DE19935767A1 - Verfahren zur Auswahl von Primerpaaren für Reverse-Transkriptase-Kettenreaktionen zur spezifischen Vervielfältigung von cDNS bei der Analyse von mRNS Expression unter Beachtung der Existenz von Pseudogenen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Auswahl von Primerpaaren für Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenraktionen (RT-PCR) zur spezifischen Vervielfältigung von cDNS bei der Analyse von mRNS Expression unter Beachtung der Existenz von Pseudogenen und dient insbesondere zur Anwendung in der medizinischen und biologischen Forschung sowie für medizinische und gerichtsmedizinische Nachweisverfahren. DOLLAR A Aufgabe war es, mRNS eines Gens und dessen Pseudogen jeweils mit bekannter Sequenz wirksam zu unterscheiden und durch diese Unterscheidung eine Vervielfältigung des Pseudogens bei Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreatkon auszuschließen, die das Nachweisverfahren für mRNS sowohl qualitativ als auch quantitativ verfälschen würde. DOLLAR A Erfindungsgemäß werden die Nukleotidsequenzen der mRNS des Gens und des Pseudogen, die beispielsweise aus Datenbanken bekannt sind, hinsichtlich schwacher Homologie global aligniert. Die Primer zur Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion werden in Bereiche der mRNS des Gens gelegt, die, wie aus dem globalen Alignment ermittelt, jeweils eine schwache lokale Homologie zu den korrespondierenden Bereichen des Pseudogens aufweisen. In diesen Sequenzbereichen binden die Primer zwar die mRNS des Gens, nicht aber des Pseudogen, welches dadurch bei der PCR-Reaktion nicht amplifiziert wird.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Auswahl von Primerpaaren für Re­ verse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktionen (RT-PCR) zur spezifischen Vervielfältigung von cDNS bei der Analyse von mRNS Expression unter Be­ achtung der Existenz von Pseudogenen. Es dient insbesondere zur Anwen­ dung in der medizinischen und biologischen Forschung sowie für medizini­ sche und gerichtsmedizinische Nachweisverfahren.

Unter einem Pseudogen soll nachfolgend eine genomische Sequenz verstan­ den werden, die eine starke globale Homologie zur mRNS eines Gens auf­ weist. Pseudogene werden nicht transkripiert. Sie besitzen keine Exon-Intron Struktur. In der Regel ist der offene Leserahmen eines Pseudogens durch Mutationen zerstört. Die Rolle von Pseudogenen innerhalb des Genoms ist noch nicht bekannt.

Es ist bekannt (US 4.683.202, US 4.683.195, US 4.965.188 und US 5.075.216 Patente von Hoffmann-La Roche Inc. und F. Hoffmann-La Roche Ltd.), DNS mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zu vervielfältigen und mRNS mit­ tels Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktionen (RT-PCR) nachzu­ weisen.

RT-PCR birgt im allgemeinen die Gefahr, daß neben der cDNS auch genomi­ sche DNS amplifiziert wird. Die Ursache hierfür ist die Kontamination der RNS mit genomischer DNS. Eine Amplifikation von genomischer DNS tritt auf, wenn die gewählten Primer der RT-PCR an genomische DNS binden und ein DNS-Fragment einschließen, welches unter den angewandten Reaktions­ bedingungen verstärkt wird. In der Regel unterscheiden sich jedoch mRNS- und DNS-Fragmente in ihrer Größe. Liegt ein Pseudogen vor und wird dieses im PCR-Schritt vervielfältigt, so haben beide Fragmente die gleiche Größe und auf Grund der globalen Homologie nahezu die gleiche Nukleinsäurese­ quenz.

In Auswertung der RT-PCR ist es dann nicht möglich zu unterscheiden, ob cDNS und/oder Pseudogen-DNS vervielfältigt worden sind.

Ziel der RT-PCR ist jedoch ausschließlich die Amplifikation der cDNS und damit der Nachweis von mRNS. Die gleichzeitige Vervielfältigung eines Pseudogens würde das experimentelle Ergebnis verfälschen und es damit wertlos machen.

