CN102639719A - 用化学修饰的引物相比于DNA优先扩增mRNA - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用包含至少一个在环外氨基处被修饰的核苷酸的寡核苷酸而对包含外显子-外显子接头的信使RNA目标进行选择性扩增的方法、寡核苷酸、反应混合物和试剂盒。
Description
发明领域
本发明涉及核酸扩增领域,更具体地,涉及用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)的RNA扩增领域。
发明背景
逆转录聚合酶链式反应是一种产生并指数扩增RNA模板的DNA拷贝的方法。在基因表达领域,该方法具有定性和定量的应用。该方法允许检测和测量生物体表达的mRNA的水平。
RT-PCR的主要困难在于基因组DNA对于RNA制备的污染。正如RNA分离试剂和技术的领先的经销商所承认的,大部分RNA分离技术产生的RNA具有相当数量的基因组DNA污染(Ambion,Austin,Tex.,(Life Technologies,Inc.),Technical Bulletin #176 “RT-PCR中避免DNA污染。”)。DNA污染对于RT-PCR尤其有问题,其中最小量的污染DNA都会被指数扩增。一种降低RT-PCR对于DNA扩增的方法涉及用脱氧核糖核酸酶如DNase I对样品进行预处理,见Huang等人,(1996) Biotechniques 20:1012-1020。不幸的是,这种方法不是没有问题。预处理后,必须将DNase失活以防止在RT-PCR期间新生的DNA扩增子的消化。然而,DNAse彻底失活所需的高温会导致RNA模板的降解。作为加热的替代方案,可能用苯酚萃取或用各种从反应混合物中去除DNase的精细和昂贵的试剂化学去除DNase。总之,在RT-PCR中使用DNase是不实用的,因为它需要多个额外步骤,经常威胁脆弱的RNA目标。
由于DNA污染的问题被认为很棘手,已经付出了努力来防止RT-PCR对DNA污染的扩增。一种这样的策略利用了真核基因组DNA中存在内含子。在成熟的mRNA中,缺乏内含子。如果设计在内含子侧翼的引物,从mRNA产生的扩增子将缺乏内含子。然而,从相应的基因组DNA模板中产生的RT-PCR扩增子中包括内含子。如果内含子足够大,将优先扩增较短的mRNA序列(以及随后的cDNA序列),而扩增基因组DNA的效率较低或几乎不扩增(Ambion,Tech. Bull. #176)。在最坏的情形中,基因组DNA和所需的mRNA目标共同扩增,但是两种扩增子可以通过电泳辨别。
不幸的是,引物设计通常不能够克服DNA污染的问题。现在许多PCR测试涉及实时PCR,该技术不包括电泳,但能够在扩增的同时检测核酸,见美国专利No.5,994,056和5,876,930以及相关专利。没有电泳,实时PCR不能够解析出(parse out)相同引物组产生的大小不同的扩增子。检测mRNA目标的任何实时PCR探针也将不可避免地检测相应的基因组DNA污染物。这将不能辨别mRNA及其相应的基因组DNA 。因此,当感兴趣的区域中的内含子太小不能排除基因组DNA的扩增时,可能不能使用实时PCR。
因此,期望创造出一种能保证在RT-PCR期间基因组DNA污染物不与mRNA共同扩增的引物设计的新方法。这种引物设计方法能不论扩增子中内含子的大小而实现mRNA目标的定量扩增。
发明概述
在第一方面,本发明涉及在样品中选择性扩增包含外显子-外显子接头的信使RNA目标的方法,包括步骤:a)将第一寡核苷酸与所述mRNA目标杂交,用至少一种能够RNA-引导合成的酶进行RNA-引导的DNA合成,其中所述第一寡核苷酸包含至少一种在环外氨基基团被修饰的核苷酸,与所述mRNA目标至少部分互补,并在目标中横跨外显子-外显子接头;以及b) 用所述第一寡核苷酸和第二寡核苷酸以及至少一种能够DNA-引导的DNA合成的酶扩增步骤 a)的产物;其中所述第二寡核苷酸与所述mRNA目标至少部分互补。也公开了实施本发明的寡核苷酸、反应混合物和试剂盒。
附图简要说明
图1是本发明情境中下文定义的外显子-外显子接头的图示,显示了横跨外显子-外显子接头的引物。
图2为根据本发明的引物设计的图示。
图3显示了用本发明的方法中所用的引物SEQ ID No:3的扩增曲线。
图4显示了用本发明的方法中所用的引物SEQ ID No:6的扩增曲线。
图5显示了用本发明的方法中所用的引物SEQ ID No:7的扩增曲线。
图6显示了用本发明的方法中所用的引物SEQ ID No:10的扩增曲线。
图7显示了用本发明的方法中所用的引物SEQ ID No:11的扩增曲线。
图8显示了用本发明的方法中所用的引物SEQ ID No:12的扩增曲线。
图9显示了用本发明的方法中所用的引物SEQ ID No:13的扩增曲线。
图10显示了用本发明的方法中所用的引物SEQ ID No:14的扩增曲线。
图11显示了用本发明的方法中所用的引物SEQ ID No:15的扩增曲线。
发明的详细说明
定义
在本发明的说明和权利要求中,将使用下列定义。除非另有定义,此处所用的所有技术和科学术语和本发明所属领域普通技术人员通常理解的具有相同含义。
术语“信使RNA”或“mRNA”是指从基因组DNA中转录并携带蛋白合成的编码序列的RNA。在真核生物中,将mRNA的核苷酸序列进行修饰以形成编码蛋白的序列。修饰通常涉及从mRNA序列中“剪切”或去除内含子。在一些情况下,也通过“编辑”改变mRNA的核苷酸序列以形成编码蛋白的序列。
在mRNA合成的情况下,术语“对应的基因组DNA”是指含考虑的mRNA的模板的基因组DNA。对应的基因组DNA可能包含与mRNA的模板相似或互补的额外序列,如考虑的基因以及该基因的副本和假基因。通常,对应的基因组DNA来自于和mRNA相同的生物体,然而,如在某些病毒的情况下,对应的基因组DNA可能来自于不同的生物体。在以RNA形式存在的逆转录病毒的情形时,相应的基因组DNA可能是包含前病毒(整合的病毒DNA)的宿主DNA。
