CN113736900B - 一种筛选单拷贝t-dna转基因植株的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种筛选单拷贝T‑DNA转基因植株的方法，通过植物基因组中一对参考扩增片段(R1，R2)和T‑DNA(T)扩增的Ct值在双拷贝转基因植株中构成夹心关系(R1‑T‑R2)；双拷贝T‑DNA转基因植株的Ct值介于R1和R2间，形成三明治式的R1‑T‑R2的夹心Ct关系。单拷贝相对双拷贝植株，其T‑DNA扩增Ct值增大约1，其Ct值移出夹心关系，而产生R1‑R2‑T的Ct模式；通过比较不同Ct值关系找出单拷贝T‑DNA转基因植株。本发明不需要计算ΔCt，ΔΔCt以及2‑ΔΔCt，通过直接展示两对参考序列(R1，R2)和T‑DNA的扩增Ct值的关系，判断转基因拷贝数的变化，方法直接、简单且可靠。

Description

一种筛选单拷贝T-DNA转基因植株的方法
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，更具体地，涉及一种筛选单拷贝T-DNA转基因植株的方法。
背景技术
农杆菌介导的植物遗传转化(Agrobacterium-mediated transformation)依赖于根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)所拥有的Ti质粒(tumor inducing plasmid)。Ti质粒包含一段位于两个短序列LB(left border)和RB(right border)之间的T-DNA序列(Transfer DNA)，T-DNA能随农杆菌侵染植物而进入宿主细胞并整合到植物基因组中。Ti质粒除了T-DNA之外，还编码一些毒蛋白(Vir区，图1)。毒蛋白作为反式因子协助农杆菌侵染植物并实现T-DNA的转移和整合。在野生的根癌农杆菌的Ti质粒上，T-DNA基因编码的蛋白能够促使植物细胞不断分裂，引发根癌。Ti质粒的发现以及改造是植物遗传转化技术的重要发展。Ti质粒的改造包括将T-DNA内原有基因删除后并不影响植物遗传转化。这使得我们能够将目标基因插入T-DNA，而实现转基因。此外，将Ti质粒上编码反式因子的区域和T-DNA区域分别安置在两个质粒上(二元载体和辅助载体)，而构建成的二元载体(binaryvector)系统，促进了利用农杆菌进行植物遗传转化的应用(图1)。
尽管二元载体系统为植物遗传转化提供了很大的便利，但研究也表明二元载体介导的植物遗传转化也存在诸多问题。其中，多拷贝T-DNA插入和T-DNA序列之外的载体骨架序列的整合会导致基因表达不稳定以及使得相关的基因功能分析变得复杂。所以，寻找单拷贝的T-DNA转基因植株是植物转基因育种以及基因功能分析的重要目的。目前，用于筛选单拷贝转基因植株的方法有Southern杂交(Southern blot)(例如中国专利CN102533864A公开了获得单拷贝目的基因表达框整合之安全转基因植物的方法)，竞争性PCR(competitive PCR)(例如中国专利CN113046471A公开了一种基于竞争型PCR技术鉴定单拷贝转基因植株的方法)，实时定量PCR(real-time qPCR)和微滴数字PCR(digital dropPCR)等。
传统的Southern杂交操作步骤繁琐、费时。竞争性PCR对内标物的构建要求高，有一定的局限性。微滴数字PCR则存在成本高，通量有限，操作繁琐等不足。实时定量PCR在时间、成本、灵敏度等因素上具有突出的优势，但是实时定量PCR的拷贝数分析依赖于相对Ct的计算，即用参考基因进行校正获得ΔCt，并与对照样品进行比较获得ΔΔCt值，在此基础上计算2-ΔΔCt获得拷贝数的变化。多步计算极大地放大了误差，从而无法区分拷贝数的两倍差异。因此目前虽然存在多种检测单拷贝转基因植株的方法，但是还缺少操作简单且可靠的方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种基于实时定量PCR，利用Ct值相对变化筛选单拷贝T-DNA转基因植株的方法。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
