DE69333242T2

DE69333242T2 - Verfahren, reagenz und salz zum nachweis und amplifikation von nukleinsäuresequenzen

Info

Publication number: DE69333242T2
Application number: DE69333242T
Authority: DE
Inventors: Craig W. Adams; David W. Daniels
Original assignee: Beckman Coulter Inc
Current assignee: Beckman Coulter Inc
Priority date: 1992-08-04
Filing date: 1993-08-04
Publication date: 2004-08-26
Anticipated expiration: 2013-08-05
Also published as: AU676197B2; FI950487A0; WO1994003630A3; EP0658212A1; PL307341A1; JPH07509371A; RU95106503A; DE69333242D1; FI950487A; US6180338B1; CA2141537A1; WO1994003630A2; EP0658212B1; AU4802793A; ATE251674T1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft die Analyse einer Desoxyribonukleinsäure („DNA'') und einer Ribonukleinsäure („RNA"), die Bestimmung des Vorhandenseins einer vorbestimmten spezifischen DNA- und/oder RNA-Nukleotidsequenz und die exponentielle Amplifikation einer solchen Sequenz.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Fähigkeit zum Nachweis des Vorhandenseins eines Nukleinsäuremoleküls, das eine spezielle vorher festgelegte Sequenz aufweist, ist in einer Vielzahl von Gebieten, wie zum Beispiel die Gerichtsmedizin, Medizin, Epidemiologie und in der allgemeinen Gesundheit und in der Krankheitsvorhersage und -diagnose von wesentlicher Bedeutung. Eine solche Fähigkeit kann bei strafrechtlichen Untersuchungen helfen, indem fälschlich angeklagte Personen ausgeschlossen werden oder indem strafbare Parteien hinzugezogen werden. Sie kann so genutzt werden, dass die Identifikation des verursachenden Mittels einer Infektionskrankheit oder die Charakterisierung von Tumoren und Gewebeproben gestattet wird, oder daß sie die Gesundheit der Blutprodukte garantiert.
Eine Fähigkeit zum Nachweis des Vorhandenseins einer speziellen Nukleinsäuresequenz in einer Probe ist für die Vorhersage der Wahrscheinlichkeit, dass zwei Personen miteinander verwandt sind, oder dass eine Person an einer genetischen Krankheit leidet, von Bedeutung. Eine solche Fähigkeit kann ebenfalls in Assays zur Bestimmung der Reinheit von Trinkwasser, Milch oder anderen Nahrungsmitteln verwendet werden.
In vielen interessierenden Fällen ist die gewünschte Nukleinsäuresequenz in einer sehr geringen Konzentration in der Probe vorhanden. In solchen Fällen kann das Vorhandensein des gewünschten Moleküls dem Nachweis entgehen, außer die Assayempfindlichkeit kann durch die Verwendung komplizierter Markierungen erhöht werden. Die Assayempfindlichkeit kann durch Veränderung der Art, auf die der Nachweis an den Beobachter berichtet oder signalisiert wird, erhöht werden. Daher kann zum Beispiel die Assayempfindlichkeit durch die Verwendung von nachweisbar markierten Reagenzien erhöht werden. Für diese Zwecke sind eine große Vielfalt solcher Markierungen verwendet worden: Enzymmarkierungen (Kourilsky et al., U.S. Patent 4,581,333), Radioisotopmarkierungen (Falkow et al., U.S. Patent 4,358,535, Berninger, U.S. Patent 4,446,237), Fluoreszenzmarkierungen (Albarella et al., EP 144914 ), chemische Markierungen (Sheldon III et al., U.S. Patent 4,582,789, Albarella et al., U.S. Patent 4,563,417), modifizierte Basen (Miyoshi et al., EP 119448 ) usw.
Obwohl die Verwendung hoch nachweisbarer markierter Reagenzien die Empfindlichkeit von Nukleinsäurenachweisassays verbessern kann, bleibt die Empfindlichkeit solcher Assay durch praktische Probleme beschränkt, die besonders mit unspezifischen Reaktionen zusammenhängen, die das Hintergrundsignal erhöhen, das in Abwesenheit der Nukleinsäure erzeugt wird, zu deren Nachweis der Assay bestimmt ist. Für manche Anwendungen wird daher die erwartete Konzentration des gewünschten Nukleinsäuremoleküls zu gering sein, um dessen Nachweis durch irgendeines der vorstehend beschriebenen Verfahren zu gestatten.
Ein Verfahren zur Überwindung der Empfindlichkeitsbeschränkung der Nukleinsäurekonzentration ist die selektive Amplifizierung des Nukleinsäuremoleküls, dessen Nachweis vor dem Durchführen des Assays erwünscht ist. In vivo rekombinante DNA-Methodologien, die zur Amplifizierung von Nukleinsäurefragmenten in der Lage sind, sind schon lange erkannt worden (Cohen et al., U.S. Patent 4,237,224, Sambrook, J. et al., in: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)). Solche Methodologien betreffen typischerweise die Einführung des Nukleinsäurefragments in einen DNA- oder RNA-Vektor, die klonale Amplifikation des Vektors und die Rückgewinnung des amplifizierten Nukleinsäurefragments.
In letzter Zeit sind in vitro Amplifikationsverfahren entwickelt worden. Die Wirkung solcher Verfahren war phänomenal – ohne eine solche Amplifikation wären die meisten der vorhergehenden beispielhaften Gebiete nicht möglich. In den Bereichen, in die sich die DNA-Amplifikation ausbreitete, haben sich die Erfordernisse geändert, die an die verschiedenen Amplifikationsverfahren gestellt wurden. Dementsprechend besteht ein sehr ernster und fortlaufender Bedarf an hoch spezifischen Amplifikationstechniken.
Das wahrscheinlich am meisten verbreitete von diesen praktizierten Verfahren ist die „Polymerasekettenreaktion" („PCR") (Mullis, K. et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51: 263–273 (1986), Erlich H. et al., EP 50, 424 , EP 84,796 , EP 258,017 , EP 237,362 , Mullis, K., EP 201,184 , Mullis K. et al., U.S. 4,683,202, Erlich, H., U.S. 4,582,788 und Saiki, R. et al., U.S. 4,683,194), auf deren Offenbarungsgehalt hier vollumfänglich Bezug genommen wird).
Die PCR erreicht die Amplifikation einer spezifischen Nukleinsäuresequenz unter Verwendung von zwei Oligonukleotidprimern, die zu Regionen der zu amplifizierenden Sequenz komplementär sind. Die Verlängerungsprodukte mit den eingebauten Primern werden dann Template für anschließende Replikationsschritte. Das Verfahren erhöht selektiv die Konzentration eines gewünschten Nukleinsäuremoleküls, sogar wenn dieses Molekül vorher nicht gereinigt worden war und nur in einer einzigen Kopie in einer speziellen Probe vorhanden ist. Das Verfahren kann zur Amplifikation von entweder einzelsträngiger oder doppelsträngiger DNA verwendet werden.
Das Verfahren betrifft die Verwendung einer DNA-Polymerase zur Lenkung der templatabhängigen Verlängerung eines Oligonukleotidprimerpaars. Die Primerverlängerungsprodukte werden dann Template für die nachfolgenden Replikationsschritte.
Die präzise Beschaffenheit der zwei Oligonukleotidprimer des PCR-Verfahrens ist für den Erfolg dieses Verfahrens entscheidend. Wie gut bekannt ist, besitzt ein DNA- oder RNA-Molekül eine Ausrichtung, die ihm durch die 5' 3' Bindung des Zucker-Phosphatgrundgerüsts des Moleküls verliehen wird. Zwei DNA- oder RNA-Moleküle können durch die Bildung einer Phosphodiesterbindung zwischen der endständigen 5'-Phosphatgruppe eines Moleküls und der endständigen 3'-Hydroxylgruppe des zweiten Moleküls miteinander verknüpft werden. Die Polymerase abhängige Amplifikation eines Nukleinsäuremoleküls verläuft durch die Addition eines 5'-Nukleosidtriphosphats an das 3'-Hydroxylende eines Nukleinsäuremoleküls. Daher verlängert die Funktion einer Polymerase das 3'-Ende eines Nukleinsäuremoleküls. Die Oligonukleotidsequenzen der zwei PCR-Primer werden so ausgewählt, dass sie Sequenzen enthalten, die zu Sequenzen identisch oder komplementär sind, die die Sequenz des speziellen Nukleinsäuremoleküls flankieren, dessen Amplifikation erwünscht ist. Insbesondere wird die Nukleotidsequenz der „ersten" Primers so ausgewählt, dass er in der Lage ist, an eine Oligonukleotidsequenz zu hybridisieren, die bezüglich der Sequenz des gewünschten Nukleinsäuremoleküls 3' ständig ist, wohingegen die Nukleotidsequenz des „zweiten" Primers so ausgewählt wird, dass er eine Nukleotidsequenz enthält, die bezüglich der Sequenz des gewünschten Nukleinsäuremoleküls bei 5' vorhanden ist. Beide Primer besitzen die 3' Hydroxylgruppen, die für die Enzym-vermittelte Nukleinsäuresynthese notwendig sind.
Die PCR-Reaktion ist zur exponentiellen Amplifikation spezifischer Nukleinsäuresequenzen befähigt, weil das Verlängerungsprodukt des „ersten" Primers eine zu einer Sequenz des „zweiten" Primers komplementäre Sequenz enthält und somit als ein Templat für die Herstellung eines Verlängerungsprodukts des „zweiten" Primers dient. Entsprechend enthält das Verlängerungsprodukt des „zweiten" Primers gezwungenermaßen eine Sequenz, die zu einer Sequenz des „ersten" Primers komplementär ist und daher als ein Templat für die Herstellung eines Verlängerungsprodukts des „ersten" Primers dient. Durch das Gestatten von Zyklen aus Hybridisierung, Polymerisation und Denaturierung kann eine geometrische Zunahme in der Konzentration des gewünschten Nukleinsäuremoleküls erreicht werden.
Die PCR-Technologie ist brauchbar, weil sie die schnelle und umfassende Amplifikation eine Polynukleotidmoleküls erreichen kann (Mullis, K. B., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51: 263–273 (1986), Saiki, R. K., et al., Bio/Technology 3: 1008– 1012 (1985), Mullis, K. B., et al., Met. Enzymol. 155: 335–350 (1987), auf deren Offenbarungsgehalt hier vollumfänglich Bezug genommen wird). Nichtsdestotrotz gibt es mit der PCR mehrere praktische Probleme. Erstens können zusammen mit den zwei Templaten fremde Sequenzen mit den Primern hybridisieren, was aufgrund solcher unspezifischen Hybridisierung zu einer Coamplifikation führt. Mit zunehmendem Grad der Amplifikation nimmt ebenfalls die Stärke einer solchen Coamplifikation zu. Zweitens führt, aufgrund der Fähigkeit der PCR zur einfachen Erzeugung von Millionen von Kopien für jedes anfängliche Templat, eine zufällige Einführung des Endproduktes einer vorhergehenden Reaktion in andere Proben leicht zu falsch-positiven Ergebnissen. Drittens gestattet die PCR nicht, in oder von ihr Veränderungen einer einzelnen Base nachzuweisen, das heißt, dass innerhalb des Protokolls kein Unter schied zwischen einer „normalen" Sequenz und einer allelen Sequenzvariante gemacht wird.
Das Aufkommen der PCR führte zur Entwicklung zusätzlicher Amplifikationsverfahren. Ein solches alternatives Verfahren ist die „Ligase Kettenreaktion" („LCR") (Barany, F., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88: 189–193 (1991). Die LCR verwendet zur exponentiellen Amplifikation eines speziellen Ziels zwei Paare von Oligonukleotidsonden. Die Sequenzen jedes Oligonukleotidpaares wird so ausgewählt, dass dem Paar die Hybridisierung an angrenzende Sequenzen desselben Strangs des Ziels gestattet wird. Eine solche Hybridisierung bildet ein Substrat für eine templatabhängige Ligase. Daher gestattet die Hybridisierung des ersten Oligonukleotidpaars an einen „ersten" Strang des Ziels die Verknüpfung der Oligonukleotide. Die Sequenz des zweiten Oligonukleotidpaars wird so ausgewählt, daß die Oligonukleotide an angrenzende Sequenzen dieses Verknüpfungsprodukts unter Bildung eines zweiten Substrats für die Verknüpfung hybridisieren können. Das Verknüpfungsprodukt des zweiten Strangs besitzt daher eine Sequenz, die im wesentlichen zu derjenigen des „ersten" Strangs des Ziels identisch ist.
Wie bei der PCR dienen daher die resultierenden Produkte als Template in nachfolgenden Zyklen und eine exponentielle Amplifikation der gewünschten Sequenz wird erhalten. Vorteilhafterweise kann die LCR zum Nachweis von Mutationen und insbesondere von einzelnen Nukleotidmutationen verwendet werden. Die Primer können daher so ausgelegt werden, dass sie nur dann miteinander verknüpft werden, wenn das Zielmolekül eine vorher festgelegte Mutationsstelle entweder enthält oder diese fehlt.
Ein mit der LCR zusammenhängendes Problem ist per Definition, dass das Verfahren vier Oligonukleotide und eine Ligase benötigt und zu der unspezifischen „Verknüpfung stumpfer Enden" der Oligonukleotide führen kann. Eine solche unspezifische „Verknüpfung stumpfer Enden" wird, falls sie auftritt, zu einer Ziel unabhängigen exponentiellen Amplifikation der Oligonukleotide führen. Dies kann zu einem hohen Hintergrundsignal oder falsch-positiven Ergebnissen führen.
Dieser Mangel kann in mancher Beziehung unter Verwendung von Oligonukleotiden angegangen werden, die an naheliegende, jedoch nicht angrenzende Sequenzen hybridisieren (PCT Anmeldung WO 90/01069). Wie bei der LCR betrifft ein solches Verfahren die Verwendung von zwei Sätzen von Primern. Da jedoch die Primer dazu bestimmt sind, an nicht angrenzende Sequenzen des Zielmoleküls zu hybridisieren, enthält das Hybridisierungsprodukt eine „Lücke", die die hybridisierten Oligonukleotide trennt. Diese Lücken werden dann mit komplementären dNTPs (entsprechend der Vermittlung durch die DNA-Polymerase) oder durch ein zusätzliches Paar von Oligonukleotiden gefüllt. Somit weist am Ende eines jeden Zyklus jeder Einzelstrang ein Komplement auf, das in der Lage ist, als Ziel während des nächsten Zyklus zu dienen und eine exponentielle Amplifikation der gewünschten Sequenz wird erhalten.
Obwohl dieses Protokoll das LCR-Problem der unspezifischen Verknüpfung stumpfer Enden vermeidet, geht dies auf Kosten der LCR-Leistungsfähigkeit zum Nachweis von Mutationsveränderungen einer einzelnen Base und es erfordert, dass die Sequenz der gesamten „Lücke" vorher bekannt ist. Zusätzlich ist eine entscheidende Schwierigkeit zur Verwendung dieser Technik die Erfordernis, die Oligonukleotidprimer so auszulegen, dass die „Lücke" mit nur einem Untersatz der dNTPs „repariert" werden kann. Das heißt, die Lücke kann nicht alle vier Basen umfassen, so dass nur maximal drei der vier dNTPs zu dem Reaktionsbehälter gegeben werden können.
Andererseits beschreibt das Journal of Pathology, Band 162: 99–117 (1990) ein exponentielles Nukleinsäureamplifikationsverfahren, das die Verwendung von nur zwei Oligonukleotidsequenzen (Primer) und einem Polymeraseenzym betrifft. Von den Primerverlängerungsreaktionen wird ein Produktmolekül gebildet, wobei die zwei Primersequenzen, von denen jede zu den 5' Enden der antiparallelen unteren und oberen Zielstränge in 1 komplementär ist, durch eine Polymerase vermittelte Reaktion entlang der Stränge verlängert werden.
Der „Oligonucleotide Verknüpfungsassay" („OLA") (Landegreen, U. et al., Science 241: 1077–1080 (1988)) hat mit der LCR gewisse Ähnlichkeiten. Das OLA-Protokoll verwendet zwei Oligonukleotide, die so ausgelegt sind, dass sie in der Lage sind, an angrenzende Sequenzen eines Ziel-Einzelstrangs zu hybridisieren. Ebenso wie LCR ist OLA besonders zum Nachweis von Punktmutationen geeignet. Im Gegensatz zu LCR führt OLA jedoch vielmehr zu einer „linearen" als zu einer exponentiellen Amplifikation der Zielsequenz. Ein mit OLA zusammenhängendes Problem ist daher das Fehlen der exponentiellen Amplifikation.
Nickerson, D. A. et al., haben einen Nukleinsäurenachweisassay beschrieben, der Merkmale der PCR und des OLA kombiniert (Nickerson, D. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 87: 8923: 2927 (1990). In diesem Verfahren wird PCR zum Erreichen der exponentiellen Amplifikation der Ziel-DNA verwendet, die dann unter Verwendung von OLA nachgewiesen wird. Zusätzlich dazu, dass mehrfache und getrennte Verfahrenschritte erforderlich sind, ist ein mit solchen Kombinationen verbundenes Problem, dass sie alle Probleme erben, die mit PCR und OLA zusammenhängen.
Andere bekannte Nukleinsäureamplifikationsverfahren umfassen auf Transkription basierende Amplifikationssysteme (Kwoh D et al., Proc Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86: 1173 (1989), Gingeras, T. R. et al., PCT Anmeldung WO 88/10315 (Priorität: U.S. Patent Anmeldungen mit den amtlichen Aktenzeichen 064,141 und 202,978)). Es sind ebenfalls Schemata bekannt, die auf der Verknüpfung zweier (oder mehrerer) Oligonukleotide in Gegenwart einer Nukleinsäure, die die Sequenz des resultierenden „Dioligonukleotids" aufweist, basieren und dadurch das Dioligonukleotid amplifizieren. (Wu, D. Y. et al., Genomics 4: 560 (1989)).
Miller, H. I. et al., PCT Anmeldung WO 89/06700 (Priorität: U.S. Patent Anmeldung mit dem amtlichen Aktenzeichen 146,462, angemeldet am 21. Januar 1988) offenbart ein Nukleinsäuresequenzamplifikationsschema, das auf der Hybridisierung einer Promotor/Primer Sequenz an eine einzelsträngige Ziel-DNA („ssDNA"), gefolgt von der Transkription vieler RNA-Kopien der Sequenz basiert. Dieses Schema war nicht zyklisch, das heißt, es wurden keine neuen Template von den resultierenden RNA-Transkripten hergestellt.
Malek. L. T. et al., U.S. Patent 5,130,238 und Davey, C. et al., (europäische Patentanmeldung Nr. 329,822) offenbart ein Nukleinsäureamplifikationsverfahren, das die zyklische Synthese von einzelsträngiger RNA („ssRNA"), ssDNA und doppelsträngiger DNA (dsDNA) betrifft. Die ssRNA ist ein erstes Templat für ein erstes Primeroligonukleotid, das durch die reverse Transkriptase (RNA-abhäöngige DNA- Polymerase) verlängert wird. Die RNA wird dann von dem resultierenden DNA: RNA Duplex durch Wirkung von Ribonuklease H (RNase H, eine RNase, die für RNA in einem Duplex mit entweder DNA oder RNA spezifisch ist) entfernt. Die resultierende ssDNA ist ein zweites Templat für einen zweiten Primer, der ebenfalls die Sequenz eines RNA-Polymerasepromotors (am Beispiel der T7 RNA-Polymerase erläutert) 5'-zu dessen Homologie an dessen Templat umfaßt. Dieser Primer wird dann durch DNA-Polymerase (am Beispiel des großen „Klenow" Fragments von E. coli DNA-Polymerase 1 erläutert) verlängert, was zu einem doppelsträngigen DNA- („dsDNA") Molekül führt, das eine Sequenz aufweist, die zu derjenigen der ursprünglichen RNA zwischen den Primern identisch ist und zusätzlich an einem Ende eine Promotorsequenz aufweist. Diese Promotorsequenz kann durch die geeignete RNA-Polymerase zur Herstellung vieler RNA-Kopien der DNA verwendet werden. Diese Kopien können dann in den Zyklus wieder eintreten, was zu einer sehr schnellen Amplifikation führt. Mit der richtigen Wahl der Enzyme kann diese Amplifikation isothermisch ohne die Zugabe von Enzymen bei jedem Zyklus durchgeführt werden. Aufgrund der zyklischen Natur dieses Verfahrens kann die Startersequenz so gewählt werden, dass sie entweder in DNA- oder RNA-Form vorhanden ist. Eine Verbesserung dieses Verfahrens wurde von Schuster et al. (U.S. Patent 5.169,766) entwickelt, der zeigt, dass die von Malek (U.S. Patent 5,130,238) gelehrte Primerverlängerung nicht notwendig ist.
Alle vorstehenden Amplifikationsverfahren hängen von dem Prinzip ab, dass ein Endprodukt eines Zyklus zu einem Startermaterial funktional identisch ist. Durch die Wiederholung von Zyklen wird die Nukleinsäure daher exponentiell amplifiziert.
Es wurde ein isothermes Amplifikationsverfahren beschrieben, in dem Restriktionsendonukleasen und Ligasen dazu verwendet werden, die Amplifikation von Zielmolekülen zu erreichen, die in einem Strang einer Restriktionsstelle 5'-[α-thio]triphosphate enthalten (Walker, G. T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 89: 392–396 (1992)).
Verfahren, die Temperaturwechsel verwenden, zum Beispiel PCR oder Wu, D. Y. et al., Genomics 4: 560 (1989)) weisen eine theoretische maximale Produktzunahme um das 2-fache pro Zyklus auf, weil in jedem Zyklus von jedem Templat ein einziges Produkt hergestellt wird. In der Praxis ist die Zunahme immer geringer als das 2- fache. Eine weitere Verlangsamung der Amplifikation ist die Zeit, die zum Wechseln der Temperatur gebraucht wird. Eine weitere Verzögerung wird ebenfalls durch die Notwendigkeit hervorgerufen, dass in einem Zyklus allen Molekülen genügend Zeit bewilligt wird, damit ein Schritt beendet ist. Moleküle, die einen Schritt schnell beendet haben, müssen auf die Beendigung ihrer langsameren Gegenstücke „warten", bevor sie zum nächsten Schritt in dem Zyklus voranschreiten; eine Verkürzung der Zykluszeitdauer würde zum Überspringen eines Zyklus durch die „langsameren" Moleküle führen, was zu einem geringeren Exponenten der Amplifikation führt.
Verfahren, die einen Transkriptionsschritt umfassen, zum Beispiel dasjenige der vorliegenden Erfindung oder von Malek, L. T. et al. (U.S. Patent 5,130,238) oder Davey, C. et al. (veröffentlichte europäische Patentanmeldung Nr. 329,822) können das Produkt um mehr als einen Faktor von 2 bei jedem Zyklus erhöhen. Da 100 oder mehr Transkripte von einem einzelnen Templat hergestellt werden können, sind tatsächlich für die Zunahme Faktoren von 100 oder mehr theoretisch erreichbar. Werden alle Schritte unter identischen Bedingungen durchgeführt, braucht weiterhin kein Molekül, das einen speziellen Schritt beendet hat, zu „warten", bevor es zum nächsten Schritt voranschreitet. Daher sind Amplifikationen, die auf Transkription basieren und keinen Temperaturwechsel erfordern potentiell viel schneller, als Amplifikationen mit Temperaturwechsel, wie zum Beispiel PCR.
Zusammengefaßt ist, obwohl eine Vielfalt von Amplifikationsverfahren entwickelt worden sind, ein streng Ziel-abhängiges Verfahren höchst erwünscht, das in der Lage ist, die exponentielle Amplifikation eines Zielmoleküls zu vermitteln, und das die Fähigkeit besitzt, eine einzelne allele Nukleotidveränderung nachzuweisen. Die vorliegende Erfindung stellt ein solches Verfahren zur Verfügung.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt daher ein verbessertes Verfahren zum Amplifizieren einer gewünschten in einem Zielmolekül vorhandenen Sequenz zur Verfügung. Die Methodologie stützt sich im allgemeinen auf die Hybridisierung eines Blockierungs-Oligonukleotids an ein Zielmolekül. Die Hybridisierungspositionen des Blockierungs-Oligonukleotids sind derart, dass es an ein Primermolekül oder an ein Verlänge rungsprodukt des Primer-Oligonukleotids angrenzt, das ebenfalls an das Ziel hybridisiert ist. Das Ergebnis einer solchen Positionierung ist, dass das Primer-Oligonukleotid (oder dessen Verlängerungsprodukt) und das Blockierungs-Oligonukleotid miteinander verknüpft werden können. Eine solche Verknüpfung stellt ein Substrat für die Polymerase vermittelte templatabhängige Verlängerung eines End-Run-Oligonukleotids zur Verfügung, das in der Lage ist, an das Blockierungs-Oligonukleotid zu hybridisieren. Da das Verlängerungsprodukt des End-Run-Oligonukleotids zu den Primer-Oligonukleotid- und Blockierungs-Oligonukleotidsequenzen komplementär ist, ist die Reaktion in der Lage, die exponentielle Amplifikation des Zielmoleküls zu vermitteln. Das Verfahren ist bezeichnenderweise in der Lage zwischen allelen Varianten zu unterscheiden, die sich um so wenig, wie ein einzelnes Nukleotid unterscheiden.
Im einzelnen stellt die Erfindung ein Verfahren zur Amplifizierung der Konzentration eines Ziel-Nukleinsäuremoleküls zur Verfügung, umfassend die Schritte:

(A) des Hybridisierens eine Blockierungs-Oligonukleotids an das Ziel-Nukleinsäuremolekül zur Bildung eines Doppelstrang-Nukleinsäuremoleküls;
(B) des Hybridisierens eines Primer-Oligonukleotids an das Ziel-Nukleinsäuremolekül des Doppelstrang-Nukleinsäuremoleküls, so dass das 3' Ende des Primer-Oligonukleotids entweder an das 5' Ende des hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotids angrenzt oder in einer Polymerase vermittelten templatabhängigen Primerverlängerungsreaktion verlängert werden kann, damit es an das 5' Ende des hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotids angrenzt;
(C) (1) wobei das 3' Ende des hybridisierten Primer-Oligonukleotids an das 5' Ende des hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotids angrenzt und des Ausführens von Schritt (D); oder
(2) wobei das 3' Ende des hybridisierten Primer-Oligonukleotids nicht an das 5' Ende des hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotids angrenzt, was dazu führt, dass das 3' Ende des hybridisierten Primer-Oligonukleotids in einer Polymerase vermittelten templatabhängigen Primerverlängerungsreak tion verlängert wird, um dadurch ein Primerverlängerungsprodukt zu bilden, dessen 3' Ende an das 5' Ende des hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotids angrenzt und anschließendem Ausführen von Schritt (D);
(D) des Verknüpfens des angrenzenden 3' Endes des hybridisierten Primer-Oligonukleotids aus Schritt (C) (1) oder des Verknüpfens des angrenzenden 3' Endes des hybridisierten Primerverlängerungsprodukts aus Schritt (C) (2) mit dem 5' Ende des hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotids zur Bildung eines Verknüpfungsprodukts, das die Sequenz des Primer-Oligonukleotids oder des Primerverlängerungsprodukts und die Sequenz des Blockierungs-Oligonukleotids aufweist;
(E) des Hybridisierens eines End-Run-Oligonukleotids an die Sequenz des Blockierungs-Oligonukleotids des Verknüpfungsprodukts und
Verlängerns des 3' Endes des hybridisierten End-Run-(F) des Oligonukleotids in einer Polymerase vermittelten, templatabhängigen Primerverlängerungsreaktion zur Bildung eines End-Run Verlängerungsprodukts und zur Amplifizierung der Konzentration des Zielmoleküls;

Die Erfindung stellt ebenfalls die Ausführungsform des vorstehenden Verfahrens zur Verfügung, weiterhin umfassend die Schritte des:

(G) Hybridisierens eines Blockierungs-Oligonukleotids an das End-Run-Verlängerungsprodukt zur Bildung eines Doppelstrang-Nukleinsäuremoleküls;
H) des Hybridisierens eines Primer-(Oligonukleotids an das End-Run-Verlängerungsprodukt des Doppelstrang-Nukleinsäuremoleküls aus Schritt (G) zur Bildung eines Doppelstrang-Nukleinsäuremoleküls, wobei das 3' Ende des Primer-Oligonukleotids entweder an das 5' Ende des hybridisierten Blockie rungs-Oligonukleotids angrenzt oder in einer Polymerase vermittelten templatabhängigen Primerverlängerungsreaktion verlängert werden kann, damit es an das 5' Ende des hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotids angrenzt;
(I) (1) wobei das 3' Ende des hybridisierten Primer-Oligonukleotids aus Schritt H) an das 5' Ende des hybridisierten Blockierungs-(Oligonukleotids angrenzt und des Ausführens von Schritt (J); oder
(2) wobei das 3' Ende des hybridisierten Primer-Oligonukleotids aus Schritt H) nicht an das 5' Ende des hybridisierten Blockierungs-(Oligonukleotids angrenzt, was dazu führt, dass das 3' Ende des hybridisierten Primer-Oligonukleotids in einer Polymerase vermittelten templatabhängigen Primerverlängerungsreaktion verlängert werden kann, um dadurch ein Primerverlängerungsprodukt zu bilden, dessen 3' Ende an das 5' Ende des hybridisierten Blockeriungs-Oligonukleotids angrenzt und anschließendem Ausführen von Schritt (J);
(J) des Verknüpfens des angrenzenden 3' Endes des hybridisierten Primer-Oligonukleotids aus Schritt (1) (1) oder des Verknüpfens des angrenzenden 3' Endes des hybridisierten Primerverlängerungsprodukts aus Schritt (1) (2) mit dem 5' Ende des hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotids zur Bildung und Amplifikation des Verknüpfungsprodukts;
K) des Hybridisierens eines End-Run-(Oligonukleotids an die Sequenz des Blockierungs-Oligonukleotids des Verknüpfungsprodukts aus Schritt (J) und
Verlängerns des 3' Endes des hybridisierten End-Run-(L) des Oligonukleotids in einer Polymerase vermittelten templatabhängigen Primerverlängerungsreaktion zur Bildung und Amplifikation eines End-Run-Verlängerungsprodukts.

Die Erfindung richtet sich ebenfalls an die Ausführungsform der vorstehenden Verfahren, umfassend nach Schritt (F) die folgenden weiteren Schritte:

(G) des Hybridisierens eines zweiten Blockierungsoligonukleotids an das End-Run-Verlängerungsprodukt zur Bildung eines Doppelstrang-Nukleinsäuremoleküls, wobei das zweite Blockierungs-Oligonukleotid an das End-Run-Verlängerungsprodukt an einer Stelle hybridisiert, an die das Blockierungsoligonukleotid aus Schritt (A) oder das Primer-Oligonukleotid aus Schritt (B) nicht hybridisieren kann;
H) des Hybridisierens eines zweiten Primer-(Oligonukleotids an das End-Run-Verlängerungsprodukt des Doppelstrang-Nukleinsäuremoleküls, so dass das 3' Ende des zweiten Primer-Oligonukleotids entweder an das 5' Ende des hybridisierten zweiten Blockierungs-Oligonukleotids angrenzt oder in einer Polymerase vermittelten templatabhängigen Primer-Verlängerungsreaktion verlängert werden kann, so dass es an das 5' Ende des hybridisierten zweiten Blockierungs-Oligonukleotids angrenzt;
hybrdisierten zweiten Primer-(I) (1) wobei das 3' Ende des Oligonukleotids an hybrdisierten zweiten Blockierungs-das 5' Ende des Oligonukleotids angrenzt und des Ausführens von Schritt (J); oder
(2) wobei das 3' Ende des hybridisierten zweiten Primer-Oligonukleotids nicht an das 5' Ende des hybridisierten zweiten Blockierungs-Oligonukleotids angrenzt, was dazu führt, dass das 3' Ende des hybridisierten zweiten Primer-Oligonukleotids in einer Polymerase vermittelten templatabhängigen Primerverlängerungsreaktion verlängert wird, um ein zweites Primerverlängerungsprodukt zu bilden, dessen 3' Ende an das 5' Ende des hybridisierten zweiten Blockeirungs-Oligonukleotids angrenzt und anschließendem Ausführen von Schritt (J);
(J) des Verknüpfens des angrenzenden 3' Endes des hybridisierten zweiten Primer-Oligonukleotids aus Schritt (I) (1) oder des Verknüpfens des angrenzenden 3' Endes des hybridisierten zweiten Primer-Verlängerungsprodukts aus Schritt I) (2) mit dem 5' Ende des hybridisierten Blockierungs-(Oligonukleotids zur Bildung eines zweiten Verknüpfungsprodukts, das die Sequenz des zweiten Pri mer-Oligonukleotids oder des zweiten Primer-Verlängerungsprodukts und die Sequenz des zweiten Blockierungs-Oligonukleotids aufweist;
(K) des Hybridisierens eines zweiten End-Run Oligonukleotids an die Sequenz des zweiten Blockierungs-Oligonukleotids des zweiten Verknüpfungsprodukts und
(L) des Verlängerns des 3' Endes des hybridisierten zweiten End-Run-Oligonukleotids in einer Polymerase vermittelten templatabhängigen Primerverlängerungsreaktion zur Bildung eines zweiten End-Run-Verlängerungsprodukts und damit zur Amplifikation der Konzentration der Sequenz des Zielmoleküls.