术语“核酸”是指核苷酸(例如,核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、核苷酸类似物等等)的聚合物,包括脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、DNA-RNA杂合物、寡核苷酸、聚核苷酸、适体(aptamers)、肽核酸(PNAs)、PNA-DNA缀合物、PNA-RNA缀合物,等等,其包含以线性或分枝模式共同共价连接的核苷酸。核酸通常是单链的或双链的,通常包含磷酸二酯键,尽管在一些情形下,包括可能具有其它骨架的核酸类似物,例如包括磷酰胺(Beaucage等人(1993) Tetrahedron 49(10):1925);硫代磷酸(Mag等人.(1991) Nucleic Acids Res.19:1437; 和美国专利No.5,644,048),二硫代磷酸酯(Briu等人.(1989) J. Am. Chem. Soc .111:2321),O-甲基亚磷酰胺连接(见Eckstein,Oligonucleotides and Analogues:A Practical Approach,Oxford University Press (1992))和肽核酸骨架和连接(见Egholm (1992) J.Am.Chem.Soc.114:1895)。其它核酸类似物包括具有正电荷骨架(Denpcy等人.(1995) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:6097); 非离子骨架(美国专利No.5,386,023、5,637,684、5,602,240、5,216,141和4,469,863)和非核糖骨架(包括美国专利No.5,235,033和5,034,506中描述的那些)的那些核酸类似物。包含一种或更多种碳环糖的核酸也包括在核酸的定义中(见Jenkins等人.(1995) Chem.Soc.Rev.pp.169-176),类似物也在例如Rawls,C & E News Jun.2,1997 page 35中记载。可能进行核糖磷酸骨架的这些修饰以帮助额外部分如标记的加入,或改变这种分子在生理环境中的稳定性和半衰期。
除了通常在核酸中发现的天然存在的杂环碱基(例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶),核酸也可能包括具有非天然存在的杂环碱基的核苷酸类似物,如在Seela等人.(1999) Helv.Chim.Acta 82:1640中描述的那些。在核苷酸类似物中使用的某些碱基作为解链温度(Tm)改变剂。例如,这些中的一些包括7-氮杂嘌呤(例如7-氮杂鸟嘌呤、7-氮杂腺嘌呤等等)、吡唑并[3,4-d]嘧啶、丙炔基-dN(例如丙炔基-dU、丙炔基-dC等等)及其类似物。例如见美国专利No.5,990,303。其它代表性的杂环碱基包括,例如次黄嘌呤、肌苷、黄嘌呤及其衍生物。
“核苷”是指核酸组分,其包括共价连接于糖部分、糖部分的衍生物或糖部分的功能等同物(例如碳环)的碱或碱性基团(包括至少一个碳环、至少一个杂环、至少一个芳环和/或类似物)。例如,当核苷包括糖部分时,碱通常连接在糖部分的1'-位上。如上所述,碱基可以是天然存在的碱基或非天然存在的碱基。示例性核苷包括核糖核苷、脱氧核糖核苷、二脱氧核糖核苷和碳环核苷。
“核苷酸”是指核苷的酯,例如具有一个、两个、三个或更多共价连接在糖部分或其衍生物或等同物上的磷酸基团的核苷的磷酸酯。
“寡核苷酸”是指包括至少两个、但通常5-50个核苷酸、更通常地15-35个核苷酸的核酸。寡核苷酸的正确大小通常取决于各种因素,包括寡核苷酸的最终功能或用途。可能通过本领域已知的任何合适的方法制备寡核苷酸,包括例如,合适序列的克隆和限制性消化或通过如Narang等人(1979) Meth.Enzymol.68:90-99的磷酸三酯法; Brown等人.(1979) Meth.Enzymol.68:109-151的磷酸二酯法; Beaucage等人.(1981) Tetrahedron Lett.22:1859-1862的二乙基亚磷酰胺法;Matteucci等人.(1981) J.Am.Chem.Soc.103:3185-3191的三酯法; 自动合成法; 美国专利No.4,458,066的固体支持法或本领域已知的任何化学方法等方法的直接化学合成法。
“引物”是能与模板核酸杂交并允许用核苷酸引入酶链延伸或延长的寡核苷酸。尽管有时采用其它引物长度,通常引物在15-35核苷酸的范围。短引物通常采用更低的温度以与模板核酸形成充分稳定的杂交复合物。与模板核酸的亚序列至少部分互补的引物通常足以和模板核酸杂交而使延伸发生。然而,成功的延伸通常需要引物的3’-末端的更高的互补性(即和模板更低的错配)。如果需要,可以通过引入可通过放射的、光谱学的、光化学的、生化的、免疫化学的或化学的技术检测的标记而标记引物。
“引物延伸”是将额外的核苷酸加入引物的酶的作用。
“模板核酸”、“模板”或“目标”是指可以在合适条件下与引物杂交并被延伸的核酸。在核酸扩增的情况中,“目标”优选是由与至少两条引物序列和间插序列至少部分互补的序列组成的核酸的区段。模板或目标核酸可以作为分离的核酸片段存在或是更大的核酸片段的一部分。目标核酸可以从基本上任何生物来源获得或分离,如微生物、复合生物混合物、组织、血清、包括人患者样品或组织和血清、古代的或保存的组织或样品、环境分离物或类似物。而且,模板核酸任选地包括或来源于cDNA、RNA、基因组DNA、克隆的基因组DNA、基因组DNA文库、酶切的片段化DNA或RNA、化学片段化DNA或RNA、物理片段化DNA或RNA或类似物。模板核酸也可以用本领域已知的技术化学合成。
“实时PCR”测试是其中在PCR循环过程中检测和定量扩增子的PCR测试。典型的实时PCR测试涉及光学地检测扩增产物,其在循环过程中重复进行。扩增的测定值是“阈循环”或“Ct”,即当首次检测到高于背景的荧光时的循环。越早的Ct值反映了阈值水平的快速实现以及因此初始模板的更高的加入量或更高效的扩增。 越晚的Ct值可能反映了初始模板的更小量的加入量或低效或被抑制的扩增。
此处所用的“基因”是指与生物功能相关的任何DNA区段。因此,基因包括编码序列、间插性非编码序列(内含子)和任选地编码序列表达所需的调控序列。
“部分”或“基团”是指某些东西如分子被分成的部分之一(例如功能基团、取代基团或类似物)。例如,核苷酸通常包含碱性基团(例如腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、尿嘧啶或类似物)、糖部分和一种或更多种磷酸基团。
“烷基”是指线性、分枝或环状的饱和烃部分,包括所有的位置异构体,例如甲基、乙基、丙基、丁基、1-甲基丙基、2-甲基丙基、1,1-二甲基乙基、戊基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、己基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、3,3-二甲基丁基、1-乙基丁基、2-乙基丁基、1,1,2-三甲基丙基、1,2,2-三甲基丙基、1-乙基-1-甲基丙基和1-乙基-2-甲基丙基、n-己基、环己基、n-庚基、n-辛基、2-乙基己基、n-壬基、n-癸基和类似物。烷基通常包含约1-20个碳原子,更常见包含约2-15个碳原子。烷基可以是被取代或未被取代的。
