CN104342438A

CN104342438A - ClCAC基因和ClSAND基因在西瓜果实基因表达分析中作为内参基因的应用

Info

Publication number: CN104342438A
Application number: CN201410510145.6A
Authority: CN
Inventors: 别之龙; 孔秋生; 袁静贤; 高凌云; 黄远; 程菲
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2014-09-28
Filing date: 2014-09-28
Publication date: 2015-02-11

Abstract

本发明属于基因表达分析技术领域，具体涉及ClCAC基因和ClSAND基因在西瓜果实发育过程中用作为基因表达分析的内参基因的应用。本发明为ClCAC和ClSAND基因设计了特异引物，该引物跨基因上相邻的2个外显子的接头位点，以基因组DNA为模板时无扩增产物，以cDNA为模板是可以扩增出目标片段，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1-4所示。通过实时荧光定量PCR技术检测表明，ClCAC基因和ClSAND基因在不同基因型、不同坐果方式的西瓜果实的不同发育阶段均能稳定表达，是西瓜果实发育过程中利用实时荧光定量PCR技术检测基因表达分析的可靠内参基因组合。该内参基因组合具有表达稳定性好、不受cDNA样品中是否存在基因组DNA污染影响等优点。

Description

ClCAC基因和ClSAND基因在西瓜果实基因表达分析中作为内参基因的应用

技术领域

本发明属于植物分子生物学技术领域，涉及基因表达分析过程中所需的内参基因。

背景技术

目前，实时荧光定量PCR(简称为qRT-PCR)已经被广泛地用于基因表达的定量分析，以及RNA-seq和基因芯片结果的验证。该技术简单，快速，但其结果的可靠性依赖于选择表达稳定的基因作为内参进行数据的标准化。内参基因的作用主要是去除样品准备和qRT-PCR分析过程中非生物变异的干扰，如RNA提取的质量、反转录的效率、qRT-PCR分析中的扩增效率等。因此，qRT-PCR结果的准确性很大程度上受内参基因表达稳定性的影响，使用表达不稳定的基因作为内参会导致目的基因的表达数据发生很大的偏差。

当前在西瓜中利用qRT-PCR分析基因表达的研究中，选用的内参基因主要是过去用于RT-PCR等技术进行定性分析时的内参基因，如：Actin，18SrRNA等，然而这些传统内参的表达存在着一定的变异，并不适用于qRT-PCR这样灵敏度很高的分析技术。NormFinder等基因表达稳定性评价方法的出现，大大提高了人们筛选表达稳定的内参基因的准确性(Andersen CL,Jensen JL,Orntoft TF:Normalization of real-time quantitative reverse transcription-PCR data:Amodel-based variance estimation approach to identify genes suited for normalization,applied to bladder and colon cancer data sets.Cancer Res 2004,64(15):5245-5250.)。最近有研究筛选出了西瓜在正常生长、生物胁迫和非生物胁迫条件下的内参基因(Kong Q,Yuan J,Gao L,Zhao S,Jiang W,Huang Y,Bie Z:Identification ofSuitable Reference Genes for Gene Expression Normalization in qRT-PCR Analysisin Watermelon.PLoS ONE 2014,9(2):e90612.)。该研究认为，西瓜在正常生长条件下至少需要9个内参基因才能对目标基因进行准确的定量分析。显然使用如此多的内参基因是不合理的，尤其是当目标基因的数目非常少的时候。并且，越来越多研究认为没有普遍适用的内参基因。西瓜被认为是研究非呼吸跃变型果实发育的理想模式作物，但目前对西瓜果实基因进行表达分析时，仍使用表达稳定性缺乏系统验证的18SrRNA作为内参基因，这严重影响了西瓜果实发育过程中进行基因表达定量分析的准确性。

