CN110904109A - 控制水稻种子萌发的miR1866基因、过表达载体、gRNA表达载体、制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种控制水稻种子萌发的miR1866基因、过表达载体、gRNA表达载体、制备方法及其应用，属于植物基因工程技术领域。本发明依据CRISPR/Cas9和高表达miRNA的技术原理对水稻中miR1866基因的表达进行调控。设计miR1866基因小干扰片段，构建pH‑Ubi‑CAS9‑miR1866和pTCK303‑miR1866表达载体，利用农杆菌介导法导入粳稻品种日本晴，以潮霉素(Hyg)抗性标记筛选获得阳性转基因植株，分别测序和qRT‑PCR的方法鉴定miR1866的突变和miR1866基因表达量，结果表明：分别获得了miR1866突变植株和miR1866高表达植株。具有重要应用价值的水稻miR1866突变植株和miR1866高表达植株，与野生型日本晴相比，miR1866突变植株种子萌发速率显著变慢，而miR1866高表达植株种子萌发速率显著加快。

Description

控制水稻种子萌发的miR1866基因、过表达载体、gRNA表达载 体、制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种控制水稻种子萌发速率的miR1866基因，包含该基因的过表达载体、gRNA表达载体、制备方法及其应用，属于植物基因工程技术领域。

背景技术

种子萌发过程是植物生命周期的起始发育过程，这个过程决定了植物进入自然或者农业生态系统的状态，种子萌发过程也是种子打破休眠的过程。种子的休眠性是指健康的种子在适宜的条件下不萌发的现象，是植物在进化过程中形成的、广泛存在的。在生产中，水稻的休眠特性的影响主要表现为穗发芽和发芽不整齐。水稻成熟期遇到高温高湿就会使休眠弱的品种出现籽粒在稻穗上发芽的情况，穗发芽会严重影响稻米的产量和品质(方希林等,2015)。第一个通过图位克隆方法得到的控制种子休眠的基因是拟南芥休眠基因DOG1，其功能缺失突变体完全无休眠性表明在休眠调控中起着重要作用(Bentsink etal.,2006)。拟南芥种子发育中表达的锌指基因DAG1，是影响休眠和萌发的重要因子，其突变体休眠性降低(Papi et al.,2000)。

近年来，已初步定位了多个与水稻休眠性有关的QTL，广泛分布于多条染色体上，其中在第1、3、5、6、7和11染色体上检测到的休眠较多(Gu et al.,2005；Wan et al.,2005)。种子休眠是一种非常复杂的数量性状，不仅受许多基因调控，植物激素和环境因子对种子休眠也产生很大影响。植物激素与种子休眠的关系非常密切，脱落酸和赤霉素是主要的调节因子，油菜素内酯和乙烯也参与种子休眠的部分调控(Finch et al.,2006)。种子休眠是一个复杂的由多基因控制的可遗传性状，受遗传背景和环境因素的显著影响。因此挖掘优良的休眠基因，并对相关基因进行研究，对水稻生产尤为重要。

水稻是世界上最主要的粮食作物之一，为全球半数以上人口提供食物来源。水稻的稳产和增产对保障我国粮食安全具有重要的战略意义。MicroRNA(miRNA)是广泛存在于真核生物中的一种19-24个碱基的非编码蛋白质的小分子RNA，在转录或转录后水平上通过碱基互补配对原则特异地剪切或翻译抑制其靶基因的表达，在调节植物的生长发育、逆境响应、激素稳态、器官的形态建成等过程中具有重要的作用。已有研究表明，miR159、miR160、miR417、miR395、miR402、miR165/166、miR164、miR167、miR156、miR172和miR158可能参与控制种子萌发和休眠(Jung and Kang,2007；Liu et al.,2007；Reyes and Chua,2007；Kim et al.,2010a,b；Martin et al.,2010；Huang et al.,2013)。miR159通过调节GA和ABA信号进而控制拟南芥种子萌发(Martin et al.,2010)；miR160通过负调控其靶基因ARF10参与调节拟南芥种子萌发；miR395和miR402参与调控逆境条件下拟南芥种子的萌发(Kim et al.,2010a,b)。然而目前关于miRNA调控水稻种子萌发方面的研究还较少。

