1RF高度相似的基因，用于多拷贝基因各拷贝间表达稳定性比较。
表1引物的相关信息
引物特异性检验
以上述获得的cDNA为模板对候选内参基因引物进行特异性检测。
反应体系为：12.5μL 2×Taq PCR Mix；2μL cDNA模板；左右引物各1μL；8.5μLddH2O；总体系25μL。
扩增程序：94℃预变性4min；94℃变性45s；表1中对应的退火温度45s；72℃延伸20s；30个循环，72℃进一步延伸10min；12℃保存。
扩增反应结束后，用1％的琼脂糖电泳检测。将电泳检测结果良好的基因进行胶回收，按照琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明进行操作，将回收得到的目的基因与载体连接，之后转化到大肠杆菌中培养阳性单菌落，送华大基因公司测序，测序结果与预期相同的引物可用于后续实验。
以燕麦cDNA为模板进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示。图2结果表明，引物特异性良好，13个候选内参基因以及AsTUA5-6ARF、AsTUA5-7CRF两个基因片段大小与预期一致，且测序结果也与预期相同，表明13个候选内参基因以及AsTUA5-6ARF、AsTUA5-7CRF两个基因均可用于后续操作。
荧光定量PCR分析
使用Takara公司的TB GreenTM Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)RR820A试剂盒，反应设置3个重复。
反应体系为：10μL SYBR Premix Ex TaqⅡ；2μL cDNA模板；左右引物各0.8μL；6.4μL ddH2O；总体系20μL。
qPCR反应程序为：95℃预变性30s；95℃变性5s；表1中对应的退火温度45s；延伸20s；40个循环。
扩增结束后由60℃递进到95℃收集荧光信号。
荧光定量分析结果如图3所示，结果表明，13对候选内参基因引物以及AsUCH-4ARF、AsUCH-4CRF、AsTUA5-6ARF、AsTUA5-7CRF四对基因引物溶解曲线为单一峰，峰位基本重合，曲线平滑，同时也没有引物二聚体产生，进一步说明引物特异性良好，表明荧光定量PCR的结果可靠。
内参基因稳定性分析
采用geNorm、NormFinder和BestKeeper三种内参基因评估方法。
geNorm程序是可给出候选内参基因在不同条件下的M值，M值大于1.5的候选内参基因应被排除，排除后再对剩余的候选内参基因重新进行计算，M值越小表示稳定性越好。同时，geNorm软件还引入了V值，当Vn/Vn+1>0.15时，说明最适内参基因个数为n+1个；当Vn/Vn+1<0.15时，说明最适内参基因个数为n个。
NormFinder分析能够给出一个最适内参基因。
BestKeeper分析通过给出变异系数(CV)和标准偏差(SD)来确定稳定性，数值越小代表稳定性越好。
最终结果结合三大分析综合评价。
茎组结果分析
(1)geNorm分析结果
在燕麦的苗期、分蘖期和成熟期的茎中，除AsTUA5-2C1RF(3.648)、AsTUB6-3D1RF(1.688)、AsEEF1A-5D1RF(1.725)外，其余10个内参基因的M均小于1.5，表明10个候选基因均符合内参的基本条件，这10个基因的表达稳定性依次是(图4a)：AsFPGS-1D1RF(0.637)>AsTUA5-2C3RF(0.69)>AsACT11-5D2RF(0.774)>AsUCH-4D2RF(0.776)>AsFPGS-1D2RF(0.822)>AsGAPDH-7C2RF(0.842)>AsGAPDH-7C1RF(0.843)>AsACT11-5D1RF(0.883)>AsEF1A-4C1RF(1.188)>AsWDR-3C1RF(1.288)。10个内参基因配对差异分析(图4b)：V2/3<0.15，故以最稳定的AsFPGS-1D1RF和AsTUA5-2C3RF这2个基因组合。
(2)NormFinder分析结果
在燕麦的苗期、分蘖期和成熟期的茎中，13个基因的表达稳定性依次是(图5)：AsTUA5-2C3RF(0.009)>AsACT11-5D1RF(0.010)>AsFPGS-1D1RF(0.021)>AsACT11-5D2RF(0.023)>AsUCH-4D2RF(0.026)>AsGAPDH-7C2RF(0.038)>AsFPGS-1D2RF(0.043)>AsEF1A-4C1RF(0.045)>AsGAPDH-7C1RF(0.046)>AsTUB6-3D1RF(0.055)>AsEEF1A-5D1RF(0.065)>AsWDR-3C1RF(0.075)>AsTUA5-2C1RF(0.141)，最佳基因为AsTUA5-2C3RF。
(3)BestKeeper分析结果
由BestKeeper分析结果显示(表2)，AsGAPDH-7C1RF、AsACT11-5D1RF、AsEF1A-4C1RF、AsFPGS-1D2RF、AsACT11-5D2RF、AsFPGS-1D1RF、AsGAPDH-7C2RF、AsWDR-3C1RF、AsUCH-4D2RF、AsTUA5-2C3RF这10个基因的SD值小于1，符合作为内参基因的要求。
表2BestKeeper分析茎组结果
注：1-13分别是AsGAPDH-7C1RF、AsACT11-5D1RF、AsEF1A-4C1RF、AsEEF1A-5D1RF、AsFPGS-1D2RF、AsACT11-5D2RF、AsFPGS-1D1RF、AsGAPDH-7C2RF、AsWDR-3C1RF、AsUCH-4D2RF、AsTUA5-2C3RF、AsTUA5-2C1RF、AsTUB6-3D1RF。
综合三大软件分析结果，在燕麦茎组中，最适内参基因组合是AsFPGS-1D1RF及AsTUA5-2C3RF。
直系同源基因稳定性分析