番茄红素是红肉西瓜果实中一种主要的类胡萝卜素，八氢番茄红素合成酶(PSY)催化了类胡萝卜素合成路径中的第一步反应，是调控西瓜果实类胡萝卜素含量的一种关键酶。通过西瓜转录组数据分析得到PSY家族基因有两个成员，ClPSY1(Cla009122)和ClPSY2(Cla005425)，但仅ClPSY1在西瓜果实中调控番茄红素的积累(Stefania G,Gabriella P,Je M L,Yi Z,Zhang F,Giuseppe D,James J G,Marcello S L:Comparative genomics reveals candidate carotenoid pathway regulatorsof ripening Watermelon fruit.BMC Genomics2013,14:781)。因此，分析ClPSY1在西瓜果实中的动态表达变化及其与番茄红素的积累量的相关性，可以用来检测内参基因的可靠性。

发明内容

为解决在西瓜果实发育过程中进行基因表达分析时缺乏经系统验证的、表达稳定的内参基因问题，本发明提供了专门用于西瓜果实发育过程中基因表达分析的可靠的内参基因，该内参基因不仅在西瓜果实发育过程中表达稳定，而且还可以不受cDNA样品中存在基因组DNA污染的影响。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：选择12个在其他作物的果实中被验证为稳定的或目前在西瓜果实中使用的基因作为候选内参基因，为其中10个候选内参基因设计了跨外显子接头位点的引物，使其在基因组DNA模板上无扩增产物；用qRT-PCR分析了这12个候选内参基因在不同基因型、不同坐果方式和果实发育阶段的48个西瓜果实样本中的表达量；用NormFinder软件计算候选内参基因的表达稳定值，确定ClCAC为西瓜果实发育过程中表达最为稳定的单个内参基因、ClCAC和ClSAND为最佳内参组合；分别用单个ClCAC基因、ClCAC和ClSAND组合标准化目标基因ClPSY1基因的表达，以18SrRNA为对照，发现用ClCAC或ClCAC和ClSAND组合作内参时，ClPSY1基因的表达模式与西瓜果实中番茄红素生物合成表现出了很好的相关性，而以18SrRNA为内参定量ClPSY1基因的表达与西瓜果实中番茄红素生物合成并无相关性，从而验证了ClCAC或ClCAC和ClSAND组合作为内参基因对西瓜果实发育过程中基因表达进行相对定量的可靠性。

本发明的特点在于：为候选内参基因设计了跨相邻外显子接头位点的引物，可以排除cDNA样品中存在基因组DNA污染对结果的影响；全面分析了不同基因型、不同坐果方式和不同发育阶段对候选基因表达的影响；筛选出专门用于西瓜果实发育过程中基因表达分析的单个内参基因ClCAC和内参组合ClCAC和ClSAND；用ClCAC或ClCAC和ClSAND组合为内参对ClPSY1基因的表达进行相对定量，发现ClPSY1基因的表达模式与西瓜果实中番茄红素积累表现出了一致性，进一步证实了ClCAC或ClCAC和ClSAND组合作为西瓜果实发育过程中基因表达分析时内参基因的可靠性。

本发明的优点是：

(1)首先，专门针对于西瓜果实发育过程中基因表达变化，第一次筛选出了表达稳定的、适用于做内参的单个ClCAC基因、ClCAC基因和ClSAND基因组合；其次，为稳定的内参基因设计了跨相邻外显子接头位点的引物，使之不会受到cDNA样品中可能存在的基因组DNA污染的干扰。

(2)可靠性。首先，本发明考虑到基因型、坐果方式和不同发育阶段对候选内参基因表达稳定的影响，从而选出了表达最为稳定的内参基因；其次，本发明用ClPSY1基因的表达模式及其与西瓜果实中番茄红素积累的相关性，证实了ClCAC和ClSAND内参基因组合的可靠性。

(3)实用性。首先，本发明具有广泛的适用性，可以用于不同基因型、不同坐果方式和不同发育阶段的西瓜果实样品中基因表达分析时的内参基因，为西瓜果实发育中基因表达分析提供了一个一致的比较标准；其次，由于ClCAC和ClSAND基因在基因组DNA上都无扩增产物，因此，无论cDNA样品中是否存在基因组DNA污染，本内参组合都可以使用，所以更加实用。

附图说明

图1：候选内参基因的PCR扩增及琼脂糖电泳检测结果。

图2：用ClCAC基因及ClCAC和ClSAND组合基因标准化目标基因(ClPSY1基因)的表达，以18SrRNA为对照，检验ClPSY1基因的表达模式及其与西瓜果实中番茄红素积累的相关性。