一种筛选单拷贝T-DNA转基因植株的方法，包括如下步骤：
S1.从待测植物基因组中选择一对参考序列R1和R2，再从相应的二元载体上选择T-DNA序列，针对上述R1、R2、T-DNA序列设计实时定量PCR引物，使已知转基因拷贝数为2的标准植株的R1和R2的Ct值相差约1(CtR1<CtR2)，且T-DNA序列的Ct值介于R1和R2之间，即构成R1-T-R2的Ct值关系；
S2.从待测的T1代T-DNA转基因植株中挑选不含载体骨架序列的clean T-DNA植株；
S3.提取clean T-DNA植株基因组DNA，酶切基因组DNA解开反向串联T-DNA结构；
S4.以酶切处理后的基因组DNA为模板，利用步骤S1设计的实时定量PCR引物进行扩增，获得稳定的Ct值；
S5.根据Ct值关系进行判断，若Ct值关系为R1-R2-T，则检测植株为单拷贝转基因植株；若为R1-T-R2，则为双拷贝转基因植株；若为T-R1-R2，则为多拷贝转基因植株。
本发明通过植物基因组中一对单拷贝参考扩增片段(R1，R2)和T-DNA(T)扩增的Ct值在双拷贝植株中构成夹心关系(R1-T-R2)；双拷贝T-DNA植株的Ct值介于R1和R2间，形成三明治式的R1-T-R2的夹心Ct关系。单拷贝相对双拷贝植株，其T-DNA扩增Ct值增大约1，其Ct值移出夹心关系，而产生R1-R2-T的Ct模式；通过比较不同Ct值关系找出单拷贝T-DNA转基因植株。本发明利用夹心Ct实时定量PCR，SC PCR(sandwiched Ct real-time PCR)技术发现了T-DNA整合的两个规律，即反向串联T-DNA整合会严重影响拷贝数的检测；单拷贝T-DNA整合集中在无载体骨架序列的植株中，再结合SC PCR技术和这两个发现，针对常用二元载体开发了一套完整的寻找农杆菌介导的单拷贝T-DNA转基因植株的方法，通过先解开反向串联T-DNA结构，再从T1群体中挑选clean T-DNA植株后再进行SC PCR，大大提高了寻找单拷贝转基因植株的效率。本发明方法适用于拟南芥、水稻、玉米等植物的单拷贝T-DNA转基因植株。
优选地，所述单拷贝参考序列R1和R2的Ct值相距0.95～1.05(约1)。本发明在满足实时定量PCR引物扩增效率介于90％-105％的前提下，可通过调节PCR扩增长度以及优化PCR扩增条件，使R1和R2的Ct值相距约1。
优选地，所述双拷贝转基因植株T-DNA序列的Ct值与R2的Ct值相差0.4～0.6。从而满足当检测单拷贝转基因植株时，使T-DNA扩增Ct值移出夹心关系，而形成较为明显的R1-R2-T的Ct模式。
优选地，所述Ct值分布在15～20之间，该Ct值分布范围更利用进行PCR扩增、判断。
优选地，步骤S2所述挑选不含载体骨架序列的clean T-DNA植株的方法为针对载体骨架序列设计引物，并通过常规PCR，区分clean T-DNA和含有载体骨架序列的dirty T-DNA植株或者在载体骨架序列区插入具有致死基因Barnase进行负筛选，挑选出clean T-DNA植株。
优选地，在步骤S3、S4之间还包括利用标准模板进行Ct值关系验证；所述标准模板为包含有步骤S1所述单拷贝参考序列R1、R2和T-DNA序列的具有单、双拷贝的单一位点插入的转基因标准植株或包含有步骤S1所述单拷贝参考序列R1、R2和T-DNA序列的质粒。
优选地，步骤S2所述酶切基因组DNA解开反向串联T-DNA结构为根据所用二元载体，在扩增的T-DNA区域两端，且位于LB和RB间选择合适的酶切位点进行酶切。
优选地，所述植物包括但不限于拟南芥、水稻或玉米。
