CN104694631A - 一种西瓜基因表达的实时荧光定量pcr分析方法 - Google Patents

一种西瓜基因表达的实时荧光定量pcr分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种西瓜基因表达实时荧光定量PCR分析方法，属于基因表达分析技术领域。本发明根据目标基因的结构信息，将目标基因的正向或反向引物的结合位点特异地设计在相邻外显子的接头处，使之在cDNA模板上能扩增出目标片段，而在基因组DNA模板上无扩增产物，然后用该引物进行目标基因表达的实时荧光定量PCR分析。该引物设计方法可以排除cDNA样本中存在基因组DNA的污染时对基因表达结果的影响，使利用实时荧光定量PCR技术获得西瓜基因表达的数据更准确。本发明不仅使用范围广，而且能节约实验成本，具有很大的实用性。

Description

一种西瓜基因表达的实时荧光定量PCR分析方法
技术领域
本发明属于基因表达分析技术领域，具体涉及西瓜基因表达的实时荧光定量PCR分析方法。
背景技术
实时荧光定量PCR(Real-time fluorescent quantitative PCR，简称qRT-PCR)是基因表达定量分析中的常用技术，是分子生物学研究中不可缺少的重要研究手段，它是基于聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)和反转录技术发展起来。
在基因表达分析过程中，首先要提取样本的RNA，然后反转录成cDNA，之后再以cDNA为模板，利用目标基因的特异引物，采用qRT-PCR技术对基因表达进行定量分析。由于提取RNA过程中通常会有基因组DNA污染，所以反转录成cDNA之前，需要利用相关的酶来降解RNA样品中的基因组DNA(简称为gDNA)。但对于缺乏经验的实验人员而言，通常会遗漏去除gDNA的步骤，导致进行基因表达的定量分析时，除了扩增出cDNA上的基因片段外，还可能扩增了gDNA上的目标片段，从而大大增加了基因的表达量，导致结果错误。此外，即使利用酶切的方法降解gDNA，也不能完全消除酶切后的小片段gDNA对表达结果的影响。因为，有些gDNA上的假基因可能只是被酶切成了小片段，并没有被完全降解，这些假基因与对应的能表达的基因在序列上是一样的，因此，同样可能扩增出这些假基因的片段，导致目标基因的表达水平被高估。
目前在基因引物设计过程中，研究人员通常是在获取目标基因的序列后，利用Primer3等引物设计软件设计基因的特异引物，再将之用于基因的表达分析。这种引物设计方法并不考虑引物在基因上的结合位点，我们将这种方法称为随机结合位点的引物设计。利用这种方法设计出来的引物虽然能保证扩增出目标基因，但也可能在cDNA和gDNA上都能扩增出相同大小的片段。因此，无法在基因表达分析过程中排除gDNA污染和假基因的影响，从而使基因表达水平被高估，导致结果错误。所以，基因表达分析中需要一种新的引物设计方法，来排除可能的gDNA污染和假基因的存在对基因表达分析的影响，保证结果的准确性。
发明内容
在利用qRT-PCR进行基因表达分析过程中，为排除cDNA样品中gDNA污染和假基因片段对表达结果造成的影响，克服一般基因引物设计方法的缺陷，确保基因表达分析结果的准确性，本发明提供了专门用于西瓜基因表达分析中一种跨相邻外显子接头位点引物的设计方法，利用该方法设计的基因特异引物可以使实验结果不受cDNA样品中存在gDNA污染以及假基因片段的影响。
本发明解决其技术问题所采用的原理是：位于gDNA上的基因表达时，先转录成前体mRNA，前体mRNA经过编辑形成成熟的mRNA，然后成熟mRNA再翻译成蛋白，执行相应的生物功能。在前体mRNA的编辑过程中一个重要内容就是切除前体mRNA上的内含子。因此，基因的成熟mRNA序列与其DNA序列相比就只有外显子而没有内含子。如将基因的特异引物设计在两个相邻的外显子的接头位点，那么以cDNA为模板时能扩增出目标基因的片段，而在gDNA上，由于相邻两个外显子接头位点被内含子分隔，导致以gDNA为模板进行PCR扩增时引物无结合位点，就无扩增产物。因此，基因表达分析时，即使cDNA样品中有gDNA的污染或则假基因的片段，由于无法扩增而克服了其对基因表达结果的影响。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