图3：分别用单个ClCAC以及ClCAC和ClSAND组合为内参时ClPSY2基因在西瓜果实成熟过程中的相对表达量。

图4：分别用单个ClCAC以及ClCAC和ClSAND组合为内参时ClZDS基因在西瓜果实成熟过程中的相对表达量。

图5：分别用单个ClCAC以及ClCAC和ClSAND组合为内参时ClCHYB1基因在西瓜果实成熟过程中的相对表达量。

具体实施方式

实施例1

(1)植物材料和处理：选用西瓜自交系97103和F1代杂交种8424为材料，种植在塑料大棚中，开花前一天对即将开花的子房进行套袋隔离。开花当天分别进行人工授粉和CPPU处理诱导西瓜坐果。CPPU(氯吡脲0.1％；四川国光农化股份有限公司)使用浓度为20mg/L，早晨8h取下纸袋，均匀喷在西瓜子房上，然后再套袋隔离，防止传粉。每个处理重复3次，随机排列。分别在授粉及CPPU处理后0，1，3，5，7，10，12，18，23，27，30和35天对果实进行取样，每个处理随机取3个果实，作为每一个取样点的生物学重复。授粉和CPPU处理后0，1，3天取子房，3天后的果实取中心果肉，液氮速冻，-80℃保存。

(2)总RNA的分离，第一链cDNA的合成和DNA的分离：西瓜果实样本采用TaKaRa(Plant RNA Extraction Kit；包含gDNA去除的步骤)分离总RNA，每一个品种不同的处理间均有3个生物学重复。用Nanodrop2000检测RNA的浓度和质量，A260/A280和A260/A230的比值要在1.8-2之间。RNA的完整性采用2％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，电泳图谱28S，18S条带清晰，表明RNA完整性较好。RNA检测合格后，再进行反转录反应。1uL总RNA采用PrimeScript^TMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)试剂盒首先进行gDNA去除步骤，然后进行反转录(两步法：37℃15min；85℃5s)形成20μL第一链cDNA。两个品种不同处理间样本分别进行反转录，然后每一份材料进行重复，作为备份。-80℃保存。基因组DNA的分离，采用西瓜叶片作为材料，使用天根生化有限公司试剂盒-植物基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取。

(3)候选内参基因的选择，引物设计和PCR扩增：选择CAC，PP2A，RAN，RPS15，SAND，TBP2，TIP41,TUA5，TUB和UPL7作为候选内参基因，在拟南芥网站(http://www.arabidopsis.org/)搜索对应的拟南芥cDNA序列的ID，然后在西瓜基因组数据库(http://www.icugi.org/cgi-bin/ICuGI/index.cgi)对西瓜CDS进行BLASTN，得到西瓜的同源基因ID，用Primer3采用跨外显子接头位点的方式设计引物，引物产物的扩增长度控制在80-200bp之间。而Actin，18SrRNA引物参考文献中报道的序列(Kong Q,Yuan J,Gao L,Zhao S,Jiang W,Huang Y,Bie Z:Identification of Suitable Reference Genes for Gene Expression Normalizationin qRT-PCR Analysis in Watermelon.PLoS ONE 2014,9(2):e90612.)。最终，西瓜物种名的缩写词“Cl”被添加到已通过鉴定的西瓜特异性同源基因名前。用合成的引物对混合样的cDNA和gDNA进行常规PCR扩增(常规PCR程序：95℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，31个循环，72℃延伸4min)，PCR的扩增采用2×PCR反应物(天根生化科技有限公司)，产物用2％琼脂糖凝胶电泳进行检测，候选内参基因(ClCAC，ClPP2A，ClRAN，ClRPS15，ClSAND，ClTBP2，ClTIP41，ClTUA5，ClTUB，ClUPL7)cDNA条带清晰，gDNA无条带表明该引物具有特异性，并排除了gDNA的污染。ClACT在gDNA模板上扩增出的产物长度大于cDNA模板，表明ClACT在gDNA上的扩增片段中包含了内含子序列。同时，ClACT在gDNA和cDNA模板上都唯一的扩增出了目标片段，表明样品cDNA中不存在gDNA污染。而18SrRNA在cDNA和gDNA模板上都扩增出了相同的片段，表明使用该基因作为内参无法判断cDNA样品中有无gDNA的污染，同时，当有gDNA污染存在时，也无法排除其对结果的干扰。候选内参基因的引物序列及扩增特征见表1，其扩增特异性检测结果见图1。