发明内容

本发明的目的是提供一种控制水稻种子萌发的miR1866基因。

本发明还提供一种包含上述miR1866基因的过表达载体。

本发明还提供一种包含上述miR1866基因的过表达载体的制备方法。

本发明还提供一种用于突变上述miR1866基因的表达载体(即gRNA表达载体)。

本发明还提供一种上述miR1866基因、包含上述miR1866基因的过表达载体或者用于突变上述miR1866基因的表达载体在控制水稻穗发芽方面的应用。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：

控制水稻种子萌发的miR1866基因，具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

过表达载体，其上插入有如SEQ ID NO.2所示的miR1866基因的核苷酸序列。

过表达载体的制备方法，包括以下步骤：以水稻基因组DNA为模板，采用引物Pre-miR1866-F和Pre-miR1866-R扩增得到miR1866基因片段，然后使用限制性内切酶(如KpnI和BamHI)分别酶切基础质粒(如pTCK303)和miR1866基因片段，将酶切产物分别纯化后进行连接，将连接产物转化至大肠杆菌，经培养验证得到过表达载体(如pTCK303-miR1866)；

所述引物序列如下：

Pre-miR1866-F：5′-AAGCGGTACCGTACCAGGCCTCCTTTTG-3′；

Pre-miR1866-R：5′-TATTACTAGTGGATCCAGGGCTCCTTTGGAACAC-3′。

用于突变上述miR1866基因的表达载体(即gRNA表达载体)，其制备方法包括以下步骤：

1)gRNA靶点序列的选择：序列为5′-GGGATTTTGCGGGAATTTCACGG-3′，所述序列3′端的PAM序列为CGG；

gRNA寡核苷酸链上下游引物的设计：

上游引物为sgRNA-LP：5′-ggcgGGGATTTTGCGGGAATTTCA-3′，

下游引物为sgRNA-RP：5′-aaacTGAAATTCCCGCAAAATCCC-3′；

2)gRNA表达载体的构建：将上下游引物混合、退火，得寡核苷酸双链DNA；用内切酶(如BsaⅠ)酶切质粒(如pOs-gRNA)，与寡核苷酸双链DNA连接得到中间载体(pOs-gRNA-miR1866)，测序验证后把gRNA序列重组至目的载体(如pH-Ubi-CAS9载体)上，得到gRNA表达载体(如pH-Ubi-CAS9-miR1866)。

本发明根据基因miR1866序列，分别根据miR1866的前体序列设计miR1866突变靶点和扩增引物，构建pH-Ubi-CAS9-miR1866和pTCK303-miR1866表达载体；然后利用农杆菌介导法转化水稻品种日本晴，通过测序和qRT-PCR的方法分别对pH-Ubi-CAS9-miR1866和pTCK303-miR1866转基因株系中miR1866的序列和miR1866的表达量进行验证，结果显示pH-Ubi-CAS9-miR1866转基因株系中miR1866发生了突变，pTCK303-miR1866转基因株系中miR1866的表达量极显著提高。与野生型相比，miR1866纯合突变单株株系种子萌发速率显著降低，miR1866高表达转基因株系种子萌发速率显著增加，表明miR1866基因与水稻种子萌发速率密切相关。

上述控制水稻种子萌发的miR1866基因、包含miR1866基因的过表达载体或者用于突变miR1866基因的表达载体在水稻育种中的应用。具体的，miR1866突变后抑制种子的萌发速率，miR1866基因过表达后能够促进水稻种子萌发。

进一步的，上述控制水稻种子萌发的miR1866基因、包含miR1866基因的过表达载体或者用于突变miR1866基因的表达载体在控制水稻穗发芽方面的应用。

更进一步的，上述控制水稻种子萌发的miR1866基因或者包含miR1866基因的过表达载体在构建miR1866高表达转基因株系中的应用。具体的，通过促进miR1866基因的表达，进而促进水稻种子发芽速度。

更进一步的，用于突变miR1866基因的表达载体在制备水稻miR1866基因突变体中的应用。具体的，通过抑制miR1866基因的表达，进而抑制水稻穗发芽。

本发明的有益效果：

本发明依据CRISPR/Cas9和高表达miRNA的技术原理对水稻中miR1866基因的表达进行调控。设计miR1866基因小干扰片段，构建pH-Ubi-CAS9-miR1866和pTCK303-miR1866表达载体，利用农杆菌介导法导入粳稻品种日本晴，以潮霉素(Hyg)抗性标记筛选获得阳性转基因植株，分别测序和qRT-PCR的方法鉴定miR1866的突变和miR1866基因表达量，结果表明：分别获得了miR1866突变植株和miR1866高表达植株。具有重要应用价值的水稻miR1866突变植株和miR1866高表达植株，与野生型日本晴相比，miR1866突变植株种子萌发速率显著变慢，而miR1866高表达植株种子萌发速率显著加快。