燕麦是典型的异源六倍体植物，亚基因组中的同源基因在序列上有很高的相似性，为了研究这些直系同源基因在表达模式上是否一致，我们对来自于不同亚基因组的同源基因进行了表达分析。
结果发现AsUCH-4ARF、AsUCH-4CRF这两个基因与同源基因AsUCH-4D2RF在基因表达稳定性上一致，而AsTUA5-2C1RF作为本发明的候选内参基因，在所有样品组中无论是geNorm分析还是BestKeeper分析均未达到作为内参基因的理想条件，表明该基因在所有样品组中表达稳定性并不理想，但与其同源的AsTUA5-7CRF、AsTUA5-6ARF这两个基因在所有样品组中表达较为稳定。AsTUA5-2C1RF、AsTUA5-7CRF、AsTUA5-6ARF这三个基因同源性在80％以上，其中AsTUA5-2C1RF和AsTUA5-7CRF同源性高达95％(图6)。将这三个基因在所有样品组中通过BestKeeper分析(表3)，AsTUA5-2C1RF基因SD值大于1，不符合作为内参基因的条件，但AsTUA5-7CRF、AsTUA5-6ARF的SD值小于1，表明就BestKeeper分析而言AsTUA5-7CRF的表达稳定性优于AsTUA5-6ARF，更优于AsTUA5-2C1RF。由此也以看出，即便是基因序列极其相似、高度同源的各拷贝，基因表达稳定性也可能具有很大差别。
表3BestKeeper分析在所有样品中3个基因表达稳定性
本发明通过比较燕麦两组高度相似的基因表达稳定性发现AsUCH-4ARF、AsUCH-4CRF和AsUCH-4D2RF这一组同源基因表达稳定性极其相近，但AsTUA5-7CRF、AsTUA5-6ARF和AsTUA5-6ARF这一组同源基因存在表达稳定性差异。AsTUA5-2C1RF在所有样品组中稳定性很差，甚至达不到理想内参基因的标准，但AsTUA5-7CRF、AsTUA5-6ARF这两个基因却很稳定，可见高度同源的基因之间表达稳定性的确存在差异。我们猜测，可能是AsTUA5-7CRF、AsTUA5-6ARF和AsTUA5-6ARF基因的启动子存在着差异，从而导致了基因转录水平的不同。由此可见，不同亚基因组的同源基因在作为内参基因的选择上要分开考虑，避免出现同源基因差异表达的情况，进而影响基因表达分析结果的准确性。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 吉林省白城市农业科学院（吉林省向日葵研究所）
<120> 用于燕麦茎中基因表达分析的内参基因及应用
<160> 36
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 128
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttaaccgtac tgatccctta ccagacgagt tcattaaagg gctctcaagt gcttctttgc 60
aaggccgagc acaaattgtt ccagattcac aagtaaattc tgaagagaag gaccgagatt 120
gttcttta 128
<210> 2
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggccactaca ctgttggaaa ggagatcgta gatctatgtc tggatcgtgt acgcaagttg 60
gcggacaatt gcaccgggct gcagggattc ttggtgctca atgctgttgg tggtggaact 120
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttaaccgtac tgatccctta 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
taaagaacaa tctcggtcct 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggccactaca ctgttggaaa 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
agttccacca ccaacagcat 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ccaccaaata ctactgcacg 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
catccatctt gttgcagcag 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ccctttgaga tccacatctg 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tgctggaatc catgagacca 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ttacgagtct acaaggtaca 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
aacagatgtg gatctcaaag 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tttccaacag tgtagtggcc 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
caacacgttc ttcagcgaga 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