表1候选内参基因的引物序列及qRT-PCR的扩增特征

序列表SEQ ID NO：1是本发明开发的ClCAC基因的跨相邻外显子接头引物的正向引物序列。序列表SEQ ID NO：2是本发明开发的ClCAC基因的跨相邻外显子接头引物的反向引物序列。序列表SEQ ID NO：3是本发明开发的ClSAND基因的跨相邻外显子接头引物的正向引物序列。序列表SEQ ID NO：4是本发明开发的ClSAND基因的跨相邻外显子接头引物的反向引物序列。序列表SEQ ID NO：5是ClCAC基因的核苷酸序列。序列表SEQ ID NO：6是ClSAND基因的核苷酸序列。

(4)qRT-PCR分析：qRT-PCR采用的是TransStart^TM Top Green qPCRSuperMix(天根生化科技有限公司)作为荧光染料。试验采用10μL上样体系，包括1μL模版(100ng)，前后引物各1μL(5nmol)，5μL的2×TransStart TopGreen qPCR SuperMix和2μL的ddH₂O。qRT-PCR在Roche480实时定量PCR检测系统中进行，PCR循环如下：

在56℃这一步采集荧光。最终的Cp(Crossing point)值包括了所有果实样本的生物学重复以及技术重复。分析引物标准曲线，计算引物扩增效率(E)。通过混合样品cDNA以5倍的浓度梯度依次稀释5个浓度(500，100，20，4和0.8ng/μL)，进行qRT-PCR，运用扩增效率的计算公式E＝(10^-1//slope-1)×100进行计算。

(5)候选内参基因稳定性分析：对12个候选内参基因在48个样本中的Cp值，按照Q＝(1+E)^{(minCp-sampleCp)}公式进行数据转换，然后对每个候选内参转换后的数据，按照不同基因型和不同坐果方式分为4组，用NormFinder软件计算表达稳定值M，结果见表2。由表2可知ClCAC的M最小，表明其在西瓜果实发育过程中表达最稳定，是最佳的内参基因。同时ClCAC和ClSAND组合被NormFinder确定为最佳内参基因组合。当前在西瓜果实中用作内参基因进行定量表达分析的18SrRNA只排在第9位，表明其并不适于用作西瓜果实发育过程中基因表达分析的内参基因。

表2用NormFinder计算的候选内参基因的稳定值及排序

稳定性排序	基因名称	稳定值(M)
			1	ClCAC*	0.16
2	ClSAND*	0.18
			3	ClACT	0.22
4	ClPP2A	0.30
			5	ClTIP41	0.32
6	ClTUA5	0.34
			7	ClRPS15	0.41
8	ClUPL7	0.42
			9	Cl18SrRNA	0.46
10	ClRAN	0.49
			11	ClTUB	0.62
12	ClTBP2	0.73