Die Erfindung kann alternativ zu den vorstehend beschriebenen Schritten (G) bis (H) die Ausführungsform umfassen, die nach Schritt (F) die folgenden weiteren Schritte umfaßt:

(G) des Hybridisierens eines zweiten Blockierungs-Oligonukleotids an das Verknüpfungsprodukt zur Bildung eines Doppelstrang-Nukleinsäuremoleküls, wobei das zweite Blockierungs-Oligonukleotid an das Verknüpfungsprodukt an einer Stelle hybridisiert, an die das Blockierungs-Oligonukleotid aus Schritt (A) oder das Primer-Oligonukleotid aus Schritt (B) nicht hybridisieren kann;
H) des Hybridisierens eines zweiten Primer-(Oligonukleotids an das Verknüpfungsprodukt des Doppelstrang-Nukleinsäuremoleküls, so dass das 3' Ende des zweiten Primer-Oligonukleotids an das 5' Ende des hybridisierten zweiten Blockierungs-Oligonukleotids angrenzt oder einer Polymerase vermittelten templatabhängigen Primerverlängerungsreaktion verlängert werden kann, damit es an das 5' Ende des hybridisierten zweiten Blockierungs-Oligonukleotids angrenzt;
I) (1) wobei das 3' Ende des hybridisierten zweiten Primer-(Oligonukleotids an das 5' Ende des hybridisierten zweiten Blockierungs-Oligonukleotids angrenzt und des Ausführens von Schritt (J); oder
(2) wobei das 3' Ende des hybridisierten zweiten Primer-Oligonukleotids nicht an das 5' Ende des hybridisierten zweiten Blockierungs-Oligonukleotids angrenzt, was dazu führt, dass das 3' Ende des hybridisierten zweiten Primer-Oligonukleotids in einer Polymerase vermittelten templatabhängigen Primerverlängerungsreaktion verlängert wird, um dadurch ein zweites Primerverlängerungsprodukt zu bilden, dessen 3' Ende an das 5' Ende des hybridisierten zweiten Blockierungs-Oligonukleotids angrenzt und anschließendem Ausführen von Schritt (J);
(J) des Verknüpfens des angrenzenden 3' Endes des hybridisierten zweiten Primer-Oligonukleotids aus Schritt (1) (1) oder des Verknüpfens des angrenzenden 3' Endes des hybridisierten zweiten Primer-Verlängerungsprodukts aus Schritt I) (2) mit dem 5' Ende des hybridisierten Blockierungs-(Oligonukleotids zur Bildung eines zweiten Verknüpfungsprodukts, das die Sequenz des zweiten Primer-Oligonukleotids oder des zweiten Primer-Verlängerungsprodukts und die Sequenz des zweiten Blockierungs-Oliogonukleotids aufweist;
(K) des Hybridisierens eines zweiten End-Run Oligonukleotids an die Sequenz des zweiten Blockierungs-Oligonukleotids des zweiten Verknüpfungsprodukts und
(L) des Verlängerns des 3' Endes des hybridisierten zweiten End-Run-Oligonukleotids in einer Polymerase vermittelten templatabhängigen Primerverlängerungsreaktion zur Bildung eines zweiten End-Run-Verlängerungsprodukts und damit zur Amplifikation der Konzentration der Sequenz des Zielmoleküls.

Die Erfindung stellt ebenfalls Verfahren zur Bestimmung zur Verfügung, ob ein ausgewähltes Nukleotid an einer vorbestimmten Stelle eines Ziel-Nukleinsäuremoleküls vorhanden ist. Solche Nachweisverfahren können von der Fähigkeit der Blockierungs-Oligonukleotide und Primer-Oligonukleotide zum Verknüpfen und zur Bildung von Verknüpfungsprodukten, von Primer-Oligonukleotiden zur Bildung von Verlängerungsprodukten, von End-Run-Oligonukleotiden zur Bildung von Verlängerungsprodukten und von jedem Oligonukleotid zur Hybridisierung an Teile des Ziel-Nukleinsäuremoleküls abhängen. Vorbestimmte Stellen von Ziel-Nukleinsäuremolekülen umfassen nahe an dem 5' Ende des Blockierungs-Oligonukleotids liegende oder daran angrenzende Stellen, nahe an dem 3' Ende des Primer-Oligonukleotids liegende oder daran angrenzende Stellen und nahe an dem 3' Ende des End-Run-Oligonukleotids liegende oder daran angrenzende Stellen.
Eine beispielhafte Ausführungsform zur Bestimmung, ob ein ausgewähltes Nukleotid vorhanden ist, umfaßt die Schritte:

(A) des Bereitstellens von Bedingungen zur Hybridisierung eines Blockierungs-Oligonukleotids an das Ziel-Nukleinsäuremolekül zur Bildung eines teilweisen Doppelstrang-Nukleinsäuremoleküls, wobei das 5' Ende des hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotids derart angeordnet ist, dass sein 5' endständiges Nukleotid der vorbestimmten Stelle des Zielmoleküls gegenüberliegt und wobei es zum ausgewählten Nukleotid komplementär ist;
(B) des Bereitstellens von Bedingungen zur Hybridisierung eines Primer-Oligonukleotids an das Ziel-Nukleinsäuremolekül des teilweisen Doppelstrang-Nukleinsäuremoleküls, so dass das 3' Ende des Primer-Oligonukleotids entweder an das 5' Ende des hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotids angrenzt oder in einer Polymerase vermittelten templatabhängigen Primerverlängerungsreaktion verlängert werden kann, damit es an das 5' Ende des hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotids angrenzt;
(C) (1) des Ausführens von Schritt (D), wenn das 3' Ende des Primer-Oligonukleotids an das 5' Ende des Blockierungs-Oligonukleotids angrenzt, oder
(2) des Ausführens von Schritt (D) im Anschluß an die Verlängerung des 3' Endes des hybridisierten Primer-Oligonukleotids in einer Polymerase vermittelten templatabhängigen Primerverlängerungsreaktion zur Bildung eines Primerverlängerungsprodukts, dessen 3' Ende an das 5' Ende des Blockierungs-Oligonukleotids angrenzt, wenn das 3' Ende des Primer-Oligonukleotids nicht an das 5' Ende des Blockierungs-Oligonukleotids angrenzt;
(D) des Inkubierens des angrenzenden 3' Endes des hybridisierten Primer-Oligonukleotids aus Schritt (C) (1) oder des angrenzenden 3' Endes des hybridisierten Primerverlängerungsprodukts aus Schritt (C) (2) und des 5' Endes des hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotids in Gegenwart einer Ligase und unter Bedingungen, die einer Nukleinsäureverknüpfung förderlich sind;
(E) des Bestimmens, ob das ausgewählte Nukleotid an der vorbestimmten Stelle vorhanden ist, in dem nachgewiesen wird, ob Schritt (D) in der Bildung eines Verknüpfungsprodukts resultiert, das die Sequenz des Primer-Oligonukleotids Primer-Verlängerungsprodukts und des Blockierungs-oder des Oligonukleotids aufweist, wobei die Bildung des Verknüpfungsprodukts von der Fähigkeit des 5' Nukleotids des Blockierungs-endständigen Oligonukleotids abhängt, an das Nukleotid an der vorbestimmten Stelle zu hybridisieren, und wobei der Nachweis durch die folgenden Unterschritte erreicht wird:
(1) des Bereitstellens eines End-Run-Oligonukleotids für die Inkubation, wobei das End-Run-Oligonukleotid in der Lage ist, an mindestens einen Teil des Blockierungs-Oligonukleotids zu hybridisieren, und des Aufrechterhaltens von Bedingungen, die ausreichend sind, um eine Nukleinsäurehybridisierung zu ermöglichen und eine Polymerase vermittelte templatabhängige Primerverlängerung stattfinden zu lassen und
(2) des Bestimmens, ob das End-Run-Oligonukleotid so verlängert ist, dass es eine Sequenz enthält, die zu einer Sequenz des Primer-Oligonukleotids komplementär ist.

Ein weiteres erfindungsgemäßes Verfahren zur Bestimmung, ob ein ausgewähltes Nukleotid an einer vorbestimmten Stelle eines Ziel-Nukleinsäuremoleküls vorhanden ist, umfaßt die Schritte:

(A) des Bereitstellens von Bedingungen zur Hybridisierung eines Blockierungs-Oligonukleotids an das Ziel-Nukleinsäuremolekül zur Bildung eines Doppelstrang-Nukleinsäuremoleküls, wobei das 5' Ende des hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotids derart angeordnet ist, dass sein 5' endständiges Nukleo tid an das direkt zur vorbestimmten Stelle des Zielmoleküls 3' ständige Nukleotid hybridisiert;
(B) des Bereitstellens von Bedingungen zur Hybridisierung eines Primer-Oligonukleotids an das Ziel-Nukleinsäuremolekül des teilweisen Doppelstrang-Nukleinsäuremoleküls, so dass das 3' Ende des Primer-Oligonukleotids entweder an das 5' Ende des hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotids angrenzt und wobei das 3' endständige Nukleotid zum ausgewählten Nukleotid komplementär ist;
(C) des Inkubierens des angrenzenden 3' Endes des hybridisierten Primer-Oligonukleotids und des 5' Endes des hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotids in Gegenwart einer Ligase und unter Bedingungen, die einer Nukleinsäureverknüpfung förderlich sind;
(D) des Bestimmens, ob das ausgewählte Nukleotid an der vorbestimmten Stelle vorhanden ist, in dem nachgewiesen wird, ob Schritt (C) in der Bildung eines Verknüpfungsprodukts resultiert, das die Sequenz des Primer-Oligonukleotids und des Blockierungs-Oligonukleotids aufweist, wobei der Nachweis durch die folgenden Unterschritte erreicht wird:
(1) des Bereitstellens eines End-Run-Oligonukleotids für die Inkubation, wobei das End-Run-Oligonukleotid in der Lage ist, an mindestens einen Teil des Blockierungs-Oligonukleotids zu hybridisieren, und des Aufrechterhaltens der Inkubation unter Bedingungen, die ausreichend sind, um eine Nukleinsäurehybridisierung zu ermöglichen und eine Polymerase vermittelte templatabhängige Primerverlängerung stattfinden zu lassen und
(2) des Bestimmens, ob das End-Run-Oligonukleotid so verlängert ist, dass es eine Sequenz enthält, die zu einer Sequenz des Primer-Oligonukleotids komplementär ist.

Die Erfindung umfaßt ebenfalls eine Ausführungsform des vorstehenden Verfahrens, wobei die Bestimmung, ob ein End-Run-Oligonukleotid verlängert ist, um eine Se quenz zu erhalten, die zu einer Sequenz des Primer-Oligonukleotids komplementär ist, über die Amplifikation jedes End-Run-Verlängerungsprodukts durchgeführt wird und wobei ein Verfahren verwendet wird, das die folgenden Unterschritte umfaßt:

a) des Hybridisierens des Blockierungs-(Oligonukleotids an jegliche End-Run-Verlängerungsprodukte, die bei der Inkubation vorhanden sind, um dadurch Doppelstrang-Nukleinsäuremoleküle zu bilden;
Hybridisierene des Primer-(b) des Oligonukleotids an das End-Run-Verlängerungsprodukt jeglicher Doppelstrang-Nukleinsäuremoleküle in einer Weise, dass das 3' Ende des Primer-Oligonukleotids entweder an das 5' Ende des hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotids angrenzt oder in einer Polymerase vermittelten templatabhängigen Primerverlängerungsreaktion verlängert werden kann, damit es an das 5' Ende des hybridiserten Blockierungs-Oligonukleotids angrenzt;
(c) (1) wobei das 3' Ende des hybridisierten Primer-Oligonukleotids an das 5' Ende des hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotids angrenzt und des Ausführens von Schritt (d); oder
(2) wobei das 3' Ende des hybridisierten Primer-Oligonukleotids nicht an das 5' Ende des hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotids angrenzt, was dazu führt, dass das 3' Ende des hybridisierten Primer-Oligonukleotids in einer Polymerase vermittelten templatabhängigen Primerverlängerungsreaktion verlängert wird, um dadurch ein Primerverlängerungsprodukt zu bilden, dessen 3' Ende an das 5' Ende des hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotids angrenzt und des anschließenden Ausführen von Schritt (d);
(d) des Verknüpfens des angrenzenden 3' Endes aller hybridisierten Primer-Oligonukleotide aus Schritt (c) (1) oder des Verknüpfens aller angrenzenden 3' Enden der hybridisierten Primerverlängerungsprodukte aus Schritt (c) (2) mit dem 5' Ende aller hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotide zur Bildung eines Verknüpfungsprodukts, das die Sequenz des Primer-Oligonukleotids oder des Primerverlängerungsprodukts und die Sequenz des Blockierungs-Oligonukleotids aufweist;
(E) des Hybridisierens eines End-Run-Oligonukleotids an die Sequenz des Blockierungs-Oligonukleotids jeglichen Verknüpfungsprodukts und
Verlängerns des 3' Endes des hybridisierten End-Run-(F) des Oligonukleotids in einer Polymerase vermittelten, templatabhängigen Primerverlängerungsreaktion zur Bildung und Amplifikation des End-Run Verlängerungsprodukts.

Ferner ist ein weiteres erfindungsgemäßes Verfahren zur Bestimmung, ob ein ausgewähltes Nukleotid an einer vorbestimmten Stelle eines Ziel-Nukleinsäuremoleküls vorhanden ist, von der Fähigkeit eines End-Run-Oligonukleotids zur Verlängerung in einer Polymerase vermittelten templatabhängigen Reaktion abhängig. Dieses Verfahren umfaßt die Schritte:

(A) des Hybridisierens eines Blockierungs-Oligonukleotids an eine Nukleinsäuresequenz, die zum Ziel-Nukleinsäuremolekül komplementär ist, um dadurch ein teilweises Doppelstrang-Nukleinsäuremolekül zu bilden;
(B) des Hybridisierens eines Primer-Oligonukleotids an die Nukleinsäuresequenz, die zum Ziel-Nukleinsäuremolekül des Doppelstrang-Nukleinsäuremoleküls komplementär ist, damit das 3' Ende des Primer-Oligonukleotids entweder an das 5' Ende des hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotids angrenzt oder in einer Polymerase vermittelten templatabhängigen Primerverlängerungsreaktion verlängert werden kann, damit es an das 5' Ende des hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotids angrenzt;
(C) (1) wobei das 3' Ende des hybridisierten Primer-Oligonukleotids an das 5' Ende des hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotids angrenzt und des Ausführens von Schritt (D); oder
(2) wobei das 3' Ende des hybridisierten Primer-Oligonukleotids nicht an das 5' Ende des hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotids angrenzt, was da zu führt, dass das 3' Ende des hybridisierten Primer-Oligonukleotids in einer Polymerase vermittelten templatabhängigen Primerverlängerungsreaktion verlängert wird, um dadurch ein Primerverlängerungsprodukt zu bilden, dessen 3' Ende an das 5' Ende des hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotids angrenzt und anschließendem Ausführen von Schritt (D);
(D) des Verknüpfens des angrenzenden 3' Endes des hybridisierten Primer-Oligonukleotids aus Schritt (C) (1) oder des Verknüpfens des angrenzenden 3' Endes des hybridisierten Primerverlängerungsprodukts aus Schritt (C) (2) mit dem 5' Ende des hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotids zur Bildung eines Verknüpfungsprodukts, das die Sequenz des Primer-Oligonukleotids oder des Primerverlängerungsprodukts und die Sequenz des Blockierungs-Oligonukleotids aufweist;
(E) des Hybridisierens eines End-Run-Oligonukleotids an die Sequenz des Blockierungs-Oligonukleotids des Verknüpfungsprodukts, wobei das 3' Ende des End-Run-Oligonukleotids zu dem ausgewählten Nukleotid komplementär ist und das 3' endständige Nukleotid des End-Run-Oliognukleotids der vorbestimmten Stelle des Zielmoleküls gegenüberliegen kann;
(F) des Bereitstellens von Bedingungen zur Verlängerung des 3' Endes des hybridisierten End-Run-Oligonukleotids in einer Polymerase vermittelten templatabhängigen Primerverlängerungsreaktion zur Bildung eines End-Run-Verlängerungsprodukts;
(G) des Bestimmens des Vorhandenseins des ausgewählten Nukleotids an der vorbestimmten Stelle, indem nachgewiesen wird, ob Schritt (F) in der Bildung eines End-Run-Verlängerungsprodukts resultiert.

Die vorliegende Erfindung betrachtet ebenfalls alternative Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins eines ausgewählten Nukleotids an einer vorbestimmten Stelle eines Ziel-Nukleinsäuremoleküls. Solche Nachweisverfahren können von der Fähigkeit eines Primer-Oligonukleotids zur Hybridisierung an das Ziel-Nukleinsäuremolekül und zur Bildung eines Primer-Verlängerungsprodukts abhängen. Eine derartige Ausführungsform umfaßt die Schritte:

(A) des Bereitstellens von Bedingungen zur Hybridisierung eines Blockierungs-Oligonukleotids an das Ziel-Nukleinsäuremolekül zur Bildung eines teilweisen Doppelstrang-Nukleinsäuremoleküls;
(B) des Bereitstellens von Bedingungen zur Hybridisierung eines Primer-Oligonukleotids an das Ziel-Nukleinsäuremolekül des teilweisen Doppelstrang-Nukleinsäuremoleküls, so dass das 3' Ende des Primer-Oligonukleotids der vorbestimmten Stelle des Zielmoleküls gegenüberliegt;
(C) des Bereitstellens von Bedingungen zur Verlängerung des 3' Endes des hybridisierten Primer-Oligonukleotids in einer Polymerase vermittelten templatabhängigen Primer-Verlängerungsreaktion, um dadurch ein Primer-Verlängerungsprodukt zu bilden;
(D) des Bestimmens, ob das ausgewählte Nukleotid an der vorbestimmten Stelle vorhanden ist, in dem nachgewiesen wird, ob Schritt (C) in der Bildung eines Primerverlängerungsprodukts resultiert, wobei der Nachweis durch die folgenden Unterschritte erreicht wird:
(1) des Inkubierens des Primer-Verlängerungsprodukts und des 5' Endes des hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotids in Gegenwart einer Ligase unter Bedingungen, die einer Nukleinsäureverknüpfung förderlich sind.;
(2) des Nachweisens, ob Schritt (1) in der Bildung eines Verknüpfungsprodukts resultiert, das die Sequenz des Primer-Oligonukleotidverlängerungsprodukts und des Blockierung-Oligonukleotids aufweist, wobei der Nachweis durch die folgenden Schritte erreicht wird:
a) des Bereitstellens eines End-Run-(Oligonukleotids für die Inkubation, wobei das End-Run-Oligonukleotid mit wenigstens einem Teil des Blockierungs-Oligonukleotids hybridisieren kann und des Beibehal tens der Inkubation unter Bedingungen, die ausreichend sind, um eine Nukleinsäurehybridisierung zu ermöglichen und eine Polymerase vermittelte templatabhängige Primer-Verlängerung stattfinden zu lassen; und
(b) des Bestimmens, ob das End-Run-Oligonukleotid verlängert ist, so dass es eine Sequenz enthält, die zu einer Sequenz des Primer-Oligonukleotids komplementär ist.