从葫芦科基因组数据库(http://www.icugi.org)获取目标西瓜基因的完整序列和结构信息；根据目标基因结构信息，确定外显子的接头位点；采用Primer3Plus(http://primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi)进行引物设计，将两个相邻外显子序列接头位点上下游15bp的序列用“{}”标识，限制基因的一个引物在这个两个相邻外显子结合位点区域进行设计，然后将扩增产物大小设为80-150bp，以满足qRT-PCR的要求；分别以cDNA和gDNA为模板进行PCR扩增，然后电泳检测，如在cDNA模板上扩增出了目标片段，而在gDNA模板上无扩增产物，则引物设计正确，用该引物对目标基因的表达进行qRT-PCR分析；如扩增失败，则选择另外的外显子结合位点按照上述方法重新进行引物设计。
本发明的特点在于：在进行基因表达分析时，根据基因的结构进行引物设计，将引物与模板的结合位点特异地设置在跨相邻外显子的接头位置，使其只能在cDNA模板上扩增出目标片段，而在gDNA模板上无扩增产物，从而有效地克服了cDNA样品中存在的gDNA污染对基因表达分析结果的影响。利用该方法成功设计了西瓜果实中类胡萝卜素生物合成及代谢途径中重要的调控基因类胡萝卜素过氧化氢裂解酶基因(CCD1)和β-胡萝卜素羟化酶基因(CHYB)的跨外显子接头特异性引物。
本发明的优点是：
(1)准确性。克服了基因表达分析中传统引物设计方法的缺陷，本发明设计的跨相邻外显子接头位点的基因引物，在表达分析中可以不受到cDNA样品中存在的gDNA污染和假基因片段的干扰，从而有效保证了基因表达分析结果的准确性。
(2)实用性。利用本发明设计的引物由于在gDNA上无扩增产物，所以在cDNA样品制备过程中，可以不需加相关的酶去除gDNA，从而节约了实验成本；同时，对于未知的cDNA样本也不需要检测是否存在gDNA的污染，而直接可以用于基因表达分析。因此，本发明不仅使用范围广，而且能节约实验成本，具有很大的实用性。
附图说明
图1：西瓜CCD1基因结构示意图。
图2：西瓜CCD1基因PCR扩增时跨外显子接头位点的引物与模板cDNA结合及扩增示意图。
图3：西瓜CCD1基因PCR扩增时跨外显子接头位点的引物与模板gDNA结合及扩增示意图。
图4：西瓜CCD1和CHYB基因引物PCR扩增的特异性电泳检测结果。
图5：西瓜CCD1基因在西瓜果实成熟过程中的相对表达量的qRT-PCR分析结果。
图6：西瓜CHYB基因结构示意图。
图7：西瓜CHYB基因PCR扩增时跨外显子接头位点的引物与模板cDNA结合及扩增示意图。
图8：西瓜CHYB基因PCR扩增时跨外显子接头位点的引物与模板gDNA结合及扩增示意图。
图9：西瓜CHYB基因在西瓜果实成熟过程中的相对表达量的qRT-PCR分析结果。
具体实施方式
实施例1西瓜CCD1基因跨相邻外显子接头位点引物的设计及其表达分析
(1)西瓜CCD1基因序列和结构信息的获得：
类胡萝卜素过氧化氢裂解酶基因(CCD1)的序列参考文献Grassi S,Piro G,Lee J M,et al.Comparative genomics reveals candidate carotenoid pathway regulators of ripeningwatermelon fruit[J].BMC genomics,2013,14(1):781。从葫芦科基因组数据库(http://www.icugi.org/)下载该基因的序列及基因结构信息(ID:Cla015245)，基因序列见SEQ ID NO.5，结构信息见图1。
(2)CCD1基因随机结合位点引物设计：