本发明针对当前人口不断增长和粮食需求不断增加的现状，探讨了miR1866基因在水稻改良中的作用。在阴雨潮湿环境中，水稻种子较易出现穗发芽现象，本试验发现miR1866基因突变可抑制水稻种子萌发，而高表达miR1866基因突变可促进水稻种子萌发，因此利用CRISPR/Cas9和高表达miRNA技术研究水稻miR1866的生物学功能，同时在生产上加以利用，对有效控制水稻穗发芽的发生以及促进种子快速萌发具有重要意义和潜在应用价值，对水稻高产和稳产育种具有重要的实践意义。

附图说明

图1为sgRNA与Cas9蛋白靶向miR1866基因示意图；

图2为不同miR1866突变体突变序列与野生型日本晴序列分析比对图；

图3为qRT-PCR检测高表达转基因株系中miR1866基因表达量图；

图4为野生型和转基因株系种子萌发速率对比图；

图5为野生型和转基因株系种子萌发60h表型图。

具体实施方式

下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。除特殊说明的外，以下实施例及试验例中所用设备和试剂均可从商业途径购买得到。

以下实施例及试验例中所使用的引物如下表1所示。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1实施例及试验例中所使用的引物序列

实施例1

用于突变miR1866基因的表达载体的构建，包括以下步骤：

1、miR1866基因gRNA靶点序列的选择及gRNA寡核苷酸链的上下游引物的设计

根据水稻miR1866前体(miRBase登录号MI0008267)的序列设计gRNA靶点序列5′-GGGATTTTGCGGGAATTTCACGG-3′(如SEQ ID NO.22所示)，该序列3′端PAM序列为CGG，Cas9蛋白将在CGG序列上游第3-4bp处剪切DNA形成平滑末端，靶位点及PAM序列如图1所示，图1为sgRNA与Cas9蛋白靶向miR1866基因示意图。

miR1866-5p成熟体序列如下所示：

GAGGGATTTTGCGGGAATTTCACG(如SEQ ID NO.1所示)。

根据sgRNA序列设计gRNA寡核苷酸链的上下游引物，引物序列见表1中sgRNA-LP和sgRNA-RP。

2、CRISPR/Cas9-gRNA(pH-Ubi-CAS9-miR1866)表达载体的构建

1)取等量的gRNA寡核苷酸链上下游引物(终浓度100μM)混合，经37℃ 5min，95℃5min，然后以5℃/min的速度降至25℃形成互补双链DNA，用于后续载体的构建；

2)使用限制性内切酶BsaⅠ酶切中间载体pOs-gRNA，使其线性化，50μL酶切体系如下：pOs-gRNA质粒2μg，10×CutSmart Buffer 5μL，Bsa Ⅰ 10U，加ddH₂O至50μL，37℃酶切4h后65℃热处理20min使酶失活；纯化后加入如下连接体系：线性质粒1.5μL，稀释200倍的寡核苷酸双链DNA 6.5μL，10×Buffer 1μL，T4 DNA连接酶1μL；连接的条件为：4℃连接12h。

3)连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，菌液涂布于含50mg/L的卡那霉素LB培养基平板，过夜培养后挑取单克隆摇菌扩繁。使用引物U3-F和sgRNA-RP(引物序列见表1)进行菌落PCR验证。

PCR体系为：2×Taq MasterMix 5μL；U3-F(10μM)0.4μL；sgRNA-R(10μM)0.4μL；单克隆模板1μL；ddH₂O 3.2μL。PCR条件为：预变性94℃ 2min，变性94℃ 30s，退火55℃ 30s，延伸72℃ 30s，终延伸72℃ 10min，其中变性，退火和延伸为35个循环。

选取PCR片段在291bp的菌落，提取质粒，送往测序公司进行测序，测序正确表明中间载体pOs-gRNA-miR1866构建成功。

4)采用Invitrogen重组试剂盒把gRNA序列重组至目的载体pH-Ubi-CAS9载体上。重组反应：将测序正确的pOs-gRNA-miR1866中间载体7μL，pH-Ubi-CAS9 1μL，LRCloneaseTMII enzyme Mix 1μL，25℃反应1h，然后加入1μL proteinase K，终止反应，37℃，10min，4℃过夜。