agttggagta gcacacgatg 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tttccaacag tgtagtggcc 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tgcccagcga tacctctgtt 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gggagatgag ctgctctgta 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
agctttggag acctgaacca 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
cggcacacat catgttcttc 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ccgagtacat gacctacatg 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
tggactccac gacatagtct 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
tccagagcga ggatgtcgag 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
ttcctcaggg ttcctgacgc 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
cctccttcct tcgagtttgt 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
cacgcatact tgaacgacct 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
agaggacatg tggtattgcc 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
gttggacatc tgcctgcttt 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
agaggacatg tggtattgcc 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
ttggacatct gcccgctttt 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
agaggacatg tggtattgcc 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
ttggatatct gcccgcttct 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
aggaccgaga ttgttcttta 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
agaatctttc gagatttgcc 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
cctggacatg ctcagagtat 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
gacttctgct gcgaaattcc 20

Claims (3)

1.用于燕麦茎中基因表达分析的内参基因，其特征在于，所述内参基因为AsFPGS-1D1RF和AsTUA5-2C3RF；其中，
AsFPGS-1D1RF的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
TTAACCGTACTGATCCCTTACCAGACGAGTTCATTAAAGGGCTCTCA AGTGCTTCTTTGCAAGGCCGAGCACAAATTGTTCCAGATTCACAAGTAA ATTCTGAAGAGAAGGACCGAGATTGTTCTTTA；SEQ ID NO:1；
AsTUA5-2C3RF的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
GGCCACTACACTGTTGGAAAGGAGATCGTAGATCTATGTCTGGATCG TGTACGCAAGTTGGCGGACAATTGCACCGGGCTGCAGGGATTCTTGGTG CTCAATGCTGTTGGTGGTGGAACT；SEQ ID NO:2。
2.根据权利要求1所述的用于燕麦茎中基因表达分析的内参基因，其特征在于，AsFPGS-1D1RF的实时荧光定量PCR引物序列见SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4；
TTAACCGTACTGATCCCTTA；SEQ ID NO:3；
TAAAGAACAATCTCGGTCCT；SEQ ID NO:4；
AsTUA5-2C3RF的实时荧光定量PCR引物序列见SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6；
GGCCACTACACTGTTGGAAA；SEQ ID NO:5；
AGTTCCACCACCAACAGCAT；SEQ ID NO:6。
3.权利要求1所述的内参基因在燕麦茎中基因表达分析中的应用。
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