Die vorliegende Erfindung zeichnet sich dadurch aus, dass die hier gelehrten Verfahren erstens zum Amplifizieren der Konzentration einer beliebigen Nukleinsäure verwendet werden können, gefolgt von ebenfalls hier gelehrten Verfahren zur Bestimmung, ob ein ausgewähltes Nukleotid an einer vorbestimmten Stelle der amplifizierten Nukleinsäure vorhanden ist.
Die Erfindung richtet sich ebenfalls auf „Kits" und insbesondere auf ein Kit, das Reagenzien zur Amplifikation von wenigstens einer Zielsequenz umfaßt, die wenigstens eine Region umfaßt, die eine definierte Nukleinsäuresequenz aufweist, wobei der Kit mindestens einen Behälter umfaßt und der Behälter wenigstens eine Blockierungseinheit, wenigstens eine Primereinheit und wenigstens eine End-Run-Einheit umfaßt, wobei die Blockierungseinheit in der Lage ist, an einen Teil der Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren, die Primereinheit in der Lage ist, an einen unterschiedlichen Teil der Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren und die End-Run-Einheit eine Sequenz umfaßt, die zu wenigstens einem Teil der Blockierungseinheit komplementär ist.
Die Kits können optional Reagenzien, Enzyme und/oder Puffer umfassen, die so ausgelegt sind, dass sie die End-Run-Amplifikation erleichtern.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 stellt eine schematische Darstellung der Positionierung und Merkmale der „End-Run-", „Blockierungs-" und „Primer-" Oligonukleotide zur Verfügung, die zum Amplifizieren eines Doppelstrang-Zielmoleküls in der ERA Ausführungsform „ohne Lücke" der vorliegenden Erfindung verwendet werden. In der Figur werden „End- Run-", „Blockierungs-" und „Primer-" Oligonukleotide als A, B beziehungsweise C bezeichnet.
2 stellt eine schematische Darstellung der Positionierung und Merkmale der „End-Run-", „Blockierungs-" und „Primer-" Oligonukleotide zur Verfügung, die zum Amplifizieren eines Doppelstrang-Zielmoleküls in der ERA Ausführungsform „mit Lücke" der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
3 erläutert die Verwendung der ERA Ausführungsform ohne „Lücke" des End-Run-Amplifikationsverfahrens zur Amplifizierung eines gewünschten Doppelstrang-Zielmoleküls. Die Oligonukleotide sind wie in 1 definiert.
4 erläutert die Verwendung der ERA Ausführungsform „mit Lücke" des End-Run-Amplifikationsverfahrens zur Amplifizierung eines gewünschten Doppelstrang-Zielmoleküls. Die Oligonukleotide sind wie in 1 definiert.
5A stellt eine schematische Darstellung der Positionierung und Merkmale der „End-Run-", „Blockierungs-" und „Primer-" Oligonukleotide zur Verfügung, die in der ERA Ausführungsform „ohne Lücke" der vorliegenden Erfindung in Bezug auf ein Einzelstrang-Zielmolekül verwendet werden. 5B erläutert die Verwendung der ERA Ausführungsform „ohne Lücke" zum Amplifizieren eines gewünschten Einzelstrang-Zielmoleküls. Die 5C und 5D erläutern die Amplifikation eines Einzelstrang-Zielmoleküls, wenn das End-Run-Oligonukleotid vor der Verknüpfung der Blockierungs- und Primer-Oligonukleotide verlängert worden ist. Die Moleküle sind wie in 1 definiert.
6A stellt eine schematische Darstellung der Positionierung und Merkmale der End-Run-, Blockierungs- und Primer-Oligonukleotide zur Verfügung, die in der ERA-Ausführungsform „mit Lücke" der vorliegenden Erfindung in Bezug auf ein Einzelstrang-Zielmolekül verwendet werden. 6B erläutert die Verwendung der ERA-Ausführungsform „mit Lücke" zum Amplifizieren eines gewünschten Einzelstrang-Zielmoleküls. Die 6C und 6D erläutern die Amplifikation eines Einzelstrang-Zielmoleküls, wenn das End-Run-Oligonukleotid vor der Verknüpfung der Blockie rungs- und Primer-Oligonukleotide verlängert wird. Die Moleküle sind wie in 1 definiert.
7 erläutert die Verwendung der „verschachtelten" ERA Ausführungsform („NERA") der Erfindung zum Amplifizieren eines Doppelstrang-Zielmoleküls. Die Oligonukleotide sind wie in 1 definiert.
8 erläutert die Verwendung der „verschachtelten" ERA Ausführungsform („NERA") der Erfindung zum Amplifizieren eines Einzelstrang-Zielmoleküls. Die Oligonukleotide sind wie in 1 definiert.
9 stellt eine schematische Darstellung der „Schleifen" ERA Ausführungsform („LERA") der vorliegenden Erfindung zu Verfügung. 9A erläutert die Anbindung von Blockierungs- und Primer-Oligonukleotiden. 9B stellt eine schematische Darstellung der an eine Zielsequenz hybridisierten Schleife von 9A zur Verfügung. 9C stellt eine schematische Darstellung einer End-Run-Verlängerungsreaktion entlang der verknüpften Blockierungs-Oligonukleotid- und Primer-Oligonukleotidregionen der Schleife von 9A zur Verfügung. 9D stellt eine schematische Darstellung des von 9C stammenden resultierenden Ziels zur Verfügung.
10 stellt eine schematische Anordnung des Ziels mit den Blockierungs-, Primer- und End-Run-Oligonukleotiden zur Verfügung, die in den Beispielen I und II verwendet werden.
11 stellt eine schematische Darstellung der Elektrophoreseergebnisse der Amplifikationsreaktionen zur Verfügung, die entsprechend der Beschreibung in Beispiel 1 durchgeführt wurden. Spur 1 zeigt die Ergebnisse der ERA-Reaktion in Gegenwart von Primer-Oligonukleotid (Pr), End-Run-Oligonukleotid (ER), Polymerase (P) und Ligase (L), jedoch in Abwesenheit eines Blockierungs-Oligonukleotids (B). Spur 2 zeigt die Ergebnisse der ERA Reaktion in Gegenwart von Blockierungs- und Primer-Oligonukleotiden, Polymerase und Ligase, jedoch in Abwesenheit des End-Run-Oligonukleotids. Spur 3 zeigt die Ergebnisse der ERA Reaktion, wenn Blockierungs-, Primer-, End-Run-Oligonukleotide, Polymerase und Ligase gemeinsam vor handen sind. Spur 4 zeigt die Ergebnisse der ERA Reaktion in Gegenwart von Blockierungs-, Primer-, End-Run-Oligonukleotiden und Polymerase, jedoch in Abwesenheit von Ligase. Spur 5 zeigt die Ergebnisse der ERA Reaktion in Gegenwart der Blockierungs-, Primer- und End-Run-Oligonukleotide und Ligase, jedoch in Abwesenheit von Polymerase.
12 stellt eine schematische Wiedergabe der Elektrophoreseergebnisse der Amplifikationsreaktion zur Verfügung, die entsprechend der Beschreibung in Beispiel II durchgeführt wurde und wobei Ziel-Molekülkonzentrationen von 10^–12 M (A) oder 10^–15 M (12B) verwendet wurden. Spur M erläutert die relative Position der End-Run- und Primer-Oligonukleotide und des Ziels auf dem Gel. Die relative Position des Blockierungs-Oligonukleotids ist in Spur 2 gezeigt. Spur 1 zeigt die Position des Primers. Spur 2 zeigt die Ergebnisse der ERA Reaktion in Gegenwart der Blockierungs- und Primeroligonukleotide, Polymerase und Ligase, jedoch in Abwesenheit des End-Run-Oligonukleotids. Spur 3 zeigt die Ergebnisse der ERA Reaktion in Gegenwart des Primer- und End-Run-Oligonukleotids, Polymerase und Ligase, jedoch in Abwesenheit des Blockierungs-Oligonukleotids. Spur 4 zeigt die Ergebnisse der ERA Reaktion in Gegenwart von Blockierungs-, Primen- und End-Run-Oligonukleotiden und Polymerase, jedoch in Abwesenheit von Ligase. Spur 5 zeigt die Ergebnisse der ERA Reaktion, wenn Blockierungs-, Primer- und End-Run-Oligonukleotide, Polymerase und Ligase gemeinsam vorhanden sind. Spur 6 zeigt die Ergebnisse der ERA Reaktion in Gegenwart von Blockierungs-, Primer-, End-Run-Oligonukleotiden und Ligase, jedoch in Abwesenheit von Polymerase.
13 stellt Balkendiagramm zur Verfügung, das die Wirkung verschiedener 3' Enden des End-Run-Oligonukleotids auf den Einbau eines markierten Primer-Oligonukleotids und eines markierten End-Run-Oligonukleotids in Verknüpfungs- und Verlängerungsprodukten zeigt. Weist das End-Run-Oligonukleotid einen „Überhang" von 1 oder 2 Basen auf, bauen sowohl die Verknüpfungs- als auch die Verlängerungsreaktionen signifikant mehr markiertes Oligonukleotid ein, als bei Verwendung eines End-Run-Oligonukleotid, das ein „stumpfes" 3' Ende aufweist.
14 stellt ein Balkendiagramm zur Verfügung, das die Fähigkeit des Amplifikationsverfahrens der vorliegenden Erfindung zur Unterscheidung einzelner Basen er läutert. Die Ergebnisse zeigen, dass nach 20 ERA Amplifikationszyklen, es einen deutlichen Unterschied zwischen einem Wildtyp-Zieloligonukleotid und einer Zieloligonukleotidmutante gibt, die sich durch eine einzelne Base von dem Wildtyp-Oligonukleotid unterscheidet.
15 stellt ein Balkendiagramm zur Verfügung, das die Fähigkeit des Amplifikationsverfahrens der vorliegenden Erfindung zur Unterscheidung einzelner Basen erläutert. Die Reaktionen sind zu den in 14 ausgeführten Reaktionen identisch, abgesehen davon, dass sich die Daten auf 40 ERA Zyklen beziehen.
16 stellt ein Schaubild der verwendeten Zieloligonukleotidkonzentration gegen den Grad an eingebautem markiertem Oligonukleotid und gegen die Amlifikationsmenge für ERA Verlängerungsprodukte zur Verfügung. Die Daten zeigen, dass in der vorliegenden Erfindung Zielkonzentrationen in dem Bereich verwendet werden können, der zum Nachweis eines einzelnen Gens notwendig ist, damit Amplifikations- und Verlängerungsprodukte erhalten werden.
17 stellt ein Schaubild der verwendeten Zieloligonukleotidkonzentration gegen den Grad an eingebautem markiertem Oligonukleotid und gegen die Amplifikationsmenge für ERA Verknüpfungsprodukte zur Verfügung. Die Daten zeigen, dass in der vorliegenden Erfindung Zielkonzentrationen in dem Bereich verwendet werden können, der zum Nachweis eines einzelnen Gens notwendig ist, damit Amplifikations- und Verlängerungsprodukte erhalten werden.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
I. Amplifikation von Nukleinsäuremolekülen
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren – „End-Run-Amplifikation" oder „ERA" – zum Amplifizieren eines gewünschten in einer Probe vorhandenen Nukleinsäuremoleküls zur Verfügung. Somit stellt sie sowohl ein Mittel zur Bestimmung, ob ein spezielles gewünschtes Molekül in einer Probe vorhanden ist, und ein Mittel zum Erhalten von Mengen der gewünschten Sequenz zur Verfügung, die ausreichend sind, um deren Sequenz- oder Strukturanalyse zu gestatten.
Die Moleküle, die durch Verwendung des vorliegenden Verfahrens erzeugt werden können, können eine Länge im Bereich weniger Nukleotide bis zu mehreren Kilobasen aufweisen. Die „gewünschten" Moleküle der Erfindung sollen eine Sequenz aufweisen, die zu der Sequenz eines „Ziel"-Strangs eines Nukleinsäuremoleküls „komplementär" oder im wesentlichen dazu komplementär ist.
Wie hier verwendet wird, sollen zwei Sequenzen in der Lage sein, aneinander zu „hybridisieren", wenn sie in der Lage sind, eine antiparallele Doppelstrang-Nukleinsäurestruktur zu bilden. Zwei Nukleinsäuremoleküle sollen „komplementär" sein, wenn sie aneinander mit einer Stabilität hybridisieren können, die ausreicht, um ihnen zu gestatten, dass sie aneinander unter zumindest üblichen „wenig strengen" Bedingungen annealed bleiben (siehe Sambrook, J., et al., (in: Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)) und Haymes, B. D., et al. (in: Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985)), auf deren Offenbarungsgehalt hier vollumfänglich Bezug genommen wird). Zwei komplementäre Moleküle müssen somit keine genaue Komplementarität aufweisen, sondern sie müssen in einer Sequenz nur eine Komplementarität aufweisen, die ausreichend ist, damit sie eine stabile Doppelstrang-Struktur bilden können. Abweichungen von einer vollständigen Komplementarität sind daher zulässig, so lange solche Abweichungen nicht dazu ausreichen, eine Hybridisierung zur Bildung einer Doppelstrangstruktur zu verhindern.
Die „Amplifikation", die durch die Verfahren der vorliegenden Erfindung erreicht wird, bezeichnet eine Zunahme in der Menge der in einem Reaktionsbehälter vorhandenen Nukleinsäuremoleküle. Eine „beträchtliche Amplifikation" bezieht sich auf eine Amplifikation um mehr als das 100 fache.
Die Nukleinsäuresequenz, die durch die Verfahren der vorliegenden Erfindung amplifiziert werden kann, kann eine DNA oder RNA sein. Ist die Sequenz anfänglich als DNA vorhanden, so muß eine solche DNA weder transkribiert noch translatiert werden. Die vorliegende Erfindung kann somit zur Identifikation und/oder zur Amplifikation nicht transkribierter DNA oder nicht translatierter DNA sowie auch einer DNA, die transkribiert oder translatiert ist, verwendet werden. Wenn die gewünschte Sequenz anfänglich in einem RNA-Molekül vorhanden ist, muß ebenso eine solche RNA nicht translatiert werden.
Die Moleküle, die amplifiziert werden können, umfassen jede natürlich vorkommenden prokaryotischen (zum Beispiel krankheitsauslösende oder nicht krankheitsauslösende Bakterien, Escherichia, Salmonella, Clostridium, Agrobacter, Staphylococcus und Streptomyces, Streptococcus, Rickettsiae, Chlamydia, Mycoplasma, usw.), eukaryotischen (zum Beispiel Protozoen und Parasiten, Pilze, Hefe, höhere Pflanzen, niedere und höhere Tiere, einschließlich Säugetiere und Menschen) oder viralen zum Beispiel Herpes Viren, HIV, Influenza Virus, Epstein-Barr Virus, Hepatitis Virus, Polio Virus, usw.) oder Viroid-Nukleinsäuren. Das Nukleinsäuremolekül kann ebenfalls jedes Nukleinsäuremolekül sein, das chemisch synthetisiert worden ist oder synthetisiert werden kann. Daher kann die Nukleinsäuresequenz in der Natur gefunden oder nicht gefunden werden. Zusammengefaßt sind die Verfahren der vorliegenden Erfindung in der Lage, jedes Nukleinsäuremolekül zu identifizieren oder zu amplifizieren und erfordern nicht, dass die zu amplifizierenden Moleküle irgendeine spezielle Sequenz oder einen speziellen Ursprung aufweisen.
Obwohl das Nukleinsäuremolekül, das amplifiziert werden soll, entweder in einer Doppelstrang- oder Einzelstrangform vorliegen kann, wird die Nukleinsäure, wenn sie am Beginn der Amplifikationsreaktion doppelsträngig ist, vorteilhafterweise zuerst behandelt, um die zwei Stränge in Einzelstrangform oder teilweise Einzelstrangform zu bringen. Es sind Verfahren zur Überführung von Doppelstrang-Nukleinsäuren in Einzelstrangnukleinsäuren oder teilweise Einzelstrangformen, wie zum Beispiel durch Erhitzen oder Alkalibehandlung oder durch enzymatische Verfahren (wie zum Beispiel durch die Wirkung von Helikase, usw.) oder durch Bindungsproteine usw. bekannt. Allgemeine Verfahren zum Ausführen dieser Behandlung werden von Sambrook, J. et al., in: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)) und von Haymes, B. D., et al. (in: Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985)) zur Verfügung gestellt, auf deren Offenbarungsgehalt hier vollumfänglich Bezug genommen wird.
Es ist bezeichnend, dass die Erfindung keine Einschränkungen in Bezug auf die Natur der zu bewertenden Probe macht. Solche Proben können zum Beispiel von einem Tier (wie zum Beispiel von einem Mensch oder einem anderen Säugetier) oder von einer Pflanze stammen, oder sie können synthetisch abgeleitet werden.
Insbesondere kann die Erfindung zur Identifizierung und Amplifizierung von Nukleinsäuremolekülen verwendet werden, die in Blut (und Blutprodukten, wie zum Beispiel Serum, Plasma, Blutplättchen), Stuhl, Sputum, Schleim, Serum, Urin, Speichel, Tränen, Biopsieproben, histologische Gewebsproben, PAP Abstriche und andere Vaginalabstriche, Hautabschabungen, Sperma, Muttermale, Warzen, usw. vorhanden sind. Sie kann entsprechend zur Identifizierung und Amplifzierung von Nukleinsäuremolekülen verwendet werden, die in pflanzlichem Gewebe vorhanden sind.
Die Nukleinsäuren solcher Proben können von jeglicher anderen Komponente, die auf natürliche Weise zu Probe gehört, vollständig ungereinigt, teilweise gereinigt oder vollständig gereinigt sein. Typischerweise wird die Probe jedoch zu einem Grad behandelt worden sein, der ausreicht, damit nicht dazu gehörende Materialien, entfernt sind, die ansonsten die Amplifikation der Nukleinsäuren stören könnten. Die Präparation von Nukleinsäuren von zum Beispiel einer Serumprobe kann im allgemeinen die folgenden Schritte umfassen: Inkubieren des Serums während 1 Stunde bei 70°C mit Proteinase K (Boehringer Mannheim) mit 2,5 mg/ml in 25 mM MOPS (pH-Wert 6,5), 2,5 mM EDTA und 0,5% SDS. Danach folgen die folgenden Extraktionen: Phenolextraktion und Etherextraktion. Danach folgt eine Ethanolfällung. Siehe zum Beispiel Larzul, et al. J. Heptol. 5: 199–204 (1987). Wie angemerkt ist, sind andere Protokolle und Techniken für eine solche Reinigung leicht verfügbar.
Da die Erfindung in Bezug auf die Natur der zu identifizierenden und/oder amplifizierenden Nukleinsäuresequenz keine Einschränkungen macht, ist die Erfindung in der Lage, Nukleinsäuremoleküle zu identifizieren, die natürlicherweise in der Probe vorgefunden werden (wie zum Beispiel Insulin mRNA-Sequenzen in pankreatischem β-Zellgewebe), sowie auch Sequenzen zu identifizieren, die durch die Erzeugung von einer tierischen oder pflanzlichen Quelle auf eine Krankheit hinweisen (zum Beispiel eine Gensequenz, die eine Hämoglobinhistopathologie kodiert, oder ein Onkogenprodukt, das ausschließlich oder vorzugsweise von neoplastischen Zellen expri miert wird). Überdies kann die Erfindung jedoch ebenfalls zur Bestimmung verwendet werden, ob Gensequenzen von krankheitsauslösenden Bakterien, Schimmel, Pilzen oder Viren in einer Gewebeprobe vorhanden sind.
Daher können die Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Diagnose einer Krankheit oder zum Nachweis der Herkunft und Identität, sowie zur Bewertung der Reinheit von Agrarprodukten (Milch, verarbeitete Nahrungsmittel, usw.) Abwasser, Trinkwasser, Luft, usw. verwendet werden.
Besonders bevorzugt werden die zu amplifizierenden RNA- oder DNA-Sequenzen über eine DNA-Polymerase oder eine reverse Transkriptase zur Bildung eines DNA-Amplifikationsprodukts amplifiziert, jedoch kann in Ausführungsformen, in denen ein RNA-Amplifikationsprodukt erwünscht ist, eine RNA-Polymerase verwendet werden. Eine „Polymerase" ist ein Enzym, das in der Lage ist, Nukleotidtriphosphate zur Verlängerung einer 3' Hydroxylgruppe eines Nukleinsäuremoleküls einzubauen, falls dieses Molekül an ein geeignetes Templatnukleinsäuremolekül hybridisiert hat. Ein Oligonukleotid oder Polynukleotid, dessen 3' Ende durch eine Polymerase verlängert werden kann, ist ein „Primer".
Da DNA-Polymerasen Nukleinsäuremoleküle in 5' 3' Richtung polymerisieren, verlängern sie folglich das 3' Ende eines komplementären Primers auf „templatabhängige Weise". Wie hier verwendet wird, bezieht sich der Ausdruck „templatabhängige Weise" auf eine RNA- oder DNA-Nukleinsäuresynthese, wobei die Sequenz des neu synthetisierten Nukleinsäurestrangs durch die komplementäre Basenpaarung vorgeschrieben ist. In einer solchen Reaktion dient das Zielmolekül als ein „Templat" zur Verlängerung des Primers derart, dass das Primerverlängerungsprodukt eine Sequenz aufweist, die zu derjenigen des Templats komplementär ist. Eine solche Polymerisation erfordert typischerweise das Vorhandensein von Nukleotidtriphosphaten („dNTP"), das heißt, Desoxyadenosin-5'-triphosphat („dATP"), Desoxycytidin-5'-triphosphat („dCTP"), Desoxyguanosin-5'-triphosphat („dGTP") und Desoxythymidin-5'-triphosphat (typischerweise mit „TTP" abgekürzt, jedoch wird es hier zum Zwecke der Konsistenz mit „DTTP" abgekürzt). Nukleosidtriphosphatanaloga, usw. (Piccirilli, J. A. et al., Nature 343: 33–37 (1990) kann an die vorstehend spezifizierten Verbindungen substituiert oder addiert werden, vorausgesetzt, dass die Basenpaarung, Polymerase- und Strangverdrängungsfunktionen nicht derart beeinflusst werden, dass die Amplifikation nicht bis zu dem erwünschten Ausmaß verläuft. Insbesondere können Desoxyinosintriphosphate (dl) und Dexoxyuridintriphosphate (dUTP) verwendet werden.
Polymeraseenzyme werden in Watson, J. D., in: Molecular Biology of the Gene, 4. Ausgabe, W. A. Benjamin, Inc., Menlo Park, CA (1987), auf dessen Offenbarungsgehalt hier vollumfänglich Bezug genommen wird, und ähnlichen Texten besprochen. Beispiele geeigneter DNA-Polymerasen umfassen das große proteolytische Fragment der DNA-Polymerase 1 des Bakteriums E. coli, das im allgemeinen als „Klenow" Polymerase bekannt ist, E. coli DNA-Polymerase 1 und die Bakteriophagen T7 DNA-Polymerase.
Auf Wunsch können „wärmebeständige Enzyme" verwendet werden. Entsprechend der Verwendung hier, ist ein „wärmebeständiges Enzym" ein Enzym, das eine Reaktion bei Temperaturen zwischen ungefähr 50°C bis ungefähr 100°C katalysieren kann. Beispielhafte wärmebeständige Polymerasen sind in der europäischen Patentanmeldung 0258017 beschrieben, auf deren Offenbarungsgehalt hier vollumfänglich Bezug genommen wird. Die wärmebeständige „Tag" DNA-Polymerase ist von Cetus, Corp. beziehbar.
Beispiele geeigneter RAN-Polymerasen umfassen E. coli RNA-Polymerase, T7 RNA-Polymerase, usw. Reverse Transkriptasen werden von Sambrook, J. et al. (in: Molecular Cloning: A Laboraton Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)) und von Noonan, K. F. et al. (Nucleic Acids Res. 16: 10366 (1988)) diskutiert.
Die Ausführungsformen der offenbarten Verfahren erfordern ein Verknüpfungsereignis, um die Amplifikation der gewünschten Sequenz zu erreichen. Zum Zwecke der Identifikation einer speziellen Nukleinsäuresequenz ist jedoch ein gleichwertig bedeutendes Ziel, dass das Probenmaterial nicht amplifiziert wird. Das heißt, für die Identifikation von zum Beispiel einer spezifischen Mutation einer einzelnen Base sind zwei Oligonukleotideinheiten, die eine zu der nicht mutierten Version der Zielsequenz komplementäre Sequenz aufweisen und so ausgelegt sind, dass sie die Mutations region flankieren, einem Verknüpfungsereignis nicht zugänglich, wenn die Zielsequenz die Einzelbasenmutation enthält. Somit kann in dem vorangegangenen nicht einschränkenden Beispiel die Abwesenheit von Amplifikation als ein Indikator für das Vorhandensein einer Mutation gesehen werden. Wie offensichtlich ist, kann die offenbarte Erfindung unter anderem zum Amplifizieren einer Zielsequenz und/oder zum Identifizieren des Vorhandenseins einer Zielsequenz verwendet werden.
Die für die Amplifikation des gewünschten Moleküls benötigte Verknüpfungsreaktion wird besonders bevorzugt ein „Ligase" Enzym anwenden, das in der Lage ist, das 3' Ende eines Oligonukleotids mit dem 5' PO₄ Ende eines zweiten Oligonukleotids zu verbinden. Die Kinetik einer derartigen Verknüpfung wird stark erhöht, wenn das Verknüpfungssubstrat doppelsträngig ist (wie es der Fall ist, wenn beide Oligonukleotide an dasselbe Ziel-DNA- oder Ziel-RNA-Molekül hybridisiert sind). Signifikanterweise kann eine Ligase zwei Oligonukleotide nicht verbinden, die bei der Hybridisierung an ihr entsprechendes Zielmolekül nicht aneinander grenzende Enden aufweisen. Obwohl eine Ligase einen „Bruch" in einem Strang „reparieren" kann, kann sie daher nicht eine „Lücke" „auffüllen". In alternativen Ausführungsformen können nicht enzymatische Verknüpfungsverfahren, wie zum Beispiel chemische Reaktionen, photochemische Reaktionen (zum Beispiel Photokopplung; siehe zum Beispiel die PCT Patentanmeldung WO 90/01069, auf deren Offenbarungsgehalt hier vollumfänglich Bezug genommen wird), thermochemische, Redoxreaktionen, usw. verwendet werden.
Für die Ziele der vorliegenden Erfindung ist es vorteilhaft, dass die Kinetik, mit der eine Ligase die Verknüpfung zweier Oligonukleotide vermitteln kann, stark erhöht ist, wenn die zu verbindenden Enden eine richtige Basenpaarung mit dem Zielmolekül aufweisen. Obwohl die Verknüpfung bei Enden mit fehlender Übereinstimmung stattfinden kann, ist daher die Leistungsfähigkeit einer solchen Verknüpfung signifikant geringer, als diejenige von Oligonukleotiden, die Enden mit richtiger Basenpaarung aufweisen. Bevorzugte Ligasen umfassen E. coli Ligase, T4 Ligase und T7 Ligase (Life Technologies, Inc. Gaithersburg, MD). Auf Wunsch können wärmebeständige Ligasen verwendet werden, wie zum Beispiel die in der PCT Patentanmeldung WO 91/17239 beschriebenen, auf deren Offenbarungsgehalt hier vollumfänglich Bezug genommen wird.
Alle Enzyme, die in den Amplifikationsreaktionen der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können in Gegenwart eines geeigneten Puffers derart kombiniert werden, daß das Amplifikationsverfahren der vorliegenden Erfindung in einem einzelnen Reaktionsvolumen ohne Veränderung der Bedingungen, wie zum Beispiel die Zugabe von Reaktanden, durchgeführt werden kann.
Die ERA Reaktion findet vorzugsweise in einer gepufferten wässrigen Lösung statt, die vorzugsweise einen pH-Wert zwischen ungefähr 6,0 und ungefähr 9,0 aufweist. Der Reaktionspuffer umfaßt vorzugsweise verschiedene Komponenten, die das wirksame und spezifische zyklische Durchlaufen der ERA Reaktion gestatten. Eine besonders bevorzugte Pufferlösung ist 20 mM Trishydroxymethylaminomethansalzsäure („Tris-HCl"), pH-Wert 7,8. Zu dem Reaktionspuffer werden vorzugsweise zusätzliche Materialen gegeben; diese Materialien werden so ausgewählt, dass das zyklische Durchlaufen der Reaktion mit großer Leistungsfähigkeit (zum Beispiel ist die höchste Produktmenge pro Zielmolekül vorzugsweise größer als das 2x, bevorzugter x^y und besonders bevorzugt ungefähr x², wobei x die Zahl der Zieltemplate ist, die während jedem Zyklus verfügbar sind, und Y größer als 1,0 aber weniger als ungefähr 2 ist) und großer Spezifität erfolgt (das heißt, die Richtigkeit der Genauigkeit der Ligase- und Polymeraseenzyme, wobei „Polymerasegenauigkeit" als die Priorität des Enzyms zum Einbau des richtigen Nukleotids definiert ist, und die „Ligasegenauigkeit" dadurch definiert ist, dass die Ligaseaktivität durch die Bruchschließungsaktivität eingeschränkt ist, zum Beispiel die Verknüpfung zweier komplementärer Oligonukleotideinheiten, die zueinander benachbart sind, wenn sie an eine Zielsequenz hybridisiert werden); der Verfahrensablauf wird maximiert; die katalytische Stabilität des Enzyms (der Enzyme) wird aufrechterhalten und die Reaktionsstabilität (das heißt die Reaktionskomponenten werden in Lösung gehalten; unspezifische Aktivität wird verringert; Haftung der Reaktionskomponenten an der Oberfläche des Reaktionsbehälters wird minimiert, usw.) wird aufrechterhalten. Für das hier offenbarte ERA Protokoll wurde festgestellt, dass die folgenden Komponenten und Mengen (Endkonzentration) diese Ziele erreichen: 20 mM Kaliumchlorid; 2,0 mM Magnesiumchlorid; 5,0 mM Dithiothreitol („DTT"); 50 um Nicotinamidadenindinukleotid („NAD⁺"); 50 μg/ml Rinderserumalbumin und 0,1% eines nicht ionischen Detergenz (zum Beispiel Triton × 100^TM). Diese Materialien können in Abhängigkeit von den verwendeten spe zischen Enzymen leicht variiert und angepasst werden; dem Fachmann wird zugetraut, dass er solche Materialien leicht auswählen und optimieren kann.
Andere Materialien, wie zum Beispiel Konservierungsstoffe und dergleichen können optional zu dem Reaktionspuffer gegeben werden. Es wird besonders bevorzugt, dass zweifach entionisiertes Wasser zum Erreichen eines gewünschten Endvolumens des Reaktionspuffers verwendet wird.
Die Temperatur des Behälters wird typischerweise zwischen ungefähr 30°C und 90 °C, besonders bevorzugt bei ungefähr 65°C gehalten. Wird von der Denaturierung durch Wärme Gebrauch gemacht, so kann die Temperatur während des Denaturierungsschritts auf einen Wert oberhalb dieser Werte erhöht werden. Wird von der Denaturierung durch Wärme Gebrauch gemacht (wie bevorzugt wird), werden vorzugsweise Temperaturwechsler verwendet, die in der Lage sind, in dem Reaktionsbehälter eine Umgebung mit einer Temperatur zur Verfügung zu stellen, die innerhalb eines zyklischen Bereichs von Temperaturen geregelt ist. Ein Beispiel dafür ist der Perkin Elmer 480^TM Temperaturwechsler.
Obwohl dieses Verfahren auf molekularer Ebene mehrere Schritte aufweist, kann es im Betrieb einen einzigen Schritt aufweisen. Sobald die Reaktanden zusammengemischt sind, braucht man weder etwas hinzuzufügen noch die Bedingungen zu verändern, bis die Amplifikationsreaktion eine oder mehrere Komponenten verbraucht hat. Während dieser Zeit wird die Nukleinsäuresequenz, die amplifiziert wird, um ein Vielfaches zugenommen haben. Der Gehalt der Zunahme wird für viele Zwecke ausreichend sein; jedoch kann für manche Zwecke die Reaktion mit frischen Komponenten wiederholt werden müssen, um einen höheren gewünschten Amplifikationsgrad zu erhalten.
II. „ERA:" Die „End-Run-Amplifikations"-Reaktion
In ihrer einfachsten Ausführungsform verwendet das Verfahren der vorliegenden Erfindung drei Oligonukleotide zur Amplifikation der Zielsequenz. Das erste und zweite dieser Oligonukleotide ist so ausgelegt, dass ihre Sequenzen zu einem Teil der Zielsequenz komplementär sind. Das dritte Oligonukleotid ist so ausgelegt, dass es in der Lage ist, an ein Nukleinsäuremolekül zu hybridisieren, das die Sequenz des zweiten Oligonukleotids aufweist. Das erste Oligonukleotid (in den Figuren mit „C" bezeichnet) wird als das „Primer-Oligonukleotid" bezeichnet. Das zweite Oligonukleotid (in den Figuren mit „B" bezeichnet) wird als das „Blockierungs-Oligonukleotid" bezeichnet. Das dritte Oligonukleotid (in den Figuren mit „A" bezeichnet) wird als „End-Run-Oligonukleotid"-Primer bezeichnet. Die Art und Strukturen dieser Oligonukleotide wird nachstehend genau diskutiert. Auf Wunsch kann mehr als ein Satz von Blockierungs-Oligonukleotiden, Primer-Oligonukleotiden und/oder End-Run-Oligonukleotiden verwendet werden, vorausgesetzt diese sind in der Lage, verschiedene spezifische Nukleinsäuresequenz(en) zu amplifizieren.
Im allgemeinen umfassen die Oligonukleotide jedoch jedes beliebige synthetische, halb-synthetische oder natürliche Nukleinsäurefragment oder jede beliebige chemische Einheit, die in der Lage ist, an eine spezifische Nukleinsäuresequenz in einer spezifischen Art zu binden und als ein Substrat, zum Beispiel für eine Verlängerungsreaktion oder für ein Verknüpfungsereignis zu dienen; beispielhafte chemische Einheiten sind die sogenannten „Peptidnukleinsäuren" (siehe Egholm, M. et al., J. Am. Chem. Soc. 114: 1895–1897 (1992) und Nielsen, P. E. et al., Science 254: 1497–1500 (1991), auf deren Offenbarungsgehalt hier vollumfänglich Bezug genommen wird). Ein Oligonukleotid umfaßt typischerweise weniger als 150 Nukleotide und/oder chemische Einheiten. Die Nukleinsäure kann eine Desoxyribonukleinsäure, Desoxyribonukleinsäurederivate, Ribonukleinsäure oder Ribonukleinsäurederivate sein.
Blockierungs-, Primer- und End-Run-Oligonukleotide können unter Verwendung eines beliebigen geeigneten Verfahrens unter Verwendung von zum Beispiel den in Beaucage, S. et al., Tetrahedron Letters 22: 1859–1862 (1981) beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Zur Erzeugung von Oligonukleotideinheiten werden handelsübliche Geräte bevorzugt, da diese weithin verwendet werden und typischerweise zeit- und kostengünstig sind. Beispielhafte Geräte, die zur Erzeugung definierter Oligonukleotide in der Lage sind umfassen, sind aber nicht beschränkt auf den OLIGO 1000^TM (Beckman Instruments, Inc., Fullerton, CA); Gene Assembler^TM (Pharmacia, Uppsala, Schweden), Biosearch 8750^TM (Milligen Biosearch, San Rafael, CA) und den ABI PCR Mate^TM (ABE, Foster City, CA).
Ein beliebiges oder alle Oligonukleotide können für viele Zwecke markiert werden, es ist wünschenswert, dass mindestens eines der Oligonukleotide markiert ist. Zusätzlich können die dNTPs markiert werden. Bei Markierung des Blockierungs-Oligonukleotids kann vorteilhafterweise die Markierung an dessen 3' Stelle so konjugiert werden, dass das Blockierungs-Oliognukleotid mit dem Ziel hybridisieren kann, wobei eine Verlängerung von dessen 3' Ende nicht möglich ist; der Grund dafür wird nachstehend beschrieben. Alternativ dazu kann das 5' Ende des End-Run-Oligonukleotids markiert werden. Beispielhafte Markierungsprotokolle sind gut bekannt, siehe, zum Beispiel die europäische Patentanmeldung 292128, auf deren Offenbarungsgehalt hier vollumfänglich Bezug genommen wird.