如果扩增测试产生相对于其它可能产物占优势(即占大部分、但少于100%)的一种产物,那么它是“选择性的”或“目标选择性的”。只要目标序列的非期望变异体的扩增是可检测的,那么该测试被描述未“选择性的”。其中非期望的目标的扩增是不可检测的测试被称为“特异性的”。随着检测方法变得越来越敏感,一些以前已知的特异的测试,变得仅仅是选择性的,即一些目标的非期望的变异体的扩增变为可检测的。因此,在本发明的上下文中,术语“特异性的”意在涵盖严格目标特异性的以及目标选择性的扩增。
“互补核酸”是可以与另一种核酸的至少一种亚序列杂交或形成双链体的核酸或核酸区段。对于形成双链体,互补性不必完美,即双链体中的核酸可以是“部分互补的”。考虑到包括例如互补区域的长度、碱基组成和互补区域中核苷酸的序列、核酸溶液的离子强度和错配碱基对的发生率的大量变量,核酸技术领域的技术人员可以经验性地确定双链体的稳定性。
关于样品中分析物如核酸的术语“可检测的”是指用在本领域检测方法的状态下的可检测。可以理解的是,随着检测方法的改进,分析物现有的不可检测水平可能变得可检测的。因此,此处所用的术语“可检测的”表示用合理获得、在实验室设置下可用的并为本领域技术人员已知的合适的分析技术测量物种的存在或缺乏的能力。
“核苷酸引入酶”是指催化核苷酸引入核酸的酶。示例性的核苷酸引入酶包括DNA聚合酶、RNA聚合酶、末端转移酶、逆转录酶、端粒酶和类似物。
“热稳定酶”是指当经受选择时间期间的升高的温度时,稳定(即耐受降解或变性)并保持足够的催化活性的酶。例如,当经受将双链核酸变性所需的时间的升高的温度时,热稳定聚合酶保持足够的活性以影响随后的引物延伸反应。核酸变性所需的加热条件为本领域所熟知,在美国专利No. 4,683,202和4,683,195中示例。此处所用的热稳定聚合酶通常适用于温度循环反应如聚合酶链式反应(“PCR”)。热稳定性核酸聚合酶的例子包括水生栖热菌(Thermus aquaticus)Taq DNA聚合酶、栖热菌属(Thermus sp.)Z05聚合酶、黄栖热菌(Thermus flavus)聚合酶、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)聚合酶如TMA-25和TMA-30聚合酶、Tth DNA聚合酶和类似物。
“修饰的”酶是指包含其中至少一个单体不同于参照序列、如酶的天然或野生型形式或酶的另一种修饰形式的氨基酸聚合物的酶。示例性的修饰包括单体插入、缺失和取代。修饰的酶也包括具有源自两种或更多亲本的可视作同一的(identifiable)组成序列(例如结构的或功能性结构域、等等)的嵌合酶。修饰的酶的定义也包括包含参照序列的化学修饰的那些酶。修饰酶的例子包括G46E E678G CS5 DNA聚合酶、G46E L329A E678G CS5 DNA聚合酶、G46E L329A D640G S671F CS5 DNA聚合酶、G46E L329A D640G S671F E678G CS5 DNA聚合酶、G46E E678G CS6 DNA聚合酶、△Z05聚合酶、△Z05-Gold聚合酶、△Z05R聚合酶、E615G Taq DNA聚合酶、E678G TMA-25聚合酶、E678G TMA-30聚合酶和类似物。
术语"5'至3'核酸酶活性"或“5’-3’核酸酶活性”是指通常与核酸链合成相关的核酸聚合酶的活性,借此核苷酸从核酸链的5'末端去除,例如大肠杆菌(E. coli)DNA聚合酶I具有这种活性,然而Klenow片段却没有。
“基本上缺失5’-3’核酸酶活性”的聚合酶是指与Taq DNA聚合酶相比具有50%或更低(例如<25%、<20%、<15%、<10%)5’-3’核酸酶活性的聚合酶。测量5'-3'核酸酶活性的方法和测量的条件是本领域熟知的。例如见美国专利No. 5,466,591。基本上缺失5’-3’核酸酶活性的DNA聚合酶的例子包括大肠杆菌(E.coli)DNA聚合酶I的Klenow片段;缺失N-末端235个氨基酸的水生栖热菌(Thermus aquaticus)的DNA聚合酶(Taq)(例如,如美国专利No.5,616,494中描述的,在本领域中通常被称为"Stoffel片段")。其它例子包括具有足够缺失(例如N-末端缺失)、突变或修饰以去除或失活负责5’-3’核酸酶活性的结构域的热稳定性DNA聚合酶。例如见美国专利No.5,795,762。
“标记”是指结合(共价或非共价地)至分子并能够提供关于该分子的信息的部分。示例性的标记包括荧光标记、色度标记、化学发光标记、生物发光标记、放射性标记、质量修饰基团、抗体、抗原、生物素、半抗原和酶(包括过氧化物酶、磷酸酶等)。
“外显子”是存在于基因组DNA和信使RNA的成熟形式中的核酸。外显子序列是被翻译为蛋白的基因部分。外显子通常包含作为开放阅读框(ORF)的部分的编码序列。
“外显子-外显子接头”的表述是指与所述外显子相邻的内含子被去除后两个外显子相连导致的两个外显子间的连接。
“目标中横跨外显子-外显子接头的第一寡核苷酸”的表述是指能够横跨目标寡核苷酸中被内含子分隔的两个外显子的寡核苷酸。提供图1的目的仅仅在于说明。图1为包含外显子和内含子的典型寡核苷酸的图示。图1显示了该寡核苷酸中的外显子-外显子接头的例子,横跨该连接的第一寡核苷酸用箭头表示。第一寡核苷酸通过与内含子相邻和与内含子不相邻的两个外显子杂交而横跨外显子-外显子接头。
“内含子”是指存在于基因组DNA、但不存在于信使RNA的成熟形式中的核酸。内含子序列是既不被转录为RNA也不被翻译为蛋白的基因部分。
“基因表达”是指在功能性基因产物、如蛋白或功能性RNA的合成中利用来自基因的信息的过程。基因表达的一部分通常涉及通过被称为“转录”的过程将基因组DNA分子的一部分拷贝为RNA分子。基因表达研究涉及研究用基因中的信息合成的RNA或蛋白。
“反转录”是指从单链RNA模板制备双链DNA分子的过程。通过具有反转录活性的核酸聚合酶催化反转录。
“逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)”是聚合酶链式反应(PCR)的变种,其中RNA链被首先转录为其DNA互补物(cDNA),获得的cDNA用传统PCR扩增。RT-PCR需要具有反转录酶活性的酶以及优选的具有DNA聚合酶活性的热稳定性酶。在一些情况下,在同种酶中存在两种活性。