Ein Pseudogen existiert zum Beispiel für das Gen der humanen Glyceralde­ hyd-3-phospho-dehydrogenase (GAPDH), einem sogenannten Haushaltsgen. Haushaltsgene sind Gene, die in allen Zellen und Zell-Linien gleichermaßen exprimiert werden. Sie werden deshalb für die Normierung von quantitativer RT-PCR verwendet, was zusätzlich bedeutet, daß die RT-PCR über einen Be­ reich von sehr variablen Reaktionsbedingungen funktionieren muß. Die gleichzeitige Vervielfältigung von cDNS und Pseudogen hätte also fatale Fol­ gen und würde die experimentellen Aussage verfälschen.

Das Verfahren wurde speziell für das Gen der humanen GAPDH angewandt. Es wurde ein Paar von Primern abgeleitet, das die Vervielfältigung des Pseu­ dogens bei RT-PCR ausschließt und über ein weites Spektrum von Reaktions­ bedingungen die mRNS des Gens nachweist.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, die mRNS eines Gens und des­ sen Pseudogen jeweils mit bekannter Sequenz wirksam zu unterscheiden und durch diese Unterscheidung eine Vervielfältigung des Pseudogens bei Rever­ se-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion auszuschließen, die das Nach­ weisverfahren für mRNS sowohl qualitativ als auch quantitativ verfälschen würde.

Erfindungsgemäß werden die Sequenz der mRNS und des Pseudogens global aligniert. In der Regel können die Sequenzdaten den frei verfügbaren Nu­ kleotiddatenbanken Genbank und/oder EMBL entnommen werden. Nicht notwendig, aber durchaus von Vorteil wäre dabei im übrigen die Kenntnis der Exon-Intron-Struktur des ausgewählten Gens. Der Grund hierfür wird später genannt. Pseudogene eines Gens und auch die Struktur eines Gens müssen nicht als separater Datenbankeintrag existieren. Mit dem Fortschreiten insbe­ sondere des humanen Genomprojekts erfolgt die Annotierung von genomi­ schen Strukturen immer mehr in langen zusammenhängenden genomischen Abschnitten. Das bedeutet, daß für den Sequenzvergleich entsprechende Be­ reiche aus der langen genomischen Sequenz herausgeschnitten werden müs­ sen.

Der besagte Sequenzvergleich wird mit einem an sich bekannten globalen Se­ quenz-Alignment-Programm durchgeführt. Aus dem globalen Alignment werden Bereiche mit schwacher lokaler Homologie ausgewählt, d. h. es wer­ den für den Einsatz der Primer Bereiche der mRNS gewählt, in denen die Übereinstimmung mit dem Pseudogen geringer ist. Primer, die in diese Berei­ che gelegt werden, binden zwar die cDNS des Gens nicht aber das Pseudogen, so daß dieses bei der PCR nicht vervielfältigt wird.

Die in der Sequenz schwach homologen Bereiche zwischen mRNS und Pseu­ dogen sollten etwa 25 Basenpaare umfassen. Dies entspricht der üblichen Länge von Primern. Die Bereiche schwacher Homologie werden paarweise zusammengefaßt.

Zunächst wird ein Bereichspaar ausgewählt. Ist die Exon-Intron-Struktur des Gens bekannt, so sollte mit einem Paar begonnen werden, in dem wenigstens ein Bereich zwei Exons des Gens überstreicht. Damit kann verhindert werden, daß ein genomisches DNS-Fragment aus dem eigentlichen Gen vervielfältigt wird.

Mittels eines an sich bekannten Primerbestimmungsprogramms wird nun für das selektierte Bereichspaar überprüft, ob ein Primerpaar für die mRNS exi­ stiert, wobei der Vorwärts-Primer den vorderen und der Rückwärts-Primer den hinteren schwach homologen Bereich überstreicht. Existiert kein Primer­ paar für den gewählten Bereich der mRNS, so wird diese Prüfung für das nächste selektierte Bereichspaar wiederholt. Ansonsten werden die Primer hergestellt und ihre Brauchbarkeit experimentell überprüft.