进一步优选地，当所述植物为拟南芥时，所述R1、R2选自拟南芥基因组中的单拷贝基因At1g06570，R1的扩增引物序列如SEQ ID NO.7～8所示，R2的扩增引物如SEQ ID NO.9～10所示；针对T-DNA扩增，基于常用二元载体序列的T-DNA设计了定量PCR引物，包括卡那霉素抗性基因KanR和潮霉素抗性基因HygR，以及绿色荧光蛋白基因GFP，GFP扩增引物序列如SEQ ID NO.1～2所示，KanR扩增引物如SEQ ID NO.3～4所示，HygR扩增引物序列如SEQ IDNO.5～6所示。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种基于夹心Ct实时定量PCR，SC PCR(sandwiched Ct real-timePCR)方法以筛选单拷贝T-DNA转基因植物的方法。SC PCR基于实时定量PCR技术开发，但不需要计算ΔCt，ΔΔCt以及2-ΔΔCt，通过直接展示两对参考序列(R1，R2)和T-DNA的扩增Ct值的关系，判断拷贝数的变化，方法直接、简单且可靠。本发明利用SC PCR技术发现了T-DNA整合的两个规律，即反向串联T-DNA整合会严重影响拷贝数的检测，单拷贝T-DNA整合集中在无载体骨架序列的植株中，再结合SC PCR技术和这两个发现，针对常用二元载体开发了一套完整的寻找单拷贝转基因植株的方法，通过SC PCR设计，解开反向串联T-DNA结构，再从T1群体中挑选clean T-DNA植株后再进行SC PCR，大大提高了寻找单拷贝转基因植株的效率，具有较大的应用前景。
附图说明
图1为根癌农杆菌Ti质粒及用于转基因的二元载体系统。LB，left border序列；RB，right border序列；OriA在农杆菌中的复制起始位点；OriE在大肠杆菌中的复制其实位点；R，R’为抗性筛选基因。
图2为SC PCR技术原理。SC PCR通过实时定量PCR获得各扩增片段的Ct值。参考片段R1和R2的Ct值相差约1。双拷贝转基因植株的T-DNA Ct值介于R1和R2之间(R1-T-R2)，单拷贝植株的T-DNACt值右移约1，产生R1-R2-T关系。
图3为SC PCR方法中Ct值关系的稳定性检测。(a)在三株纯合seb19-S植株(双拷贝)中Ct值关系均为R1-T-R2；三株杂合seb19-L植株中Ct值关系均为R1-R2-T。(b)在不同模板浓度下，seb19-S，seb19-L以及质粒pCGHK均获得稳定的Ct值关系。
图4为反向串联T-DNA整合对拷贝数检测的影响。(a)基因组酶切或不酶切对SCPCR结果的影响。候选单拷贝植株S1，S2，S3酶切前后的Ct关系，均为R1-R2-T。S4，S5，S6不一致。S7和S8为多拷贝植株，呈现T-R1-R2关系。(b)SC PCR检测植株的southern杂交检测结果，S1-S8植株对应与a图。S9-S13植株为基因组DNA酶切后SC PCR结果呈现R1-R2-T的候选单拷贝植株。(c)植株S4，S5的T-DNA插入位点和反向串联结构。(d)反向串联T-DNA在PCR过程中可能形成发卡结构并抑制PCR进程。
图5为单拷贝T-DNA整合在clean T-DNA植株中富集。此现象在三种二元载体pCGMK，d33C9LG，fC-0029的T1代植株中均存在。
图6为SC PCR的完整流程。通过PCR从T1代植株挑选不含载体骨架序列的clean T-DNA植株。基因组DNA酶切解开反向串联结构后再做PCR扩增，依据R1，R2和T-DNA的Ct值判断转基因拷贝数。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
本发明提供一种夹心Ct实时定量PCR，SC PCR(sandwiched Ct real-time PCR)方法，以检测单拷贝T-DNA转基因植物。
实施例1SC PCR方法的原理和设计思路