(6)内参基因可靠性的验证：对8424西瓜在人工授粉后10，18，23，27，30和35天进行采样，用来分析ClPSY1(Cla009122)(ClPSY基因参考文献:StefaniaG,Gabriella P,Je M L,Yi Z,Zhang F,Giuseppe D,James J G,Marcello SL:Comparative genomics reveals candidate carotenoid pathway regulators of ripeningWatermelon fruit.BMC Genomics2013,14:781)的表达模式。在西瓜基因组数据库(http://www.icugi.org/cgi-bin/ICuGI/index.cgi)获得该基因的序列，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：7所示。用Primer3采用跨外显子接头位点的方式设计引物，引物产物的扩增长度控制在80-200bp之间，获得ClPSY1的正向引物序列为：5’-CTAGCAGATGGCCGGTGT-3’，反向引物序列为：5’-GCCCTCTTTGTGAAGTTGTTG-3’。按照上述步骤(2)中的方法进行总RNA的分离，第一链cDNA的合成选。用NormFinder鉴定出来的最佳单个内参ClCAC，以及组合内参ClCAC和ClSAND作为内参基因对ClPSY1的表达进行相对定量，同时选用在西瓜果实中基因表达分析过程中广泛使用的内参18SrRNA作为对照。qRT-PCR分析按照上述步骤(4)所述方法进行。对组合内参ClCAC和ClSAND先计算其几何平均数，然后再进行相对定量，相对表达量的计算运用公式：2^-△△Cp＝2^{[(目标基因对照Cp-目标基因样品CP)-(内参基因对照Cp-内参基因样品Cp)]}(Schmittgen,T.D,Livak,K.J:Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method.NatureProtocols 2008,3,1101-1108)。选用人工授粉后10天的ClPSY1表达量作为对照。按照Liu等的方法测定授粉后18，23，27，30和35天果肉中番茄红素含量进行(Liu C,Zhang H,Dai Z,Liu X,Liu Y,Deng X,Chen F,Xu J:Volatile chemical andcarotenoid profiles in watermelons[Citrullus vulgaris(Thunb.)Schrad(Cucurbitaceae)]with different flesh colors.Food Sci Biotechnol 2012,21(2):531-541)。所采用的沃特世1525高效液相色谱仪，配有一个2996光电二极管阵列检测器，1个717自动进样器，一个色谱分析软件(沃特世，超高液相色谱仪，产地：美国)和一个碳30液相色谱分析柱(标准：150*4.6mm，孔径为3μm，YMC公司生产，威明顿市，美国)用来检测和量化番茄红素。从西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司购买色谱纯标准番茄红素样本。在qRT-PCR分析和番茄红素含量的测定中设置3个生物学重复2个技术重复，结果见图2。由图2可知，西瓜果肉中番茄红素的含量随着果实的成熟而逐渐上升，在授粉后27天达到最高值，之后含量趋于稳定。当以最佳单个内参ClCAC和最佳内参组合ClCAC和ClSAND定量ClPSY1基因的表达时，ClPSY1基因的表达水平与番茄红素的生物合成表现出了很好的相关性。但当以18SrRNA为内参时，ClPSY1基因在授粉后23天达到了最高值，其后表达水平急剧降低，表现出了与番茄生物合成完全不一致的表达模式。由此可见，利用本发明中筛选出的单个内参ClCAC及内参组合ClCAC和ClSAND能够获得更准确的定量结果。利用单个内参ClCAC及内参组合ClCAC和ClSAND进行相对定量时，虽然ClPSY1的表达趋势是一致的，但ClPSY1的相对表达水平却不同。利用ClCAC进行相对定量时，ClPSY1的表达水平要高于内参组合ClCAC和ClSAND。由于做内参时，ClCAC和ClSAND组合计算的是几何平均数，相对于单个最佳基因ClCAC而言，更能够降低表达变异，因此，利用ClCAC和ClSAND组合作为内参时获得的目标基因的相对定量结果应该更加准确。

实施例2

(1)植物材料：将西瓜F1代杂交种8424种植在塑料大棚中，开花当天分行人工授粉并标记。在人工授粉后10，18，23，27，30和35天对果实进行取样，每个时间点随机取2个果实，作为一次生物学重复，设三个生物学重复。取西瓜果实的中心果肉，液氮速冻，-80℃保存。

(2)总RNA的分离，第一链cDNA的合成和DNA的分离按照实施例1中描述的方法进行。

(3)目标基因：选择番茄红素合成途径中的八氢番茄红素合成酶基因(ClPSY2)，胡萝卜素脱氢酶基因(ClZDS)和β-胡萝卜素羟化酶基因(ClCHYB1)作为目标基因，分析其在西瓜果实成熟过程中的表达。这些基因的信息从文献(Stefania G,Gabriella P,Je M L,Yi Z,Zhang F,Giuseppe D,James J G,Marcello SL:Comparative genomics reveals candidate carotenoid pathway regulators ofripening Watermelon fruit.BMC Genomics，2013,14:781)中获得。