Solche Markierungen können entweder den direkten Schnellnachweis oder den indirekten Nachweis und/oder das Auffangen des amplifizierten Produkts erleichtern. Weiterhin können zwei der Einheiten derart Teil einer Einheitsstruktur sein, dass in der Amplifikationsreaktion nur zwei Oligonukleotideinheiten verwendet werden. Wie hier verwendet wird, erzeugt eine direkt nachweisbare Markierung ein Signal, das entweder direkt oder durch dessen Wechselwirkung mit einer Substanz, wie zum Beispiel ein Substrat (im Fall eines Enzyms), einer Lichtquelle (im Fall einer Fluoreszenzverbindung) oder einem Photovervielfacher (im Fall einer radioaktiven oder Chemolumineszenzverbindung) nachweisbar ist.
Beispiele bevorzugter direkter Markierungen umfassen Radiosiotopmarkierungen, zum Beispiel die Verwendung von Oligonukleotiden mit eingebautem ³²P, ³⁵S, ¹²⁵I, ³H und ¹⁴C. Eine besonders bevorzugte Methode zur direkten Markierung von Oligonukleotiden ist die „Endmarkierungs-" Methode, wobei T4 Polynukleotidkinase zur Einführung einer Markierung in das 5' Ende des Oligonukleotids verwendet wird (siehe zum Beispiel Richardson, C. C., The Enzymes, Bd. XIV, Nucleic Acids Part A, Hrsg. Boyer, P. D., Acad. Press, S. 299 (1981)). Alternativ dazu kann endständige Desoxynukleotidyltransferase zum Hinzufügen einer Reihe bereitgestellter Desoxynukleotiden an das 3' Ende des Oligonukleotids verwendet werden; es können ebenfalls Markierungsverfahren für ein einzelnes Nukleotid verwendet werden (siehe zum Beispiel Bollum, F. J. The Enzymes, Bd. X, Hrsg. Boyer, P. D. Acad. Press, (1974); Yousaf, S. I. et al., Gene 27: 209 (1984) und Wahl, G. M. et al. Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A.) 76: 3683–3687 (1979). Es können ebenfalls markierte ddNTPs, zum Beispiel [α³²P] ddATP verwendet werden.
In einer Forschungsumgebung, in der die Zielamplifikation nicht immer auf fortlaufender Basis durchgeführt wird, kann die Verwendung von radioaktiven Markierungen bevorzugt sein. In einer Umgebung, in der keine Forschung durchgeführt wird, zum Beispiel in einem klinischen Aufbau, kann es sein, dass solche Markierungen aufgrund von Entsorgungsproblemen und verwandten Risiken, die mit der fortlaufenden Aussetzung gegenüber radioaktiven Markierungen zusammenhängen, nicht bevorzugt sind. In diesen Aufbauten können daher indirekte Markierungen bevorzugt sein. Eine Markierung, die indirekt nachweisbar ist, liefert nicht selbst oder von sich selbst ein nachweisbares Signal, jedoch kann sie zur Identifizierung eines Oligonukleotids verwendet werden, an das die indirekt nachweisbare Markierung gebunden ist. Beispiele von indirekt nachweisbaren Markierungen umfassen Biotin, Antikörper, Enzyme, Ferritin, Antigene, Haptene usw, wenn sie an dNTP oder ddNTP konjugiert werden. Bevorzugte nicht radioaktive direkte Markierungen, die Fluorescein-11-dUTP (siehe Simmonds, A. C. et al Clin. Chem. 37: 1527–1528 (1991), auf dessen Offenbarungsgehalt hier vollumfänglich Bezug genommen wird) und Digoxigenin-11 dUTP (siehe Muhlegger, K. et al. Nucleosides & Nucleotides 8: 1161–1163 (1989), auf dessen Offenbarungsgehalt hier vollumfänglich Bezug genommen wird, umfassen, können als Markierungen verwendet werden. Weiterhin können nicht radioaktiv markierte Oligonukleotide verwendet werden (siehe zum Beispiel Adams, C. W., PCT Patent Anmeldung WO 91/19729), auf deren Offenbarungsgehalt hier vollumfänglich Bezug genommen wird. Ein Nachweisschema, das solche Haptenmarkierungen betrifft, umfasst die Verwendung von Antikörpern an dem Hapten, wobei die Antikörper markiert sind.
Biotin ist eine besonders bevorzugte indirekte Markierung, wobei der Nachweis von biotinylierten Nukleinsäuremolekülen unter Verwendung von markiertem oder unlöslich gemachtem Avidin, Strepatavidin, Antibiotin Antikörpern, usw. ausgeführt wird. Biotinylierte Moleküle können ebenfalls leicht von nicht biotinylierten Molekülen getrennt werden, indem die Moleküle mit unlöslichem oder immobilisiertem Avidin in Kontakt gebracht werden.
In dieser Hinsicht kann zum Beispiel Biotin-11-dUTP anstatt von dTTP, oder Biotin-14-dATP anstatt von dATP verwendet werden (siehe allgemein Langer, P. R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 78: 6633–6637 (1981), auf dessen Offenbarungsgehalt hier vollumfänglich Bezug genommen wird). Biotinylierte Phosphoramidite können ebenfalls verwendet werden (Misiura, K. et al. Nucl. Acids. Res. 18: 4345–4354 (1990), auf dessen Offenbarungsgehalt hier vollumfänglich Bezug genommen wird. Solche Phosphoramidite gestatten deren genauen Einbau an den gewünschten Stellen längs der wachsenden Oligonukleotideinheit während deren Synthese.
Chemolumineszenzsubstrate können ebenfalls als indirekte Markierung verwendet werden. Es können Enzyme verwendet werden, wie zum Beispiel Meerrettichperoxidase („HRP"), alkalische Phosphatase („AP"), usw., die direkt an Nukleinsäuren vernetzt werden (siehe Renz, M. und Kurz, C. Nucl. Acids Res. 12: 3435–3444 (1964), auf dessen Offenbarungsgehalt hier vollumfänglich Bezug genommen wird). Luminal, ein Substrat für HRP und substituierte Dioxetane, Substrate für AP, können als Chemolumineszenzsubstrate verwendet werden. Ein Beispiel für das HRP Markierungsprotokoll ist das von Amersham (Arlington Heights, Illinois, USA) erhältliche ECL System.
Ein weiteres Mittel zum Nachweis eines amplifizierten Produkts umfaßt die Verwendung von Nukleinsonden, die zu dem amplifizierten Produkt komplementär sind. Für diese Art des Nachweises ist keine Markierung der Oligonukleotideinheiten notwendig. Ist das Ziel vorhanden, wird dessen Amplifikation in Mengen des Ziels resultieren, die ausreichen, damit die markierten Nukleinsonden zum Nachweis verwendet werden können. Es können einzelne Sonden, die direkt oder indirekt nachweisbare Markierungen umfassen, oder Mehrfachsonden, die eine direkt oder indirekt nachweisbare Markierung umfassen, und Einfangeinheiten verwendet werden. Siehe zum Beispiel die U.S. Patentanmeldung mit dem amtlichen Aktenzeichen 07/576,137 „Solution Phase Nucleic Acid Hybridization and Solid Phase Capture For Detection of Target Nucleic Acid, and Kit Therefore", auf deren Offenbarungsgehalt hier vollumfänglich Bezug genommen wird.
Anstelle von direkten oder indirekten Markierungen kann eine Proximitätsmarkierung verwendet werden. Eine derartige Markierung ist eine chemische Einheit, die nur in Gegenwart einer zweiten Markierung, die mit ihr wechselwirkt, ein Signal erzeugt. Eine erste Proximitätsmarkierung wird typischerweise in Kombination mit einer entsprechenden zweiten Proximitätsmarkierung verwendet.
Die Moleküle der Reaktanden werden entsprechend den nachstehend beschriebenen Verfahren zur Erzeugung des Amplifikationsprodukts verwendet. Das Amplifikationsprodukt wird typischerweise doppelsträngig sein und umfaßt sowohl die gewünschte Sequenz, als auch deren Komplement. Es ist bezeichnend, dass, abhängig von den Sequenzen der Blockierungs- und der End-Run-Oligonukleotide, es möglich ist, Doppelstrangmoleküle zu erzeugen, die zueinander vollständig komplementär sind oder die nicht komplementäre Regionen aufweisen. Es ist weiterhin möglich, Doppelstrangmoleküle zu erzeugen, die entweder ein herausragendes 3' Ende oder ein herausragendes 5' Ende aufweisen.
Ist die Herstellung einer Nukleinsäure gewünscht, die die gewünschte Sequenz enthält, ohne dass ein komplementäres Nukleinsäuremolekül hergestellt wird, können die Verfahren der vorliegenden Erfindung entsprechend nachstehender Ausführung so angepasst werden, dass nur solche Einzelstrangmoleküle erzeugt werden.
A. Das „Primer-Oligonukleotid" der vorliegenden Erfindung
Das erste Oligonukleotid der Erfindung, das heißt das „Primer-Oligonukleotid", ist ein Primermolekül und muß daher ein 3' Ende besitzen, das durch eine DNA-Polymerase verlängert werden kann. Das Oligonukleotid kann von beliebiger Länge im Bereich von ungefähr 5 bis zu mehreren hundert Nukleotiden sein. Das Primer-Oligonukleotid wird vorzugsweise eine Länge von mehr als 10 Nukleotiden und bevorzugter eine Länge von ungefähr 12–50 Nukleotiden aufweisen. Die Länge des Primer-Oligonukleotids muß ausreichen, um dem Primer-Oligonukleotid zu gestatten, dass es zur Hybridisierung an das Zielmolekül in der Lage ist.
Die Sequenz des Primer-Oligonukleotids wird so ausgewählt, dass sie zu einer vorbestimmten Sequenz des Zielmoleküls komplementär ist. Diese vorbestimmte Sequenz kann eine vorher bestimmte Sequenz sein (wie zum Beispiel ein Gen, eine Regulationssequenz, usw.) oder sie kann eine hypothetische Sequenz sein (wie zum Beispiel die Erkennungsstelle einer Restriktionsendonuklease, eine Kombination solcher Stellen, usw.).
Die Zielsequenz ist vorzugsweise ein Teil einer kodierenden Region in einem Gen, die mit einer genetischen Krankheit zusammenhängt, und die Primer-Oligonukleotidsequenz wird so ausgewählt, dass deren Verlängerung eine gewünschte Sequenz bildet, die die genetische Mutation enthält, die die Krankheit charakterisiert. Wie nachstehend beschrieben ist, ist es durch eine geeignete Kontrolle der Sequenzen der Oligonukleotide der vorliegenden Erfindung möglich, eine genetische Krankheit in Personen zu diagnostizieren oder vorherzusagen, deren Gensequenzen sich um einige wenige Nukleotide von den entsprechenden Sequenzen der Personen unterschieden, die diese Krankheit nicht haben.
In den grundlegenderen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung bestimmt die Sequenz des Primer-Oligonukleotids der Erfindung die Sequenz von einem Ende des Amplifikationsprodukts, das durch die Erfindung erhalten wird. Wird somit das Primer-Oligonukleotid so ausgewählt, dass es zu einer gewünschten Sequenz komplementär ist, so gestatten die Verfahren der vorliegenden Erfindung die Amplifikation dieser Gensequenz. Ist entsprechend die Primer-Oligonukleotidsequenz zu einer Restriktionsstelle, einer Kombination von Restriktionsstellen, einer Promotorstelle oder zu einer Regulationsproteinbindungsstelle komplementär, so erlauben die Verfahren der Erfindung die Amplifikation der Zielsequenzen, die diese Stellen enthalten. In einer alternativen Ausführungsform („blinde ERA") erlauben daher die Verfahren der vorliegenden Erfindung zum Beispiel die Amplifikation aller Promotorsequenzen, die zusätzlich Schilddrüsenhormonbindungsstellen enthalten.
B. Das „Blockierungs-Oligonukleotid" der vorliegenden Erfindung
Das zweite Oligonukleotid der Erfindung, das heißt das „Blockierungs-Oligonukleotid" kann von beliebiger Länge sein und ist so ausgewählt, dass es zu einem Teil eines Zielmoleküls komplementär ist. Obwohl es für die Ausführung der vorliegenden Erfindung nicht wesentlich ist, ist in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung das Blockierungs-Oligonukleotid im wesentlichen nicht in der Lage, als Primer zu dienen. Das 3' Ende des Blockierungs-Oligonukleotids ist daher vorzugsweise so modifiziert, dass es eine „Blockierungsgruppe" enthält. Jede Verbindung, die dieses Ziel erreicht, kann als „Blockierungsgruppe" dienen". Beispielhafte Blockierungsgruppen sind Biotin, Didesoxynukleotidtriphosphate („ddNTPs"), die ebenfalls als „Ketten beendende" ddNTPs bezeichnet werden. In mehreren nachstehend diskutierten bevorzugten Ausführungsformen ist die Blockierungsgruppe nachweisbar markiert. Weiterhin ist es möglich, ein Blockierungs-Oligonukleotid zu verwenden, das über den Verknüpfungspunkt mit dem Primer-Oligonukleotid „hängt", so dass zum Beispiel das Blockierungs-Oligonukleotid einer „zurück geschleuderten" Reaktion zugänglich ist (siehe zum Beispiel Holland et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88: 7276–7280 (1991)).
Das Blockierungs-Oligonukleotid weist vorzugsweise zwischen ungefähr 10 bis ungefähr 40 Nukleotiden, bevorzugter zwischen ungefähr 15 und ungefähr 35 Nukleotiden und besonders bevorzugt ungefähr 23 Nukleotide auf. Das Blockierungs-Oligonukleotid kann jedoch eine so kleine Länge wie von zwei Nukleotiden aufweisen (wobei das Nukleotid am 3' Ende eine Blockierungseinheit umfaßt); daher kann die Länge des Blockierungs-Oligonukleotids in Abhängigkeit von den experimentellen Bedürfnissen der untersuchenden Person und dem Erkennen, dass bei Abnehmendem „T_m" die Länge abnimmt (das heißt eine bevorzugte Hybridisierung kann nicht sichergestellt werden), variieren. „T_m" ist die Temperatur, bei der 50% der Basenpaarung zwischen zwei Strängen einer Nukleinsäure gespalten wird. T_m ist eine Funktion der Länge einer Einzelstrang-DNA und deren Basenzusammensetzung. Im allgemeinen ist für kurze Oligonukleotideinheiten (das heißt weniger als ungefähr 25 Nukleotide) ein Näherungswert von T_m gleich dem 4 fachen der Zahl der G/C Basenpaare plus 2 mal die Zahl der A/T Basenpaare (das heißt 4(G/C) + 2(A/T)).
Alternativ dazu kann die Länge und/oder Sequenz des Blockierungs-Oligonukleotids so angepasst werden, dass der T_m Wert des Blockierungs-Oligonukleotids zwischen ungefähr 37°C und ungefähr 98°C, bevorzugter zwischen ungefähr 70°C und ungefähr 90°C und besonders bevorzugt bei ungefähr 85°C liegt.
Die Primer-Oligonukleotideinheit ist so ausgelegt, dass sie stromaufwärts des Blockierungs-Oligonukleotids hybridisiert (das heißt, in einer solchen Ausrichtung, dass das 3' Ende des Primer-Oligonukleotids an das 5' Ende des Blockierungs- Oligonukleotids angrenzt oder verlängert werden kann, damit es an das 5' Ende des Blockierungs-Olignokleotids angrenzt, wenn beide Moleküle an (denselben Strang des) Zielmoleküls hybridisiert werden. In einigen Ausführungsformen der Erfindung ist das 5' Ende des Blockierungs-Oligonukleotids so ausgelegt, dass bei Hybridisierung das 5' endständige Nukleotid des Blockierungs-Oligonukleotids einer vorbestimmten Stelle in einem anderen Nukleinsäuremolekül „gegenüberliegt". Wie hier verwendet wird, liegt ein Nukleotid eines hybridisierten Oligonukleotids einem anderen Nukleotid „gegenüber", wenn die zwei Nukleotide in dem hybridisierten Produkt einander gegenüberliegen (das heißt, sie sind so positioniert, dass sie miteinander eine Basenpaarung eingehen würden, wenn sie komplementär wären). Eine zweite Funktion des Blockierungs-Oligonukleotids ist es, die Verlängerung des 3' Ende des „Primer-Oligonukleotids" bis hinter das 5' Ende des Blockierungs-Oligonukleotids zu blockieren.
Das blockierte 3' Ende des Blockierungs-Oligonukleotids definiert das 3' Ende von einem Strang des Amplifikationsprodukts. Das 3' Ende des Blockierungs-Oligonukleotids wird typischerweise in der Lage sein, an das Zielmolekül zu hybridisieren. Wie das 5' Ende des End-Run-Oligonukleotids, braucht das 3' Ende des Blockierungs-Oligonukleotids jedoch nicht zu einer solchen Hybridisierung in der Lage zu sein. Daher kann eines von beiden oder beide dieser Enden so ausgelegt werden, dass sie andere erwünschten Nukleinsäuresequenzen enthalten, wie zum Beispiel Restriktionsstellen, Bindungssequenzen, usw.
Wurde die Sequenz des Zielmoleküls vorher bestimmt, ist es möglich die Primer- und Blockierungs-Oligonukleotide so auszulegen, dass bei Hybridisierung an das Zielmolekül das 3' Ende des Primer-Oligonukleotids und das 5' Ende des Blockierungs- Oligonukleotids aneinander angrenzen. In dieser Ausführungsform kann zwischen den Blockierungs- und Primer-Oligonukleotiden ein Verknüpfungsereignis stattfinden, ohne dass eine Primerverlängerung stattfinden muß.
Bezeichnenderweise ist eine derartige a priori Zielsequenzinformation nicht erforderlich. Die Zielsequenz kann daher teilweise oder vollständig undefiniert sein. In dieser Ausführungsform sind die Primer- und Blockierungs-Oligonukleotide so ausgelegt, dass bei Hybridisierung an das Zielmolekül das 3' Ende des Primer-Oligonukleotids und das 5' Ende des Blockierungs-Oligonukleotids durch eine „Lücke" getrennt sind (die entweder bekannte oder unbekannte Sequenzen oder eine Kombination von bekannten und unbekannten Sequenzen enthält). Eine solche Lücke kann eine Länge von 1 bis ungefähr 10000 Nukleotiden aufweisen. In einer derartigen Ausführungsform findet eine Verknüpfung nicht statt, außer die „Lücke" ist „aufgefüllt", vorzugsweise durch die Polymerase vermittelte templatabhängige Verlängerung des 3' Endes des Primer-Oligonukleotids, bis ein solches Ende das 5' Ende des Blockierungs-Oligonukleotids erreicht; an dieser Stelle kann ein Verknüpfungsereignis zwischen dem Blockierungs-Oligonukleotid und dem verlängerten Primer-Oligonukleotid stattfinden. 1 (Doppelstrang-Ziel) und 5 (Einzelstrang-Ziel) erläutern die relativen Anordnungen der Blockierungs- und Primer-Oligonukleotide in der ERA Ausführungsform, in der die Oligonukleotide aneinandergrenzen. 2 (Doppelstrang-Ziel) und 6 (Einzelstrang-Ziel) erläutern die relativen Anordnungen von Blockierungs- und Primer-Oligonukleotiden in der ERA Ausführungsform, in der die Oligonukleotide durch eine Lücke getrennt sind.
Zur Herstellung der gewünschten Amplifikation in Abhängigkeit von der Verknüpfung des Blockierungs-Oligonukleotids und des Primer-Oligonukleotids (oder dessen Verlängerungsprodukts) ist es unentbehrlich, dass das Blockierungs-Oligonukleotid an eine Zielsequenz hybridisiert, bevor das Primer-Oligonukleotid oder bevor das Primerverlängerungsprodukt zu einer Stelle hin verlängert worden ist, die jenseits der Stelle liegt, an die das 5' Ende des Blockierungs-Oligonukleotids hybridisieren kann. Tritt irgendeines dieser Ereignisse zuerst auf, so kann das hybridisierte Primer-Oligonukleotid längs der Region des Ziels verlängert werden, an die das Blockierungs-Oligonukleotid ansonsten hybridisieren würde, und sogar in Abwesenheit eines Verknüpfungsereignisses würde ein falsch-positiver Nachweis und Amplifikation resultieren.
Damit dieses Szenario vermieden werden kann, wird bevorzugt, dass die Länge des Primer-Oligonukeotids ungefähr weniger als 75% der Länge des Blockierungs-Oligonukleotids, bevorzugter weniger als ungefähr 60% der Länge des Blockierungs-Oligonukleotids und besonders bevorzugt weniger als ungefähr 50% der Länge des Blockierungs-Oligonukleotids beträgt. Alternativ dazu wird bevorzugt, dass die T_m des Primer-Oligonukleotids weniger als ungefähr 75% der T_m des Blockie rungs-Oligonukleotids, bevorzugter weniger als ungefähr 60% der T_m des Blockierungs-Oligonukleotids und besonders bevorzugt weniger als ungefähr 50% der T_m des Blockierungs-Oligonukleotids beträgt. Indem dafür gesorgt wird, daß das Primer-Oligonukleotid „kürzer" als das Blockierungs-Oligonukleotid ist, gibt es eine erhöhte Wahrscheinlichkeit, dass die Hybridisierung des Blockierungs-Oligonukleotids vor der Hybridisierung des Primer-Oligonukleotids stattfindet. Eine gleichwertige Methode, um das Ziel der Hybridisierung des Blockierungs-Oligonukleotids an das Ziel vor dem Primer-Oligonukleotid zu erreichen, ist die Einheiten auf serielle Weise hinzuzufügen, wobei das Blockierungs-Oligonukleotid vor dem Primer-Oligonukleotid der Reaktionsmischung zugegeben wird. Alternativ dazu sollte beachtet werden, dass die Reihenfolge de Bindung ebenfalls gesteuert werden kann, indem das Verhältnis und/oder die Konzentration der Reaktanden verändert wird. Im „Schleifen ERA" (nachstehend diskutiert) wird eine bevorzugte Bindung durch Verwendung von T_m und Proximität gesteuert.
Dem Fachmann ist klar, dass die Länge einer Olginukleotideinheit, die für deren T_m in Anbetracht einer Hybridisierung an einen komplementäre Sequenz Bedeutung ist, manipuliert werden kann, um die „Geschwindigkeit" der Hybridisierung der Einheit an die komplementäre Sequenz zu erhöhen. Ist beispielsweise eine Zielsequenz vorgegeben, die zwei Regionen mit definierter Sequenz, X und Y aufweist; wobei ein erstes Oligonukleotid eine Länge X' aufweist, die zu einer Region X komplementär ist; und wobei ein zweites Oligonukleotid eine Länge Y' aufweist, die zu einer Region Y komplementär ist, so hybridisiert typischerweise das erste Oligonukleotid unter schärferen Bedingungen „schneller" an das Ziel, als das zweite Oligonukleotid, wenn X' > Y' ist. Dieser Aspekt der Oligonukleotidhybridisierung ist einer wirkungsvollen Verwertung für das offenbarte Amplifikationsverfahren zugänglich.
C. Das „End-Run-Oligonukleotid" der vorliegenden Erfindung
Das dritte Oligonukleotid der Erfindung, das heißt der „End-Run"-Primer ist ein Primermolekül und muß daher ein 3' Ende besitzen, das durch eine DNA-Polymerase verlängert werden kann.
Die Sequenz des End-Run-Oligonukleotids ist so ausgewählt, dass dessen 3' Ende zu einer vorbestimmten Sequenz des Blockierungs-Oligonukleotids oder weniger bevorzugt zu einer Sequenz komplementär ist, die durch Verlängerung des Primer-Oligonukleotids erzeugt wird. Die vorbestimmte komplementäre Sequenz des Blockierungs-Oligonukleotids umfaßt das 5' endständige Nukleotid des Blockierungs-Oligonukleotids, jedoch kann ebenfalls eine innere Sequenz geeignet sein.
Die komplementäre 3' endständige Sequenz des End-Run-Oligonukleotids muß eine Länge aufweisen, die ausreichend ist, um die Hybridisierung zwischen der 3' endständigen Sequenz des End-Run-Oligonukleotids und einer komplementären Sequenz des Blockierungs-Oligonukleotids zu erlauben. Die einzige Einschränkung des End-Run-Oligonukleotids ist, dass dessen 3' Ende im wesentlichen nicht in der Lage ist, mit dem Primer-Oligonukleotid zu hybridisieren. Vorzugsweise wird jedoch das 3' Ende des End-Run-Oligonukloetids sich nicht jenseits des 5' Endes des Blockierungs-Oligonukleotids erstrecken, wenn die beiden aneinander hybridisieren. In der Ausführungsform der Erfindung, entsprechend der Darstellung in 1, und in Situationen, in denen ein Verknüpfungsereignis nicht stattfinden kann, könnte ein End-Run-Oligonukleotid, dessen 3' Ende sich über das 5' Ende des Blockierungs-Oligonukleotids hinaus erstreckt, ebenfalls mit einer Region des 3' Endes des Primer-Oligonukleotids (oder dessen Verlängerungsprodukt) hybridisieren und sich somit längs des Primer-Oligonukleotids erstrecken; Im Fall einer Ausführungsform der Erfindung, wie sie in 2 dargestellt ist, kann eine unechte PCR-Reaktion sogar in Abwesenheit des definierten Ziels stattfinden, was zu falsch positiven Ergebnissen führt. Das heißt, dieses Ereignis könnte dem Primer-Oligonukleotid das „Primer" einer Verlängerungsreaktion gestatten, die zu der Herstellung eines Produkts führt, das eine „Kopie" des End-Run-Oligonukleotids umfaßt, wenn das 3' Ende des End-Run-Oligonukleotids überhängt und mit dem 3' Ende des Primer-Oligonukleotids hybridisiert und eine Verknüpfung zwischen Primer- und Blockierungs-Oligonukleotiden könnte unabhängig von der Gegenwart eines spezifischen Ziels stattfinden.
Die Länge des End-Run-Oligonukleotids kann kleiner, gleich oder größer als die Länge des Blockierungs-Oligonukleotids sein. Somit wird bevorzugt, dass die Gesamtlänge des End-Run-Oligonukleotids zwischen ungefähr 50% und ungefähr 100 der Länge des Blockierungs-Oligonukleotids, bevorzugter zwischen ungefähr 75 und ungefähr 95% der Länge des Blockierungs-Oligonukleotids und besonders bevorzugt ungefähr 80% der Länge des Blockierungs-Oligonukleotids beträgt. Alternativ dazu wird bevorzugt, dass die T_m des End-Run-Oligonukleotids zwischen ungefähr 50% und ungefähr 100% der T_m des Blockierungs-Oligonukleotids, bevorzugter zwischen ungefähr 75% und ungefähr 95% der T_m des Blockierungs-Oligonukleotids und besonders bevorzugt ungefähr 80% der T_m des Blockierungs-Oligonukleotids beträgt. Weiterhin wird besonders bevorzugt, dass das 3' Ende des End-Run-Oligonukleotids mit dem 5' Ende des Blockierungs-Oligonukleotids so weggespült wird, dass die Folgen eines End-Run-„Überhangs", wie vorstehend beschrieben wurde, wirksam vermieden werden. Es wird angemerkt, dass das 5' Ende des End-Run-Oligonukleotids nicht mit dem 3' Ende des Blockierungs-Oligonukleotids weggespült werden muß.
Obwohl das 3' Ende des End-Run-Oligonukleotids in der Lage sein muß, an das Blockierungs-Oligonukleotid zu hybridisieren, ist es nicht notwendig, dass die inneren oder 5' endständigen Sequenzen des End-Run-Oligonukleotids zu den Sequenzen des Blockierungs-Oligonukleotids entsprechend komplementär sind. Während in einer bevorzugten Ausführungsform das gesamte End-Run-Oligonukleotid zur Hybridisierung an das Blockierungs-Oligonukleotid in der Lage ist, ist somit in dazu alternativen Ausführungsformen das End-Run-Oligonukleotid so ausgelegt, dass es innere oder 5' endständige Sequenzen enthält, die im wesentlichen nicht zur Hybridisierung mit dem Blockierungs-Oligonukleotid in der Lage sind. Eine solche Fähigkeit weist einen großen Nutzen auf, da wie nachstehend genau beschrieben ist, sie ein einfaches Mittel zur Reinigung eines Strangs des Amplifikationsprodukt von einem anderen zur Verfügung stellt. Entsprechend gestattet sie die Sequenzen von beiden Strängen eines Doppelstrang-Amplifikationsprodukts gleichzeitig abzuleiten.
III. Überblick über die „End-Run-Amplifikations-" Reaktion
Obwohl die folgende Diskussion durch Bezugnahme auf die Amplifikation einer Doppelstrang-DNA (oder DNA-RNA-Hybride) erläutert wird, ist verständlich, dass die Diskussion genauso auf die Amplifikation einer RNA, Einzelstrang-DNA oder auf Mischungen von beliebigen vorstehenden Nukleinsäuretypen anwendbar ist.
Die einfachste Ausführungsform der „End-Run-Amplifikations-" („ERA") Reaktion der vorliegenden Erfindung umfaßt das Inkubieren des Zielmoleküls in Gegenwart des Blockierungs-Oligonukleotids, so dass das Blockierungs-Oligonukleotid an eine komplementäre Sequenz des Ziels hybridisiert. Nachdem dieses ausgeführt worden ist, kann entweder das Primer-Oligonukleotid oder das End-Run-Oligonukleotid zugegeben werden. Die besonders bevorzugte Reihenfolge der Oligonukleotidhybridisierung an die Zielsequenzstränge ist die folgende: Blockierungs-Oligonukleotid, dann End-Run-Oligonukleotid, anschließend Primer-Oligonukleotid. In bevorzugten Ausführungsformen kann die Reihenfolge Blockierungs-, dann Primer-Oligonukleotid, anschließend End-Run-Oligonukleotid und Blockierungs-Oligonukleotid oder End-Run-Oligonukleotid und Primer-Oligonukleotid sein. Wie offensichtlich ist, wird bevorzugt, dass das Blockierungs-Oligonukleotid das erste Oligonukleotid ist, das an das Ziel hybridisiert. Derartige Reihenfolgen der Zugabe sind erläuternd und schränken keineswegs die Erfindung ein. Wie offensichtlich ist, sind alle Reaktanden in jeder Stufe jeder nachfolgenden Amplifikationsrunde unmittelbar verfügbar, es sei denn nicht gebrauchte Reaktanden werden aus der Reaktion entfernt. Wird jedoch eine sequentielle Zugabe in solchen nachfolgenden Amplifikationsrunden gewünscht, können nicht gebrauchte Oligonukleotide am Schluß eines Amplifikationszyklus aus der Reaktion entfernt oder davon abgetrennt werden und dann später in der gewünschten Sequenz für eine nachfolgende Amplifkationsrunde wieder zugegeben werden.
Besonders bevorzugt beträgt das Verhältnis von Blockierungs-Oligonukleotid zu Primer-Oligonukleotid zu End-Run-Oligonukleotid innerhalb des Reaktionsbehälters 1 : 1 : 1. Jedoch sind auch Abweichungen möglich. Das Blockierungs-Oligonukleotid sollte vorzugsweise mit einer Konzentration vorhanden sein, die gleich oder größer als die Konzentration des Primer-Oligonukleotids ist, zum Beispiel I,5 : 1 oder mehr. Dementsprechend wird besonders bevorzugt, dass die Menge an Primer-Oligonukleotid die Menge an Blockierungs-Oligonukleotid nicht überschreitet, denn eine derartige Situation könnte die Tendenz des Primer-Oligonukleotids zur Hybridisierung mit dem Ziel vor dem Blockierungs-Oligonukleotid erhöhen, was ein Szenario ist, das vermieden werden muß, wie nachstehend genau ausgeführt wird. Das Verhältnis von Blockierungs-Oligonukleotid zu End-Run-Oligonukleotid kann von dem bevorzugten Verhältnis 1 : 1 abweichen, ohne das ERA Protokoll zu beeinflussen.
Das zu vermeidende Szenario ist die Titration des Blockierungs-Oligonukleotids durch das End-Run-Oligonukleotid, so dass das Blockierungs-Oligonukleotid nicht ausreichend verfügbar ist, wenn das Primer-Oligonukleotid an die Zielsequenz hybridisiert. Dieses Szenario kann durch Anpassen der Zykluszeit, Reaktionstemperatur, T_m, Oligonukleotidlängen, Konzentration des Ziels oder durch Anpassen des Verhältnisses von Blockierungs-Oligonukleotid zu End-Run-Oligonukleotid vermieden werden. Es wird bevorzugt, dass von diesen Faktoren zur Vermeidung des vorstehenden Szenarios das Verhältnis von Blockierungs-Oligonukleotid zu End-Run-Oligonukleotid angepasst wird, da dieser Faktor im Vergleich zu den anderen einfacher zu steuern ist. Dieses Verhältnis beträgt vorzugsweise 1 : 1.
Gibt es eine Lücke, die das hybridisierte Primer-Oligonukleotid von dem hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotid trennt, wird zusammen mit den dNTPs eine Polymerase zugegeben und die Reaktion wird unter Bedingungen aufrechterhalten, die zum Katalysieren der Polymerase vermittelten, templatabhängigen Verlängerung des Primer-Oligonukleotids geeignet sind. Die „Lücke" zwischen dem hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotid und dem hybridisierten Primer-Oligonukleotid kann von beliebiger Nukleotidlänge sein. Bei einer großen Länge wird die Zeiteinteilung des Amplifikationszyklus so gesteuert, daß für eine Zeitdauer gesorgt ist, die ausreicht, um die Verlängerung des Primer-Oligonukleotids und dessen Verknüpfung mit dem Blockierungs-Oligonukleotid zu gestatten. Weil es jedoch im allgemeinen bevorzugt ist, die Zeitdauer von jedem Amplifikationszyklus zu verringern, um die Produktion des amplifizierten Produkts innerhalb einer vernünftigen Zeitdauer zu maximieren, beträgt der Abstand zwischen dem 5' Ende des Blockierungs-Oligonukleotids und dem 3' Ende des Primer-Oligonukleotids, wenn beide an das Ziel hybridisiert werden, vorzugsweise zwischen ungefähr 2 bis ungefähr 10000 Basen, bevorzugter zwischen ungefähr 2 bis ungefähr 1000 Basen und besonders bevorzugt zwischen ungefähr 2 bis ungefähr 200 Basen. Es ist natürlich offensichtlich, dass mehr als ein Primer-Oligonukleotid verwendet werden kann, das heißt es können weitere Primer-Oligonukleotid(e) verwendet werden, die an eine Region mit definierter Sequenz innerhalb der Lücke hybridisieren. Wie aufgezeigt wurde, betrachtet die vorliegende Erfindung die Verknüpfung der zwei Oligonukleotide miteinander, sobald das Primer-Oligonukleotid derart verlängert worden ist, dass dessen 3' Ende an das 5' Ende des Blockierungs-Oligonukleotids angrenzt.
Sind die Primer- und Blockierungs-Oligonukleotide so ausgelegt, dass bei Hybridisierung an das Ziel ihre entsprechenden 3' und 5' Enden aneinanderangrenzen, können die Oligonukleotide ohne den Primerverlängerungsschritt miteinander verknüpft werden.
In diesem Stadium werden die Reaktionsbedingungen so geändert, dass eine Strangtrennung auftritt. Eine Strangtrennung kann unter Verwendung eines beliebigen geeigneten Denaturierungsverfahrens ausgeführt werden; diese umfassen die Verwendung physikalischer, chemischer oder enzymatischer Mittel. Ein physikalisches Verfahren für die Strangtrennung betrifft die Erwärmung der Nukleinsäure, bis sie vollständig denaturiert ist; die Wärmedenaturierung erfordert typischerweise die Verwendung von Temperaturen im Bereich von ungefähr 80°C bis ungefähr 105°C (vorzugsweise ungefähr 95°C) während zwischen ungefähr 1 bis 10 Minuten (vorzugsweise ungefähr 4–5 Minuten). Ein weiteres physikalisches Verfahren zur Strangtrennung betrifft die Änderung des pH-Werts des Mediums, in dem sich die Doppelstränge befinden; die pH-Wert-Denaturierung erfordert typischerweise die Verwendung eines pH-Wertbereichs von ungefähr pH-Wert 11 bis ungefähr pH-Wert 14 während zwischen ungefähr 1 Sekunden bis ungefähr 10 Minuten. Ein enzymatisches Verfahren zur Strangtrennung kann auf die Verwendung von Enzymen, die als Helikase bezeichnet werden, oder das Enzym RecA angewiesen sein, das Helikaseaktivität aufweist und von dem berichtet wurde, dass es in Gegenwart von ATP zu doppelsträngiger DNA denaturiert. Reaktionsbedingungen, die zur Trennung der Nukleinsäurestränge mit Helikase geeignet sind, sind in Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, Bd. XLIII, "DNA Replication and Recombination (New York: Cold Spring Harbor Laboraton, 1978), B. Kuhn et al., „DNA Helicases", Seiten 63–67 ausgeführt, auf deren Offenbarungsgehalt hier vollumfänglich Bezug genommen wird. Bei Verwendung von Wärmedenaturierung (wie bevorzugt ist) sind die in dem ERA-Protokoll verwendeten Enzyme besonders bevorzugt wärmebeständige Enzyme.