在保证扩增效率的情况下，PCR扩增按接近2n进行扩增(n为循环数)。实时定量PCR通过比较扩增产物的荧光信号达到阈值的循环数(Ct值)来判断模板的拷贝数。单拷贝T-DNA模板扩增相对于双拷贝T-DNA的模板数减少一半，因而Ct值增加1。我们用植物基因组(以拟南芥基因组为例)中的一对参考序列(R1和R2)的Ct值来评估T-DNA的Ct值变化。在我们的设计中，一对参考序列R1和R2的扩增Ct值相距约1，双拷贝T-DNA植株的Ct值介于R1和R2间，形成三明治式的R1-T-R2的夹心Ct关系。单拷贝相对双拷贝植株，其T-DNA扩增Ct值增大约1，其Ct值移出夹心关系，而产生R1-R2-T的Ct模式(图2)。利用T-DNA的Ct值变化导致的Ct关系的变化，直接判断拷贝数变化，避免了常规Ct值分析的多步计算带来的误差。
实施例2SC PCR方法筛选单拷贝T-DNA转基因植株的建立与验证
(1)我们选用单一位点插入的转基因植株seb19作为标准模板(Hu,Y.,Chen,Z.,Zhuang,C.and Huang,J.(2017)Cascade of chromosomal rearrangements caused by aheterogeneous T-DNA integration supports the double-stranded break repairmodel for T-DNA integration.Plant J,90,954-965.)，对Ct值的夹心关系进行标定。seb19转基因植株仅有一个插入位点，其后代seb19-S为纯合植株，拥有两个T-DNA拷贝；而seb19-L为杂合而只有一个T-DNA拷贝。这两种后代植株的营养生长表现不一，容易区分。seb19-L营养生长与野生型一致，而seb19-S营养生长矮小。我们针对拟南芥基因组中的单拷贝基因At1g06570设计两对参考序列：R1和R2。针对T-DNA扩增，我们基于常用二元载体序列的T-DNA设计了定量PCR引物，包括卡那霉素抗性基因KanR和潮霉素抗性基因HygR，以及绿色荧光蛋白基因GFP(表1)。
表1扩增片段的引物序列及扩增条件
为了验证扩增片段R1，R2及T-DNA的Ct值关系在不同模板浓度下是否稳定，我们对模板进行了连续稀释，均可以获得稳定的Ct值关系(图3b)。
此外，我们构建了包括参考基因At1g06570(R1和R2)，GFP，HygR以及KanR的载体pCGHK。该载体上R1和R2以及T-DNA的拷贝数比值为1：1：1，与双拷贝T-DNA植株seb19-S一致。以载体pCGHK为模板，我们同样可以获得稳定的R1-T-R2关系(图3b)，说明该载体可以作SCPCR的标准模板(类似seb19-S)对Ct值关系进行标定。
(2)反向串联T-DNA对拷贝数检测的影响
通过SC PCR检测T1代转基因拟南芥植株的Ct关系，我们能够检测出Ct值关系为R1-R2-T的潜在单拷贝转基因植株(图4a左，未酶切)。我们对候选单拷贝植株进行了Southern杂交验证，发现部分候选植株的确为单拷贝植株(如S1，S3)，部分候选单拷贝植株却拥有双拷贝的T-DNA(S4，S5和S6)。为了解释SC PCR与southern杂交结果的不一致，我们对其中的两株(S4，S5)进行了基因组重测序，发现S4和S5候选植株的T-DNA均为反向串联插入(图4c)。反向串联重复插入的T-DNA结构在PCR进程中经变性后会自行退火形成发卡结构(图4d)。发卡结构会阻碍引物与模板的结合，抑制PCR扩增从而增大T-DNA的Ct值。对此，我们在SC PCR步骤前，选用识别位点在T-DNA上且分布在扩增区域两侧的限制性内切酶对基因组DNA模板进行酶切。限制性酶切能够解开反向串联结构。酶切后SC PCR获得的Ct值关系显示出与southern杂交一致的拷贝数(图4b，植株S9-S13)。由于反向串联的T-DNA整合在农杆菌介导的植物遗传转化中是常见现象(De Neve,M.,De Buck,S.,Jacobs,A.,Van Montagu,M.and Depicker,A.(1997)T-DNA integration patterns in co-transformed plantcells suggest that T-DNA repeats originate from co-integration of separate T-DNAs.Plant J,11,15-29.)，因此所有基于PCR检测T-DNA拷贝数的方法均存在低估拷贝数的问题，因而需要重新评估。我们是第一次观察到这一现象，并提出了简单可行的解决方案。