在核酸扩增反应情形中的“热启动”是指一种方案,其中至少一种关键试剂被保留不加入反应混合物中(或者,如果物理存在于反应混合物中,则该试剂保持失活),直至温度被升高道足以提供引物的必要的杂交特异性的温度。“热启动酶”是一种酶,通常是核酸聚合酶,在热启动方案中能够作为“被保留的”或失活的试剂。例如这种热启动酶可以通过将酶化学修饰而获得。这种化学修饰的酶的非限制性例子是商业可获得的Eagle Taq。也可以通过连接于聚合酶的抗体或适体而获得这些热启动酶,如在商业可获得的Hawk Z05的例子中。
术语“不可检测的”是指在本发明时应用的检测方法不能检测。可以理解的是,术语“不可检测的”不是指完全缺失检测所针对的物质。它是指,本发明时已知的常规方法不能检测到检测所针对的物质。
术语“分析特异性”是指检测对期望的核酸目标仍然特异的不期望的核酸目标的量。例如,在mRNA扩增测试中,“对于1微克基因组DNA的分析特异性”是指当基因组DNA污染的水平为每个反应1微克时,DNA不能被可检测地扩增,而mRNA能被可检测地扩增。
本发明提供了一种用化学修饰的引物在存在基因组DNA污染的情况下优先扩增信使RNA的方法。本发明包括用于样品中优先于DNA的扩增和检测mRNA的方法、试剂盒和反应混合物。本发明可用于从包括临床应用中的患者组织和样品的各种真核生物和真核生物组织中检测、鉴定和定量mRNA。
定量mRNA的一个示例性应用是基因表达研究。基因表达研究是基础和应用研究和临床诊断的一部分。在临床应用中,信使RNA的水平可能反映疾病的进程。在药物治疗中,mRNA的水平可能反映药物针对特定基因表达途径的效率。例如,用抗体针对EGF受体家族的处理导致EGFR途径中许多基因的下调,Tzahar等人,(1998)Biochim. Biophys. Acta 1337:M25。EGFR途径中基因表达的测量的改变反映了特定药物的疗效。
在典型的研究中,可以从样品中分离总RNA或mRNA并用选择的核酸分析方法分析。不幸的是,RNA和DNA间化学特性的相似性导致了RNA和DNA的共分离。对于一些分析方法,存在小量DNA污染是可接受的。然而,对于更灵敏的基于扩增的方法如PCR和RT-PCR,甚至小量的DNA可能使测试结果偏离。在大部分情况下,对于特定种类的RNA特异的引物和探针与相应的基因组DNA序列杂交,导致基因组DNA污染物的共同扩增和共同检测。因此,基因组DNA污染物的存在可能产生假阳性结果,错误地表明基因表达或使定量结果偏离,表明不正确的基因表达的水平。
DNA污染的问题通常被视为棘手的,即在RNA制备中总是存在一些 DNA。因此,需要将污染物的影响最小化。在RT-PCR的情况下,需要将DNA污染物的扩增最小化。作为针对mRNA的特异性的量度,每种RNA-特异性测试可能通过分析特异性或DNA不与mRNA被共同可检测地扩增时的基因组DNA污染物的量来表征。
本发明提供了一种在存在基因组DNA的情况下具有临床可接受的分析特异性的选择性扩增mRNA的方法。例如,在用于说明而非限制本发明的实施例中,分析特异性是每个反应1微克基因组DNA。可以认识到的是,一些污染物的扩增可能与本发明的方法同时发生。然而,只要存在最高至某种可接受的最高水平的DNA污染物的扩增用所用的本领域检测方法的状态不可检测,这种方法就可以被认为能令人满意地进行。
现有的降低或去除RT-PCR反应中的污染性DNA的扩增的方法利用内含子的存在。目标mRNA可能在其缺少间插性序列或内含子方面不同于相应的基因组DNA。一种防止污染性基因组DNA扩增的途径是设计在内含子侧翼的扩增引物。如果引物在内含子的侧翼,基因组DNA将产生不同大小的产物,或者如果内含子过大,将完全不产生产物。不幸的是,在一些情况下,感兴趣的基因中的内含子不够大,不足以排除扩增。当不期望的扩增发生时,需要额外的步骤根据大小将扩增产物分离以便去除污染物。
降低或去除污染性DNA的另一种途径是通过设计横跨两个外显子接头的引物而利用内含子。在那种情况下,由于在引物-模板杂合体的5’部分和3’部分之间存在内含子,引物不能够与基因组DNA序列退火和形成稳定的杂合体。不幸的是,在实践中,这种方法经常不成功。在一些情况下,在基因组DNA和横跨内含子的引物间形成稳定的杂合体。这可能由于内含子的“环出”或由于引物的3’-末端和内含子序列之间足够的相似性而发生。如实施例(表1)所示,在存在至少一种横跨外显子-外显子接头的引物存在条件下,PCR能轻易地扩增基因组DNA。
已经发现,对于mRNA的横跨外显子-外显子接头的引物的特异性可以通过某种化学修饰而大大改进。
最近已经报道了具有化学修饰的核苷酸的扩增引物。例如,美国专利No. 6,001,611描述了包含修饰的核苷酸的引物,特别是具有在环外氨基处被共价修饰的碱基的核苷酸。在美国专利No.6,001,611中也描述了这种核苷酸和包含这种核苷酸的寡核苷酸的合成。
在一个实施方式中,本发明涉及存在相应的基因组DNA污染物的情况下,选择性扩增包含外显子-外显子接头的信使RNA (mRNA)目标的寡核苷酸。寡核苷酸包括至少与所述mRNA目标部分互补、横跨目标中的外显子-外显子接头的序列并进一步包括至少一个具有在环外氨基处被共价修饰的碱基的核苷酸。
本发明通常涉及选择性扩增目标核酸的特定区域的寡核苷酸的设计和应用。用于扩增引物的设计的参数对于本领域技术人员是熟悉的。用于这种设计的程序包括例如Visual OMP (DNA Software,Inc.,Ann Arbor,MI)、Oligo 6 (Stratagene,La Jolla,CA)、Sequencher (Gene Codes,Ann Arbor,MI)和DNAStar (DNAStar,Inc.,Madison,WI)。
本发明涉及至少一种具有至少一个具有在环外氨基处被化学修饰的碱基的核苷酸的引物的应用。优选地,修饰的引物是横跨外显子-外显子接头的引物。美国专利No. 6,001,611中描述了具有环外氨基的共价修饰的核苷酸。在611专利中也描述了这种核苷酸和包含这种核苷酸的寡核苷酸的合成。
根据本发明,合适的环外氨基的修饰可能基于存在下列特性选择:(1) 该修饰干扰但不阻止双链核酸中修饰碱基与互补碱基之间的Watson-Crick碱基配对;(2) 该修饰干扰但不阻止反转录酶应用mRNA模板对包含修饰碱基的引物的延伸;(3) 该修饰允许与包含修饰碱基的链互补的链的合成;以及(4) 该修饰增加了包含修饰的引物对mRNA模板相对于DNA模板的选择性。
环外氨基的例子包含腺苷的6-位、鸟苷的2-位和胞苷的4-位。参与和互补核酸链碱基配对的环外氨基也发生在核苷酸中的各种非常规含氮碱基中。具有非常规碱基的核苷的例子非限制性地包括3-甲基腺苷、7-甲基鸟苷、3-甲基鸟苷、5-甲基胞苷和5-羟甲基胞苷。这种非常规碱基的环外氨基的合适修饰也可能根据本发明的经验方法选择。
下面显示了分别包含修饰的腺嘌呤、鸟嘌呤和胞嘧啶碱基的修饰的核苷酸的结构。