Hat die Verknüpfung stattgefunden, dann ist das Blockierungs-Oligonukleotid und das Primer-Olignukleotid (oder dessen Verlängerungsprodukt) kovalent in einem einzigen Molekül miteinander verbunden (das heißt das „gewünschte Molekül").
Wie aufgezeigt wurde, weist das End-Run-Oligonukleotid ein 3' Ende auf, dessen Sequenz zu einer Sequenz des Blockierungs-Oligonukleotids komplementär ist. Das aus der Verknüpfung des Primer-Oligonukleotids (oder dessen Verlängerungsprodukts) und Blockierungs-Oligonukleotids resultierende einzelne Molekül kann daher als die Templat für die Polymerase vermittelte templatabhängige Verlängerung des End-Run-Oligonukleotids dienen. Damit dies erreicht wird, werden die Reaktionsbedingungen so geändert, dass die Zwischenstranghybridisierung stattfinden kann.
Die Verlängerung des End-Run-Oligonukleotids erzeugt ein Molekül, dessen Sequenz die Zielsequenz umfaßt. Daher können die Blockierungs- und Primer-Oligonukleotide an das End-Run-Verlängerungsprodukt hybridisieren und dadurch ein neues „gewünschten Moleküls" bilden.
Wie klar ist, kann der vorstehend beschriebene Zyklus so oft wie gewünscht wiederholt werden, um den gewählten Grad der Amplifikation des gewünschten Moleküls herzustellen. Da ein Produkt von einem Schritt ein Substrat eines anderen wird, führt die durch die Reaktionszyklen gesteuerte Amplifkation zu einer exponentiellen Amplifikation der gewünschten Sequenz.
Die vorliegende Erfindung ist dementsprechend besonders zum Amplifizieren von entweder bekannten oder unbekannten Sequenzen verwendbar, die zum Beispiel eine genetische Störung anzeigen; insbesondere richtet sich die vorliegende Erfindung auf die Bestimmung des Vorhandenseins eines einzelnen Basendefekts in einer Polynukleotidsequenz. Weiterhin kann die vorliegende Erfindung zur Amplifikation von Polynukleotiden verwendet werden, die eine bekannte Sequenz oder eine teilweise unbekannte Sequenz aufweisen, was die Analyse (zum Beispiel Sequenzierung) des amplifizierten Produkts gestattet.
Nach Durchführung einer Amplifikationsreaktion, kann jede aus einer Vielfalt von aus dem Stand der Technik bekannten Techniken angepasst werden, um einen solchen Nachweis ohne übermäßiges Experimentieren zu erlauben oder zu vereinfachen. In machen Situationen ist es besonders vorteilhaft, die RNA-Amplifikationsprodukte durch ein DNA-Oligonukleotid einzufangen, das zu einer durch die Zielsequenz be stimmten RNA-Sequenz komplementär ist, wobei das Oligonukleotid an einen festen Träger, wie zum Beispiel eine magnetische Mikroperle oder ein Harzträger gebunden ist. Diese Oligonukleotidsequenz überlappt vorzugsweise nicht mit derjenigen irgendeines Oligonukleotids, das zur Reinigung des Ziels vor der Amplifikation verwendet wird. Somit gebildete RNA : DNA Hybride können dann durch vorzugsweise markierte Antikörper (oder deren Fragmente) nachgewiesen werden, die an RNA : DNA Duplexe binden. Der Nachweis der Bindung solcher Antikörper kann durch eine Anzahl gut bekannter Verfahren aus dem Stand der Technik durchgeführt werden.
Alternativ dazu kann die amplifizierte Nukleinsäure durch Gelelektrophorese, Hybridisierung oder einer Kombination aus den beiden Verfahren nachgewiesen werden, wie im Stand der Technik gut verstanden ist. Der Fachmann wird feststellen, dass die vorliegende Erfindung so angepasst werden kann, dass sie viele Nachweisschemata einschließt.
Sequenzen, die entsprechend den Verfahren der Erfindung amplifiziert wurden, können gereinigt werden (zum Beispiel durch Gelelektrophorese, durch Säulenchromatographie, durch Affinitätschromatographie, durch Hybridisierung, usw.) und die die gereinigten Produkte enthaltenden Fraktionen können einer weiteren Amplifikation entsprechend den Verfahren der Erfindung unterzogen werden.
IV. Bevorzugte allgemeine Verfahren zur Durchführung der „End-Run-Amplifikations-" Reaktion
Entsprechend der vorstehend beschriebenen Übersicht über das allgemeine Verfahren der Erfindung wurden bestimmte besonders zu bevorzugende Verfahren festgestellt.
Allgemeine Parameter hinsichtlich der bevorzugten Längen und T_m der Blockierungs-Primer- und End-Run-Oligonukleotide sind vorstehend genau offenbart. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind die Längen (in den Nukleotiden) folgende: Blockierungs-Oligonukleotid – 23, Primer-Oligonukleotid – 10, End-Run-Oligonukleotid – 18. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind die T_m (in °C) folgende: Blockierungs-Oligonukleotid – 85, Primer-Oligonukleotid – 45, End-Run-Oligonukleotid – 75.
Besonders bevorzugt wird, dass in dem Verfahren die Blockierungs-Oligonukleotid-, Primer-Oliognukleotid- und der End-Run-Oligonukleotidreaktanden gleichzeitig in den Reaktionsbehälter gegeben werden. Die Reaktanden können jedoch nacheinander oder gruppenweise zugegeben werden. Werden die Oligonukleotide nacheinander zugegeben, so wird die Verwendung folgender Reihenfolgen bevorzugt. Blockierungs-, End-Run-, Primeroligonukleotid; Blockierungs-, Primer-, End-Run-Oligonukleotid; Blockierungs-, End-Run- und Primeroligonukleotid; Blockierungs- und Primer-, End-Run-Oligonukleotid; oder Blockierungs- und End-Run-, Primer-Oligonukleotid. Alternativ dazu können die Einheiten in jeder beliebigen Reihenfolge oder als einzelne Beimischung zugegeben werden, wenn der Reaktionsbehälter (umfassend die Zielsequenz) bei ungefähr 4°C gehalten wird – denn wie dem Fachmann klar ist, ist bei dieser Temperatur die Hybridisierung und enzymatische Aktivität im wesentlichen und typischerweise vollständig verhindert.
Da die Längen (und/oder T_m) der Oligonukleotideinheiten so ausgelegt sind, dass sie die Wahrscheinlichkeit erhöhen, dass das Ziel zuerst mit dem Blockierungs-Oligonukleotid, anschließend mit dem Primer-Oligonukleotid und zuletzt mit dem End-Run-Oligonukleotid hybridisiert, werden die Oligonukleotide typischerweise so zugegeben, dass die Konzentration des Blockierungs-Oligonukleotids größer oder gleich der Konzentration von entweder dem Primer-Oligonukleotid oder dem End-Run-Oliognukleotid ist. Jede Einheit ist in einer Konzentration im Bereich von ungefähr 10 nM (nanomolar) bis ungefähr 400 nM, vorzugsweise von ungefähr 50 nM bis ungefähr 300 nM und besonders bevorzugt von ungefähr 100 nM vorhanden. Die für jede Reaktion verwendete optimale Sondenmenge variiert ebenfalls in Abhängigkeit von der Anzahl der Amplifikationszyklen, die durchgeführt werden. Optimale Konzentrationen können leicht von dem Fachmann bestimmt werden.
Wie dem Fachmann im allgemeinen klar ist, ist die Strenge der Bedingungen von der Temperatur, dem Puffer (den Puffern) und damit zusammenhängenden Parametern abhängig; der Temperaturparameter ist jedoch typischerweise am einfachsten zu steuern und ist daher ein bevorzugter einschränkender Parameter, der bei Variation zur Optimierung der Leistungsfähigkeit der ERA verwendet werden kann. Wie angemerkt wurde, hängt die Oligonukleotidlänge direkt mit der durch die Temperatur gesteuerte Schärfe der Bedingungen zusammen – somit können die verschärfenden Bedingungen leicht durch den Fachmann optimiert werden in Übereinstimmung mit den Zielen, dass das Blockierungs-Oligonukleotid mit dem Ziel vor dem Primer-Oliognukleotid hybridisiert und das Primer-Oligonukleotid und die Zielmoleküle aneinander hybridisieren.
Sofern die Primer- und Blockierungs-Oliogonukleotide nicht so ausgelegt wurden, dass sie aneinandergrenzen, wird eine Polymerase zur Verlängerung des Primers in Richtung des Blockierungs-Oligonukleotids verwendet, bis ein verknüpfbares Substrat erhalten wird. Falls eine Verlängerung des Primer-Oligonukleotids benötigt wird, wird bevorzugt, dass das Polymeraseenzym in Verbindung mit dNTPs in dem Reaktionsbehälter vorhanden ist, bevor, während oder nachdem die Einheiten zu der Zielsequenz gemischt werden. Besonders bevorzugt ist, daß das Polymeraseenzym ein wärmebeständiges Polymeraseenzym ist. Ein weiterer besonders bevorzugter Schritt betrifft die Beimischung der Polymerase zu dem Reaktionsbehälter, der schon die Zielsequenz, dNTPs und die Oligonukleotidreaktanden enthält. Anstatt solcher aufeinanderfolgender Zugaben können alle Reagenzien in einem Reaktionsbehälter gemischt werden, dessen Temperatur bei ungefähr 4°C gehalten wird, um im wesentlichen Hybridisierung und enzymatische Aktivität zu verhindern.
Da das Amplifikationsstadium der ERA von einem Verknüpfungsereignis sowie auch von einem Verlängerungsereignis abhängt, wird bevorzugt, dass der nächste Schritt in dem Verfahren die Verknüpfung der an das Ziel hybridisierten Blockierungs- und Primer-Oligonukleotide ist. Daher sind die Mittel zur kovalenten Kopplung der zwei Moleküle, vorzugsweise ein Ligaseenzym und besonders bevorzugt ein wärmebeständiges Ligaseenzym, in dem Reaktionsbehälter vor, während oder nach der Beimischung der Moleküle zu der Zielsequenz vorhanden. Besonders bevorzugt wird die Ligase zu dem Reaktionsbehälter zugegeben, nachdem die Oligonukleotideinheiten dazu gegeben wurden.
Der nächste bevorzugte Schritt in der Reaktion ist die Polymerase vermittelte templatabhängige Verlängerung des End-Run-Oliognukleotids, das entweder an einen Ziel strang oder an ein verknüpftes Blockierungs-Primer-Oligonukleotid hybridisiert ist. Falls eine Polymerase nicht vorher zu dem Reaktionsbehälter gegeben worden ist, wird eine solche Polymerase vorzugsweise unter denselben Erwägungen hinsichtlich der Zugabe der Polymerase zugegeben, wie vorstehend diskutiert ist.
Eine besonders bevorzugte Reihenfolge der Zugabe der Reaktandenkomponenten ist folgende: Reaktionspuffer, Zielsequenz, dNTPs, Oligonukleotide, wärmebeständiges Ligaseenzym, wärmebeständiges Polymeraseenzym. Besonders bevorzugt wird das wärmebeständige Polymeraseenzym nach einem „Heißstart" zugegeben, das heißt ein erster „Denaturierungszyklus" wird vor der Zugabe des Polymeraseenzyms zu dem Rektionsbehälter durchgeführt. Wie angegeben wurde, werden diese Komponenten besonders bevorzugt bei näherungsweise 4°C gehalten, bis die Einleitung des Amplifikationsverfahrens gewünscht wird. Die Reaktionskomponenten können zu dem Reaktionsbehälter manuell oder mittels eines automatisieren Laborroboterarbeitsplatzes zugegeben werden, der in der Lage ist, eine Vielfalt von Reaktionskomponenten automatisch zu einem (mehreren) Reaktionsbehälter(n) zuzugeben. Ein besonders bevorzugter automatisierter Laborroboterarbeitsplatz ist das Biomek^® 1000 (Beckman Instruments, Inc., Fullterton, CA.).
Falls, wie besonders bevorzugt ist, der Reaktionsbehälter bei 4°C gehalten wurde, wird nach der Zumischung der Reaktionskomponenten der Reaktionsbehälter einem „Heißstart" unterzogen, das heißt die Temperatur wird während ungefähr 5 Min. auf ungefähr 95°C erhöht, um vor Einleitung der ERA durch Zugabe des Polymeraseenzyms die Zielsequenz vollständig zu denaturieren. Danach folgen vorzugsweise die Amplifikationszyklen. In jedem speziellen Zyklus wird gewünscht, dass mindestens ein Verknüpfungsereignis zwischen einem Blockierungs-Oligonukleotid und einem Primer-Oligonukleotid, die an ein Ziel hybridisiert sind, stattfindet und mindestens eine Verlängerung eines an ein Ziel und/oder an Blockierungs-Oligonukleotid-Primer-Oligonukleotidverknüpfungsprodukt hybridisierten End-Run-Oliognukleotids stattfindet, da bei einer im wesentlichen exponentiellen Amplifikation die Zahl solcher Ereignisse nach jedem Zyklus dramatisch zunimmt.
Ein Zyklus erfordert das Annealing der Oligonukleotide an ihre entsprechenden Ziele und davon die Denaturierung. Wird somit die Denaturierung durch die Temperatur vermittelt (wie besonders bevorzugt ist), werden die Zyklen durch Anpassung der Temperatur des Reaktionsbehälters reguliert. Bei Verwendung nicht wärmebeständiger Enzyme kann die enzymatische Aktivität der Enzyme im wesentlichen zerstört sein, wenn die zur Denaturierung der Stränge notwendige Temperatur erreicht ist; und somit kann nach jedem Zyklus die Zugabe von frischem Enzym notwendig sein. Aus diesem Grund werden vorzugsweise hauptsächlich wärmebeständige Enzyme verwendet.
Die innerhalb eines jeden Zyklus verwendete Temperatur hängt hauptsächlich von der T_m der Oligonukleotideinheiten ab. Oligonukleotide mit einer Länge von ungefähr 6 bis ungefähr 10 Basen weisen ein T_m von ungefähr 40°C auf, wobei bei dieser Temperatur wärmeempfindliche (das heißt nicht wärmebeständige) Enzyme aktiv sind. Bei Verwendung längerer Oligonukleotide nimmt die T_m zu und erfordert die Verwendung wärmebeständiger Enzyme oder die Zugabe von wärmeempfindlichen Enzymen nach jedem Zyklus. Für die besonders bevorzugten Oligonukleotidlängen (Blockierungs-Oliognukleotid – 23 Basen, Primer-Oligonukleotid – 10 Basen, End-Run-Oligonukleotid – 18 Basen) ist jeder Zyklus vorzugsweise durch die folgenden Parameter definiert: 95°C – 1 Minute, 70°C – 4 Minuten, 40°C – 4 Minuten.
Die Anzahl der Zyklen hängt hauptsächlich von den Bedürfnissen des Forschers ab. Typischerweise können nachweisbare Ergebnisse schon nach wenigen Zyklus wie ungefähr 10 bis ungefähr 20 erreicht werden. Mehr als 20 Zyklen können jedoch verwendet werden, wenn die Reaktion nicht durch die Konzentration der in dem Reaktionsbehälter vorhandenen Oligonukleotide, dNTPs und Enzym eingeschränkt ist.
Nach der Durchführung einer geeigneten Anzahl von Zyklen kann die Reaktion beendet werden. Die Kann wirksam durch Inaktivierung des Enzyms durchgeführt werden und kann besonders bevorzugt durch Erniedrigung der Temperatur des Reaktionsbehälters auf 4°C erreicht werden. Jedoch können auch andere Methoden, zum Beispiel EDTA und ein Harnstoff „Stopp-" Farbstoff verwendet werden. Weiterhin können die Enzyme unter Verwendung von Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, chemisch inaktiviert werden oder die Verbindungen können: zum Beispiel auf Sephadex^TM Säulen, durch Filtration, durch Zentrifugation oder durch Gelelektrophorese getrennt werden.
Ein mit jedem Amplifizierungsprotokoll zusammenhängendes möglicherweise verhängnisvolles Problem ist die Verunreinigung; dieses Problem ist besonders akut, wenn das Amplifikationsprotokoll für diagnostische Zwecke verwendet wird. Zum Beispiel kann sogar eine geringe Verunreinigung eines Reaktionsbehälters zu falsch positiven Ergebnissen führen, das heißt, ein gewünschtes Ziel, das in einem ersten Behälter, aber nicht in einem zweiten Behälter vorhanden ist, kann versehentlich von dem ersten Behälter zu dem zweiten Behälter übertragen werden – folglich wird der zweite Behälter eine Amplifikation des gewünschten Ziels zeigen, wenn dieses Ziel tatsächlich nicht ursprünglich in dem zweiten Behälter vorhanden war. Verschiedene Methoden zur wesentlichen Verringerung der Möglichkeit einer solchen Verunreinigung sind vorgebracht worden. Eine derartige Methode betrifft die Verwendung des Enzyms Uracil-N-glycosylase („UNG"). UNG baut Uracil so ab, dass Uracil enthaltende Oligonukleotide in Gegenwart von UNG wirksam abgebaut werden. Weiterhin kann UNG mit Wärme (das heißt ungefähr 80°C) inaktiviert werden. Eine bevorzugte Lösung, die Sorgen hinsichtlich einer Verunreinigung zu mildern, ist die Ersetzung von dTTP gegen UTP in der Reaktionsmischung, so dass die amplifizierten Produkte Uracil anstatt Thymidin eingebaut haben. Nach der Amplifikation des Ziels in dem ersten Behälter, wird UNG zu dem zweiten Behälter gegeben; falls irgendein amplifiziertes Produkt vom ersten Behälter den zweiten Behälter verunreinigt hat, wird UNG die Verunreinigung wirksam abbauen. Danach wird der zweite Behälter durch Erhitzen des Behälters auf ungefähr 80°C „heiß-gestartet", wobei das UNG inaktiviert wird. Danach können die dNTPs und/oder Enzyme zu dem zweiten Reaktionsbehälter zur Einleitung des ERA Protokolls zugegeben werden.
V. Die beispielhaften Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung und deren bevorzugte Verwendungen
Wie dem Fachmann ohne weiteres klar ist, werden die hauptsächlichen Unterschiede zwischen den verschiedenen nachstehend erläuterten Ausführungsformen von den Bedürfnissen des Untersuchers bestimmt.
1. ERA „ohne Lücke"
Die ERA Ausführungsform „ohne Lücke" ist eine, bei der das 3' Ende des hybridisierten Primer-Oligonukleotids unmittelbar zu (das heißt angrenzend) dem 5' Ende des hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotids benachbart ist. In dieser Ausführungsform ist die templatvermittelte Verlängerung des Primer-Oligonukleotids nicht erforderlich. Dieser Aspekt der Erfindung wird entsprechend den vorstehend beschriebenen allgemeinen ERA Verfahren durchgeführt und ist in 1 und 3 (Doppelstrang-Nukleinsäure) und in 5 (Einzelstrang-Nukleinsäure) erläutert.
Da in dieser Ausführungsform die hybridisierten Primer- und Blockierungs-Oligonukleotide aneinandergrenzen müssen, erfordert die Ausübung dieser Ausführungsform die a priori Bestimmung von mindestens einem Teil der Zielnukleinsäuresequenz. Eine derartige Information wird gebraucht, um die Sequenzen der Blockierungs- und Primer-Oligonukleotide zu definieren. Die Blockierungs- und Primer-Oligonukleotide brauchen notwendigerweise nicht so ausgelegt sein, dass sie vollständig längs des Ziels hybridisieren, vielmehr müssen ausreichend Einzelheiten im Hinblick auf die Zielsequenz bekannt sein, so dass das 5' Ende des Blockierungs-Oligonukleotids und das 3' Ende des Primer-Oligonukleotids unter verschärfenden Bedingungen daran hybridisieren können. Alternativ dazu kann die Zielsequenz in ausreichender Menge isoliert sein, um die Erzeugung von ausreichend Oligonukeotid-komplementären Paaren zur Verwendung in dem offenbarten Verfahren zu ermöglichen.
Diese Ausführungsform der Erfindung ist besonders zur Identifikation einer genetischen Mutation oder von polymorphen Stellen geeignet. Im Hinblick darauf wird die Sequenz des Primer-Oligonukleotids besonders bevorzugt so ausgewählt, dass deren 3' endständiges Nukleotid entweder dem „normalen" oder dem „mutierten" Allel entspricht, das identifiziert werden soll. Wie klar ist, wird, falls das Primer-Oligonukleotid mit der „normalen" Base endet, diese Base nicht an eine Zielsequenz hybridisieren, die von einem Individuum mit einer Mutation an dieser Stelle stammt. Dementsprechend wird die Amplifikation durch ERA nur stattfinden, wenn die Probe von einem „normalen" Individuum stammt. Umgekehrt ist es durch Verwendung eines Primers, der in der „mutierten" Base oder in einer „promiskuitiven" Base, wie zum Beispiel Inosin endet, möglich, die Reaktion so anzupassen, dass die Amplifikation nur stattfindet, wenn die Probe von einer „mutierten" Gensequenz stammt.
2. ERA „mit Lücke"
Wie vorstehend aufgezeigt wurde, werden in einer zweiten bevorzugten Ausführungsform Blockierungs- und Primer-Oligonukleotide verwendet, die bei Hybridisierung an ein Zielmolekül durch eine Lücke zwischen 1 und 10000 Basen getrennt sind. Bezeichnenderweise erlaubt das Vorhandensein dieser Lücke die Verwendung dieser Ausführungsform der Erfindung sogar in Situationen, in denen eine minimale Sequenzinformation verfügbar ist. Insbesondere kann die Sequenz der Lücke unbekannt sein, hingegen ist notwendig, dass genügend Einzelheiten hinsichtlich des Teils (der Teile) auf beiden Seite der Lücke bekannt müssen, so dass komplementäre Blockierungs- und Primer-Oligonukleotide erzeugt werden können.
Die ERA Ausführungsform „mit Lücke" der vorliegenden Erfindung ist in 2 und 4 für Doppelstrang-Nukleinsäuremoleküle und in 5 für Einzelstrang-Nukleinsäuremoleküle erläutert.
Die ERA Ausführungsform „mit Lücke" der vorliegenden Erfindung wird entsprechend den vorstehend beschriebenen allgemeinen ERA Verfahren durchgeführt, jedoch wird für Lücken, deren Länge ungefähr 200 Nukleotide überschreitet, bevorzugt, dass die Reaktionszeit für jeden Zyklus erhöht ist; jeder Zyklus sollte länger als ungefähr 10 Minuten sein, das heißt länger als ungefähr 12–15 Minuten sein. Mit einer derartigen Zunahme wird die Zunahme der zyklischen Durchlaufleistung beabsichtigt. Der zeitliche Verlauf der Reaktion wird vorzugsweise minimiert, um die Geschwindigkeit der Amplifikation so weit wie möglich zu erhöhen, ohne die Leistungsfähigkeit der Reaktion zu beeinflussen.
Für Lücken, die größer als 10000 Basen sind, können ein oder mehrere zusätzlichen Primer-Oligonukleotide verwendet werden (solche optionalen zusätzlichen Primer-Oligonukleotide werden als „Primer.A", „Primer.B", „Primer.C", usw. bezeichnet). Soll ein Primer.A verwendet werden, so ist dieser so ausgelegt, dass er eine Sequenz enthält, die an einen Teil der Lücke (deren Sequenz bekannt oder teilweise bekannt ist) hybridisieren kann. Falls daher die Lücke äußerst groß ist (das heißt, größer als ungefähr 10000 Nukleotide), kann es erwünscht sein, einen Primer.A (oder weitere Primer-Oligonukleotidspezies) zur Hybridisierung an eine Stelle, vorzugsweise an die ungefähre Mittel der Lücke (oder an eine Vielfalt von Stellen bei Verwendung mehrfacher Primer) zu verwenden, um die Verlängerung des Primer-Oliognukleotids durch Primer.A (und beliebigen anderen Primer-Oligonukleotiden) an das 5' Ende des Blockierungs-Oligonukleotids zu erleichtern. Bei der Verknüpfung werden das Primer-Oliognukleotid, Primer.A und das Blockierungs-Oligonukleotid kovalent miteinander verbunden, wodurch das Templat in der Reaktion für das End-Run-Oliognukleotid gebildet wird. Die Verfahrensschritte der ERA Ausführungsform „ohne Lücke" sind genauso auf die ERA Ausführungsform „mit Lücke" anwendbar. Diese Ausführungsform der Erfindung ist besonders zur Amplifikation von Zielsequenzen) geeignet, die eine (mehrere) Regionen) mit völlig oder teilweiser unbekannter Sequenz umfassen, das Verknüpfungsereignis findet nach der Verlängerung des Primer-Oligonukleotids (der Primer-Oligonukleotide) bis zu einem Punkt statt, der zu dem Blockierungs-Oligonukleotid unmittelbar benachbart liegt, daraufhin kann ein Verknüpfungsereignis stattfinden.
Obwohl die vorstehend beschriebenen Nachweisverfahren auf diese Ausführungsform der Erfindung gleichwertig anwendbar sind, wird bei der Ausübung dieser Ausführungsform bevorzugt, die Amplifikation unter Verwendung von Nukleinsäuresonden nachzuweisen, die zu einem (oder mehreren) der Oligonukleotide komplementär sind; dies würde das „Ziehen" von Amplikonen aus dem Reaktionsbehälter gestatten, wobei deren Sequenzierung ausgeführt werden kann.
In diagnostischen Anwendungen sorgt diese Ausführungsform der Erfindung für die Gelegenheit eine Vielfalt markierter Sonden zu verwenden, die auf spezifische Mutationen gerichtet sind, die zu einem oder mehreren Allelen führen. Das heißt, für eine Vielfalt von Mutationen, von denen bekannt ist, dass sie innerhalb einer speziellen Region eines Gens vorkommen, können Blockierungs-Oligonukleotid(e) und Primer-Oligonukleotid(e) so ausgelegt werden, dass sie diese Region flankieren; die Amplifikation des Ziels wird dann Amplikonen mit undefinierten Mutationen erzeugen. Anschließend können spezifische auf die bekannten Mutationssequenzen gerichtete Sonden zum Screenen der Amplikonen verwendet werden, so dass in Abhängigkeit davon, welche Sonde mit den Amplikonen hybridisiert, die Identifikation der Mutation erreicht werden kann.
Diese Ausführungsform der Erfindung kann ebenfalls zur Vereinfachung des Nachweises und der Amplifikation von Genen verwendet werden, die mit genetischen Krankheiten zusammenhängen. Im Gegensatz zu der Ausführungsform „ohne Lücke" der Erfindung brauchen in dieser Ausführungsform die Blockierungs- und Primer-Oligonukleotide nach Hybridisierung an das Ziel nicht unmittelbar zu einander benachbart sein. Somit kann die Ausführungsform zum Beispiel im Fall einer genetischen Krankheit verwendet werden, die durch eine Vielfalt von Allelen (wie zum Beispiel Deletionen, Einschübe, Umordnungen, so wie auch Punktmutationen) charakterisiert ist, die durch eine Vielfalt von Mutationsveränderungen in definierten Regionen des Gens verursacht werden, wobei die Blockierungs- und Primer-Oligonukleotide so erzeugt werden können, dass sie diese Region bei Hybridisierung an das Ziel flankieren. Die Verlängerung des Primer-Oligonukleotids und die Verknüpfung des Blockierungs-Oligonukleotids mit dem Primer-Verlängerungsprodukt, gestattet dem End-Run-Oligonukleotid die Amplifikation der Zielsequenz, die der polymorphen Stelle entspricht. Danach kann das amplifizierte Produkt sequenziert werden, oder Sonden (die zum Beispiel auf jede der verschiedenen Mutationen gerichtet sind, die in der „Lücken-„ Region vorkommen können) können zum Screenen des amplifizierten Produkts verwendet werden, um zu bestimmen, welche Mutation in einer speziellen Probe vorhanden oder nicht vorhanden ist.
Diese Ausführungsform der Erfindung ist ebenfalls ideal zur Amplifikation genomischer oder cDNA-Sequenzen geeignet, in denen nur fragmentarische Sequenzinformation verfügbar ist. Ein Verfahren zum Amplifizieren von cDNA oder DNA unter Verwendung dieser Ausführungsform erfordert nur die Kenntnis der endständigen Aminosequenz des exprimierten Proteins. Diese Information kann zum Definieren eines Blockierungs-Oligonukleotids, das zur Hybridisierung an (alle oder einen Untersatz von) Codone(n) in der Lage ist, die eine derartige Sequenz kodieren, und eines End-Run-Oligonukleotids verwendet werden, das zur Hybridisierung an das Blockierungs-Oligonukleotid in der Lage ist. Das Primer-Oligonukleotidmolekül in dieser Ausführungsform könnte eine Poly-T Sequenz umfassen, so dass die Moleküle zusammen eine beliebige cDNA oder DNA-Sequenz amplifizieren würden, die ein mit den spezifizierten Codonen beginnendes Protein kodiert.
3. „NERA" – „Verschachtelte" ERA
Die „NERA" oder „verschachtelte ERA" Ausführungsform des ERA Protokolls ist ein Hybrid der ERA „mit Lücke" und ERA „ohne Lücke". NERA wird vorzugsweise als eine zweistufige Reaktion durchgeführt. Die erste Stufe ist so ausgelegt, dass eine Zielsequenz amplifiziert wird, die eine „quasi Lücke" umfaßt, das heißt wobei die „Lücke" eine Region umfaßt, deren Sequenz im wesentlichen definiert worden ist. Die zweite Stufe ist so ausgelegt, dass die quasi Lücke der ersten Stufe amplifiziert wird, wobei besonders bevorzugt Moleküle verwendet werden, die in Bezug auf die Reaktandenmoleküle der ersten Stufe ein „verschachteltes" Blockierungs-Oligonukleotid und ein „verschachteltes" Primer-Oligonukleotid umfassen, die aneinander angrenzend hybridisieren.
Die NERA Ausführungsform stellt daher ein Protokoll zur Bestimmung zur Verfügung, ob oder ob nicht eine unechte Amplifikation stattfand (infolge Verunreinigung, falschen Hybridisierungsreaktionen oder anderen Gründen). Das NERA Protokoll ist schematisch in 7 für Doppelstrang-Zielmoleküle und in 8 für Einzelstrang-Zielmoleküle ausgeführt.
In der ersten Stufe der NERA werden Blockierungs-, Primer- und End-Run-Oligonukleotide auf dieselbe Weise verwendet, wie für ERA „mit Lücke" beschrieben ist – das heißt, Blockierungs- und Primer-Oligonukleotide sind so ausgelegt, dass sie einen Lückenabschnitt flankieren, das Primer-Oligonukleotid ist derart verlängert, dass es an das Blockierungs-Oligonukleotid angrenzt und die Moleküle werden über eine Ligase miteinander verknüpft.
Das Amplifikationsprodukt der ersten Stufe der Reaktion wird als das Ziel für die zweite Stufe der Reaktion verwendet. Somit können in der zweiten Stufe die Blockierungs-, Primer- und End-Run-Oligonukleotide in Bezug auf ihre Gegenstücke in der ersten Stufe als „verschachtelt" betrachtet werden. Die Reaktanden der zweiten Stufe werden zu dem amplifizierten Produkt aus der ersten Stufe (unter anderem zusammen mit Ligase- und Polymeraseenzymen und dNTPs) gemischt. Die verschachtelten Blockierungs- und Primer-Oligonukleotide sind so ausgelegt, dass sie mit dem „aufgefüllten" Teil der Lücke des ursprünglichen Ziels hybridisieren. Ein solcher Ent wurf löst jedes Problem, das durch unechte Amplifikation aus der ersten Stufe verursacht worden ist. Unechte Amplifikation könnte in der ersten Stufe stattfinden, wenn zum Beispiel die Blockierungs- und Primer-Oligonukleotide aus der ersten Stufe während der Reaktion der ersten Stufe an nicht spezifische „Pseudo-Ziel-" Regionen hybridisiert hätten. Bei einem solchen Vorfall würde die aufgefüllte Lücke nicht der gewünschten „Ziel-" Lücke entsprechen und könnte daher nicht durch die verschachtelten Blockierungs- und Primer-Oligonukleotide in der zweiten Stufe der Reaktion amplifiziert werden. Die NERA Ausführungsform verringert daher die Möglichkeit einer unechten Amplifikation.
Die NERA Ausführungsform vereinfacht den Nachweis der unechten Amplifikation. Falls keine derartige unechte Amplifikation stattgefunden hat, das heißt, falls die Blockierungs- und Primer-Oligonukleotide der ersten Stufe an die wahre Zielsequenz hybridisiert hatten, kann das resultierende amplifizierte Produkt als eine Zielsequenz für die verschachtelten Reaktanden der zweiten Stufe dienen und wird durch diese Reaktion entsprechend amplifiziert.
In der NERA Ausführungsform werden ebenfalls die allgemeinen ERA Verfahren verwendet. Die vorstehend diskutierten Überlegungen, Merkmale und Charakteristika der ERA „mit Lücke" sind genauso auf die erste NERA Stufe anwendbar, abgesehen davon, dass, wie angemerkt ist, obwohl für NERA eine „Lücke" verwendet wird, die Sequenz innerhalb der Lücke ausreichend definiert sein muß, so dass das verschachtelte Blockierungs-, Primer und End-Run-Oligonukleotid so erzeugt werden können, dass sie an den aufgefüllten Teil des amplifizierten Produkts aus ersten Stufe hybridisieren können.
Da ein bevorzugtes Ziel der ersten Stufe die Erzeugung von genügend Ziel für die zweite Stufe ist, ist in der ersten Stufe Markieren nicht erforderlich – da, wie offensichtlich ist, der Nachweis oder das Einfangen unter diesen Parametern als solches nicht notwendig ist. Ein Markieren wird jedoch für die zweite Stufe bevorzugt.
Nach ausreichenden Zyklen in der ersten Stufe (das heißt zwischen ungefähr 5–80 Zyklen) kann die Reaktion vorzugsweise durch Steuerung der Temperatur (das heißt Absenken der Temperatur auf ungefähr 4°C) angehalten werden und die zweite Stu fe beginnt. Das amplifizierte Produkt der ersten Stufe braucht von den unverbrauchten Reaktanden, die in dem Reaktionsbehälter vorhanden sein können, nicht getrennt werden. Das heißt, dass aufgrund Grads, bis zu dem die exponentielle Amplifikation verlief, die Zugabe der verschachtelten Einheiten zu dem Reaktionsbehälter nicht mit derartigen unverbrauchten Reaktanden konkurriert – entsprechend der Definition, sind die verschachtelten Einheiten so ausgelegt, dass sie an Regionen längs des amplifizierten Produkts hybridisieren und somit unter verschärfenden Bedingungen nicht mit den unverbrauchten Reaktanden hybridisieren. Die amplifizierten Produkte aus der ersten Stufe können jedoch von den unverbrauchten Reaktanden zum Beispiel durch Säulenchromatographie, biospezifische Affinität (zum Beispiel Biotin-Avidin), Gelreinigung, usw. getrennt werden.
Die zweite NERA Stufe wird entsprechend den vorstehend diskutierten Erwägungen, Merkmalen und Charakteristika der ERA „ohne Lücke" ausgeführt. Wie angemerkt wurde, sind die Amplifikationsprodukte der ersten Stufe vorzugsweise nicht markiert. Im Gegensatz dazu sind die Amplifikationsprodukte der zweiten Stufe vorzugsweise markiert und werden auf die vorstehend beschriebene Weise nachgewiesen.
4. „LERA" – „Schleifen" ERA
Die „Schleifen ERA" oder „LERA" Ausführungsform der Erfindung unterscheidet sich von den vorher beschriebenen ERA Ausführungsformen dadurch, dass in der LERA die Blockierungs- und Primer-Oligonukleotide vorzugsweise über eine Oligonukleotidbrücke aneinander gebunden sind. Insbesondere verbindet die Brücke das 3' Ende des Blockierungs-Oligonukleotids mit dem 5' Ende des Primer-Oligonukleotids, so dass das resultierende Molekül als ein offen kreisförmiges, oder „Schleifen-" Oligonukleotid beschrieben werden kann.