5)将连接产物转化大肠杆菌DB3.1感受态细胞，菌液涂布于含50mg/L的壮观霉素LB培养基平板，过夜培养后挑取单克隆摇菌扩繁；使用引物U3-F和sgRNA-R(引物序列见表1)进行菌落PCR验证，扩增片段为372bp的为候选的pH-Ubi-CAS9-miR1866载体，然后送测序公司进行测序验证，测序正确的质粒导入土壤农杆菌EHA105用于后续转基因试验。

实施例2

用于突变miR1866基因的表达载体在制备水稻miR1866基因突变体中的应用，包括以下步骤：

1、农杆菌介导水稻愈伤遗传转化和阳性转基因植株检测

采用热激法，参照Hood等报道方法(Hood et al.,1993)将pH-Ubi-CAS9-miR1866表达载体导入土壤农杆菌EHA105，使用含有CRISPR/Cas9-gRNA质粒的农杆菌侵染水稻品种日本晴(Oryza sativa ssp.Japonica cv.Nipponbare)的愈伤组织，参照Nishimura等(Nishimura et al.,2006)报道方法进行水稻转基因，用潮霉素筛选获得再生苗。采用SLS法提取转基因植株基因组DNA，使用载体通用引物U3-F和sgRNA-R(引物序列见表1)进行转基因植株阳性筛选(该基因位于pH-Ubi-CAS9-miR1866表达载体上)。

PCR体系为：2×Taq MasterMix 5μL；U3-F(10μM)0.4μL；sgRNA-R(10μM)0.4μL；DNA模板1μL；ddH₂O 3.2μL。PCR条件为：预变性94℃ 2min，变性94℃ 30s，退火52℃ 30s，延伸72℃ 30s，终延伸72℃ 10min，其中变性，退火和延伸为35个循环。PCR扩增产物长度为372bp，即为阳性转基因植株。

2、miR1866基因T₀代突变体筛选鉴定

1)为了检测获得T₀代阳性转基因植株靶位点的突变情况，根据miR1866基因全长序列在靶位点两侧设计引物miR1866-test-F和miR1866-test-R(引物序列见表1)，以转基因阳性单株DNA为模板扩增靶位点序列，50μL扩增体系如下：2×Taq MasterMix 25μL，miR1866-test-F 2μL，miR1866-test-R 2μL，DNA模板1μg，加ddH₂O至50μL。PCR条件：预变性94℃ 2min，变性94℃ 30s，退火55℃ 30s，延伸72℃ 30s，终延伸72℃ 10min，其中变性，退火和延伸为35个循环。

将一部分扩增产物使用琼脂糖凝胶电泳分离，结果如图2所示，野生型扩增片段大小为391bp，将T₀代阳性转基因单株1、2、3、4、5、6、7、8和9的PCR产物送出测序，测序结果与野生型序列比对分析突变株基因型。分析测序结果得到株系突变情况，如图2所示，共得到1株纯合突变(单株2)和8株杂合单株(单株1、3、4、5、6、7、8和9)，包含10种不同突变类型。进一步选取单株进行自交分离，T₁代得到纯合分离类型，选取单株5和7中缺失2nt(mir1866-5)和11nt(mir1866-7)的纯合突变类型进行后续实验。

突变体mir1866-5中，突变的水稻miR1866的编码序列如下所示：

CTTTTGCACGGAGGGATTTTGCGGGAAT--CACGGGAATTGAGTTGATTCCTGAAATTCCTGTAAAATTCTTGTGTTCCAAAGGA(如SEQ ID NO.5所示)。

突变体mir1866-7中，突变的水稻miR1866的编码序列如下所示：

CTTTTGCACGGAGGGATTTTGCGGGAATT-----------GAGTTGATTCCTGAAATTCCTGTAAAATTCTTGTGTTCCAAAGGA(如SEQ ID NO.6所示)。

本发明通过对水稻miR1866进行试验，发现miR1866在控制水稻种子萌发速率方面具有重要功能，因此构建miR1866突变体对于水稻稳产及种子生产等领域具有重要的意义。