其中S代表糖部分,R代表修饰的基团。预想了具有上面概述的四种特性的多种修饰基团。在本发明的优选实施方式中,修饰的基团具有如下结构:
其中R1和R2独立选自氢、烷基、烷氧基、未取代或取代的芳基和苯氧基。
烷基可能是分枝或未分枝的。
烷基可以是C1-C20烷基、例如C1-C10烷基。
烷氧基可以是C1-C20烷氧基、例如C1-C10烷氧基。
芳基可以是未取代或取代的苯基或萘基。
在另一个优选实施方式中,修饰的基团R是苄基或取代的苄基。在某些实施例中,取代的苄基可具有下列结构:
其中R3代表C1-C6分枝或未分枝的烷基,更优选C1-C4分枝或未分枝的烷基、烷氧基或硝基。优选地,R3结合在对位。
本发明的优选的修饰基团用如下结构表示:
通常,根据存在上面列举的四种特性,本领域技术人员可以从此处所述的化合物的类别中常规地经验选择具体的合适的修饰基团。优选地,通过在mRNA扩增反应中相比于DNA扩增反应中使用具有修饰核苷酸的引物而经验地确定具体基团的适用性。当使用修饰的引物时通过mRNA模板的扩增和相应的DNA模板的可检测扩增的缺失或显著延迟而确定修饰的适用性。当与采用未修饰的引物的相同反应比较时,采用具有碱基修饰的引物观察到反应选择性的增高。
在另一个实施方式中,本发明是存在相应的基因组DNA污染物的情况下,选择性扩增包含外显子-外显子接头的信使RNA (mRNA)目标的方法。该方法包括提供一种样品,其可能包含目标信使RNA、但也可能包含相应的基因组DNA;a)将第一寡核苷酸与所述mRNA目标杂交,用至少一种能够RNA-引导合成的酶进行RNA-引导的DNA合成,其中所述第一寡核苷酸包含至少一个在环外氨基基团处被修饰的核苷酸,与所述mRNA目标至少部分互补,并在目标中横跨外显子-外显子接头;以及b) 用所述第一寡核苷酸和第二寡核苷酸以及至少一种能够DNA-引导的DNA合成的酶扩增步骤 a)的产物;其中所述第二寡核苷酸与所述mRNA目标至少部分互补。
本发明的方法采用了用于扩增目标核酸序列的聚合酶链式反应(PCR)。特别地,为了扩增mRNA目标,本方法采用逆转录–聚合酶链式反应(RT-PCR)。在一些实施方式中,本发明的方法采用“实时”或“动态”PCR。通常,在存在至少两条引物和标记的寡核苷酸探针的条件下进行动态PCR以便在扩增期间实现扩增产物的检测。在一些实施方式中,探针是在每个扩增循环期间与目标序列杂交后释放可检测信号的杂交探针。在其它实施方式中,探针是在每个扩增循环期间在杂交的探针被DNA聚合酶的5’-3’核酸酶消化后释放信号的核酸酶探针。
在一些实施方式中,RT-PCR反应涉及热启动方案。在RT-PCR的情况下,通过使用热启动方案可能增加引物关于RNA和相应的DNA的选择性。许多热启动方案为本领域所知,例如,使用蜡、将关键试剂从反应混合物的其它部分分离(美国专利No.5,411,876)、使用核酸聚合酶、用抗体可逆性失活(美国专利No.5,338,671)、用设计特异性结合核酸聚合酶活性位点的寡核苷酸将核酸聚合酶可逆性失活(美国专利No.5,840,867)或如美国专利No.5,677,152和5,773,528中所述使用具有可逆性化学修饰的核酸聚合酶。
在本发明的一些实施方式中,RT-PCR测试包括实时PCR测试。在实时PCR测试中,扩增的量度为“阈值循环”或Ct值。越早的Ct值反映了阈值水平的快速实现以及因此目标核酸的更高效的扩增或更高的加入量。越晚的Ct值可能反映了目标核酸的低效或被抑制的扩增或更小量的加入量。在RNA特异性扩增测试的情况下,对应于DNA目标的更高的Ct值是RNA和DNA目标间的差别或测试的选择性的量度。
RT-PCR测试可能采用任何适合的本领域已知的热稳定性核苷酸引入酶以及非热稳定性酶如MMLV RT和AMV RT。有时需要使用无校正(3’-5’-核酸外切酶)活性的酶,如Taq DNA聚合酶、如rTth或Z05。也可能需要使用基本上或完全缺失5’-3’核酸酶活性的酶,如美国专利No. 5,795,762中所述。这种酶的一个例子是ΔZ05聚合酶。有时可能需要使用具有“热启动”能力的酶,如美国专利No.5,677,152和5,773,528中所述的可逆性修饰的酶。这种热启动酶的一个例子是ΔZ05-Gold聚合酶。在一些实施方式中,也可能使用具有需要的工程化特性的修饰的酶。
可能用本领域已知的任何方法完成扩增产物的检测。这些方法包括使用标记的引物和探针以及各种核酸结合性染料。检测方法可能对于目标序列的一个变种是特异的,或者对于目标序列的所有变种或者甚至对所有双链DNA是通用的。当目标的不期望变种的扩增最低并期望落在该方法的检测下限之下时,使用非特异性的检测方法。可以在扩增完成后检测扩增产物,例如,通过未标记产物的凝胶电泳以及用核酸结合性染料对凝胶进行染色。另外,可能通过在合成时掺入或通过作为标记引物的延伸产物而使扩增产物携带放射性或化学的标记。在电泳后或期间,可能用本领域已知的合适的放射性或化学工具检测标记的扩增产物。在电泳后,也可能用本领域已知任一种方法标记的目标特异性探针检测产物。标记的探针也可能应用于未电泳的目标,即在“斑点印记”测试或类似方法中。
在其它实施方式中,可能在均相测试中检测扩增产物的存在,即在该测试中,在扩增循环期间或至少在相同的未开启的管中检测新生产物,无需扩增后的操作。例如,如美国专利No. 5,210,015中所述的均相扩增测试。例如,如美国专利No. 5,871,908和6,569,627中所述的用核酸嵌入染料的均相扩增测试。均相测试也可能采用用两种相互作用的荧光团标记的荧光探针,如“分子信标”探针(Tyagi等人,(1996) Nat. Biotechnol.,14:303-308)或荧光标记的核酸酶探针(Livak等人,(1995) PCR Meth.Appl.,4:357-362)。在这些技术的某些变种中,也可能通过其不同的解链温度而鉴定扩增产物,见美国专利No.5,871,908和6,569,627。
在均相扩增的情况下,通过使用寡核苷酸探针检测目标。用帮助确定目标存在或身份的标记标记探针。探针可以包含一种或更多种标记部分以及任选地一种或更多种猝灭部分。标记部分可能是通过光谱学的、光化学的、生物化学的、免疫化学的或化学的方法可检测的部分。
在一些实施方式中,标记是荧光部分。荧光标记可以包括带负电荷的染料、如荧光素家族的染料,或电荷中性的染料、如若丹明家族的染料或带正电荷的染料、如花青家族的染料。在本发明中可以使用的其它染料家族包括,例如聚卤代荧光素家族染料、六氯荧光素家族染料、香豆素家族染料、嗪家族染料、噻嗪家族染料、squarine家族染料、镧系元素螯合物家族染料、ALEXA FLUOR? dyes BODIPY?家族染料(Molecular Probes,Inc.,Eugene,Ore.)。