当前进行基因表达分析时，在对目标基因进行引物设计的过程中，通常都是将基因的CDS序列放到引物设计软件中进行引物设计，这种方法并不考虑引物在基因上的结合位点，我们将这种方法称为随机结合位点的引物设计。为说明我们发明的跨相邻外显子接头位点引物设计方法的可靠性，我们同时也利用随机结合位点的引物设计方法对CCD1基因进行了引物设计，并作为对照。随机结合位点的引物设计过程为：将CCD1基因的CDS序列放入Primer3Plus软件，选用qPCR默认参数，产物长度设为80-150bp，点击Pick primers，选用排在第一位的引物对，序列见表1。将获取的引物序列和CCD1基因的CDS序列进行比对，发现该引物对位于第1个外显子上，即该引物对的扩增的序列全部在第1号外显子的内部。为与步骤(3)中跨相邻外显子接头位点的引物对进行区分，将该引物对命名为CCD1’。
(3)CCD1基因跨相邻外显子接头位点的引物设计：
根据CCD1基因的结构信息，在其编码区序列(CDS)的第7和第8外显子接头位点上下游各15bp的序列用“{}”标识，然后利用Primer3Plus(http://primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi)设计引物，选用qPCR默认参数，产物长度设为80-150bp，点击Pick primers，选用排在第一位的引物对，命名为CCD1，引物序列见表2，正向引物序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物序列如SEQ ID NO.2所示。
图2为以cDNA为模板进行PCR扩增时，西瓜CCD1基因跨外显子接头位点引物与模板的结合及扩增示意图。由图2可得，正向引物结合在在第7个外显子上，反向引物结合在第7和第8个外显子的接头位点上，扩增出长度94bp的目标片段。图3为以gDNA为模板进行PCR扩增时，西瓜CCD1基因跨外显子接头位点的引物与模板gDNA的结合及扩增示意图。由图3可得，由于gDNA上内含子的间隔导致反向引物无法结合到gDNA模板上，故无扩增产物。所以，利用本发明设计的引物，在cDNA模板上能扩增出目的片段条带，但在gDNA模板上则无扩增产物。
(4)RNA和DNA的提取：
取红瓤西瓜授粉后24和30天的果肉样品为材料，采用Trizol法提取RNA。用Nanodrop2000检测RNA的浓度和质量，A260/A280和A260/A230的比值在1.8-2之间。RNA的完整性采用2％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，电泳图谱28S，18S条带清晰，表明RNA完整性较好。RNA检测合格后，再进行反转录反应。采用CTAB法提取基因组DNA，用Nanodrop2000检测DNA的浓度和质量，分装保存。
(5)cDNA的反转录：
反转录时进行去除gDNA和不去除gDNA两种处理：
第一种(不去除gDNA)：2uL总RNA采用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNAEraser(TaKaRa)试剂盒直接进行反转录的第二步骤(37℃15min；85℃5s)，形成40ul的没有去除gDNA的cDNA。用Nanodrop2000检测cDNA的浓度和质量，做好记录，分装备份于-80℃保存。
第二种(去除gDNA)：2uL总RNA采用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNAEraser(TaKaRa)试剂盒首先进行gDNA去除步骤，然后进行反转录(两步法：42℃2min和37℃15min；85℃5s)形成40μL的去除gDNA的cDNA。用Nanodrop2000检测cDNA的浓度和质量，做好记录，分装备份于-80℃保存。
(6)CCD1基因引物的PCR扩增特异性检测：