实施例3

miR1866基因片段的扩增，包括以下步骤：

根据miR1866基因的序列(如SEQ ID NO.3所示)设计包含miR1866前体序列扩增引物Pre-miR1866-F和Pre-miR1866-R(引物序列见表1)，根据目标载体pTCK303酶切位点，分别在正反引物5′端添加KpnI和BamHI酶切位点及保护碱基。以日本晴幼苗DNA为模板，扩增得到miR1866基因片段，如下所示：

aagcggtaccGTACCAGGCCTCCTTTTGCACGGAGGGATTTTGCGGGAATTTCACGGGAATTGAGTTG ATTCCTGAAATTCCTGTAAAATTCTTGTGTTCCAAAGGAGCCCTggatccactagtaata，其中小写下划线碱基为保护碱基、小写无下划线碱基为酶切位点KpnI和BamHI、大写下划线碱基为miR1866前体序列、大写无下划线序列为miR1866前体侧翼序列。

miR1866前体序列如下所示：

CTTTTGCACGGAGGGATTTTGCGGGAATTTCACGGGAATTGAGTTGATTCCTGAAATTCCTGTAAAATTCTTGTGTTCCAAAGGA(如SEQ ID NO.2所示)。

miR1866基因片段扩增体系：正反引物(终浓度10μM)和DNA模板各取1μL，加入25μL2×Taq MasterMix，加ddH₂O至50μL。PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃预变性30s、56℃退火30s、72℃延伸1min，35个循环，最终扩增得到128bp的双链miR1866基因片段(如SEQ IDNO.23所示)，用于后续pTCK303-miR1866载体的构建。

带前体侧翼序列的miR1866基因片段序列如下所示：

GTACCAGGCCTCCTTTTGCACGGAGGGATTTTGCGGGAATTTCACGGGAATTGAGTTGATTCCTGAAA TTCCTGTAAAATTCTTGTGTTCCAAAGGAGCCCT(如SEQ ID NO.4所示)。

实施例4

pTCK303-miR1866表达载体构建，包括以下步骤：

使用限制性内切酶KpnI和BamHI分别酶切pTCK303质粒和MiR1866基因片段，50μL酶切体系如下：pTCK303质粒2μg(miR1866基因片段1μg)，10×Buffer 5μL，KpnI 10U，BamHI10 U，加ddH₂O至50μL，37℃酶切4h。将酶切产物分别纯化后加入如下连接体系：线性质粒4μL，miR1866基因片段4μL，10×Buffer 1μL，T4 DNA连接酶1μL，4℃连接过夜。连接产物用热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，菌液涂布于含50mg/L卡那霉素平板，过夜培养后选取单克隆摇菌扩繁，使用引物pTCK303-VF和pTCK303-VR(引物序列见表1)进行菌落PCR验证。pTCK303空载体扩增片段大小为102bp，连接干扰片段后扩增片段大小应为187bp，经菌落PCR验证后提取质粒送往测序，测序正确表明pTCK303-miR1866载体构建成功。

实施例5

miR1866高表达载体在水稻育种中的应用，包括农杆菌介导水稻愈伤遗传转化和阳性转基因植株检测：取pTCK303-miR1866载体转化农杆菌EHA105，参照Nishimura等方法(Nishimura et al.,2007)侵染水稻日本晴成熟胚愈伤组织，潮霉素(Hyg)抗性筛选获得再生苗，利用GUS染色筛选阳性植株(OE1866-9、OE1866-13株系)进行后续试验。

试验例1

pTCK303-miR1866转基因株系miR1866基因表达量检测：

取pTCK303-miR1866转基因植株叶片，以野生型日本晴为对照，使用TRIzol试剂提取植株总RNA，采用stem-loop qRT-PCR的方法(Chen et al.,2005)对miR1866的表达量进行测定。以β-actin为参照基因，以稀释(1:10)的cDNA为模板，采用2^-ΔΔCT法(Livak et al.,2001)计算miR1866基因相对表达量，miR1866荧光定量反转录所使用的引物为miR1866-RT，定量是采用引物为miR1866-F和stem-loop_U，β-actin荧光定量所使用的引物为β-actin-F和β-actin-R(引物序列见表1)。

qRT-PCR反应体系：20μL定量体系，其中模板cDNA按1:20稀释后加5μL，miR1866-F和stem-loop_U引物各加0.5μL，再加入4μL的ddH₂O，荧光染料(SYBR Green qRT-PCRMaster Mix；Toyobo)为10μL，使用CFX 96Real Time System(BioRad,USA)进行定量检测。

qRT-PCR反应条件如表2所示。

表2 miR1866基因qRT-PCR反应条件

qRT-PCR结果如图3所示，与野生型相比，两组转基因株系中miR1866基因表达量均极显著增加，OE1866-9和OE1866-13转基因株系中miR1866的表达连分别增加了12.81和110.43倍。