除了荧光标记,探针可能具有一种或多种猝灭部分。猝灭剂是指能吸收荧光染料释放的能量或者干扰荧光染料释放光的能力的化学部分。猝灭剂可能以该猝灭剂特征性信号再次释放从荧光染料吸收的能量。另外地,猝灭剂可能以热的形式耗散从荧光染料吸收的能量。示例性的非荧光猝灭剂包括Biosearch Technologies,Inc. (Novato,Calif.)销售的Black Hole Quenchers?、Epoch Biosciences (Bothell,Wash.)的Eclipse Dark Quenchers以及Iowa Black (Integrated DNA Technologies,Coralville,Iowa)。
标记和猝灭剂可能通过许多技术直接或间接连接于寡核苷酸探针。根据所用探针的准确类型,标记可能被定位在探针的5'-末端或3'-末端或被定位在核苷酸序列的内部。标记和猝灭剂可能直接连接于核苷酸,或者通过连接子或间隔基间接连接。Innis等人编的PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications,Academic Press,Inc.,1990中描述了从商业可获得的试剂如亚磷酰胺制备标记的寡核苷酸。
在另一个实施方式中,本发明提供了用于在存在相应的基因组DNA污染物的情况下特异性或选择性扩增mRNA的反应混合物,该混合物包含至少一种与所述mRNA目标至少部分互补并横跨目标中外显子外显子接头的第一寡核苷酸;其中所述第一寡核苷酸包含至少一种具有在环外氨基处被修饰的碱基的核苷酸;以及至少一种与所述mRNA目标至少部分互补的第二寡核苷酸。反应混合物可能进一步包含一种或更多种能够RNA-引导和DNA-引导的DNA合成的酶。反应混合物可能进一步包含通常对于核酸的扩增必需的试剂和溶液,包括核酸前体,即核苷三磷酸盐以及适合支持存在于反应混合物中的酶的活性的有机和无机离子。反应混合物可能进一步包含目标mRNA。反应混合物可能进一步包含对应的基因组DNA。反应混合物可能还另外包含扩增的核酸的检测必需的试剂。
在另一个实施方式中,本发明提供了用于在存在相应的基因组DNA污染物的情况下特异性或选择性扩增mRNA的试剂盒,该试剂盒包含至少一种与所述mRNA目标至少部分互补并横跨目标中外显子外显子接头的第一寡核苷酸;其中所述第一寡核苷酸包含至少一种具有在环外氨基处被修饰的碱基的核苷酸;以及至少一种与所述mRNA目标至少部分互补的第二寡核苷酸。该试剂盒也可能包含一种或更多种能够RNA-引导和DNA-引导的DNA合成的酶。该试剂盒可能进一步包含通常对于核酸的扩增必需的试剂和溶液,包括核酸前体,即核苷三磷酸盐以及适合支持存在于试剂盒中的酶的活性的有机和无机离子。该试剂盒可能进一步包含一定量的目标mRNA。该试剂盒可能进一步包含一定量的相应的基因组DNA。该试剂盒可能还另外包含扩增的核酸的检测必需的试剂。该试剂盒可能还另外包含用于实施本发明的方法的说明书。
提供下列示例是为了帮助理解本发明,其真正的范围在随附的权利要求中记载。可以理解的是,在不偏离本发明的精神的情况下可以对所述的方法进行修改。
实施例
在下列实施例中,每个50 μl反应包含10 ng、100 ng或1 μg人基因组DNA或10 ng或100 ng作为模板的ffpet RNA。在一些实验中,使用包含体外RNA转录物混合物的阳性对照试剂作为模板。不同的模板如结果表中所述。包含每一条不同反向引物的分开反应与通用的正向引物和通用探针相混合。每个反应包含正向和反向引物每种0.3 μM、0.1 μM探针、2.5 mM醋酸锰、50 mM N-三(羟甲基)甲基甘氨酸(Tricine)、150 mM醋酸钾、13.4 mM氢氧化钾、8%甘油、1% DMSO、dATP、dCTP、dGTP每种200 μM、400 μM dUTP、50 μM dTTP、0.075 μM Hawk Z05、0.2 U/μl Z05聚合酶、0.04 U/μl UNG、0.018%叠氮化钠、0.01% Tween-20和0.1 mM EDTA。
用Roche LightCycler 480仪器进行反转录(RT)和扩增。该反应经受下列温度变化:50℃ 5分钟(UNG步骤),95 ℃ 1分钟(聚合酶激活),61 ℃ 30分钟(RT步骤),随后95 ℃ 15秒和61 ℃ 30分钟进行55个循环。在最后53个循环的每个61 ℃步骤的最终收集荧光数据以产生增长曲线(未显示)。最终,反应物冷却至40 ℃ 30秒。
表 1: 引物和探针
E=cx-HEX
Q=BHQ-2
P=磷酸盐
X = 叔丁基苄基-dA
Y = 叔丁基苄基-dC。
实施例1
用mRNA特异性引物进行基因组DNA的突破式(break-through)扩增
在本实施例中,erbB2目标的扩增采用正向引物(SEQ ID NO:1)、反向引物(SEQ ID NOs:3)和检测探针(SEQ ID NO:2)。正向引物和探针被定位在外显子30中,而反向引物横跨erbB2基因的外显子30和外显子31的接头。模板核酸是购自Roche (material # 11691112001)的人基因组DNA。
扩增反应的Ct值结果如表2中所示。该结果显示现有技术中避免DNA污染扩增的策略是不足的。用横跨外显子-外显子接头的mRNA-特异性反向引物能轻易地扩增基因组DNA。
表 2: 用mRNA-特异性引物扩增(Ct*)基因组DNA
反向 引物的Seq ID No | 1 μg基因组DNA | 100 ng基因组DNA |
3 | 23.12 (0.14) | 26.83 (0.27) |
* 五次实验的平均值,(标准偏差)。
实施例2
用包含更多与外显子30互补的碱基的mRNA特异性引物的RNA特异性扩增的改进。
在本实施例中,erbB2目标的扩增采用正向引物(SEQ ID NO:1)、选自SEQ ID NO:3-6的反向引物和检测探针(SEQ ID NO:2)。正向引物和探针被定位在外显子30中,而反向引物横跨erbB2基因的外显子30和外显子31的接头,比反向引物SEQ ID No 3包含更多与外显子30互补的碱基。
所用的模板是人基因组DNA、从福尔马林固定、石蜡包埋的组织(FFPET)中分离的DNA、和从FFPET分离的RNA。扩增反应的Ct值结果如表3中所示。RNA和DNA模板间的Ct差别表明了针对RNA模板的测试的更高的特异性。反向引物SEQ ID No:6显示出针对RNA模板的特异性的最大改进。
表 3: RNA和DNA模板的扩增(Ct*)
*三次实验的平均值,(标准偏差)
**三次实验之一得到可检测的结果。
实施例3
用包含更多与外显子30互补的碱基的mRNA特异性引物的RNA特异性扩增的进一步改进。