分别以cDNA(分去除gDNA和未去除gDNA两种)和gDNA为模板，进行PCR扩增特异性的检测。PCR程序为95℃预变性5min，然后94℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸30s进行35个循环，72℃延伸4min。采用20ul扩增体系，包含：1×PCR mix(天根生化科技有限公司)，0.5umol/L的引物，30ng基因组DNA模板或400ng cDNA模板。为表明未去除gDNA的cDNA样品中存在gDNA污染，我们同时选择了文献中报道的西瓜的YLS8基因对模板进行扩增。西瓜YLS8基因的引物序列来自于文献Kong Q,Yuan J,Gao L,et al.Identification of Suitable Reference Genes for Gene ExpressionNormalization in qRT-PCR Analysis in Watermelon.PloS one,2014,9(2):e90612.PCR扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果见图4。图4中，c代表以cDNA为模板时PCR扩增产物的电泳检测结果；c(g)代表以含有gDNA污染的cDNA为模板时PCR扩增产物的电泳检测结果；g代表以gDNA为模板时PCR扩增产物的电泳检测结果。
从图4可以看出，ClYLS8在cDNA、gDNA模板上均扩增出条带，ClYLS8基因的扩增片段包含了内含子，所以，在gDNA上的扩增产物要大于cDNA模板上的扩增产物。同时，ClYLS8基因在未去除gDNA的cDNA模板上扩增出了2条带，表明该cDNA样品中确实存在gDNA污染。采用本发明跨相邻外显子接头方法设计的CCD1基因的引物，以cDNA为模板和含有gDNA污染的cDNA为模板均扩增出了目标片段，而以gDNA为模板则无扩增产物，表明利用本发明设计的引物进行PCR扩增时，只能在cDNA模板上扩增出目标片段，而在gDNA模板上则无扩增产物，所以，进行基因表达分析时可以不受cDNA样品中gDNA污染的影响。而当前普遍采用的随机结合位点引物设计方法设计的引物对CCD1’无论是在cDNA模板还是gDNA模板上都扩增出了相同大小的目标片段，表明利用该方法设计的引物不能排除cDNA样品中存在gDNA污染时对基因表达结果的影响。
(7)ClCCD1基因表达的qRT-PCR分析
分别以去除gDNA的cDNA模板和未去除gDNA的cDNA为模板，用Roche 480分析ClCCD1基因在西瓜果实授粉后24天和30天中的相对表达量。qRT-PCR采用10μL上样体系，包括1μL模版(120ng)，前后引物各1μL(5nmol)，5μL的2×TransStartTop Green qPCR SuperMix(和2μL的ddH2O。PCR循环体系为94℃30s，然后94℃5s、56℃15s 40个循环，72℃10s。选用西瓜果实的24d基因表达的Cp值为对照，采用ClACT，ClCAC和ClSAND作为内参(引物序列来自于文献Kong Q,Yuan J,Gao L,et al.Identification of Suitable Reference Genes for Gene Expression Normalization in qRT-PCRAnalysis in Watermelon.PloS one,2014,9(2):e90612.)。采用2-△△Cp＝2[(目标基因对照Cp-目标基因样品 CP)-(内参基因对照Cp-内参基因样品Cp)]法计算目标基因的相对表达量(Schmittgen,T.D,Livak,K.J:Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method.Nature Protocols 2008,3,1101-1108)，结果见图5。图5中，A代表以cDNA(去除gDNA)为模板，用常规方法设计的CCD1’引物检测的基因相对表达量；B代表以cDNA(去除gDNA)为模板，用本发明设计的CCD1引物检测的基因相对表达量；C代表以cDNA(未去除gDNA)为模板，用常规方法设计的CCD1’引物检测的基因相对表达量；D代表以cDNA(未去除gDNA)为模板，用本发明设计的CCD1引物检测的基因相对表达量。