(3)单拷贝T-DNA整合集中在不含载体骨架序列的转基因植株中
我们发现多拷贝T-DNA插入往往伴随着载体骨架序列(vector-backbonesequence)的整合。与T-DNA相对，在此我们称载体骨架序列为V-DNA。我们将携带V-DNA的转基因植株称为“dirty T-DNA”，只有T-DNA的转基因植株为“clean T-DNA“植株。通过对不同二元载体(pCGMK，ddC9LG和fC-0029)转化获得的T1代拟南芥植株检测，对比dirty T-DNA植株，clean T-DNA植株的T1代中单拷贝T-DNA的整合频率明显增加(图5)。这一发现提示我们在clean T-DNA植株中更容易找到单拷贝转基因植株。我们可以针对载体骨架序列设计引物，并通过常规PCR，区分“clean T-DNA”和“dirty T-DNA”植株。或者，在载体骨架序列区插入具有致死基因Barnase进行负筛选，挑选出clean T-DNA植株。在此，我们利用PCR方法区分两类转基因植株。根据以上发现，我们提出了一套完整的高效检测单拷贝植株的流程(图6)。
实施例3一种获取单拷贝T-DNA转基因植株的方法
(1)拟南芥转基因植株的获得
拟南芥转基因采用花序侵染法(Clough,S.J.and Bent,A.F.(1998)Floral dip:asimplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsisthaliana.Plant J,16,735-743.)。简单而言，首先将包括目标基因的二元载体按冻融法导入农杆菌感受态菌株GV3101(上海唯地生物，AC1001S)，28度培养。4000转/分离心8分钟收集过夜培养的农杆菌菌液，用含5％蔗糖，0.02％silwet77溶液重悬细菌，并侵染花序。约一个月后收获T0代转化植株的种子。种子在相应抗性培养基上筛选获得T1代转基因植株。种子萌发两周后移栽至土壤，待检测。
(2)利用常规PCR筛选clean T-DNA植株
利用SDS粗提法(Edwards,K.,Johnstone,C.and Thompson,C.(1991)Asimple andrapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCRanalysis.Nucleic Acids Res,19,1349.)或者AmPure Plant Kit基因组DNA粗提试剂盒(美基生物，D7107-01)提取T1代植株叶片基因组DNA。
利用载体骨架序列上特异设计的引物扩增(表1)，能扩增出目标条带的植株标识为dirty T-DNA植株，其余为clean T-DNA植株。
(3)提取用于实时定量PCR的基因组DNA
使用Easy Pure Plant Genomic DNA Kit试剂盒(全式金，EE111-01)对clean T-DNA植株叶片提取高纯度基因组DNA。提取仅需100毫克叶片，提取后无需测DNA浓度。
(4)对标准模板Ct值关系验证
在使用SC PCR对T1代转基因植株进行检测之前，先对标准模板的Ct关系进行验证，以确定能否获得稳定的Ct值关系。我们所构建的pCGKH载体包括了R1，R2和HygR，KanR和GFP等常见T-DNA序列，可以用作标准模板。如待检测植株含有GFP或KanR基因，也可以用seb19作为标准模板进行标定。pCGKH质粒或seb19基因组模板需用水稀释，以确保Ct值分布在15-20之间。具体扩增体系和条件见步骤(6)。
(5)酶切基因组，解开反向串联T-DNA结构
根据所用二元载体，在扩增的T-DNA区域两端，且位于LB和RB间选择合适的酶切位点，利用Takara Quickcut酶进行切割。切割体系如下：16μL基因组DNA，2μL 10x buffer，不同Quickcut酶各1μL。37度30分钟，65度5分钟处理使限制性内切酶失活。