在本实施例中,erbB2目标的扩增采用正向引物(SEQ ID NO:1)、选自SEQ ID NO:6-9的反向引物和检测探针(SEQ ID NO:2)。正向引物和探针被定位在外显子30中,而反向引物横跨erbB2基因的外显子30和外显子31的接头,比反向引物SEQ ID No 3包含更多与外显子30互补的碱基。所用的模板为人基因组DNA、从FFPET分离的RNA和阳性对照试剂,所述阳性对照试剂为包含反应中16拷贝/μl的ERBB2体外RNA转录物的RNA转录物混合物。
扩增反应的Ct值结果如表4和5中所示。RNA和DNA模板间的Ct差别表明了针对RNA模板的测试的更高的特异性,ND(未检测到)的结果表明模板没有扩增。反向引物SEQ ID No:7显示出针对RNA模板的特异性的最大改进。
表 4: RNA和DNA模板的扩增(Ct*)
*三次实验的平均值,(标准偏差)
**三次实验之一得到可检测的结果。
表 5: RNA和DNA模板的扩增(Ct)
*六次实验的平均值,(标准偏差)
**三次实验的平均值,(标准偏差)
***六次实验之三得到可检测的结果。
实施例4
用包含修饰的mRNA特异性引物的RNA特异性扩增的改进。
在本实施例中,erbB2目标的扩增采用正向引物(SEQ ID NO:1)、选自SEQ ID NO:3-10的反向引物和检测探针(SEQ ID NO:2)。正向引物和探针被定位在外显子30中,而反向引物横跨erbB2基因的外显子30和外显子31的接头,比反向引物SEQ ID No 3包含更多与外显子30互补的碱基。反向引物SEQ ID No:10包含修饰。所用的模板为人基因组DNA和阳性对照试剂,所述阳性对照试剂为包含反应中16拷贝/μl的体外RNA ERBB2转录物的RNA转录物混合物。
扩增反应的Ct值结果如表6中所示。RNA和DNA模板间的Ct差别表明了针对RNA模板的测试的更高的特异性,ND(未检测到)的结果表明模板没有扩增。反向引物SEQ ID No:10包含修饰,显示出针对RNA模板的特异性的最大改进。
表 6: RNA和DNA模板的扩增(Ct)
*六次实验的平均值,(标准偏差)
**三次实验的平均值,(标准偏差)
***六次实验之三得到可检测的结果 三次实验的平均值,(标准偏差)。
实施例5
用包含修饰的mRNA特异性引物的RNA特异性扩增的改进。
在本实施例中,erbB2目标的扩增采用正向引物(SEQ ID NO:1)、选自SEQ ID NO:7-10的反向引物和检测探针(SEQ ID NO:2)。正向引物和探针被定位在外显子30中,而反向引物横跨erbB2基因的外显子30和外显子31的接头,并包含修饰。所用的模板为人基因组DNA、从FFPET分离的RNA和阳性对照试剂,所述阳性对照试剂为包含反应中16拷贝/μl的ERBB2体外RNA转录物的RNA转录物混合物。
扩增反应的Ct值结果如表7中所示。RNA和DNA模板间的Ct差别表明了针对RNA模板的测试的更高的特异性。反向引物SEQ ID No:10包含修饰,显示出针对RNA模板的特异性的最大改进。
表 7: RNA和DNA模板的扩增(Ct*)
*五次实验的平均值,(标准偏差)
**三次实验的平均值,(标准偏差)
***五次实验之一得到可检测的结果。
实施例6
用包含修饰的mRNA特异性引物的RNA特异性扩增的改进。
在本实施例中,erbB2目标的扩增采用正向引物(SEQ ID NO:1)、选自SEQ ID NO:3、6、7、10、11、12、13、14和15的反向引物和检测探针(SEQ ID NO:2)。正向引物和探针被定位在外显子30中,而反向引物横跨erbB2基因的外显子30和外显子31的接头,并包含修饰。所用的模板是从FFPET中分离的人基因组DNA和RNA。扩增反应的Ct值结果如表8中所示。RNA和DNA模板间的Ct差别表明了针对RNA模板的测试的更高的特异性。反向引物SEQ ID No:10包含修饰,显示出针对RNA模板的特异性的最大改进。反向引物SEQ ID No:11和SEQ ID No:15也显示出针对RNA模板的特异性的改进;然而,RNA FFPET模板的Ct值相比于SEQ ID No:10得到的结果延迟了。
表 8: RNA和DNA模板的扩增(Ct*)
*三次实验的平均值,(标准偏差)
**三次实验之二得到可检测的结果 两次实验的平均值,(标准偏差)。
引物SEQ ID:No 3、6、7、10、11、12、13、14 和15的扩增曲线分别如图3、4、5、6、7、8、9、10和11所示。
尽管参考特定实施例详细描述了本发明,对本领域技术人员而言显而易见的是,可以在本发明的范围内进行各种修改。因此,本发明的范围不应由此处所述的任何实施例、而应由下面给出的权利要求来限定。
序列表
<110> F. Hoffmann-La Roche AG
Roche Diagnostics GmbH
<120> 用化学修饰的引物相比于DNA优先扩增mRNA
<130> 26422 WO-KOE
<150> US 61/285,678
<151> 2009-12-11
<160> 15
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成的引物
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (21)..(21)
<223> 叔丁基-苄基-dA
<400> 1
cagtacccct gccctctgag a 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成的探针
<400> 2
ccccctgacc tgcagccccc a 21
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成的引物
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (26)..(26)
<223> 叔丁基-苄基-dA
<400> 3
gaacatctgg ctggttcaca tattca 26
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成的引物
<400> 4
catctggctg gttcacatat tcag 24
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成的引物
<400> 5
catctggctg gttcacatat tcagg 25
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成的引物