由图5可知，当以去除gDNA的cDNA为模板时，利用随机结合位点设计的引物(CCD1’)和本发明的跨相邻外显子接头位点设计的引物(CCD1)获得的CCD1基因在西瓜果实30天的相对表达量是相同的。而当以有gDNA污染的cDNA为模板时，利用随机结合位点设计的引物(CCD1’)获得的CCD1基因在西瓜果实30天的相对表达量要显著高于以无gDNA污染的cDNA为模板时利用该引物(CCD1’)所获得的CCD1基因在西瓜果实30天的相对表达量，表明利用该引物进行基因表达的qRT-PCR分析时，会受到cDNA样品中存在的gDNA污染的影响。而无论cDNA样品中是否存在gDNA污染，利用本发明设计的跨相邻外显子接头位点设计的引物(CCD1)所获得的CCD1基因在西瓜果实30天的相对表达量都是一样的，表明本发明所设计的基因引物可以克服cDNA样品中存在的gDNA污染对目标基因表达量的干扰。而利用常规方法设计的引物，当cDNA样品中存在gDNA污染时，显著高估了目标基因的表达量，导致结果错误。
实施例2西瓜CHYB跨相邻外显子接头位点引物的设计及表达分析
(1)西瓜CHYB基因序列和结构信息的获得：
西瓜β-胡萝卜素羟化酶基因(CHYB)基因序列参考文献Grassi S,Piro G,Lee J M,etal.Comparative genomics reveals candidate carotenoid pathway regulators of ripeningwatermelon fruit[J].BMC genomics,2013,14(1):781。从葫芦科基因组数据库(http://www.icugi.org/)下载该基因的序列及基因结构信息(ID:Cla006149)。基因序列见SEQ ID NO.6，结构信息见图6。
(2)CHYB基因随机结合位点引物设计：
方法参考实施例1中的步骤(2)，引物命名为CHYB’，序列见表1。经序列比对发现CHYB’引物对都位于第1个外显子上。
(3)CHYB基因跨相邻外显子接头位点的引物设计：
根据CHYB基因的结构信息，在其编码区序列(CDS)的第1和第2外显子接头位点上下游各15bp的序列用“{}”标识，然后利用Primer3Plus设计引物，选用qPCR默认参数，产物长度设为80-150bp，点击Pick primers，选用排在第一位的引物对，命名为CHYB，引物序列见表2，正向引物序列如SEQ ID NO.3所示，反向引物序列如SEQID NO.4所示。
图7为以cDNA为模板进行PCR扩增时，西瓜CHYB基因跨外显子接头位点引物与模板cDNA的结合及扩增示意图。由图7可得，正向引物结合在第1个外显子上，反向引物结合在第1和第2个外显子的接头位点，扩增出长度为114bp目的片段为。图8为以gDNA为模板进行PCR扩增时，西瓜CHYB基因跨外显子接头位点引物与模板gDNA的结合及扩增示意图。由图8可得，由于gDNA上内含子的间隔导致反向引物无法结合到DNA模板上，故无扩增产物。所以，利用本发明设计的引物进行扩增，在cDNA上可以扩增出目的片段条带，但在gDNA上则无扩增产物。
(4)RNA和DNA的提取：
方法参考实施例1中的步骤(4)。
(5)cDNA的反转录：
方法参考实施例1中的步骤(5)。
(6)CHYB基因引物的PCR扩增特异性检测：
方法参考实施例1中的步骤(6)，结果见图4。ClYLS8在cDNA、gDNA模板上均扩增出条带，ClYLS8基因的扩增片段包含了内含子，所以，在基因组DNA上的扩增产物要大于cDNA模板上的扩增产物。同时，ClYLS8基因在未去除gDNA的cDNA模板上扩增出了2条带，表明该cDNA样品中确实存在gDNA污染。采用本发明跨相邻外显子接头方法设计的CHYB基因的引物，以cDNA为模板和含有gDNA污染的cDNA为模板均扩增出了目标片段，而以gDNA为模板则无扩增产物，表明利用本发明设计的引物进行PCR扩增时，只能在cDNA模板上扩增出目标片段，而在gDNA模板上则无扩增产物，所以，进行基因表达分析时可以不受cDNA样品中gDNA污染的影响。而当前普遍采用的随机结合位点引物设计方法设计的引物对CHYB’无论是在cDNA模板还是gDNA模板上都扩增出了相同大小的目标片段，表明利用该方法设计的引物不能排除cDNA样品中存在gDNA污染时对基因表达结果的影响。