(6)实时定量PCR体系及扩增条件
将酶切处理后的基因组DNA用水稀释2-3倍，用作实时定量PCR的模板。使用染料法反应液2×RealStar Green Power Mixture(康润生物(GenStar)，A311-10)进行PCR。本方法推荐使用包含化学修饰的热启动酶反应体系，以获得稳定的Ct值。反应体系为20μL，包括2μL DNA模板，预混引物(10uM正向和反向引物等体积混合)1μL，10μL mix。按照相应的T-DNA扩增片段选择扩增条件()表1)。每个反应设置3个技术重复。PCR反应使用耶拿(qTOWER3G)定量PCR仪进行。
(7)根据Ct值关系判定转基因植株的T-DNA拷贝数
如果SC PCR结果显示Ct值关系为R1-R2-T，则检测植株为单拷贝转基因植株；如果是R1-T-R2为双拷贝；如果是T-R1-R2则判定为多拷贝。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 一种筛选单拷贝T-DNA转基因植株的方法
<141> 2021-08-30
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tcgtcggcct attaacacaa tc 22
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
accgacaacc acagcttcta tc 22
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
accgagacca tgtgaagaga ag 22

Claims (3)

1.一种筛选单拷贝T-DNA转基因植株的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.从待测植物基因组中选择一对参考序列R1和R2，再从相应二元载体上选择T-DNA序列，针对所述R1、R2、T-DNA序列设计实时定量PCR引物，使已知转基因拷贝数为2的标准植株的R1和R2的Ct值相差0.95～1.05、CtR1<CtR2，且T-DNA序列的Ct值介于R1和R2之间，即构成R1-T-R2的Ct值关系；所述Ct值分布在15～20之间；所述参考序列选自单拷贝基因；
S2.从待测的T1代T-DNA转基因植株中挑选不含载体骨架序列的clean T-DNA植株；
S3.提取clean T-DNA植株基因组DNA，酶切基因组DNA解开反向串联T-DNA结构；所述酶切基因组DNA解开反向串联T-DNA结构为根据所用二元载体，在扩增的T-DNA区域两端，且位于LB和RB间选择合适的酶切位点进行酶切；
S4.以酶切处理后的基因组DNA为模板，利用步骤S1设计的实时定量PCR引物进行扩增，获得稳定的Ct值；
S5.根据Ct值关系进行判断，若Ct值关系为R1-R2-T，则检测植株为单拷贝转基因植株；若为R1-T-R2，则为双拷贝转基因植株；若为T-R1-R2，则为多拷贝转基因植株；
所述植物为拟南芥。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S2所述挑选不含载体骨架序列的cleanT-DNA植株的方法为针对载体骨架序列设计引物，并通过常规PCR，区分clean T-DNA和含有载体骨架序列的dirty T-DNA植株或者在载体骨架序列区插入具有致死基因Barnase进行负筛选，挑选出clean T-DNA植株。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，在步骤S3、S4之间还包括利用标准模板进行Ct值关系验证；所述标准模板为包含有步骤S1所述参考序列R1、R2和T-DNA序列的具有单、双拷贝的单一位点插入的转基因标准植株或包含有步骤S1所述参考序列R1、R2和T-DNA序列的质粒。
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