试验例2

miR1866基因功能初步分析：

取T₂代pTCK303-miR1866转基因株系和野生型日本晴抽穗后40d成熟种子，收获后置于室温保存30d，然后用于测定各株系种子发芽速率。随机选取发育良好的种子40粒，均匀排列于垫有双层滤纸的培养皿内，加适量无菌水后置于30℃培养箱(相对湿度100％)内萌发，设三组重复。以胚芽长度不短于1/2种子长度且胚根长度不短于种子长度作为种子萌发标准。萌发结果如图4、5所示，从图中可以看出，miR1866突变体和高表达材料在萌发后60h基本全部萌发，但miR1866突变体mir1866-5和mir1866-7在萌发前期(24-36h)的发芽率基本上都低于对照，特别是在萌发后36h，两突变体的发芽率分别比对照低22.67％和69.33％(如图4A)；miR1866高表达转基因株系OE1866-9和OE1866-13在萌发前期(24-36h)的发芽率基本上都高于对照，特别是在萌发后24h，两转基因株系的发芽率分别比对照高32.98％和47.41％(如图4B)，说明miR1866低表达可以抑制萌发，高表达促进萌发。

以上对本发明的具体实施例进行了描述，但本发明的实施方式不受上述特定实施例的限制。本领域技术人员在权利要求的范围内做所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

SEQUENCE LISTING

<110> 河南农业大学

<120> 控制水稻种子萌发的miR1866基因、过表达载体、gRNA表达载体、制备方法及其应用

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<160> 23

<211> 24

<212> DNA

<213> 水稻

<221> miR1866-5p成熟体序列

<400> 1

gagggatttt gcgggaattt cacg 24

<211> 85

<212> DNA

<213> 水稻

<221> miR1866前体序列

<400> 2

cttttgcacg gagggatttt gcgggaattt cacgggaatt gagttgattc ctgaaattcc 60

tgtaaaattc ttgtgttcca aagga 85

<211> 722

<212> DNA

<213> 水稻

<221> pri-miR1866初级序列

<400> 3

ataccattat tcttttattc taaaagagac ctttcgatga tctaccgttg gatcagcatc 60

acatggatct atgtctaccc tgtacccttt atatagccct cttcctcctt cacaccctaa 120

ccctagtcca atacctcctc cctccaccgc gctgcgccgc cgccgccacc accaccctca 180

tgcttagatc ttgccaacaa ttcagggcgg taatgatgtt cttcctcaat agagtagaga 240

tggacgcgat gtactcacta gtttcctttg caggtgctct ttctaacttg atctatagta 300

ttcttctaat agtaccaggc ctccttttgc acggagggat tttgcgggaa tttcacggga 360

attgagttga ttcctgaaat tcctgtaaaa ttcttgtgtt ccaaaggagc ccttgatgtt 420

gatatccctg gccctgcccc ctagatctga gactccttag cttctataac ttcgatattc 480

atcggttttc caagaccgaa ggtggaagtg caaacgttgc attgccaccg gtagattcca 540

caaaaaagag catcacgatg cgaaaatcat gatagccgcc ttcgaagccc ttattggagc 600

atggattaaa acaacaatca gttggtaaga aaatcaacta ttttcactat aaagttcttc 660

aatttattca ttgtgcatcc tttagattgt ataaattttc tattgagata gtagtagcgc 720

gg 722

<211> 102

<212> DNA

<213> 水稻

<221> 带前体侧翼序列的miR1866基因片段序列

<400> 4

gtaccaggcc tccttttgca cggagggatt ttgcgggaat ttcacgggaa ttgagttgat 60

tcctgaaatt cctgtaaaat tcttgtgttc caaaggagcc ct 102

<211> 83

<212> DNA

<213> 水稻突变体

<221> miR1866-5序列（-2nt）

<400> 5

cttttgcacg gagggatttt gcgggaatca cgggaattga gttgattcct gaaattcctg 60

taaaattctt gtgttccaaa gga 83

<211> 74

<212> DNA

<213> 水稻突变体

<221> miR1866-7序列（-11nt）

<400> 6

cttttgcacg gagggatttt gcgggaattg agttgattcc tgaaattcct gtaaaattct 60

tgtgttccaa agga 74

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物sgRNA-LP

<400> 7

ggcggggatt ttgcgggaat ttca 24

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物sgRNA-RP

<400> 8

aaactgaaat tcccgcaaaa tccc 24

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物U3-F

<400> 9

agcacaggac aggcgtcttc t 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物sgRNA-R