Das Verbinden des Blockierungs-Oligonukleotids an das Primer-Oligonukleotid kann durch beliebige Mittel erreicht werden, die nicht die Hybridisierung der Blockierungs-Oligonukleotid- und Primer-Oligonukleotidteile der Schleife an eine gewünschte Zielsequenz unter sehr scharfen Bedingungen stören und die nicht die exponentielle Amplifikation der Zielsequenz stören. Das Verbinden wird unter Verwendung einer Sequenz mit „unspezifischen" Nukleotiden (das heißt eine Sequenz, die zu einem beliebigen Abschnitt der Zielsequenz nicht komplementär sein muß) ausgeführt; die Verwendung solcher unspezifischer Nukleotide gestattet vorteilhafterweise die Synthese der Schleife während der Herstellung der Oligonukleotide, das heißt ein einzelnes Oligonukleotid wird hergestellt, das sowohl das Blockierungs-Oligonukleotid als auch das Primer-Oligonukleotid und eine nicht spezifische Region umfaßt.
Die LERA Ausführungsform ist in 9 erläutert. Besonders bevorzugt kann die Schleife als ein Einzelstrang synthetisiert werden; wie in 9A schematisch ausgeführt ist, sind Blockierungs-Oligonukleotid- und Primer-Oligonukleotidregionen der Schleife gekennzeichnet, wobei die gestrichelten Linien die unspezifische Region (vorzugsweise Nukleotide) darstellen. Die Blockierungs-Oligonukleotid- und Primer-Oligonukleotidregionen der Schleife sind zu den vorstehend diskutierten Blockierungs- und Primer-Oligonukleotiden funktional gleichwertig.
Da die Blockierungs-Oligonukleotid- und Primer-Oligonukleotidregionen der Schleife in der Lage sein müssen, so an ein Ziel zu hybridisieren, dass das 5' Ende der Blockierungs-Oligonukleotidregion an das 3' Ende der Primer-Oligonukleotidregion angrenzt oder so, dass zwischen diesen Regionen eine Lücke erzeugt wird, muß die unspezifische Region der Schleife eine Länge aufweisen, die ausreichend ist, um die Hybridisierung der Blockierungs-Oligonukleotid- und Primer-Oligonukleotidregionen an die Zielsequenz in einer mit dieser Forderung übereinstimmenden Weise zu gestatten. 9B stellt eine solche Hybridisierung schematisch dar und wie bei der Hybridisierung der Blockierungs-Oligonukleotid- und Primer-Oligonukleotidregionen an das Ziel ersichtlich ist, wird eine „Schleife'' gebildet, die eine Öffnung umfaßt.
Besteht die unspezifische Region nur aus Nukleotiden (wie besonders bevorzugt ist), ist deren Länge vorzugsweise größer als ungefähr 40 Basen, bevorzugter größer als ungefähr 50 Basen. Bei Verwendung von anderen Linkern, wie zum Beispiel hydrophile, lineare oder verzweigte organische Moleküle, wie zum Beispiel hydrophile aliphatische Linker, kann die Zahl an Basen entsprechend abnehmen. Die funktionale Absicht der unspezifischen Region ist es, eine Verbindung zur Verfügung zu stellen, die ausreicht, um (a) die Bindung der Blockierungs-Oligonukleotidregion an die Primer-Oligonukleotidregion und (b) die Hybridisierung der Blockierungs- Oligonukleotidregion und der Primer-Oligonukleotidregion an ihre entsprechenden komplementäre Regionen auf der Zielsequenz (den Zielsequenzen) zu gestatten.
Nach Hybridisierung der Schleife an die Zielsequenzen) findet im Fall eines Einzelstrangziels ein Verknüpfungsereignis oder eine Primer-Oligonukleotidverlängerungsreaktion mit anschließendem Verknüpfungsereignis statt (bei geeigneter Anordnung von Ziel und der definierten Sequenzen der Blockierungs-Oligonukleotid- und Primer-Oligonukleotidregionen der Schleife). Danach trennt sich die vervollständigte Schleife vom Ziel. Anschließend ist das End-Run-Oligonukleotid, das in Übereinstimmung mit den allgemeinen Merkmalen der ERA besonders bevorzugt zu einem Segment der Blockierungs-Oligonukleotidregion komplementär ist, in der Lage, an die vervollständigte Schleife zu hybridisieren, und wird längs der Schleife in einer Polymerase vermittelten templatabhängigen Verlängerungsreaktion verlängert. 9C stellt eine schematische Darstellung der Hybridisierung des End-Run-Oligonukleotids an die vervollständigte Schleife und der Verlängerung des End-Run-Oligonukleotids zur Verfügung.
Bezeichnenderweise kann das Vorhandensein von Ligaseenzym innerhalb des Reaktionsbehälters ein Verknüpfungsereignis zwischen dem 5' Ende des End-Run-Oligonukleotids und dem 3' Ende von dessen Verlängerungsprodukt katalysieren und dadurch ein kovalent geschlossenes kreisförmiges Doppelstrangmolekül erzeugen. Da die Trennung der Stränge eines solchen Moleküls schwierig sein kann, kann die Bildung eines derartigen Moleküls die exponentielle Amplifikation des Zielmoleküls beeinträchtigen. Damit diese Möglichkeit vermieden wird, wird der Einbau einer Verknüpfungs-Blockierungsgruppe am 5' Ende des End-Run-Oligonukleotids bevorzugt. Falls eine derartige Gruppe vorhanden ist, dann wird unter Denaturierungsbedingungen das verlängerte End-Run-Oligonukleotid als ein Templat dienen, das zu den Blockierungs-Oligonukleotid- und Primer-Oligonukleotidregionen der Schleife komplementäre Regionen umfaßt, wodurch die exponentielle Amplifikation erleichtert wird. 9D stellt schematisch die Trennung des End-Run-Verlängerungsprodukts von der vervollständigten Schleife dar.
LERA kann ebenfalls verwendet werden, wenn das Ziel ein Doppelstrangmolekül ist. Weiterhin findet eine Verlängerung des End-Run-Oligonukleotids längs des Ziel strangs statt, da das End-Run-Oligonukleotid ebenfalls mit einem Abschnitt eines der Zielstränge hybridisieren kann.
In manchen LERA Unterausführungsformen ist die nicht spezifische Brückenregion der Schleife so modifiziert, dass sie Regionen einschließt, die gewünschte Merkmale besitzen. Zum Beispiel kann die Brücke eine oder mehrere Restriktionsstellen enthalten, so dass das Klonieren oder Sequenzieren des amplifizierten Moleküls erleichtert ist. Bezeichnenderweise kann eine derartige Restriktionsstelle anstatt des Zugebens der Blockierungsgruppe verwendet werden, die erwünschterweise zum 5' Ende des Blockierungs-Oligonukleotids als ein alternatives Mittel zur Absicherung gegen die Bildung kovalent geschlossener kreisförmiger Doppelstrangmoleküle zugegeben wird. Die Brückenregion kann ebenfalls modifizierte Basen enthalten, insbesondere Desoxyuridin oder Ribonukleotide, so dass das resultierende Molekül dem Abbau, durch zum Beispiel RNAse H, UDG und Endonuklease IV unterzogen werden kann, so dass jede Verknüpfung der 3' und 5' Enden des End-Run-Verlängerungsprodukts die geschlossene Schleife „öffnen" wird, wodurch sich ein Templat für die weitere Amplifikation bildet. Vorteilhafterweise kann wärmebeständige RNAse H verwendet werden. Siehe Itaya et al., Nuc. Acids Res. 19: 4443–4449 (1991), auf dessen Offenbarungsgehalt hier vollumfänglich Bezug genommen wird.
Die unpezifische Brückenregion kann ebenfalls so ausgelegt werden, dass sie eine Vielfalt verschiedener funktioneller Parameter enthält. Zum Beispiel können in die Region Hybridisierungseinfangregionen eingebaut werden, um die Rückgewinnung des amplifizierten Produkts zu erleichtern.
Bezeichnenderweise kann die Brückenregion den Ursprung der Replikationssequenzen enthalten, so dass das Amplifikationsprodukt nach Transformation in einen geeigneten Wirt klonal repliziert werden kann. In einer solchen Unterausführungsform ist die Blockierung des 5' Endes des Blockierungs-Oligonukleotids nicht notwendig. Die Brückenregion kann ebenfalls Gensequenzen enthalten, besonders Gensequenzen, die auswählbare Markierungen kodieren.
In noch einer anderen Unterausführungsform kann die Brückensequenz Promotor- oder Proto-Promotorsequenzen enthalten (das heißt, eine Sequenz, deren Komple ment ein Promotor ist), so dass nach Verlängerung des End-Run-Oligonukleotids eine zur Transkription aktive Stelle erzeugt wird, die zum Transkribieren der Zielsequenzen in der Lage ist. Bevorzugte derartige Stellen umfassen die T7 und SP6 RNA-Polymerasebindungsstellen, die die Transkription (in Gegenwart von zum Beispiel RNA-Polymerase und Ribonukleotidtriphosphaten) gestatten. In dieser Unterausführungsform ist keine Blockierungsgruppe erforderlich, da der Zusammenschluß des End-Run-Verlängerungsprodukts nicht von Bedeutung ist.
Vorteilhafterweise wird ein Strang, der über RNA-Polymerase vermittelte Transkription gebildet wurde, von der Schleife verdrängt, ohne dass zum Beispiel Wärmedenaturierung benötigt wird. Somit werden durch die Zugabe von RNA-Polymerase und Ribonukleotidtriphosphaten vielfache Kopien eines Templats von nur einer einzigen geschlossenen Schleife erzeugt. Dies führt sogar zu einer größeren exponentiellen Amplifikation (das heißt Amplifikation mit einem höheren Exponenten). Weiterhin können die Zyklusreaktionen bei isothermen Temperaturen durchgeführt werden, das heißt bei ungefähr 37°C, weil die durch die RNA-Polymerase vermittelten amplifizierten Stränge verdrängt werden, ohne dass Denaturierung benötigt wird. Wie klar ist, gestattet dies die Verwendung nicht wärmebeständiger Ligase und Polymerase und vermeidet den Bedarf von Temperaturwechseln.
Bei der Verwendung der RNA-Polymerase vermittelten LERA wird bevorzugt, dass das Verhältnis von RNA-Polymerase zu Ligase und/oder DNA-Polymerase mindestens ungefähr 5 : 1 oder mehr beträgt. Weiterhin beträgt das Verhältnis der gesamten Rinonukleotidtriphosphate zu den gesamten Desoxyribonukleotidtriphosphaten vorzugsweise mindestens ungefähr 5 : 1 oder mehr.
Die Brückenregion kann ebenfalls eine ortsspezifische Rekombinationsstelle, wie zum Beispiel att oder loxP Stellen (Weisberg, R. et al., In: Lambda II, (Hendrix, R. et al., Herausgeber), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, Seiten 211– 250 (1983); Hoess, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A) 79: 3398–3402 (1982); Sauer, B. L., U.S. Patent Nr. 4,959,317, auf deren Offenbarungsgehalt hier vollumfänglich Bezug genommen wird)) enthalten, um die Klonierung oder Multiplexsequenzierung des Ziels zu erleichtern (PCT Patentanmeldung WO92/22650).
Die LERA Ausführungsform kann auf dieselbe Weise wie die ERA „mit Lücke" oder die ERA „ohne Lücke" verwendet werden und kann somit sowohl zu Identifizierung genetischer Mutationen sowie auch zur Amplifizierung von Nukleinsäuremolekülen mit teilweise unbekannten Sequenzen verwendet werden. Bezeichnenderweise wird die LERA Ausführungsform jedoch besonders in Amplifikationsverfahren bevorzugt, die eine eventuelle Klonierung des amplifizierten Zielmoleküls erfordern.
5. „Zwillingsverknüpfungs" ERA
Die „Zwillingsverknüpfungs" ERA ist eine ERA Ausführungsform, die insbesondere so angepasst ist, dass sie den Nachweis mehrfach verbundener Mutationen in einem Zielmolekül gestattet.
Das Verfahren unterscheidet sich von anderen ERA Verfahren dadurch, daß es ein zusätzliches Blockierungs-Oligonukleotid verwendet. Dieses zweite Blockierungs-Oligonukleotid ist so gelegen und ausgerichtet, dass es die Verlängerung des End-Run-Oligonukleotids an einer speziellen Stelle blockiert. So wie die Verknüpfung des Primer-Oligonukleotids und des Blockierungs-Oligonukleotids zur Amplifikation in ERA notwendig sind, so ist zusätzlich die Verknüpfung des 5' Endes des zweiten Blockierungs-Oligonukleotids mit dem 3' Ende des End-Run-Verlängerungsprodukts in der „Zwillingsverknüpfungs" ERA erforderlich.
Da die Verknüpfungsreaktionen zur Herstellung eines Amplifikationsprodukts auf jedem Strang stattfinden müssen, kann das Verfahren zur Identifikation der Nukleotide verwendet werden, die an zwei Positionen in der Zielsequenz vorhanden sind. Die Amplifikation ist daher von der Fähigkeit des 5' endständigen Nukleotids von jedem Blockierungs-Oligonukleotid zur Hybridisierung an das Ziel abhängig.
In dieser Ausführungsform wird besonders bevorzugt, das Blockierungs-Oligonukleotid des End-Run-Oligonukleotids so auszulegen, dass es zur Hybridisierung an eine Sequenz innerhalb oder in der Nähe der Primer-Oligonukleotid-Hybridisierungsstelle in der Lage ist.
Das Vorhandensein von stumpfen Doppelstrang-Oligonukleotiden kann den Gehalt an unechter Verknüpfung stumpfer Enden erhöhen. Bei der Ausübung dieser Ausführungsform ist daher die Verwendung von Blockierungsgruppen und Überhängen erwünscht.
Wie klar ist, kann die Ausführungsform so gegliedert werden, dass entweder für einen oder beiden Stränge das Primer-Oligonukleotid oder das End-Run-Oligonukleotid und deren entsprechenden Blockierungen aneinandergrenzen oder an das Ziel unter Bildung einer „Lücke" hybridisieren. Ähnlich kann entweder einer der beiden oder beide Sätze von Primern und Blockierungen unter Bildung einer „Schleifen" ERA Reaktion aneinander gebunden werden. Ähnlich kann die „Zwillingsverknüpfungs" Ausführungsform mit jeder anderen ERA Ausführungsform kombiniert werden.
6. „Inverse" ERA
Die meisten Nukleinsäureamplifikationsverfahren vermitteln die Amplifikation einer Gensequenz nur dann, wenn die flankierende Sequenzinformation bestimmt worden ist. In vielen Fällen stellt die Erfordernis für die Sequenzinformation von zwei Regionen eines Zielmoleküls ein unüberwindliches Hindernis für die Amplifikation dar. Die „inverse" ERA ist eine Variation der ERA, die in solchen Umständen mit Doppelstrang-DNA verwendet werden kann, um die exponentielle Amplifikation der Zielsequenz zu erreichen. Die „inverse" ERA ist daher analog zur „inversen" PCR (U.S. Patent 4,994,370).
Bei der Ausübung der „inversen" ERA ist somit eine vorherige Sequenzinformation nur für eine Region des Zielmoleküls vorhanden. Die vorhandene Sequenzinformation wird vorzugsweise zur Bestimmung der Identität von mindestens einer Restriktionsendonuklease überprüft, die nicht zur Spaltung innerhalb des sequenzierten Bereichs des Ziels in der Lage ist. Sobald ein derartiges geeignetes Enzym identifiziert worden ist, wird es zum Spalten des Zielmoleküls angewandt. Alle dadurch erzeugten Fragmente werden Enden enthalten, die entweder stumpf oder kohäsiv sind. Bezeichnenderweise können die Enden von jedem Fragment unter Bildung kovalent geschlossener kreisförmiger Doppelstrangmoleküle miteinander verknüpft werden.
Eine derartige Verknüpfung ist der nächste Schritt in dem „inversen" ERA Protokoll. Besonders bevorzugt werden die resultierenden kovalent geschlossenen kreisförmigen Doppelstrangmoleküle so eingeschnitten sein, dass die Strangverdrängung erleichtert ist. Besonders bevorzugt wird die Strangverdrängung so ausgeführt, dass kovalent geschlossene Einzelstrangmoleküle erhalten werden.
Der sequenzierte Bereich des Ziels wird zur Definition der Sequenz des Primer-, Blockierungs- und End-Run-Oligonukleotids verwendet. In der „inversen" ERA hybridisiert das Blockierungs-Oligonukleotid an einer bezüglich der Primer-Oligonukleotidhybridisierungsstelle 5' befindlichen Stelle. Daher sind in Bezug auf die vorhergehenden Ausführungsformen die entsprechenden Positionen der Blockierungs- und Primer-Oligonukleotide umgekehrt.
In der „inversen" ERA sind die Primer- und Blockierungs-Oligonukleotide so ausgelegt, dass das 3' Ende des hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotids an das 5' Ende des Primer-Oligonukleotids angrenzt. Bei einer solchen Ausrichtung führt die Polymerase vermittelte templatabhängige Verlängerung des Primer-Oligonukleotids zu einem Verlängerungsprodukt, das das kreisförmige Zielmolekül einkreist.
Das End-Run-Oligonukleotid ist so ausgelegt, dass es zur Hybridisierung an das Blockierungs-Oligonukleotid in der Lage ist. Wie in der ERA Reaktionen wird daher eine exponentielle Amplifikation des Ziels erreicht.
Die „inverse" ERA weist daher die Fähigkeit zur Amplifikation von Molekülen auf, in denen nur eine Region sequenziert worden ist. Bezeichnenderweise ist durch das Verlegen der 5' endständigen Base des Blockierungs-Oligonukleotids an eine polymorphe Stelle, es möglich, die „inverse" ERA zur Bestimmung zu verwenden, ob ein Individuum ein „normales" oder „mutiertes" Allel von einem speziellen Gen aufweist. Somit kann die „inverse" ERA auf dieselbe Weise wie die ERA „ohne Lücke" zur Diagnose einer genetischen Krankheit verwendet werden.
7. „Blinde" ERA
„Blinde" ERA ist eine Variation der ERA „mit Lücke" und ist besonders für Forschungs- und medizinische Anwendungen geeignet. „Blinde" ERA verwendet die Sequenz der Primer- und Blockierungs-Oligonukleotide, um das Vorhandensein einer „hypothetischen" Zielsequenz in einer Probe zu untersuchen. Sie wird auf dieselbe Weise wie die ERA „mit Lücke" durchgeführt, abgesehen davon, dass in der „blinden" ERA die Reaktanden zur Definition der „gewünschten" Zielsequenz verwendet werden, wohingegen in anderen ERA Ausführungsformen die Zielsequenz zur Definition der Sequenzen der Primer-, Blockierungs- und End-Run-Oligonukleotide verwendet wird Wie klar ist, kann das Verfahren zur selektiven Amplifizierung von Zielmolekülen verwendet werden, die einen beliebigen Satz von Merkmalen besitzen.
Ist zum Beispiel das Primer-Oligonukleotid in der Lage, an eine gewünschte DNA-Bindungsstelle zu binden (wie zum Beispiel eine hormonale Rezeptorbindungsstelle, eine Promotorstelle, usw.) und wird das Blockierungs-Oligonukleotid so ausgewählt, dass es in der Lage ist, an eine Restriktionsendonuklease-Erkennungsstelle oder an eine Kombination solcher Stellen zu binden, so ist daher das Verfahren der Erfindung in der Lage, alle Sequenzen zu amplifizieren, die den Kriterien genügen, eine Bindungsstelle und eine Restriktionsstelle zu besitzen.
8. „Festphasen" ERA
Die vorstehend diskutierten ERA Reaktionen können in Lösung ausgeführt werden. Alternativ dazu kann die Reaktion jedoch in einer festen Phase unter Verwendung eines Zielmoleküls durchgeführt werden, das auf einem festen Träger immobilisiert worden ist. Alternativ dazu kann das 5' Ende des Primer-Oligonukleotids oder das 3' Ende des Blockierungs-Oligonukleotids immobilisiert werden.
Verfahren zur Immobilisierung von Nukleinsäuren werden zum Beispiel von Ruth, J. L. (U.P. Patent 4.948,882), Gilham et al. (J. Amer. Chem. Soc., 86: 4982 (1964)), Nickerson et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 87: 8923–8927 (1990) und Kremsky et al. (Nucleic Acids Research 15: 3131–3139 (1987)) diskutiert.
Das Trägermaterial, auf das das Zielmolekül oder ein Reaktand gebunden werden kann, kann einen beliebigen festen Träger (zum Beispiel Glas, Polystyrol, Polypropy len, Polyethylen, Dextran, Nylon, Amylasen, natürliche und modifizierte Zellulosen, Polyacrylamide, Agarosen und Magnetit) umfassen. Die Beschaffenheit des Trägers kann so sein, dass er für die Zwecke der vorliegenden Erfindung bis zu einem gewissen Ausmaß entweder löslich oder unlöslich ist. Das Trägermaterial kann praktisch jede mögliche strukturelle Konfiguration aufweisen. Die Trägerkonfiguration kann somit kugelförmig, wie bei einer Perle, oder zylindrisch, wie die innere Oberfläche eines Teströhrchens oder die äußere Oberfläche eines Stabes sein. Alternativ dazu kann die Oberfläche flach wie ein Blatt, Teststreifen, usw. sein.
9. „ERA Sequenzierung"
Die ERA Reaktionen sind zur Verwendung für die Bestimmung der Sequenz von Zielmolekülen besonders geeignet. Insbesondere erleichtert die Erfindung die Verwendung von sowohl dem „Didesoxy vermittelten Kettenabbruchverfahren", das ebenfalls als „Sanger Verfahren" der DNA-Sequenzierung bekannt ist (Sanger, F., et al., J. Mol. Biol. 94: 441 (1975)), als auch dem „Maxam-Gilbert chemischen Abbauverfahren" (Maxam, A. M., et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 74: 560 (1977)), auf deren Offenbarungsgehalte hier vollumfänglich Bezug genommen wird.
A. Anwendung auf die Didesoxy-Sequenzierung
In dem Didesoxy vermittelten oder „Sanger" Kettenabbruchverfahren der DNA-Sequenzierung, wird die Sequenz eines DNA-Moleküls durch die Verlängerung eines Oligonukleotidprimers erhalten, der an das zu sequenzierende Nukleinsäuremolekül hybridisiert ist (das heißt, das „Ziel"). In den einfachsten Ausführungsformen werden vier einzelne Primerverlängerungsreaktionen durchgeführt. Jede Reaktion wird in Gegenwart von DNA-Polymerase, dNTPs und einem 2',3' Didesoxyderivat von A, T, C oder G Nukleotidtriphosphat durchgeführt. Der Einbau eines Didesoxynukleotids führt zur Beendigung der Verlängerungsreaktion. Da die Didesoxyderivate in geringeren Konzentrationen vorhanden sind, als ihre entsprechenden üblichen Nukleotidtriphosphatanaloga, ist das Endergebnis von jeder der vier Reaktionen, die Erzeugung eines Satzes verschachtelter Oligonukleotide, von denen jedes durch das in der Reaktion verwendete spezielle Didesoxyderivat beendet ist. Indem die Reaktionsprodukte von jeder der Verlängerungsreaktionen der Elektrophorese unterzogen werden, ist es möglich eine Reihe von vier „Leitern" zu erhalten, die leicht in die Sequenz des verlängerten Primers translatiert werden können.
Kürzlich wurden verbesserte Verfahren der Didesoxy-Sequenzierung entwickelt, die die Geschwindigkeit der Datengewinnung stark erhöhen. Durch die Verwendung verschieden markierter Didesoxynukleotide wurde insbesondere vermieden, dass die Durchführung der vorstehend beschriebenen einzelnen Sequenzierungsreaktionen erforderlich ist. Durch die Verwendung fluoreszierend markierter Didesoxynukleotidderivate ist es möglich, das Verfahren zu Ableitung der Nukleotidsequenzierung des Ziels vollständig zu automatisieren. Solche Fortschritte in der Sequenzierungstechnologie sind zum Beispiel von Prober, J. M. et al., Science 238: 336–340 (1987) beschrieben, auf dessen Offenbarungsgehalt hier vollumfänglich Bezug genommen wird).
Die vorliegende Erfindung vereinfacht Didesoxy-Sequenzierungsverfahren, indem die Verfahren, die zum Trennen der Stränge der Amplifikationsprodukte befolgt werden, vereinfacht werden. In einer Ausführungsform wird dies durch Denaturierung des Doppelstrang-Amplifikationsprodukts und durch anschließendes in Kontakt bringen der Mischung der Einzelstrangmoleküle mit einer immobilisierten Sonde erreicht, die in der Lage ist, spezifisch an einen der Stränge zu binden.
Eine wesentliche Verbesserung in der Didesoxy DNA-Sequenzierungstechnologie wurde kürzlich entwickelt und mit „Multiplex DNA-Sequenzierung" bezeichnet (Church, G. M., et al., Science 240: 185–188 (1988); Church, G. M. et al., U.S. Patent 4,942,124; auf deren Offenbarungsgehalte hier vollumfänglich Bezug genommen wird). Die Multiplex DNA-Sequenzierung verwendet DNA-Bibliotheken, die in verschiedenen Vektoren einzeln so aufgebaut werden, dass die zu bestimmende Sequenz von zwei verschiedenen vorher definierten Oligonukleotid- „Markierungen" flankiert wird.
Der Pool der Reaktionsprodukte wird dann auf ein Sequenzierungsgel aufgetragen und die Oligonukleotide in der DNA-Probe werden unter Verwendung von Gelelektrophorese getrennt. Die somit erhaltenen DNA-Muster werden dann von den Ge len auf Nylonmembranen elektrisch übertragen und mit den Membranen unter Verwendung von UV-Licht vernetzt.
Da jede Spur des Gels die Reaktionsprodukte der Sequenzierung von vielen verschiedenen DNA-Molekülen enthält, enthält jede Spur vielfach überlagerte Leitern der Sequenzinformation. Jede einzelne Leiter kann jedoch getrennt durch Hybridisierung einer markierten Sonde für eine spezielle Markierung an die DNA sichtbar gemacht werden, die an die Membran gebunden ist. Durch wiederholtes Testen der Membran mit verschiedenen Sonden, kann die Sequenz jedes Zielmoleküls bestimmt werden.
Die vorliegende Erfindung kann zur Vereinfachung Anwendung der Multiplexsequenzierung verwendet werden. In dieser Hinsicht können die Primer- und Blockierungs-Oligonukleotide (oder deren Komplemente) als „Markierungen" wirken, um die zu verwendenden Multiplexanalyseverfahren zu gestatten.
B. Anwendung auf die Maxam-Gilbert Sequenzierung
Das Maxam-Gilbert Verfahren der DNA-Squenzierung ist ein abbauendes Verfahren. In diesem Verfahren wird ein DNA-Fragment an einem Ende markiert und in vier einzelnen chemischen Reaktionen teilweise gespalten, von denen jede für das Spalten des DNA-Moleküls an einer speziellen Base (G oder C) bei einem speziellen Basentyp (A/G, C/T oder A > C) spezifisch ist. Wie in dem vorstehend beschriebenen Didesoxy-Verfahren bewirken solche Reaktionen die Erzeugung eines Satzes verschachtelter Moleküle, deren Längen durch die Stellen einer speziellen Base längs der Länge des zu sequenzierenden DNA-Moleküls bestimmt werden. Die verschachtelten Reaktionsprodukte werden dann durch Elektrophorese zerlegt und die Sequenz wird abgeleitet.
10. Verwendung der „ERA" in amplifizierbaren Nachweissystemen
Die hier beschriebenen ERA Reaktionen sind gut zur Verwendung in amplifizierbaren Nachweissystemen zum Nachweis von praktisch allem geeignet, an das eine DNA oder RNA chemisch oder physikalisch gebunden werden kann. ERA kann zur Be stimmung des Vorhandenseins oder der Abwesenheit der DNA oder RNA verwendet werden. In einer Ausführungsform wird ERA in Techniken verwendet, die den Nachweis von Antigenen in diagnostischen oder gerichtsmedizinischen Anwendungen betreffen. In dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein bispezifisches Linkermolekül zur Bindung eines DNA-Zielmoleküls an einen Antigen-Antikörperkomplex verwendet. Wurde das Zielmolekül so angepasst, dass es biotinylierte Nukleotide enthält, kann somit der DNA-Bindungsteil des Linker zum Beispiel Avidin, Streptavidin oder ein Biotin-bindendes Protein umfassen. Der Antigen-Antikörperbindungsteil des Linkers kann einen Antikörper (der entweder mit dem Antigen oder mit dem Antikörper des Komplexes reaktiv ist) oder ein Bindungsprotein umfassen. Solche Antikörper können polyklonal, monoklonal oder synthetisch (das heißt aus rekombinanten oder synthetischen Verfahren resultierend) sein. Antikörperfragmente (wie zum Beispiel Fab- oder F(ab)²-Fragmente, usw.) können alternativ dazu verwendet werden.
In dieser Ausführungsform erleichtert die Erfindung den Nachweis des Antigen-Antikörperkomplexes. Dies wird durch Inkubieren des Antigen-Antikörperkomplexes in Gegenwart der Ziel-DNA und des Linkermoleküls erreicht. Eine dieser molekularen Spezies wird vorzugsweise so auf einen festen Träger immobilisiert, wie zum Beispiel eine Mikrotiterplatte, ein Pegelstab, eine Membran, Papier usw., dass die Trennung der nicht gebundenen Ziel-DNA von gebundener Ziel-DNA vereinfacht ist.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung werden dann zur Amplifikation eines beliebigen Zielmoleküls angewandt, das an den Antigen-Antikörperkomplex gebunden oder damit assoziiert worden ist. Der Nachweis eines beliebigen amplifizierten Zielmoleküls zeigt somit das Vorhandensein des Antigen-Antikörperkomplexes an. Die Verwendung von PCR zum Nachweis von Antigen-Antikörperkomplexen wurde von Sano et al. (Science 258: 120–122 (1992), auf dessen Offenbarungsgehalt hier vollumfänglich Bezug genommen wird) berichtet.
Die vorliegende Erfindung umfaßt Herstellungsgegenstände, wie zum Beispiel „Kits". Derartige Kits werden typischerweise speziell so angepasst, dass sie Reagenzien (einschließlich Oligonukleotide), Enzyme, Puffer, usw. zur Amplifikation von wenigstens einer Zielsequenz enthalten, die wenigstens eine Region mit einer definierten Nukleinsäuresequenz umfaßt. Ein bevorzugtes Kit umfaßt wenigstens einen Behälter, der wenigstens ein Blockierungs-Oligonukleotid, wenigstens ein Primer-Oligonukleotid und wenigstens ein End-Run-Oligonukleotid enthält. Diese Moleküle werden einen oder mehrere Sätze von Blockierungs-, Primer- und End-Run-Oligonukleotiden umfassen, wobei das Blockierings-Oligonukleotid eines Satzes von Oligonukleotiden zur Hybridisierung an einen Teil (das heißt eine Region oder Oligonukleotid-Untersatz) einer Zielnukleinsäuresequenz in der Lage ist, das Primer-Oligonukleotid dieses Satzes zur Hybridisierung an einen unterschiedlichen Teil derselben Zielnukleinsäuresequenz in der Lage ist und das End-Run-Oligonukleotid dieses Satzes eine Sequenz umfaßt, die zu wenigstens einem Teil des Blockierungs-Oligonukleotids des Satzes komplementär ist.
In einer Ausführungsform umfaßt das Kit für jedes oder einige der Reagenzien, Enzyme oder Puffer getrennte Behälter. Vorzugsweise werden einige oder die gesamten Oligonukleotide des Kits zusammengemischt. Tatsächlich können die gesamten Blockierungs-, Primer- und End-Run-Oligonukleotide innerhalb eines einzigen Behälters vorhanden sein.
Ein besonders bevorzugtes Kit, das Reagenzien zur Amplifikation von wenigstens einer Zielsequenz umfaßt, die wenigstens eine Region umfaßt, die eine definierte Nukleinsäuresequenz aufweist, würde ein Kit sein, das wenigstens einen Behälter umfaßt, wobei der Behälter wenigstens eine Blockierungseinheit, wenigstens eine Primereinheit und wenigstens eine End-Run-Einheit umfaßt und wobei die Blockierungseinheit zur Hybridisierung an einen Teil der Nukleinsäuresequenz in der Lage ist, die Primereinheit zur Hybridisierung an einen unterschiedlichen Teil der Nukleinsäuresequenz in der Lage ist und die End-Run-Einheit eine Sequenz umfaßt, die zu wenigstens einem Teil der Blockierungseinheit komplementär ist.
Die Puffer, die optional in dem Kit enthalten sein können, können so eingestellt werden, dass sie eine spezielle Reaktion (wie zum Beispiel eine Verknüpfung oder Polymerisation) auf Kosten anderer Reaktionen optimieren. Alternativ dazu können die Puffer so ausgelegt werden, dass sie einen Satz enzymatischer Reaktionen (wie zum Beispiel eine Verknüpfung oder Polymerisation) optimieren. Solche Puffer können in konzentrierter Form vorliegen, so daß nach Verdünnung eine gewünschte Pufferka pazität erhalten wird. In einem bevorzugten Kit enthalten die Behälter, die die Oligonukleotide enthalten, ebenfalls Puffer. In einer alternativen Ausführungsform können die Behälter derartige Oligonukleotide in einer gefriergetrockneten Form enthalten, die mit Wasser oder einem geeigneten Puffer wiederhergestellt werden können. In einer Unterausführungsform können solche Behälter ebenfalls Salze oder gefriergetrocknete Puffer enthalten, so dass nach Wiederherstellung mit Wasser eine gepufferte Lösung erhalten wird.
Das Kit kann weiterhin Polymerase- und/oder Ligaseenzyme, Gebrauchsanweisungen und dergleichen enthalten.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Kits zur Verfügung gestellt, die wenigstens einen geeigneten Puffer und optional Zusatzstoffe zur Optimierung der Verlängerungs-, Hybridisierungs- und Verknüpfungsreaktionen der vorliegenden Erfindung umfassen. Solche Kits stellen alle oder Teile von geeigneten Puffern, Enzymen und Zusatzstoffen zur Verfügung, damit der Fachmann zur Ausübung der hier beschriebenen ERA Verfahren in der Lage ist, und sie sind besonders für den Fachmann geeignet, der Blockierungs-, Primer- und End-Run-Oligonukleotide synthetisiert oder anderweitig erhält. Pufferkits können einen einzigen geeigneten Puffer, wie zum Beispiel Trishydranrmethylaminomethansalzsäure in konzentrierter, gefriergetrockneter oder verdünnter Form umfassen. Kits können optional Puffer und Zusatzstoffe, wie zum Beispiel Enzyme, Kaliumchlorid, Magnesiumchlorid, Nikotinamidadenindinukleotid, Rinderserumalbumin und nicht-ionisches Detergenz umfassen.
Nach der jetzigen allgemein beschriebenen Erfindung, wird die Erfindung leichter durch Bezugnahme auf die folgenden zur Erläuterung bereitgestellten Beispiele verständlich, die keine Einschränkung der vorliegenden Erfindung beabsichtigen, es sei denn, es ist angegeben.
BEISPIEL I
Zur Erläuterung der ERA wurde ein „Zielmolekül", und Primer-, Blockierungs- und End-Run-Oligonukleotide hergestellt. Eine schematische Ausrichtung der Blockie rungs-, Primer- und End-Run-Oligonukleotideinheiten, gegenüber dem Ziel ist in 10 dargestellt.
Die Synthese der Oligonukleotideinheiten (Blockierungs-, Primer-, End-Run-Oligonukleotid) und des Einzelstrang-Ziels wurde auf einem Pharmacia LKB (Upsal-la, Sweden) Gen Assembler^® plus DNA-Synthesevorrichtung unter Verwendung von Beckman Instruments, Inc. (Fullerton, CA) Phosphoramiditen (Produktnummern A:338231, C:338232; G:338233; T:338234) durchgeführt. Für die Synthese, Entschützung und Spaltung wurden die Anweisungen des Herstellers befolgt. dNTPs wurden von einem Geneamp^® PCR Reagenzkit (Perkin Elmer, Kat.-Nr. N801-055) erhalten. Wie in den gesamten anschließenden Verfahren waren die Chemikalien mindestens von ACS Qualität.
Die Sequenzen wurden folgendermaßen erzeugt:
Ziel (SEQ ID Nr. 1)
Blockienings-Oligonukleotid (SEQ ID Nr. 2)

CCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGddG

Das 3' Ende des Blockierungs-Oliognukleotids wurde durch Addition von ddGTP blockiert; daher war das Blockierungs-Oligonukleotid während der ERA Reaktion ein 24-mer.
Primer (SEQ ID Nr. 3)

GCGCCATTCG

End-Run-Oligonukleotid (SEQ ID Nr. 4)

GTTGCGCAGCCTGAATGG

Die Primer- und End-Run-Oligonukleotide wurden unter Verwendung von T4-Polynukleotidkinase und y³²P ATP (Amersham) entsprechend dem in Sambrook J. et al. (in: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)) beschriebenen Protokoll markiert. Die Reaktionsbedingung wurde modifiziert, wobei die Markierungsreaktion bei 37°C während 1 Stunde, mit anschließender Zugabe von 0,5 Mm „kaltem" ATP (das heißt nicht radioaktiv) durchgeführt wurde, um sicherzustellen, dass alle mit Kinase behandelten" Enden, die kein radioaktives PO₄ eingebaut hatten, das kalte PO₄ einbauten. Das Blockierungs-Oligonukleotid umfasste ein „kaltes" 5'-PO₄ Ende.
Die verschiedenen Komponenten wurden zu Anfang in einem Reaktionsbehälter auf Eis (4°C) gemischt, um Hybridisierung und enzymatische Aktivität zu verhindern.
Anfangs wurden 5 μl des 10 × Reaktionspuffers in einen 500 μl Behälter gegeben, gefolgt von der Zugabe von 1 μl Zielsequenz (dies sorgte für eine Endkonzentration von 50 nM in einer Gesamtlösung von 20 μl). Danach wurde jedes der vier dNTPs zugegeben, um für jedes dATP, dTTP, sCTP und dGTP in einer Gesamtlösung von 20 μl eine Endkonzentration von 200 μM zu erreichen. Zu dieser Mischung wurden die markierten Oligonukleotideinheiten zugegeben, so dass eine Endkonzentration von 200 nM für das Blockierungs-Oligonukleotid, 200 nM für das Primer-Oligonukleotid und 150 nM für das End-Run-Oligonukleotid in einer Gesamtlösung von 20 μl erreicht wurde. Darauf folgte die Zugabe von 1 Einheit AMPLIGASE^TM wärmestabiler DNA-Ligase (Epicentre Technologies, Madison, WI. Kat.-Nr A00101, 5000 Einheiten; wie definiert wurde, „katalysiert eine Einheit die Verknüpfung von 50 der cos Stellen in einem Mikrogramm Bakteriophagen lambda DNA in 1 Minute bei 45°C in einer Standard 50 μl Reaktion". Das Enzym weist eine angegebene Halbwertszeit von 48 Stunden bei 65°C und von 1 Stunde bei 95°C auf) mit anschließender Zugabe von 1 Einheit Amplitaq^® DNA-Polymerase (Perkin Elmer, Norwalk, Ct., Kat.-Nr. N801-0060). Anschließend wurde ausreichend zweifach entionisiertes Wasser zugegeben, um ein Endvolumen von 20 μl zu erreichen. Die Konzentrationen der Verbindungen in einem 10x Pufferkonzentrat in einem Endvolumen von 1,0 ml (angepasst mit zweifach destilliertem Wasser) waren folgende: 100 mM Trishydroxymethylaminomethansalzsäure („Tris-HCl"), pH-Wert 7,8; 500 mM Kaliumchlorid, 150 mM Magnesiumchlorid, 25 mM Nad⁺ und 0,01% (w/v) Gelatine (Sigma, St. Louis, MO., Kat.-Nr. G2500).
Nach dem Zusammenmischen der Komponenten wurde der Reaktionsbehälter auf 95°C während 5 Min. auf einem Perkin Elmer Temperaturwechsler 480^TM entsprechend den Anweisungen des Herstellers erwärmt. Darauf wurden 20 Zyklen durchgeführt, wobei jeder Zyklus die folgenden Parameter aufwies: 95°C – 1 Min., 75°C – 4 Min., 45°C – 4 Min. Nach 20 Zyklen wurden 3 μl Harnstoff „Stopp-" Farbstoff (50 Harnstoff, 1% Xylolcyanol, 1% Bromphenolblau, 2x TBE) zugegeben, um Aliquoten von 10 μl abzusondern, die von jedem Reaktionsbehälter erhalten wurden, und die Reaktionsbehälter wurden dann bei 4°C bis zur Analyse gehalten.
Die Reaktionsbehälter wurden während 10 Min gekocht, gefolgt von dem Aufbringen auf ein Elektrophoreseplattengel (15% Acrylamidgel, 19 : 1 Acrylamid : Bis-acrylamid in 7 M Harnstoff und 1 × TBE). Die Elektrophorese wurde unter Verwendung von 250 V (50 mA) während 2 Stunden durchgeführt. Danach wurde die der Elektrophorese unterzogenen Aliquoten einem Kodak X-OMAT^TM AR-Röntgenfilm (Eastman Kodak, Rochester, N. Y. Kat.-Nr. 165-1512) während 90 Min ausgesetzt.
11 stellt eine photographische Wiedergabe der Elektrophoreseergebnisse der Aliquoten zur Verfügung, die von dem vorstehenden Experiment erhalten wurden. Wie aus den belichteten dunklen Banden von Spur 3 in 11 offensichtlich ist, führte das ERA Protokoll zu der Amplifikation der Zielsequenz und es wurde daher festgestellt, dass es eine einzigartige und durchführbare Methode zur Amplifikation einer Zielsequenz zur Verfügung stellte. Signifikanterweise wurden in Spur 3 zwei Banden gefunden, wobei eine aus der Amplifikation eines sogenannten „Verlängerungsprodukts" und eine aus der Amplifikation eines sogenannten „Verknüpfungsprpdukts" resultierte. Solche Banden sind voneinander unterscheidbar, weil das End-Run-Oligonukleotid „kürzer" als das Blockierungs-Oligonukleotid ist und somit das End-Run-Verlängerungsprodukt zu amplifizierten Produkten führt, die „kürzer" als die amplifizierten Produkte sind, die aus der Verknüpfung der Blockierungs- und Primer-Oligonukleotide folgen.
Zur weiteren Bewertung der Leistungsfähigkeit des ERA Protokolls wurden gemeinsam mit der vorstehenden ERA Reaktion mehrere Kontrollexperimente durchgeführt.
Die erste Kontrolle verwendete die vorstehend beschriebenen Ziel, Primer-Oligonukleotid- und End-Run-Oligonukleotidreaktanden, sie wurde jedoch in Abwesenheit des Blockierungs-Oligonukleotids durchgeführt. Daher misst die Reaktion, mit welchem Ausmaß die Verknüpfung des Blockierungs-Oligonukleotids und des Primer-Oligonukleotidverlängerungsprodukts das Amplifikationsprotokoll beeinflusst.
Als Kontrolle wurde das vorstehende Verfahren in Abwesenheit des Blockierungs-Oligonukleotids durchgeführt. Unter solchen Bedingungen findet die Amplifikation vielmehr über PCR als ERA statt. Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Spur 1 von 11 gezeigt. Wie für die PCR charakteristisch ist, haben die Stränge der Amplifikationsprodukte gleiche Größe. Die Tatsache, dass eine PCR-Amplifikation stattfand, zeigte, dass die ERA Amplifikation durch ein unterschiedliches Verfahren vermittelt wurde und nicht durch einen Scheineingriff durch die PCR.
Diese Ergebnisse weisen deshalb darauf hin, dass die durch ERA vermittelte Amplifikation (in Gegenwart von Primer-, Blockierungs- und End-Run-Oligonukleotiden) keine PCR ist.
Als weitere Kontrolle wurde das vorstehend beschriebene ERA Verfahren in Abwesenheit von Ligase durchgeführt. Der Zweck dieser Kontrolle war zu zeigen, dass die Amplifikation nicht von einer PCR resultiert, die durch die Verdrängung des Blockierungs-Oligonukleotids stattfindet. Spur 4 von 11 stellt die Ergebnisse dieses Experiments zur Verfügung. Die Ergebnisse bestätigen die Erwartung, dass wie erwartet in Abwesenheit von Ligase die Blockierungs- und Primer-Oligonukleotide nicht in der Lage sind, kovalent aneinander zu binden und es fand keine Amplifikation der Zielsequenz statt. Denn ohne das Verknüpfungsereignis (und aufgrund der Verwendung eine Einzelstrangziels) wird kein Templat amplifiziert, das in der Lage ist, die Verlängerung des End-Run-Oligonukleotids zu unterstützen.
Als weitere Kontrolle wurde das ERA Protokoll in Abwesenheit des End-Run-Oligonukleotids durchgeführt. Diese Kontrolle untersucht, ob das End-Run-Oligonukleotid benötigt wird, um die exponentielle Amplifikation des Ziels zu erhalten. Spur 2 von 11 zeigt, dass bei abwesendem End-Run-Oligonukleotid nur eine lineare Amplifikation der Zielsequenz erhalten wird. Insbesondere wird nur ein Strang (der Primer-Oligonukleotid – Blockierungs-Oligonukleotidstrang) amplifiziert. Diese Kontrolle zeigt, dass in Abwesenheit des End-Run-Oligonukleotids ein linearer „Oligonukleotid-Verknüpfungsassay" erhalten wird.
Spur 5 von 11 stellt die Ergebnisse einer weiteren Kontrolle zur Verfügung, bei der die ERA Reaktion in Abwesenheit von DNA-Polymerase durchgeführt wird. Wie offensichtlich ist, fand nur eine lineare Amplifikation statt.
Die Spuren 2 und 5 von 11 beweisen weiterhin, dass das ERA Protokoll nicht zu einer exponentiellen Amplifikation führt, es sei denn die gesamten Einheiten werden verwendet. Spur 2, die ein OLA Protokoll zur Verfügung stellte, offenbart eine lineare Amplifikation der Zielsequenz (basierend auf zum Beispiel der relativen Größe und Dichte der autographischen Bande), wie zu erwarten ist. OLA führt nicht zu einer exponentiellen Amplifikation, bei der nur zwei „Primer" und ein Ligaseenzym verwendet werden. Auch wenn das End-Run-Oligonukleotid in Abwesenheit einer Polymerase zu dem Reaktionsbehälter gegeben wird (Spur 5) ist jedoch die resultierende Bande im wesentlichen zu derjenigen von Spur 2 identisch.
Beispiel II
Zu weiteren Bewertung der ERA Leistungsfähigkeit zur Amplifikation eines Zielmoleküls wurde eine weitere Reihe von Experimenten unter Verwendung der Ziel-, Primen, Blockierungs- und End-Run-Oligonukleotide entsprechend der Beschreibung in Beispiel I durchgeführt.
In dieser Reihe von Experimenten wurde die Zielkonzentration um das eintausendfache oder Einmillionfache bezüglich der in Beispiel I verwendeten erniedrigt. In Beispiel 1 betrug die Zielkonzentration ungefähr 10^–9 M (das heißt 10¹² Moleküle pro Probe). In Beispiel II wurden Zielkonzentrationen von ungefähr 10^–12 M (das heißt 10⁹ Moleküle pro Probe) und 10^–15 M (10⁶ Moleküle pro Probe) verwendet. Diese Konzentrationen wurden so ausgewählt, dass sie innerhalb des zum Nachweisen eines einzelnen Gens innerhalb einer menschlichen Probe notwendigen Bereichs lagen.
Für Beispiel II wurden Ziel-, Primer- und End-Run-Oligonukleotide wie in Beispiel I synthetisiert. Das Blockierungs-Oligonukleotid wurde unter Verwendung einer Biosearch 8750^TM Oligonukleotidsynthesevorrichtung (Milligen Biosearch, Sam Rafael, CA) zur Erzeugung eines wie in Beispiel I definierten Blockierungs-Oligonukleotids synthetisiert, das jedoch an dessen 3' Ende ein Biotinmolekül enthielt. Für die Blockierungs-Oligonukleotidsynthese wurde eine 3' Biotin-ON CPG Säule (Clontech Labs, Inc., Palo Alto, CA. Kat.-Nr. 5225-1) verwendet.
ERA wurde wie in Beispiel I durchgeführt, das Polymeraseenzym war jedoch Amplitaq^® DNA-Polymerase, Stoffel Fragment (Exonuklease defiziente Version) (Perkin Elmer Kat.-Nr. N808-0038). Die Konzentrationen der Komponenten in einem 10x Reaktionspufferkonzentrat in einem Endvolumen von 1,0 ml (angepasst mit zweifach destilliertem Wasser) waren die folgenden: 200 mM TRIS-HCl, pH-Wert 7,8; 200 mM Kaliumchlorid; 25 mM Ammoniumchlorid; 20 mM Magnesiumchlorid; 50 mM Dithiothreitol; 500 μM NAD⁺; 500 μg/ml Rinderserumablumin und 1% Triton X-100^TM (Sigma, Kat.-Nr. T6878).
Die End-Run- und Primer-Oligonukleotide wurden wie in Beispiel I markiert und das Blockierungs-Oligonukleotid wurde entsprechend der Ausführung für die End-Run- und Primer-Oligonukleotide in Beispiel I markiert (das heißt, in das Blockierungs-Oligonukleotid wurde eine radioaktive Markierung eingebaut).
Die verschiedenen Komponenten wurden zu Anfang in einem Reaktionsbehälter auf Eis (4°C) zusammen gemischt, um Hybridisierung und unspezifische Hybridisierung im wesentlichen zu vermeiden.
Zu Anfang wurden 5 μl des 10x Reaktionspuffers in einen 500 μl Behälter gegeben, gefolgt von der Zugabe von 1 μl einer 1,0 nM Stammlösung der Zielsequenz (Endkonzentration der Zielsequenz in 50 μl Gesamtlösung: 20 pikomolar) oder 1 μl einer 1,0 pM Stammlösung der Zielsequenz (Endzielsequenzkonzentration in 50 μl Gesamtlösung: 20 Femtomolar). Danach wurde jedes der vier dNTPs zugegeben, um für jedes dATP, dCTP und dGTP eine Endkonzentration von 200 μM in 50 μl Gesamtlösung zu erreichen. Zu dieser Mischung wurden die markierten Oligonukleotideinheiten gegeben, so dass eine Endkonzentration von 120 nM für das Blockie rungs-Oligonukleotid, 40 nM für das Primer-Oligonukleotid und 40 nM für das End-Run-Oligonukleotid (3 : 1 : 1 für Blockierungs-: Primer-: End-Run-Oligonukleotid) in 50 μl Gesamtlösung erreicht wurde. Danach wurden 10 Einheiten des vorstehend erwähnten Ligaseenzyms und anschließend ausreichend zweifach entionisiertes Wasser zugegeben, damit ein Volumen von 49 μl erreicht wurde.
Nach der Mischung der Komponenten wurde der Reaktionsbehälter auf 95°C während 5 Min. auf dem vorstehend erwähnten Temperaturwechsler erwärmt, um eine vollständige Denaturierung der Ziel- und Oligonukleotideinheiten zu erreichen. Danach wurden 2 Einheiten (1 μl) des vorstehend erwähnten Polymeraseenzyms zu dem Reaktionsbehälter gegeben. Darauf wurden 40 Zyklen durchgeführt, wobei jeder Zyklus die folgenden Parameter aufwies: 95°C – 1 Min., 70°C – 4 Min., 40°C – 4 Min.
Nach 40 Zyklen wurden 3 μl „Stopp-" Farbstoff (entsprechend der Beschreibung in Beispiel I) zugegeben, um Aliquoten von 10 μl abzusondern, die von jedem der Reaktionsbehälter der Abschnitte II.G-I erhalten wurden. Danach wurden die Aliquoten während 10 Min. gekocht und anschließend auf ein Elektrophoreseplattengel aufgebracht. Die Elektrophorese wurde durchgeführt und die Belichtung wurde wie in Beispiel 1 erhalten.
12A und 12B zeigen die Fähigkeit von ERA zum Nachweis eines Zielmoleküls, auch wenn es mit einer Konzentration von 10^–12 M beziehungsweise 10^–15 M vorhanden ist. Spur 5 der 12A und 12B zeigt, dass die End-Run Amplifikation der Zielsequenz erhalten wurde. Von besonderer Bedeutung ist, dass 12B beweist, dass der Nachweis und die Amplifikation einer Zielsequenz, die in einer Konzentration, ähnlich zu der interessierenden Gens vorhanden ist, unter Verwendung des offenbarten ERA Protokolls erreicht werden kann.
Verschiedene Kontrollen wurden durchgeführt, um sicherzustellen, dass die beobachtete Amplifikation auf die ERA Reaktionen zurückzuführen ist. Insbesondere wurden die Reaktionen in Abwesenheit von Ligase durchgeführt, um zu bestimmen, ob eine PCR Amplifikation stattgefunden hat. Spur 4 der 12A und 12B zeigt die Ergebnisse der „Ligase freien" ERA Kontrollreaktionen und zeigt, dass in Abwe senheit einer Verknüpfung die Blockierungs- und Primer-Oligonukleotide nicht in der Lage sind, kovalent aneinander zu binden und es fand keine Amplifikation der Zielsequenz statt.
Wie mit Beispiel I wird die Amplifikation der Zielsequenz unter Verwendung eines PCR Protokolls aus den Ergebnissen von Spur 3 der 12A und B offensichtlich; weil wiederum die gesamten Bedingungen für jedes Protokoll im wesentlichen identisch sind, weisen die Ergebnisse von Spur 3 darauf hin, dass die verwendeten Parameter nicht in die PCR Amplifikation der Zielsequenz eingriffen.
In Übereinstimmung mit den in Beispiel I gezeigten Ergebnissen ist ebenfalls, dass in Abwesenheit von Polymerase (Spur 6, 12A und 12B) nur eine lineare Amplifikation (von einem Strang) beobachtet wurde.
Spur M stellt die aus End-Run-Oligonukleotid, Primer-Oligonukleotid und Ziel resultierende Belichtung zur Verfügung. Spur 1 zeigt die Position des Primer-Oligonukleotids. Die Position des Blockierungs-Oligonukleotids ist in Spur 2 gezeigt.
Beispiel III
Das folgende ist eine Erläuterung einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, in der ein ERA Reaktionssystem ein End-Run-Oligonukleotid einbaut, das so ausgelegt ist, dass es sich auf funktionelle Merkmale bestimmter wärmestabiler DNA-Polymerasen richtet. Insbesondere ist von wärmestabilen DNA-Polymerasen ohne ausgeübte Exonukleaseaktivität bekannt, dass sie während der Verlängerung eine nicht Templat gesteuerte Addition einer extra Base an stumpfe 3' Enden von Doppelstrangmolekülen verursachen. In mehr als 90% der Verlängerungsprodukte, die diese nicht Templat gesteuerte Addition zeigen, ist die Addition diejenige von dATP. Findet diese nicht Templat gesteuerte Addition in ERA Reaktionssystemen statt, kann es eine fehlende Übereinstimmung am 3' Ende zwischen dem End-Run-Oligonukleotid und dem Verknüpfungsprodukts geben. Da die fehlende A : G Übereinstimmung durch DNA-Polymerase kaum verlängert wird, ist die Gesamtwirkung eine Verringerung in der Leistungsfähigkeit der ERA Reaktion.
In der nachfolgenden Beschreiung werden ERA Reaktionen unter Verwendung von End-Run-Oligonukleotiden ausgeführt, die einen „Überhang" von 1 oder 2 Basen aufweisen, die sich jenseits des 5' Endes des Blockierungs-Oligonukleotids erstrecken. Hybridisiert dieses End-Run-Oligonukleotid mit einem Blockierungs-Oligonukleotid, so weist das resultierende teilweise doppelsträngige Molekül einen 3' Ende Überhang auf. Im Fall von ERA Systemen ohne Lücke ist der Überhang zu dem 3' Ende des Primer-Oligonukleotids komplementär. Wie nachstehend gezeigt ist, eliminiert dieses eine nicht Templat gesteuerte Addition der dNTPs durch DNA-Polymerase.
Doppelstrang-Zieloligonukleotid, Primer-Oligonukleotid, Blockierungs-Oligonukleotid und End-Run-Oligonukleotide wurden auf einer Pharmacia LKB Genmontagevorrichtung zuzüglich einer DNA-Synthesevorrichtung synthetisiert, die von Pharmacia, Upsalla, Schweden erhältlich ist. In der Synthese wurden Phosphoramidite (Produkt Nummern A:338231, C:338232, G:338233, T:338234 von Beckman Instruments, Inc. Fullerton, CA) verwendet. Die dNTPs wurden von einem ultrareinen dNTP Satz mit 100 mM Stammlösungen von 2'Desoxynukleoside-5'-triphosphat in Wasser bei einem pH-Wert von 7,5, das von Pharmacia Kat.-Nr. 27-2035 zur Verfügung gestellt wurde, erhalten. Synthese, Enschützung und Spaltung wurde entsprechend den Anweisungen des Herstellers ausgeführt. Alle verwendeten Chemikalien waren wenigstens von ACS Qualität. Das Ziel-Oligonukleotid, Primer-Oligonukleotid, Blockierungs-Oligonukleotid und End-Run-Oligonukleotid waren die folgenden:
Ziel (SEQ ID Nr. 5)
Ziel (SEQ ID Nr. 6)
Primer-Oliponukleotid (SEQ ID Nr. 3)

GCGCCATTCG

Blockierungs-Oligonukleotid (SEQ ID Nr. 7)

PO₄-CCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGG-Biotin

End-Run-Oligonukleotid („stumpf") (SEQ ID Nr. 4)

GTTGCGCAGCCTGAATGG

End-Run („+1") (SEQ ID Nr. 8)

GTTGCGCAGCCTGAATGGC

End-Run („+2") (SEQ ID Nr. 9)
Das Primer-Oliognukleotid und die End-Run-Oligonukleotide wurden unter Verwendung von T4-Polynukleotidkinase und [y³²P]ATP, bezogen von Amersham, und entsprechend dem in Sambrook J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989) beschriebenen Protokoll markiert. Das Blockierungs-Oligonukleotid umfasste ein „kaltes" 5'-PO₄ Ende, das während der Synthese unter Verwendung von 5'-Phosphat-ON, bezogen von Clontech aus Palo Alto, CA (Kat.-Nr. 5210-3) eingebaut wurde.
Drei getrennte Amplifikationsreaktionen wurden durchgeführt. Die erste verwendete das End-Run-Oligonukleotid SEQ ID Nr. 4 und die zweite und dritte Reaktion verwendete das End-Run-Oligonukleotid SEQ ID Nr. 8 beziehungsweise SEQ ID Nr. 9. Für jede Reaktion wurden 2,5 μl des vorstehend beschriebenen 10x Reaktionspuffers, gefolgt von 1 μl der Zieloligonukleotide (SEQ ID Nr. 5 und SEQ ID Nr. 6) in einen 200 μl Behälter gegeben. Dies führte zu einer Endkonzentration von 40 pM in einer Gesamtlösung von 25 μl. Zu dieser Mischung wurden das markierte Primer-Oligonukleotid und das End-Run-Oligonukleotid gegeben, was zu einer Endkonzentration von 40 nM von Primer- und End-Run-Oligonukleotiden führte. Das Blockierungs-Oligonukleotid wurde mit einer Endkonzentration von 800 nM zugegeben. Die vier dNTPs wurden mit einer Endkonzentration von je 200 μM für dATP, dGTP, dCTP und dTTP zugegeben. Anschließend wurden 2 μg menschliche Plazenta-DNA zur Erhöhung der Komplexität der Reaktionsmischung zugegeben. Danach wurden 40 Einheiten Taq DNA-Ligase und 2,5 Einheiten Ampli-Taq DNA-Polymerase, Stoffel Fragment (Perkin Elmer, Kat.-Nr. N808-0038) zu dem Reaktionsbehälter gegeben.
Nach der Beimischung der Komponenten wurde der Reaktionsbehälter auf 95°C während 5 Minuten in einem Perkin Elmer 9600 Temperatunivechsler erwärmt. Anschließend wurde die Reaktion durch Zugabe von 2,5 μl einer 10x Magnesiumchloridlösung bis zu einer Endkonzentration von 15 mM eingeleitet. Die Reaktion wurde mit 40 Zyklen durchgeführt, wobei jeder Zyklus die folgenden Parameter aufwies: 95 °C während 30 Sek.; 55°C während 30 Sek. Nach 40 Zyklen wurden 10 μl Aliquoten der Reaktion mit einem gleichen Volumen des „Stopp-Farbstoffs" gemischt, der 50 Harnstoff, 1% Xylolcyanol, 1% Bromphenolblau und 0,2x TBE enthielt. Die Proben wurden 10 Minuten gekocht und dann auf ein Elektrophoreseplattengel aufgebracht. Das Gel wurde aus 15% Polyacrylamid, 19 : 1 Acrylamid : Bisacrylamid in 7 M Harnstoff und 1x TBE hergestellt. Die Elektrophorese wurde unter Verwendung von 250 Volt (50 mA) während 2 Stunden ausgeführt. Dann wurden die Elektrophoreseplatten einen Kodak X-OMAT AR-Röntgenfilm während 90 Minuten belichtet. Der Röntgenfilm wurde von Eastman Kodak in Rochester, N. Y. bezogen und unter der Kat.-Nr. 165-1512 angeboten.
Die aus dem Verknüpfungsteil der Reaktionen und aus dem Verlängerungsteil der Reaktionen resultierenden einzelnen Reaktionsprodukte wurden aus den belichteten Elektrophoresegelen geschnitten und unter Verwendung von Szintillationszählverfahren quantitativ bestimmt. Wie in 13 erläutert ist, werden die Verknüpfungs- und Verlängerungsamplifikationssignale durch Verwendung eines End-Run-Oligonukleotids, in dem das 3' Ende einen 1 oder 2 Basen Überhang enthält, signifikant erhöht. Die relative Bildung von Verknüpfungs- gegenüber Verlängerungsprodukten basiert auf der Menge an Ligase gegenüber Polymerase, die in der Reaktionsmischung zur Verfügung gestellt wird. Schätzungen der relativen Reaktionsleistungsfähigkeit weisen darauf hin, dass DNA-Polymerase leistungsfähiger als DNA-Ligase ist, wobei 90% der Primerverlängerungsversuche vollständig ablaufen und 40 % aller Bruchverknüpfungsversuche erfolgreich sind.
Die Daten zeigen, dass die Exonuklease defiziente Ampli-Taq DNA-Polymerase, Stoffel Fragment das teilweise doppelsträngige Molekül des End-Run- Oligonukleotids nicht erkennt, das einen 3' Überhang aufweist und an ein Blockierungs-Oligonukleotid/Primer-Oligonukleotid-Verlängerungsprodukt als Substrat für die nicht Templat gesteuerte dATP Addition annealed ist. Das End-Run-Oligonukleotid ist daher während des Verlaufs der Amplifikationsreaktion nicht einschränkend. Weiterhin wird die Möglichkeit zur Primer-Dimer-Bildung durch das Vorhandensein von Blockierungs-Oligonukleotid und des Aufrechterhaltens einer hohen Bodentemperatur (55°C) für die ERA Reaktion eliminiert.
Beispiel IV
Zum Aufzeigen der Fähigkeit des Verfahrens der vorliegenden Erfindung zur Unterscheidung einer Veränderung einer einzelnen Base in einem Zieloligonukleotid (Bestimmung des Vorhandenseins oder der Abwesenheit einer einzelnen Base in einem Zieloligonukleotid) wurden zwei Doppelstrang-Zieloligonukleotide hergestellt, wobei sich die beiden Doppelstrang-Zieloligonukleotide um ein einzelnes Basenpaar voneinander unterschieden. Entsprechend wurden Primer-Oligonukleotide, Blockierungs-Oligonukletide und End-Run-Oligonukleotide für jede Reaktion hergestellt.
Alle Oligonukleotide wurden auf einer Pharmacia LKB Genmontagevorrichtung zuzüglich einer DNA-Synthesevorrichtung, erhältlich von Pharmacia in Upsalla, Schweden, synthetisiert. In der Synthese wurden Phosphoramidite (Produktnummern A:338231, C:338232, G:338233, T:338234), bezogen von Beckman Instruments, Inc. in Fullerton, CA verwendet. Die dNTPs wurden von einem ultrareinen dNTP Satz mit 100 mM Stammlösungen von 2'-Desoxynukleosid-5'-triphosphat in Wasser bei einem pH-Wert von 7,5, das von Pharmacia Kat.-Nr. 27-2035 zur Verfügung gestellt wurde, erhalten. Synthese, Entschützung und Spaltung wurde entsprechend den Anweisungen des Herstellers ausgeführt. Alle verwendeten Chemikalien waren wenigstens von ACS Qualität. Die synthetisierten Ziel-Oligonukleotide, Primer-Oligonukleotide, Blockierungs-Oligonukleotid und End-Run-Oligonukleotide waren die folgenden:
Wildtyp Ziel (SEQ ID Nr. 5)
Wildtyp Ziel (SEQ ID Nr. 6)
Mutantenziel (SEQ ID Nr. 10)
Mutantenziel (SEQ ID Nr. 11)
Wildtyp Primer (SEQ ID Nr. 3)

GCGCCATTCG

Mutantenprimer (SEQ ID Nr. 12)

GCGCCATTCC

Blockierungs-Oligonukleotid (SEQ ID Nr. 7)

PO₄-CCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGG-Biotin

Wildtyp End-Run (SEQ ID Nr. 8)

GTTGCGCAGCCTGAATGGC

Mutanten-End-Run (SEQ ID Nr. 13)

GTTGCGCAGCCTGAATGGG

Das Primer-Oliognukleotid und die End-Run-Oligonukleotide wurden unter Verwendung von T4-Polynukleotidkinase und [y³²P] ATP, bezogen von Amersham, und entsprechend dem in Sambrook J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989) beschriebenen Protokoll markiert. Das Blockierungs-Oligonukleotid umfasste ein „kaltes" 5'-PO₄ Ende, das während der Synthese unter Verwendung von 5'-Phosphat-ON, bezogen von Clontech aus Palo Alto, CA (Kat.-Nr. 5210-3), eingebaut wurde.
Zwei Sätze von Reaktionen wurden ausgeführt. Eine Reaktion verwendete die Wildtyp Zieloligonukleotide, Wildtyp Primer-Oligonukleotide und Wildtyp End-Run-Oligonukleotide und die zweite verwendete die mutierten Zieloligonukleotide, mutiertes Primer-Oligonukleotid und mutiertes End-Run-Oligonukleotid. Für jede Reaktion wurden 2,5 μl des vorstehend beschriebenen 10x Reaktionspuffers in einen 200 μl Behälter gegeben, der auf 4°C gehalten wurde, um Hybridisierung zwischen Reaktanden und enzymatische Aktivität zu minimieren. Anschließend wurde 1 μl Zieloligonukleotid, markiertes Primer-Oligonukleotid, markiertes End-Run-Oligonukleotid und Blockierungs-Oligonukleotid zu der Mischung bei 4°C gegeben. Zur Erhöhung der Komplexität der Reaktionsmischung wurde ebenfalls 1 μg menschliche Plazenta-DNA zugegeben. Danach wurden 20 Einheiten Taq DNA-Ligase, bezogen von New England Biolabs, Beverly, MA, Kat.-Nr. 208 zu dem kalten Reaktionsbehälter gegeben. (Eine Einheit Taq DNA-Ligase katalysiert die Verknüpfung von 50% der 12-bp kohäsiven Enden von einem Mikrogramm BstEII verdauter Bakteriophagen lambda DNA in einem Gesamtreaktionsvolumen von 50 μl in 15 Minuten bei 45°C.) Anschließend wurden 5 Einheiten Deep Vent (exo-)DNA-Polymerase von New England Biolabs (Kat,-Nr. 259) in den Reaktionsbehälter gegeben. Es wurde ausreichend zweifach entionisiertes Wasser zugegeben, um ein Endvolumen von 25 μl zu erhalten. Die Endkonzentration der Zielsequenz betrug 40 pM, während die Endkonzentration des Primer-Oligonukleotids und End-Run-Oligonukleotids jeweils 200 nM betrugen. Das Blockierungs-Oligonukleotid war in einer Konzentration von 800 nM vorhanden. Das in diesem Beispiel verwendete 10x Reaktionspufferkonzentrat, das auf ein Volumen von 1,0 ml angepasst wurde, wies die folgenden Komponentenkonzentrationen auf: 200 mM Trishydroxymethylaminomethansalzsäure (Tris-HCl), pH-Wert 7,8; 100 mM Kaliumchlorid; 100 mM Ammoniumsulfat; 20 mM Magnesiumsulfat; 2 mM NAD⁺; 1% Triton X-100.
Die Temperatur des Reaktionsbehälters wurde von 4°C auf 95°C erhöht und während 5 Minuten auf einem Perkin Elmer Temperaturwechsler 9600 entsprechend den Anweisungen des Herstellers beibehalten. Zur Einleitung der Reaktion wurden die vier dNTPs von einer 10x Stammlösung mit je einer Endkonzentration von 200 μM für dATP, dGTP, dCTP und dTTP zugegeben. Anschließend wurden 40 Zyklen durchgeführt, wobei jeder Zyklus 95°C während 30 Sekunden und 55°C während 30 Sekunden umfasste. Nach 20 Zyklen und nach 40 Zyklen wurden 10 μl Aliquoten der Reaktion mit einem gleichen Volumen des in Beispiel III verwendeten „Stopp-Farbstoffs" verwendet. Die Proben wurden 10 Minuten gekocht und dann auf ein Elektrophoreseplattengel aufgebracht und durch Gelelektrophorese entsprechend der Beschreibung in Beispiel III zerlegt.
Die aus dem Verknüpfungsteil der Reaktionen und aus dem Verlängerungsteil der Reaktionen resultierenden einzelnen Reaktionsprodukte wurden aus den belichteten Elektrophoresegelen geschnitten und unter Verwendung von Szintillationszählverfahren quantitativ bestimmt. Die in 14 und 15 erläuterten Balkendiagramme zeigen die relativen Mengen, mit denen die Wildtyp Oligonukleotide und die mutierten Oligonukleotide in das Wildtyp Ziel und das mutierte Ziel in 20 Zyklen beziehungsweise in 40 Zyklen eingebaut wurden.
14 und 15 zeigen deutlich, dass für jeden Zielsatz mit jedem Oligonukleotidsatz eine ausgezeichnete Unterscheidung erhalten wird. Am Ende einer ERA Reaktion mit 20 Zyklen wird ein durchschnittlich höherer Einbau von mehr als das 50 fache mit dem richtigen Satz von Oligonukleotiden erhalten und nach 40 Zyklen wird für den richtigen Satz von Oligonukleotiden ein um das 3 bis 5 fache erhöhter Einbau beobachtet. Die Kombination aus Wildtyp Primer-Oligonukleotid, Wildtyp End-Run-Oligonukleotid und Blockierungs-Oligonukelotid amplifiziert somit die Wildtyp Ziel-DNA-Sequenz in einer ERA Reaktion. Entsprechend amplifizieren das mutierte Primer-Oligonukleotid, das mutierte End-Run-Oligonukleotid und das Blockierungs-Oligonukleotid die mutierte Zielsequenz.
Beispiel V
Zur weiteren Bewertung der Fähigkeit des Amplifikationsverfahren der vorliegenden Erfindung zum Amplifizieren von Ziel-Oligonukleotidsequenzen bei signifikant kleinen Konzentrationen, wurde die Amplifikation von Ziel-Oligonukleotiden unter Verwendung von Ziel-Oligonukleotidsequenzen im Bereich von 10^–11 M (10⁸ Moleküle pro Probe) bis 10^–17 M (10² Moleküle pro Probe) durchgeführt. Diese Konzentrationen wurden ausgewählt, damit sie innerhalb des zum Nachweis eines einzelnen Gens innerhalb einer menschlichen Probe notwendigen Bereichs liegen.
Die in diesen Experimenten verwendete Ziel-Oligonukleotidsequenz, das Primer-Oligonukleotid, Blockierungs-Oligonukleotid und End-Run-Oligonukleotid waren SEQ ID Nr. 5, 6, 7 beziehungsweise B. Die Oligonukleotide wurden entsprechend der Beschreibung in BEISPIEL III hergestellt.
Das Primer-Oliognukleotid und das End-Run-Oligonukleotid wurden unter Verwendung von T4-Polynukleotidkinase und [y³²P] ATP, bezogen von Amersham, und entsprechend dem in Sambrook J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989) beschriebenen Protokoll markiert. Das Blockierungs-Oligonukleotid umfasste ein „kaltes" 5'-PO₄ Ende, das während der Synthese unter Verwendung von 5'-Phosphat-ON, bezogen von Clontech aus Palo Alto, CA (Kat.-Nr. 5210-3), eingebaut wurde.
Jede dieser Reaktionen wurde wie in Beispiel III durchgeführt. Die Konzentrationen der Komponenten in dem 10x Reaktionspufferkonzentrat, das auf ein Endvolumen von 1,0 ml verdünnt wurde, waren die folgenden: 200 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,8; 200 mM Kaliumchlorid; 50 mM Ammoniumchlorid; 50 mM Dithiothreitol; 500 μM NAD⁺; 500 μg/ml Rinderserumalbumin und 1% Triton X-100.
Für jede untersuchte ERA Reaktion wurden 2,5 μl des 10x Reaktionspuffers in einen 200 μl Behälter gegeben, anschließend wurde die geeignete Menge an Ziel-Oligonukleotid zugegeben. Der Reaktionsbehälter wurde auf 4°C gehalten. Anschließend wurde das markierte Primer-Oligonukleotid und das markierte End-Run-Oligonukleotid unter Bildung einer Endreaktionskonzentration von je 40 nM zugegeben und das Blockierungs-Oligonukleotid wurde mit einer Endkonzentration von 600 nM zugegeben. Danach wurde 2 μg menschliche Plazenta-DNA zusammen mit den vier dNTPs zugegeben, von denen jedes eine Konzentration von 200 μM aufwies. Schließlich wurden 30 Einheiten Taq DNA-Ligase und 2,5 Einheiten Stoffel DNA-Polymerase zugegeben.
Der Reaktionsbehälter wurde in dem Perkin Elmer Temperaturwechsler auf 95°C während 5 Minuten erwärmt, um eine vollständige Denaturierung zu erreichen. Anschließend wurde die ERA Reaktion durch Zugabe von 2,5 μl der 10x Magnesium chlorid Stammlösung eingeleitet. Man ließ die Reaktion während 40 Zyklen verlaufen, wie in Beispiel III beschrieben ist.
Die graphischen Darstellungen der Zielkonzentration gegen Zählungen (CPM) des eingebauten Oligonukleotids und gegen die Amplifikationsmenge sind für die Verlängerungsreaktion beziehungsweise die Verknüpfungsreaktion in 16 und 17 gezeigt. Diese graphischen Darstellungen zeigen deutlich die Fähigkeit von ERA Amplifikationsreaktionen zur Verlängerung und Verknüpfung von Zielnukleinsäuren bei äußerst kleinen Konzentrationen.
Obwohl die Erfindung in Zusammenhang mit deren spezifischen Ausführungsformen beschrieben ist, ist sie derart zu verstehen, dass sie weiter modifiziert werden kann und diese Anwendung beabsichtigt beliebige Variationen, Verwendungen oder Anpassungen der Erfindung zu umfassen, wobei im allgemeinen die Prinzipien der Erfindung befolgt werden und solche Abweichungen von der vorliegenden Offenbarung umfaßt werden, die in der bekannten oder üblichen Praxis innerhalb des Fachgebiets, zu dem die Erfindung gehört, auftreten und die auf die hier vorstehend ausgeführten wesentlichen Merkmale angewandt werden können und die dem Umfang der beigefügten Ansprüche entsprechen.
SEQUENZAUFLISTUNG