<400> 6
ctggctggtt cacatattca ggc 23
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成的引物
<400> 7
tggctggttc acatattcag gct 23
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成的引物
<400> 8
ggctggttca catattcagg ctg 23
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成的引物
<400> 9
gctggttcac atattcaggc tgg 23
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成的引物
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (22)..(22)
<223> 叔丁基-苄基-dC
<400> 10
tggctggttc acatattcag gc 22
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成的引物
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (18)..(18)
<223> 叔丁基-苄基-dC
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (22)..(22)
<223> 叔丁基-苄基-dC
<400> 11
tggctggttc acatattcag gc 22
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成的引物
<400> 12
tggctggttc acatattyag gc 22
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成的引物
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (18)..(18)
<223> 叔丁基-苄基-dC
<400> 13
tggctggttc acatattcag gc 22
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成的引物
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (19)..(19)
<223> 叔丁基-苄基-dA
<400> 14
tggctggttc acatattcag gc 22
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成的引物
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (19)..(19)
<223> 叔丁基-苄基-dA
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (22)..(22)
<223> 叔丁基-苄基-dC
<400> 15
tggctggttc acatattcag gc 22
Claims (15)
1.一种选择性扩增信使RNA目标的方法,包括步骤:
a. 将第一寡核苷酸与所述mRNA目标杂交,用至少一种能够RNA-引导合成的酶进行RNA-引导的DNA合成,其中所述第一寡核苷酸:
i. 包含至少一个具有在环外氨基处被共价修饰的碱基的核苷酸,
ii. 与所述mRNA目标至少部分互补,和
iii. 在目标中横跨外显子-外显子接头;
b. 用所述第一寡核苷酸和第二寡核苷酸以及至少一种能够DNA-引导的DNA合成的酶扩增步骤 a)的产物;其中所述第二寡核苷酸与所述mRNA目标至少部分互补。
2.权利要求1的方法,其中核苷酸的在环外氨基处被共价修饰的碱基选自N6-苄基-腺嘌呤、N6-对-叔丁基-苄基腺嘌呤、N2-烷基-鸟嘌呤、N4-苄基-胞嘧啶和N4-对-叔丁基-苄基胞嘧啶。
3.权利要求1的方法,进一步包含检测所述RNA-引导和DNA-引导的DNA合成的产物的步骤c。
4.权利要求1的方法,其中所述能够RNA-引导合成的酶和所述能够DNA-引导的DNA合成的酶是相同的。
5.权利要求1的方法,其中所述一种或更多种酶基本上缺乏5’-3’核酸酶活性。
6.权利要求1的方法,其中所述至少一种酶选自Taq DNA聚合酶、Z05 DNA聚合酶、delta-Z05 DNA聚合酶和delta-Z05-Gold DNA聚合酶或其突变体。
7.权利要求1的方法,其中所述第一寡核苷酸选自SEQ ID NO:3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14和15。
8.用于选择性扩增包含外显子-外显子接头的信使RNA目标的寡核苷酸,包含与所述mRNA目标至少部分互补、横跨目标中的外显子-外显子接头并进一步包含至少一个具有在环外氨基处被共价修饰的碱基的核苷酸的核苷酸序列。
9.权利要求8的寡核苷酸,其中所述在环外氨基处被共价修饰的碱基选自N6-苄基-腺嘌呤、N6-对-叔丁基-苄基腺嘌呤、N2-烷基鸟嘌呤、N4-苄基-胞嘧啶和N4-对-叔丁基-苄基胞嘧啶。
11.用于选择性扩增包含外显子-外显子接头的信使RNA目标的反应混合物,该混合物包含至少一种与所述mRNA目标至少部分互补并横跨目标中外显子-外显子接头的第一寡核苷酸;其中所述第一寡核苷酸包含至少一个具有在环外氨基处被共价修饰的碱基的核苷酸;以及至少一种与所述mRNA目标至少部分互补的第二寡核苷酸。
12.选择性扩增包含外显子-外显子接头的信使RNA目标的试剂盒,该试剂盒包含:至少一种与所述mRNA目标至少部分互补并横跨目标中外显子-外显子接头的第一寡核苷酸;其中所述第一寡核苷酸包含至少一个具有在环外氨基处被共价修饰的碱基的核苷酸;以及至少一种与所述mRNA目标至少部分互补的第二寡核苷酸。
13.权利要求12的试剂盒或权利要求11的反应混合物,进一步包含一种或更多种能够RNA-引导和DNA-引导的DNA合成的酶。
14.权利要求12的试剂盒或权利要求11的反应混合物,进一步包含核苷三磷酸盐以及适合支持核酸聚合的有机和无机离子。
15.权利要求12的试剂盒或权利要求11的反应混合物,进一步包含检测核酸必需的试剂。
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