<400> 10

cgactcggtg ccactttttc 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物miR1866-test-F

<400> 11

tccaatacct cctccctcca 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物miR1866-test-R

<400> 12

acgtttgcac ttccaccttc 20

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物Pre-miR1866-F

<400> 13

aagcggtacc gtaccaggcc tccttttg 28

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物Pre-miR1866-R

<400> 14

tattactagt ggatccaggg ctcctttgga acac 34

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物pTCK303-VF

<400> 15

gccctgcctt catacgctat 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物pTCK303-VR

<400> 16

taacatagat gacaccgcgc 20

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物miR1866-RT

<400> 17

ctcaactggt gtcgtggagt cggcaattca gttgagcgtg aaat 44

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物miR1866-F

<400> 18

acactccagc tggggaggga ttttgcggga at 32

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物Stem-loop_U

<400> 19

tggtgtcgtg gagtcg 16

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物β-actin-F

<400> 20

ggaagtacag tgtctggatt ggag 24

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物β-actin-R

<400> 21

tcttggctta gcattcttgg gt 22

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> gRNA靶点序列

<400> 22

gggattttgc gggaatttca cgg 23

<211> 128

<212> DNA

<213> 扩增序列

<221> miR1866基因片段

<400> 23

aagcggtacc gtaccaggcc tccttttgca cggagggatt ttgcgggaat ttcacgggaa 60

ttgagttgat tcctgaaatt cctgtaaaat tcttgtgttc caaaggagcc ctggatccac 120

tagtaata 128

Claims (10)

1.控制水稻种子萌发的miR1866基因，其特征在于：所述miR1866基因具有如SEQ IDNO.2所示的核苷酸序列。

2.过表达载体，其特征在于：所述过表达载体上插入有如SEQ ID NO.2所示的miR1866基因的核苷酸序列。

3.如权利要求2所述过表达载体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：以水稻基因组DNA为模板，采用引物Pre-miR1866-F和Pre-miR1866-R扩增得到miR1866基因片段，然后使用限制性内切酶分别酶切基础质粒和miR1866基因片段，将酶切产物分别纯化后进行连接，将连接产物转化至大肠杆菌，经培养验证得到过表达载体；

所述引物序列如下：

Pre-miR1866-F：5′-AAGCGGTACCGTACCAGGCCTCCTTTTG-3′；

Pre-miR1866-R：5′-TATTACTAGTGGATCCAGGGCTCCTTTGGAACAC-3′。

4.用于突变如权利要求1所述miR1866基因的表达载体，其特征在于：所述表达载体的制备方法包括以下步骤：

1)gRNA靶点序列的选择：序列为5′-GGGATTTTGCGGGAATTTCACGG-3′，所述序列3′端的PAM序列为CGG；

gRNA寡核苷酸链上下游引物的设计：

上游引物为sgRNA-LP：5′-ggcgGGGATTTTGCGGGAATTTCA-3′，

下游引物为sgRNA-RP：5′-aaacTGAAATTCCCGCAAAATCCC-3′；

2)gRNA表达载体的构建：将上下游引物混合、退火，得寡核苷酸双链DNA；用内切酶酶切质粒，与寡核苷酸双链DNA连接得到中间载体，测序验证后把gRNA序列重组至目的载体上，即得。

5.如权利要求1所述控制水稻种子萌发的miR1866基因、或者如权利要求2所述过表达载体、或者如权利要求4所述用于突变miR1866基因的表达载体在水稻育种中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述控制水稻种子萌发的miR1866基因或者所述过表达载体在构建miR1866高表达转基因株系中的应用。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述用于突变miR1866基因的表达载体在制备水稻miR1866基因突变体中的应用。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述控制水稻种子萌发的miR1866基因、或者所述过表达载体、或者所述用于突变miR1866基因的表达载体在控制水稻穗发芽方面的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述控制水稻种子萌发的miR1866基因或者所述过表达载体在促进水稻穗发芽方面的应用。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述者用于突变miR1866基因的表达载体在抑制水稻穗发芽方面的应用。

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