(4)引物设计按照实施例1种描述的方法进行。目标基因引物序列见表3。

表3西瓜番茄红素合成途径基因引物序列

基因名称	基因编号	正向引物序列(5'-3')	反向引物序列(5'-3')	产物长度
					ClPSY2	Cla005425	CTCGGACTCGCCAATCAACT	TATGTCGTCGTCGCATAGCC	120
ClZDS	Cla003751	TCTTAAGCGGTCCCATAAGGA	TACCTCCCTACATCCCCACC	87
					ClCHYB1	Cla011420	TTCGAGCTTTGGGATCACTT	G GAAACTCTTTGCCCTCCAT	81

(5)qRT-PCR分析。采用10μL反应体系，包括1μL模版(100ng)，正向引物和反向引物各1μL(5nmol)，5μL的2×TransStart Top Green qPCRSuperMix(天根生化科技有限公司)和2μL的ddH₂O。qRT-PCR在Roche480实时定量PCR检测系统中进行，PCR循环如下：94℃30s预变性；然后94℃5s，56℃15s，72℃10s进行40个循环，在56℃这一步采集荧光。采用2次技术重复，3次生物学重复，最终的Cp(Crossing point)值包括了所有果实样本的生物学重复以及技术重复。ClCAC和ClSAND作为内参基因。

(6)目标基因相对表达量计算。选用10d基因表达的Cp值为对照，分别采用单个ClCAC，以及ClCAC和ClSAND的组合作为内参，采用2^-△△Cp＝2^[(目标基 ^{因对照Cp-目标基因样品CP)-(内参基因对照Cp-内参基因样品Cp)]}法计算目标基因的相对表达量(Schmittgen,T.D,Livak,K.J:Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method.Nature Protocols 2008,3,1101-1108)。单个内参ClCAC的Cp值直接用于公式2-^△△Cp的计算，对于组合内参ClCAC和ClSAND，先计算两个基因Cp值的几何平均数，然后将几何平均数带入公式2^-△△Cp，计算目标基因的相对表达量。分别用单个ClCAC以及ClCAC和ClSAND组合为内参时ClPSY2,ClZDS,ClCHYB1基因在西瓜果实成熟过程中的相对表达量见图3、4、5。由图可知，分别以单个ClCAC以及ClCAC和ClSAND组合为内参时，目标基因ClPSY2,ClZDS,ClCHYB1在西瓜果实成熟过程中表现出了相同的表达模式，即在授粉后27天表达量达到最高，然后开始降低，这与实施例1中西瓜果实番茄红素的积累表现出了相同的变化趋势。此外，与单个ClCAC作为内参相比，ClCAC和ClSAND组合为内参时，目标基因的表达水平都相对要低，表明ClCAC和ClSAND组合内参能够更好地减少表达变异。但使用2个内参时，实验成本会增加。所以，可以根据研究的目的和要求来决定是选用单个内参ClCAC，还是ClCAC和ClSAND组合内参。

Claims

1.ClCAC基因和ClSAND基因在采用实时荧光定量PCR分析西瓜果实的基因表达时作为内参基因的应用，其特征是：

(1)ClCAC基因单独作为西瓜果实基因表达分析中的内参基因；或

(2)ClCAC基因和ClSAND基因组合的几何平均数作为西瓜果实基因表达分析中的内参基因，

所述ClCAC基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，所述ClSAND基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。

2.一种采用实时荧光定量PCR分析西瓜果实基因表达的方法，其特征是：

3.如权利要求2所述的采用实时荧光定量PCR分析西瓜果实基因表达的方法，其特征是：

所述ClCAC基因的跨相邻外显子接头的引物核苷酸序列是：

正向引物序列：GAACTTGGCACCTGTCCTGT

反向引物序列：GAACAGTGCAACAGCCTCAA；

所述ClSAND基因的跨相邻外显子接头的引物核苷酸序列是：

正向引物序列：TGCAAACATAAGGTTATCAGTCTTG

反向引物序列：GCATACAAAAACGCCATAGGA。