(7)CHYB基因表达的qRT-PCR分析
具体方法可参考实施例1中的步骤(7)，结果见图9，图9中：A代表以cDNA(去除gDNA)为模板，用常规方法设计的CHYB’引物检测的基因相对表达量；B代表以cDNA(去除gDNA)为模板，用本发明设计的CHYB引物检测的基因相对表达量；C代表以cDNA(未去除gDNA)为模板，用常规方法设计的CHYB’引物检测的基因相对表达量；D代表以cDNA(未去除gDNA)为模板，用本发明设计的CHYB引物检测的基因相对表达量。由图9可知，当以去除gDNA的cDNA为模板时，利用随机结合位点设计的引物(CHYB’)和本发明的跨相邻外显子接头位点设计的引物(CHYB)获得的CHYB基因在西瓜果实30天的相对表达量是相同的。而当以有gDNA污染的cDNA为模板时，利用随机结合位点设计的引物(CHYB’)获得的CHYB基因在西瓜果实30天的相对表达量要显著高于以无gDNA污染的cDNA为模板时利用该引物(CHYB’)所获得的CHYB基因在西瓜果实30天的相对表达量，表明利用该引物进行基因表达的qRT-PCR分析时，会受到cDNA样品中存在的gDNA污染的影响。而无论cDNA样品中是否存在gDNA污染，利用本发明设计的跨相邻外显子接头位点设计的引物(CHYB)所获得的CHYB基因在西瓜果实30天的相对表达量都是一样的，表明本发明所设计的基因引物可以克服cDNA样品中gDNA污染对目标基因表达量的干扰。而利用常规方法设计的引物，当存在gDNA污染时，显著高估了目标基因的表达量，导致结果错误。
附表1 用常规的随机结合位点引物方法设计的引物序列
附表2 本发明设计的跨外显子接头的引物序列

Claims (5)

1.一种西瓜基因表达的实时荧光定量PCR分析方法，其特征在于包括以下步骤：
1)根据西瓜基因的序列设计跨相邻外显子接头位点引物；
2)提取西瓜样本的RNA，然后反转录成cDNA，再以cDNA为模板，用步骤1)设计的跨相邻外显子接头位点引物，对西瓜基因的表达进行实时荧光定量PCR分析。
2.一种西瓜CCD1基因表达的实时荧光定量PCR分析方法，其特征在于包括以下步骤：
1)根据西瓜CCD1基因的序列设计跨相邻外显子接头位点引物；
2)提取西瓜样本的RNA，然后反转录成cDNA，再以cDNA为模板，用步骤1)设计的跨相邻外显子接头位点引物，对西瓜CCD1基因的表达进行实时荧光定量PCR分析。
3.如权利要求2所述的西瓜CCD1基因表达的实时荧光定量PCR分析方法，其特征在于：
所述跨相邻外显子接头位点引物是跨西瓜CCD1基因第7和第8外显子接头位点引物，该引物的核苷酸序列是：
正向引物序列：CAGACACTTGGTCTGCTGGA
反向引物序列：ATGTGAACATTTCGCCAGTG。
4.一种西瓜CHYB基因表达的实时荧光定量PCR分析方法，其特征在于包括以下步骤：
1)根据西瓜CHYB基因的序列设计跨相邻外显子接头位点引物；
2)提取西瓜样本的RNA，然后反转录成cDNA，再以cDNA为模板，用步骤1)设计的跨相邻外显子接头位点引物，对西瓜CHYB基因的表达进行实时荧光定量PCR分析。
5.如权利要求4所述的西瓜CHYB基因表达的实时荧光定量PCR分析方法，其特征在于：
所述跨相邻外显子接头位点引物是跨西瓜CHYB基因第1和第2外显子接头位点引物，该引物的核苷酸序列是：
正向引物序列：TCGGAGCGCTTCACTTATCT
反向引物序列：AATCTCTCCGCCCTCCATT。
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