Es ist zweckmäßig, wenn die Primerpaare ähnlichen GC-Gehalt, Annealing- Temperatur und Länge aufweisen. Desweiteren sollte es nicht zu paarweisem Bindungen zwischen den Primern kommen und sie sollten keine Sekundär­ strukturen ausbilden können.

Das erfindungsgemäße Verfahren soll nachstehend anhand des humanen Gens GAPDH als Ausführungsbeispiel näher erläutert werden.

Es zeigen

Fig. 1 Globales Alignment von mRNS (Genbank M17851) und Pseudogen des Gens GAPHD (Genbank X01111) und Positionen der Primer

Fig. 2 Tabelle der Bereiche schwacher Homologie für die Positionierung der Primer

Fig. 3 Experimentelle Überprüfung der vorgeschlagenen Primer

Fig. 4 Nachweis der Spezifität des RT-PCR Produkts

Für das humane Gen GAPDH sind sowohl mRNS Sequenz (Genbank Eintrag M 17851), Pseudogen Sequenz (Genbank Eintrag X01111) als auch genomi­ sche Struktur des Gens bekannt.

Fig. 1 zeigt das globale Alignment von mRNS und Pseudogen des GAPDH Gens. Das Alignment wurde mit dem Progamm GAP erzeugt. Punkte zeigen Übereinstimmungen in Basen, Kreuze ungleiche Basen und Striche deletierte Basen an.

Fig. 2 gibt tabellarisch eine Aufstellung aller Bereiche schwacher Homologie von mRNS und Pseudogen, in die möglicherweise Primer gelegt werden kön­ nen. Bezogen auf die Basenpositionen der mRNS ist in Fig. 1 zu erkennen, daß der vorderen Sequenzbereich, d. h. von Position 1 bis 33, eine schwache Homologie zum Pseudogen aufweist. Aus diesem Grunde wurde dieser Be­ reich für die Lokalisierung des Vorwärtsprimers gewählt. Der zweite Bereich schwacher Homologie kann in der Sequenz zwischen den Positionen 471 und 485 ausgemacht werden. Der Rückwärtsprimer überstreicht deshalb diesen gewählten Bereich. Fig. 1 zeigt auch die Lokalisation des durch das Pro­ gramm prime (GCG Version 9.0) gefundenen Primerpaares.

In Auswertung der Exonstruktur des Gens kann zudem bemerkt werden, daß sich der Vorwärtsprimer (12-31) im vorderen untranslatieren Bereich des Gens befindet. Das Startcodon beginnt bei Position 34. Der Rückwärtsprimer (465-485) überstreicht einen Exonübergang in Position 477. Damit ist eine Amplifikation des genomischen Segmentes des Gens nicht möglich.

Erfindungsgemäß werden die Sequenzen der mRNS und des Pseudogens ver­ glichen und der Primer in Bereiche der mRNS gelegt, die nicht mit korre­ spondierenden Bereichen des Pseudogens übereinstimmen. Der Primer bindet in diesem Fall ausschließlich die mRNS und nicht das Pseudogen, welches somit bei der Nachweisreaktion nicht erfaßt und auch nicht amplifiziert wer­ den kann.

Aus der Tabelle in Fig. 2 wird der erste angegebene Sequenzbereich ausge­ wählt, d. h. es wird ein Primerpaar gesucht, bei dem der Vorwärts-Primer im untranslatierten Bereich der mRNA paßt und der Rückwärts-Primer zwei Exons überstreicht. Die Bestimmung des Primerpaares erfolgte mit dem Pro­ gramm prime (GCG Version 9.0) unter Verwendung der Standard­ einstellungen. Das erste durch dieses Programm gefundene Primerpaar (5'- AGC CAC ATC GCT CAG AAC AC-3' und 5'-GAG GCA TTG CTG ATG ATC TTG-3') wurde selektiert.

Das gefundene Primerpaar wurde experimentell überprüft. Parallel wurden eine RT-PCR und eine PCR durchgeführt. Für die RT-PCR wurde zunächst 1 µg RNS nach dem Protokoll der Firma PROMEGA revers transkripiert. Die erhaltene cDNS wurde in der RT-PCR (siehe Fig. 3 jeweils Ziffer 1) und die genomische DNS wurde in der PCR (siehe Fig. 3 jeweils Ziffer 2) als Tem­ plate verwendet. Für den PCR Ansatz wurden 200 nM von jedem Primer ein­ gesetzt. Die PCR wurde mit einem Mastercyler Gradient der Firma Eppendorf durchgeführt. Das PCR-Programm wurde mit einer initialen Denaturierung bei 95°C für drei Minuten gestartet. Anschließend wurden 30 Sekunden bei 95°C, dann ein Temperaturgradient zwischen 50,6°C bis 69,3°C für 45 Se­ kunden angelegt und danach 45 Sekunden bei 72°C durchgeführt. Dieser Zy­ klus wurde 29 mal wiederholt. Abschließend wurden die Proben für fünf Mi­ nuten bei 72°C inkubiert und dann auf 4°C abgekühlt und auf ein 1,5%iges Agarosegel aufgetragen.

Die Ergebnisse werden in Fig. 3 gezeigt. Im Temperaturbereich von 50,6°C bis 52,5°C wird neben der cDNS ein DNS Fragment unbekannter Natur ver­ vielfältigt, welches aber größer als das cDNS-Fragment ist. Im Temperaturbe­ reich von 54,6°C bis 65,5°C wird ausschließlich cDNS amplifiziert. Die Größe des RT-PCR-Produktes von 474 bp entspricht exakt den Erwartungen für GAPDH.

Das RT-PCR Produkt wurde anschließend durch die Spaltung von Restrikti­ onsenzymen analysiert (Fig. 4). Die Spaltung des RT-PCR Produktes mit dem Restriktionsenzym HinfI und anschließender Trennung auf einem hochauflö­ sendem Agarosegel ergibt vier Fragmente mit Größen von 163 bp, 141 bp, 128 bp und 42 bp. Die Spaltung mit dem Restriktionsenzym MvaI ergibt drei detektierbare Fragmente mit Größen von 220 bp, 175 bp und 71 bp. Das zu­ sätzlich zu erwartende 8 bp Fragment ist mit dem verwendeten Agarosegel nicht detektierbar. Die Spaltung mit dem Restriktionsenzym RsaI ergibt zwei Fragmente mit Größen von 302 bp und 172 bp.

Die Größe und Anzahl aller Spaltprodukte des RT-PCR Produktes entspre­ chen exakt den theoretischen Erwartungen an das cDNS Fragment des huma­ nen GAPDH, das mittels der eingesetzten Primer amplifiziert werden soll.

Das vorgeschlagene Primerpaar erfüllt damit die geforderten Bedingungen. Es amplifiziert die cDNS des humanen GAPDH, schließt die Vervielfältigung des Pseudogens aus und ist damit für den eindeutigen Nachweis der mRNS des humanen GAPDH geeignet.

Claims (3)

1. Verfahren zur Auswahl von Primerpaaren für Reverse-Transkriptase- Polymerase-Kettenreaktionen zur spezifischen Vervielfältigung von cDNS bei der Analyse von mRNS Expression unter Beachtung der Existenz von Pseu­ dogenen, dadurch gekennzeichnet, daß die, beispielsweise aus Datenbanken bekannten, Nukleotidsequenzen der mRNS und des Pseudogens eines Gens global aligniert werden und Primer in Bereiche der mRNS gelegt werden, die, wie aus dem globalen Aligment ermittelt, jeweils eine schwache lokale Ho­ mologie zu den korrespondierenden Bereichen des Pseudogens aufweisen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß für das globale Alignment nicht nur die Nukleotidsequenzen der mRNS sowie des Pseudo­ gens, sondern auch die genomische Struktur verwendet wird, und daß die Primerpaare in Bereiche gelegt werden, in denen einer der Primer einen Exonübergang, d. h. zwei Exons des Gens, überstreicht.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Primerpaar 5'-AGC CAC ATC GCT CAG AAC AC-3' und 5'-GAG GCA TTG CTG ATG ATC TTG-3' zur spezifschen Vervielfältigung der cDNS des humanen GAPDH bei der Analyse der mRNS Expression durch RT-PCR angewendet wird.