Claims

Verfahren zur Amplifizierung der Konzentration eines Ziel-Nukleinsäuremoleküls, umfassend die Schritte (A) des Hybridisierens eines Blockierungs-Oligonukleotids an das Ziel-Nukleinsäuremolekül zur Bildung eines Doppelstrangnukleinsäuremoleküls; (B) des Hybridisierens eines Primer-Oligonukleotids an das Ziel-Nukleinsäuremolekül, so dass das 3' Ende des Primer-Oligonukleotids entweder an das 5' Ende des hybridisierten Blockierungs Oligonukleotids angrenzt oder in einer Polymerase vermittelten templatabhängigen Primerverlängerungsreaktion verlängert werden kann, damit es an das 5' Ende des hybridisierten Blockierungs Oligonukleotids angrenzt; (C) (1) wobei das 3' Ende des hybridisierten Primer-Oligonukleotids an das 5' Ende des hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotid angrenzt und des Ausführens von Schritt (D); oder (2) wobei das 3' Ende des hybridisierten Primer-Oligonukleotids nicht an das 5' Ende des 5' hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotid angrenzt, was dazu führt, daß das 3' Ende des hybridisierten Primer-Oligonukleotids in einer Polymerase vermittelten, templatabhängigen Primerverlängerungsreaktion verlängert wird, um dadurch ein Primerverlängerungsprodukts zu bilden, dessen 3' Ende an das 5' Ende des hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotids angrenzt und anschließendem Ausführen von Schritt (D) (D) des Verknüpfens des angrenzenden 3' Endes des hybridisierten Primer-Oligonukleotids aus Schritt (C) (1) oder des Verknüpfens des angrenzenden 3' Endes des hybridisierten Primerverlängerungsprodukts aus Schritt (C) (2) mit dem 5' Ende des hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotids zur Bildung eines Verknüpfungsproduktes, das die Sequenz des Primer-Oligonukleotids oder des Primerverlängerungsprodukts und die Sequenz des Blockierungs-Oligonukleotids aufweist; (E) des Hybridisierens eines End-Run-Oligonukleotids an die Sequenz des Blockierungsoligonukleotids des Verknüpfungsprodukts; (F) des Verlängerns des 3' Endes des hybridisierten End-Run-Oligonukleotids in einer Polymerase vermittelten, templatabhängigen Primerverlängerungsreaktion zur Bildung eines End-Run-Verlängerungsprodukts und zur Amplifizierung der Konzentration des Zielmoleküls; wobei der Schritt (A), die Gruppe von Schritten (B), (C) und (D) und die Gruppe von Schritten (E) und (F) untereinander in jeder beliebigen Reihenfolge durchgeführt werden können.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Ziel-Nukleinsäuremolekül ein Doppelstrang-RNA-Molekül ist und wobei ein erster Strang des Doppelstrangmoleküls durch die Bildung des Verknüpfungsprodukts aus Schritt (D) und der zweite Strang durch die Bildung des End-Run-Verlängerungsprodukts aus Schritt (F) amplifiziert werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das 3' Ende des Blockierungs-Oligonukleotids und das 5' Ende des Primer-Oligonukleotids miteinander verbunden werden.
Verfahren nach Anspruch 1 weiterhin umfassend die Schritte (G) des Hybridisierens eines Blockierungsmoleküls an das End-Run-Verlängerungsprodukt zur Bildung eines Doppelstrang-Nukleinsäuremoleküls; (H) des Hybridisierens eines Primer-Oligonukleotids an das End-Run-Verlängerungsprodukt des Doppelstrang-Nukleinsäuremoleküls aus Schritt (G) zur Bildung eines Doppelstrang-Nukleinsäuremoleküls, wobei das 3' Ende des Primer-Oligonukleotids entweder an das 5' Ende des Hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotids angrenzt oder in einer Polymerase vermittelten, templatabhängigen Primerverlängerungsreaktion verlängert werden kann, damit es an das 5' Ende des Hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotids angrenzt; (I) (1) wobei das 3' Ende des Hybridisierten Primer-Oligonukleotids an das 5' Ende des Hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotid angrenzt und des Ausführens von Schritt (J); oder (2) wobei das 3' Ende des Hybridisierten Primer-Oligonukleotids aus Schritt (H) nicht an das 5' Ende des 5' Hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotid angrenzt, was dazu führt, daß das 3' Ende des Hybridisierten Primer-Oligonukleotids in einer Polymerase vermittelten, templatabhängigen Primerverlängerungsreaktion verlängert wird, um dadurch ein Primerverlängerungsprodukt zu bilden, dessen 3' Ende an das 5' Ende des Hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotids angrenzt und anschließendem Ausführen von Schritt (J); (J) des Verknüpfens des angrenzenden 3' Endes des Hybridisierten Primer-Oligonukleotids aus Schritt (I) (1) oder des Verknüpfens des angrenzenden 3' Endes des Hybridisierten Primerverlängerungsprodukts aus Schritt (I) (2) mit dem 5' Ende des hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotids zur Bildung und Amplifikation eines Verknüpfungsproduktes; (K) des Hybridisierens eines End-Run-Oligonukleotids an die Sequenz des Blockierungs-Oligonukleotids des Verknüpfungsprodukts aus Schritt (J) und (L) des Verlängerns des 3' Endes des hybridisierten End-Run Oligonukleotids in einer Polymerase vermittelten, templatabhängigen Primerverlängerungsreaktion zur Bildung und Amplifikation eines End-Run-Verlängerungsprodukts.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Abfolge der Schritte (G) bis (L) wenigstens einmal wiederholt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, weiterhin umfassend die Schritte (G) des Hybridisierens eines zweiten Blockierungsmoleküls an das End-Run-Verlängerungsprodukt zur Bildung eines Doppelstrang-Nukleinsäuremoleküls, wobei das zweite Blockierungsmolekül an das End-Run-Verlängerungsprodukt an einer Stelle hybridisiert, an die das Blockierungs-Oligonukleotid aus Schritt (A) oder das Primer-Oligonukleotid aus Schritt (B) nicht hybridisieren kann; (H) des Hybridisierens eines zweiten Primer-Oligonukleotids an das End-Run-Verlängerungsprodukt des Doppelstrang-Nukleinsäuremoleküls aus Schritt (G) zur Bildung eines Doppelstrang-Nukleinsäuremoleküls, so dass das 3' Ende des zweiten Primer-Oligonukleotids entweder an das 5' Ende des hybridisierten zweiten Blockierungs Oligonukleotids angrenzt oder in einer Polymerase vermittelten, templatabhängigen Primerverlängerungsreaktion verlängert werden kann, so dass es an das 5' Ende des hybridisierten zweiten Blockierungs-Oligonukleotids angrenzt; (I) (1) wobei das 3' Ende des hybridisierten zweiten Primer Oligonukleotids an das 5' Ende des hybridisierten zweiten Blockierungs-Oligonukleotid angrenzt und des Ausführens von Schritt (J); oder (2) wobei das 3' Ende des hybridisierten zweiten Primer Oligonukleotids nicht an das 5' Ende des 5' hybridisierten zweiten Blockierungs-Oligonukleotid angrenzt, was dazu führt, daß das 3' Ende des hybridisierten zweiten Primer-Oligonukleotids in einer Polymerase vermittelten, templatabhängigen Primerverlängerungsreaktion verlängert wird, um ein zweites Primerverlängerungsprodukts zu bilden, dessen 3' Ende an das 5' Ende des hybridisierten zweiten Blockierungs-Oligonukleotids angrenzt und anschließendem Ausführen von Schritt (J); (J) des Verknüpfens des angrenzenden 3' Endes des hybridisierten zweiten Primer-Oligonukleotids aus Schritt (I) (1) oder des Verknüpfens des angrenzenden 3' Endes des hybridisierten zweiten Primerverlängerungsprodukts aus Schritt (I) (2) mit dem 5' Ende des hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotids zur Bildung und Amplifikation eines zweiten Verknüpfungsproduktes, das die Sequenz des zweiten Primer-Oligonukleotids oder des zweiten Primer-Verlängerungsprodukts und des zweiten Blockierungsoligonukleotids aufweist; (K) des Hybridisierens eines zweiten End-Run-Oligonukleotids an die Sequenz des zweiten Blockierungsoligonukleotids des zweiten Verknüpfungsprodukts und (L) des Verlängerns des 3' Endes des hybridisierten zweiten End-Run-Oligonukleotids in einer Polymerase vermittelten, templatabhängigen Primerverlängerungsreaktion zur Bildung eines End-Run-Verlängerungsprodukts und damit zur Amplifikation der Konzentration dieser Sequenz des Zielmoleküls.
Verfahren nach Anspruch 1, weiterhin umfassend die Schritte (G') des Hybridisierens eines zweiten Blockierungsmoleküls an das Verknüpfungsprodukt zur Bildung eines Doppelstrang-Nukleinsäuremoleküls, wobei das zweite Blockierungsmolekül an das Verknüpfungsprodukt an einer Stelle hybridisiert, an die das Blockierungs-Oligonukleotid aus Schritt (A) oder das Primer-Oligonukleotid aus Schritt (B) nicht hybridisieren kann; (H') des Hybridisierens eines zweiten Primer-Oligonukleotids an das Verknüpfungsprodukt des Doppelstrang-Nukleinsäuremoleküls, so dass das 3' Ende des zweiten Primer-Oligonukleotids entweder an das 5' Ende des hybridisierten zweiten Blockierungs-Oligonukleotids angrenzt oder in einer Polymerase vermittelten, templatabhängigen Primerverlängerungsreaktion verlängert werden kann, damit es an das 5' Ende des hybridisierten zweiten Blockierungs-Oligonukleotids angrenzt; (I') (1) wobei das 3' Ende des hybridisierten zweiten Primer-Oligonukleotids an das 5' Ende des hybridisierten zweiten Blockierungs-Oligonukleotid angrenzt und des Ausführens von Schritt (J); oder (2) wobei das 3' Ende des hybridisierten zweiten Primer-Oligonukleotids nicht an das 5' Ende des 5' hybridisierten zweiten Blockierungs-Oligonukleotid angrenzt, was dazu führt, daß das 3' Ende des hybridisierten zweiten Primer-Oligonukleotids in einer Polymerase vermittelten, templatabhängigen Primerverlängerungsreaktion verlängert wird, um dadurch ein zweites Primerverlängerungsprodukt zu bilden, dessen 3' Ende an das 5' Ende des hybridisierten zweiten Blockierungs-Oligonukleotids angrenzt und des anschließenden Ausführens von Schritt (J'); (J') des Verknüpfens des angrenzenden 3' Endes des hybridisierten zweiten Primer-Oligonukleotids aus Schritt (I') (1) oder des Verknüpfens des angrenzenden 3' Endes des hybridisierten zweiten Primerverlängerungsprodukts aus Schritt (I') (2) mit dem 5' Ende des hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotids zur Bildung eines zweiten Verknüpfungsproduktes, das die Sequenz des zweiten Primer-Oligonukleotids oder des zweiten Primer-Verlängerungsprodukts und des zweiten Blockierungsoligonukleotids aufweist; (K') des Hybridisierens eines zweiten End-Run-Oligonukleotids an die Sequenz des zweiten Blockierungsoligonukleotids des zweiten Verknüpfungsprodukts und (L') des Verlängerns des 3' Endes des hybridisierten zweiten End-Run-Oligonukleotids in einer Polymerase vermittelten, templatabhängigen Primerverlängerungsreaktion zur Bildung eines End-Run-Verlängerungsprodukts und damit zur Vergrößerung der Konzentration dieser Sequenz des Zielmoleküls.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Abfolge der Schritte (G') bis (L') wenigstens einmal wiederholt wird.
Verfahren zur Bestimmung, ob ein ausgewähltes Nukleotid an einer vorbestimmten Stelle eines Ziel-Nukleinsäuremoleküls vorhanden ist, umfassend die Schritte (AA) des Bereitstellens von Bedingungen zur Hybridisierung eines Blockierungs-Oligonukleotids an das Ziel-Nukleinsäuremolekül zur Bildung eines Doppelstrang-Nukleinsäuremoleküls, wobei das 5' Ende des hybridisierten Blockierungsmoleküls derart angeordnet ist, daß sein 5' endständiges Nukleotid der vorbestimmten Stelle des Zielmoleküls gegenüberliegt und wobei es zum ausgewählten Nukleotid komplementär ist; (BB) des Bereitstellens von Bedingungen zur Hybridisierung eines Primer-Oligonukleotids an das Ziel-Nukleinsäuremolekül des Doppelstrang-Nukleinsäuremoleküls, so dass das 3' Ende des Primer-Oligonukleotids entweder an das 5' Ende des hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotids angrenzt oder in einer Polymerase vermittelten, templatabhängigen Primerverlängerungsreaktion verlängert werden kann, damit es an das 5' Ende des Hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotids angrenzt; (CC) (1) des Ausführens von Schritt (DD), wenn das 3' Ende des Hybridisierten Primer-Oligonukleotids an das 5' Ende des Hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotid angrenzt; oder (2) des anschließenden Ausführens von Schritt (DD) im Anschluß an die Verlängerung des 3' Endes des Hybridisierten Primer-Oligonukleotids in einer Polymerase vermittelten, templatabhängigen Primerverlängerungsreaktion zur Bildung eines Primerverlängerungsprodukts, dessen 3' Ende an das 5' Ende des Hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotids angrenzt, wenn das 3' Ende des Hybridisierten Primer-Oligonukleotids aus Schritt (H) nicht an das 5' Ende des 5' Hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotid angrenzt, und; (DD) des Inkubierens des angrenzenden 3' Endes des Hybridisierten Primer-Oligonukleotids aus Schritt (CC) (1) oder des angrenzenden 3' Endes des Hybridisierten Primer-Verlängerungsprodukts aus Schritt (CC) (2) und des 5' Endes des Hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotids in Gegenwart einer Ligase und unter Bedingungen, die einer Nukleinsäureverknüpfung förderlich sind; (EE) des Bestimmens, ob das ausgewählte Nukleotid an der vorbestimmten Stelle vorhanden ist, indem detektiert wird, ob Schritt (DD) in der Bildung eines Verknüpfungsproduktes resultiert, das die Sequenz des Primer-Oligonukleotids oder des Primerverlängerungsproduktes und des Blockierungs-Oligonukleotids aufweist, wobei die Bildung des Verknüpfungsproduktes von der Fähigkeit des 5' endständigen Nukleotids des Blockierungs-Oligonukleotids abhängt, an das Nukleotid an der vorbestimmten Stelle zu hybridisieren, und wobei die Detektion durch die folgenden Unterschritte erreicht wird: (1) des Bereitstellens eines End-Run-Oligonukleotids für die Inkubierung, wobei das End-Run-Oligonukleotid in der Lage ist, an mindestens einen Teil des Blockierungs-Oligonukleotids zu hybridisieren, und des Aufrechterhaltens der Inkubierung unter Bedingungen, die ausreichend sind, um eine Nukleinsäurehybridisierung zu ermöglichen und eine Polymerase gesteuerte templatabhängige Primerverlängerung stattfinden zu lassen und (2) des Bestimmens, ob das End-Run-Oligonukleotid so verlängert ist, daß es eine Sequenz enthält, die zu einer Sequenz des Primer-Oligonukleotids komplementär ist.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Ziel-Nukleinsäuremolekül ein einzelsträngiges DNA- oder RNA-Molekül ist.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei in Schritt (EE) (2) die Bestimmung, ob das End-Run-Oligonukleotid verlängert ist, um eine Sequenz zu enthalten, die zu einer Sequenz des Primer-Oligonukleotids komplementär ist, über die Amplifikation jedes End-Run-Verlängerungsproduktes durchgeführt wird, wobei ein Verfahren verwendet wird, das die folgenden Unterschritte umfasst: (aa) das Hybridisieren des Blockierungs-Oligonukleotids an jegliche End-Run-Verlängerungsprodukte, die bei der Inkubierung vorhanden sind, um dadurch Doppelstrangnukleinsäuremoleküle zu bilden. (bb) das Hybridisieren des Primer-Oligonukleotids an das End-Run-Verlängerungsprodukt jeglicher Doppelstrangnukleinsäuremoleküle in einer Weise, daß das 3' Ende des Primer-Oligonukleotids entweder an das 5' Ende des hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotids angrenzt oder in einer Polymerase vermittelten, templatabhängigen Primerverlängerungsreaktion verlängert werden kann, damit es an das 5' Ende des hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotids angrenzt, (cc) (1) wobei das 3' Ende des hybridisierten Primer-Oligonukleotids an das 5' Ende des hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotid angrenzt und des Ausführens von Schritt (dd); oder (2) wobei das 3' Ende des hybridisierten Primer-Oligonukleotids nicht an das 5' Ende des 5' hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotid angrenzt, was dazu führt, daß das 3' Ende des hybridisierten Primer-Oligonukleotids in einer Polymerase vermittelten, templatabhängigen Primerverlängerungsreaktion verlängert wird, um dadurch ein Primerverlängerungsprodukt zu bilden, dessen 3' Ende an das 5' Ende des hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotids angrenzt und des anschließenden Ausführens von Schritt (dd); (dd) das Verknüpfen des angrenzenden 3' Endes jedes der hybridisierten Primer-Oligonukleotide aus Schritt (cc) (1) oder des Verknüpfens des angrenzenden 3' Endes des hybridisierten zweiten Primerverlängerungsprodukts aus Schritt (cc) (2) mit dem 5' Ende jedes der hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotide zur Bildung eines Verknüpfungsproduktes, das die Sequenz des Primer-Oligonukleotids oder des Primer-Verlängerungsprodukts und des Blockierungsoligonukleotids aufweist; (ee) das Hybridisieren des End-Run-Oligonukleotids an die Sequenz des Blockierungs-Oligonukleotids jeglichen Vernüpfungsprodukts; und (ff) das Verlängern des 3' Endes des hybridisierten End-Run-Oligonukleotids in einer Polymerase vermittelten, templatabhängigen Primerverlängerungsreaktion zur Bildung und Amplifikation des End-Run-Verlängerungsproduktes.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Sequenz der Unterschritte (aa) bis (ff) wenigstens einmal wiederholt wird.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei das 5' endständige Nukleotid des Blockierungs-Oligonukleotids nur an die vorbestimmte Stelle hybridisieren kann, wenn die Stelle eine genetische Mutation enthält.
Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins eines ausgewählten Nukleotids an einer vorbestimmten Stelle eines Ziel-Nukleinsäuremoleküls, umfassend die Schritte: (A') des Bereitstellens von Bedingungen zur Hybridisierung eines Blockierungs-Oligonukleotids an das Ziel-Nukleinsäuremolekül zur Bildung eines Doppelstrang-Nukleinsäuremoleküls, wobei das 5' Ende des hybridisierten Blockierungsmoleküls derart angeordnet ist, daß sein 5' endständiges Nukleotid an das direkt zur vorbestimmten Stelle des Zielmoleküls 3' ständige Nukleotid hybridisiert; (B') des Bereitstellens von Bedingungen zur Hybridisierung eines Primer-Oligonukleotids an das Ziel-Nukleinsäuremolekül des teilweisen Doppelstrang-Nukleinsäuremoleküls, so dass das 3' Ende des Primer-Oligonukleotids entweder an das 5' Ende des hybridisierten Blockierungs Oligonukleotids angrenzt und wobei das 3' endständige Nukleotid zum ausgewählten Nukleotid komplementär ist; (C') des Inkubierens des angrenzenden 3' Endes des hybridisierten Primer-Oligonukleotids und des 5' Endes des hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotids in Gegenwart einer Ligase und unter Bedingungen, die einer Nukleinsäureverknüpfung förderlich sind; (D') des Bestimmens, ob das ausgewählte Nukleotid an der vorbestimmten Stelle vorhanden ist, indem detektiert wird, ob Schritt (C') in der Bildung eines Verknüpfungsproduktes resultiert, das die Sequenz des Primer-Oligonukleotids und des Blockierungs-Oligonukleotids aufweist, wobei die Bildung des Verknüpfungsproduktes von der Fähigkeit des 3' endständigen Nukleotids des Blockierungs-Oligonukleotids abhängt, an das Nukleotid an der vorbestimmten Stelle zu hybridisieren, und wobei die Detektion durch die folgenden Unterschritte erreicht wird: (1) des Bereitstellens eines End-Run-Oligonukleotids für die Inkubierung, wobei das End-Run-Oligonukleotid in der Lage ist, an mindestens einen Teil des Blockierungs-Oligonukleotids zu hybridisieren, und des Aufrechterhaltens der Inkubierung unter Bedingungen, die ausreichend sind, um eine Nukleinsäurehybridisierung zu ermöglichen und eine Polymerase gesteuerte, templatabhängige Primerverlängerung stattfinden zu lassen und (2) des Bestimmens, ob das End-Run Oligonukleotid so verlängert ist, daß es eine Sequenz enthält, die zu einer Sequenz des Primer-Oligonukleotids komplementär ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 9 oder 14, wobei das Ziel-Nukleinsäuremolekül ein einzelsträngiges DNA- oder RNA-Molekül ist.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei in Schritt (D') (2) die Bestimmung, ob das End-Run-Oligonukleotid verlängert ist, um eine Sequenz zu enthalten, die zu einer Sequenz des Primer-Oligonukleotids komplementär ist, über die Amplifikation jedes End-Run-Verlängerungsproduktes durchgeführt wird, wobei ein Verfahren verwendet wird, das die folgenden Unterschritte umfasst: (a') das Hybridisieren des Blockierungs-Oligonukleotids an jegliche End-Run-Verlängerungsprodukte, die bei der Inkubierung vorhanden sind, um dadurch Doppelstrangnukleinsäuremoleküle zu bilden. (b') das Hybridisieren des Primer-Oligonukleotids an das End-Run-Verlängerungsprodukt jeglicher Doppelstrangnukleinsäuremoleküle in einer Weise, dass das 3' Ende des Primer-Oligonukleotids entweder an das 5' Ende des Hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotids angrenzt oder in einer Polymerase vermittelten, templatabhängigen Primerverlängerungsreaktion verlängert werden kann, damit es an das 5' Ende des Hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotids angrenzt, (c') (1) wobei das 3' Ende des Hybridisierten Primer-Oligonukleotids aus Schritt (b') an das 5' Ende des Hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotid angrenzt und des Ausführens von Schritt (d'); oder (2) wobei das 3' Ende des Hybridisierten Primer-Oligonukleotids aus Schritt (b') nicht an das 5' Ende des 5' Hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotid angrenzt, was dazu führt, dass das 3' Ende des Hybridisierten Primer-Oligonukleotids in einer Polymerase vermittelten, templatabhängigen Primerverlängerungsreaktion verlängert wird, um dadurch ein Primerverlängerungsprodukt zu bilden, dessen 3' Ende an das 5' Ende des Hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotids angrenzt, und des anschließenden Ausführens von Schritt (d'); (d') des Verknüpfens des angrenzenden 3' Endes aller Hybridisierten Primer-Oligonukleotide aus Schritt (c') (1) oder des Verknüpfens aller angrenzenden 3' Enden der Hybridisierten zweiten Primerverlängerungsprodukte aus Schritt (c') (2) mit dem 5' Ende aller Hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotide zur Bildung eines Verknüpfungsproduktes, das die Sequenz der Primer-Oligonukleotide oder des Primer-Verlängerungsprodukts und des Blockierungsoligonukleotids aufweist; (e') des Hybridisierens des End-Run-Oligonukleotids an die Sequenz des Blockierungs-Oligonukleotids jeglichen Vernüpfungsprodukts; und f) des Verlängerns des 3' Endes des hybridisierten End-Run-Oligonukleotids in einer Polymerase vermittelten, templatabhängigen Primerverlängerungsreaktion zur Bildung und Amplifikation des End-Run-Verlängerungsproduktes.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Sequenz der Unterschritte (a') bis (f) wenigstens einmal wiederholt wird.
Verfahren nach Anspruch 9 oder 14, wobei die vorbestimmte Stelle ein polymorpher Locus ist.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei das 3' endständige Nukleotid des Primer-Oligonukleotids aus Schritt (B') nur an die vorbestimmte Stelle hybridisieren kann, wenn die Stelle eine genetische Mutation aufweist.
Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins eines ausgewählten Nukleotids an einer vorbestimmten Stelle eines Ziel-Nukleinsäuremoleküls, umfassend die Schritte: (A'') das Hybridisieren eines Blockierungs-Oligonukleotids an eine Ziel-Nukleinsäuremolekülsequenz, das zum Ziel-Nukleinsäuremolekül komplementär ist, um dadurch ein Doppelstrangnukleinsäuremolekül zu bilden; (B'') das Hybridisieren eines Primer-Oligonukleotids an die Ziel-Nukleinsäuresequenz, die zum Ziel-Nukleinsäuremolekül des Doppelstrangnukleinsäuremoleküls komplementär ist, damit das 3' Ende des Primer-Oligonukleotids entweder an das 5' Ende des hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotids angrenzt oder in einer Polymerase vermittelten, templatabhängigen Primerverlängerungsreaktion verlängert werden kann, damit es an das 5' Ende des hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotids angrenzt; (C'') (1) wobei das 3' Ende des Hybridisierten Primer-Oligonukleotids an das 5' Ende des Hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotid angrenzt, und das Ausführen von Schritt (D''); oder (2) wobei das 3' Ende des Hybridisierten Primer-Oligonukleotids nicht an das 5' Ende des 5' Hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotid angrenzt, was dazu führt, daß das 3' Ende des Hybridisierten Primer-Oligonukleotids in einer Polymerase vermittelten, templatabhängigen Primerverlängerungsreaktion verlängert wird, um dadurch ein Primerverlängerungsprodukt zu bilden, dessen 3' Ende an das 5' Ende des Hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotids angrenzt, und anschließendes Ausführen von Schritt (D'') (D'') das Verknüpfen des angrenzenden 3' Endes des Hybridisierten Primer-Oligonukleotids aus Schritt (C'') (1) oder das Verknüpfen des angrenzenden 3' Endes des Hybridisierten Primerverlängerungsprodukts aus Schritt (C'') (2) mit dem 5' Ende des Hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotids zur Bildung eines Verknüpfungsproduktes, das die Sequenz des Primer-Oligonukleotids oder des Primerverlängerungsprodukts und die Sequenz des Blockierungs-Oligonukleotids aufweist; (E'') das Hybridisieren eines End-Run-Oligonukleotids an die Sequenz des Blockierungs-Oligonukleotids des Verknüpfungsprodukts; wobei das 3' Ende des End-Run-Oligonukleotids zu dem ausgewählten Nukleotid komplementär ist und das 3' endständige Nukleotid des End-Run-Oligonukleotids der vorbestimmten Stelle des Zielmoleküls entgegenstehen kann; (F'') des Bereitstellens von Bedingungen zur Verlängerung des 3' Endes des Hybridisierten End-Run-Oligonukleotids in einer polymerasevermittelten, templatabhängigen Primerverlängerungsreaktion zur Bildung eines End-Run-Verlängerungsprodukts; (G'') das Bestimmen des Vorhandenseins des ausgewählten Nukleotids an der vorbestimmten Stelle, indem detektiert wird, ob Schritt (F'') in der Bildung eines End-Run-Verlängerungsproduktes resultiert.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei in Schritt (G'') die Bestimmung, ob Schritt (F'') in der Bildung eines End-Run-Verlängerungsproduktes resultiert, das eine Sequenz enthält, die zu einer Sequenz des Primer-Oligonukleotids komplementär ist, über die Amplifikation jedes End-Run Verlängerungsprodukts durchgeführt wird, wobei ein Verfahren verwendet wird, das die folgenden Unterschritte umfasst: (a'') das Hybridisieren des Blockierungsoligonukleotids an alle End-Run-Verlängerungsprodukte, die bei der Inkubierung vorhanden sind, um dadurch Doppelstrangnukleinsäuremoleküle zu bilden. (b'') das Hybridisieren des Primer-Oligonukleotids an das End-Run-Verlängerungsprodukt jeglicher Doppelstrangnukleinsäuremoleküle in einer Weise, dass das 3' Ende des Primer-Oligonukleotids entweder an das 5' Ende des hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotids angrenzt oder in einer Polymerase vermittelten, templatabhängigen Primerverlängerungsreaktion verlängert werden kann, damit es an das 5' Ende des hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotids angrenzt, (C'') (3) wobei das 3' Ende des hybridisierten Primer-Oligonukleotids aus Schritt (b'') an das 5' Ende des hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotid angrenzt, und das Ausführen von Schritt (d''); oder (4) wobei das 3' Ende des hybridisierten Primer-Oligonukleotids aus Schritt (b'') nicht an das 5' Ende des 5' hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotid angrenzt, was dazu führt, dass das 3' Ende des hybridisierten Primer-Oligonukleotids in einer Polymerase vermittelten, templatabhängigen Primerverlängerungsreaktion verlängert wird, um dadurch ein Primerverlängerungsprodukt zu bilden, dessen 3' Ende an das 5' Ende des hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotids angrenzt, und anschließendes Ausführen von Schritt (d''); (d'') das Verknüpfen des angrenzenden 3' Endes jeglichen hybridisierten Primer-Oligonukleotids aus Schritt (C'') (1) oder des angrenzenden 3' Endes jeglichen hybridisierten Primerverlängerungsprodukts aus Schritt (C'') (2) mit dem 5' Ende jeglichen hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotids zur Bildung eines Verknüpfungsproduktes, das die Sequenz dieser Primer-Oligonukleotide oder des Primer-Verlängerungsprodukts und die Sequenz des Blockierungs-Oligonukleotids aufweist; (e'') das Hybridisieren des End-Run-Oligonukleotids an die Sequenz des Blockierungs-Oligonukleotids jeglichen Vernüpfungsprodukts; und (f'') das Verlängern des 3' Endes des hybridisierten End-Run-Oligonukleotids in einer Polymerase vermittelten, templatabhängigen Primerverlängerungsreaktion zur Bildung und Amplifikation des End-Run Verlängerungsproduktes.
Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins eines ausgewählten Nukleotids an einer vorbestimmten Stelle eines Ziel-Nukleinsäuremoleküls, umfassend die Schritte: (A*) das Bereitstellen von Bedingungen zur Hybridisierung eines Blockierungs-Oligonukleotids an das Ziel-Nukleinsäuremolekül zur Bildung eines partiellen Doppelstrang-Nukleinsäuremoleküls; (B') das Bereitstellen von Bedingungen zur Hybridisierung eines Primer-Oligonukleotids an das Ziel-Nukleinsäuremolekül des partiellen Doppelstrang-Nukleinsäuremoleküls, wobei das 3' Ende des Primer-Oligonukleotids der vorbestimmten Stelle des Zielmoleküls direkt entgegengesetzt ist; (C*) das Bereitstellen von Bedingungen zur Verlängerung des 3' Endes des hybridisierten Primer-Oligonukleotids in einer polymerasevermittelten, templatabhängigen Primerverlängerungsreaktion zur Bildung eines Primer-Verlängerungsprodukts; (D*) das Bestimmen, ob das ausgewählte Nukleotid an der vorbestimmten Stelle vorhanden ist, indem detektiert wird, ob Schritt (C*) in der Bildung eines Primerverknüpfungsproduktes resultiert, und wobei die Detektion durch die folgenden Unterschritte erreicht wird: (1) das Inkubieren eines Primerverlängerungsprodukts und des 5' Endes des hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotids in Gegenwart einer Ligase und unter Bedingungen, die einer Nukleinsäureverknüpfung förderlich sind; (2) das Bestimmen, ob Schritt (1) in der Bildung eines Verknüpfungsprodukts resultiert, das die Sequenz des Primer-Oligonukleotidverlängerungsproduktes und des Blockierungs-Oligonukleotids aufweist, und wobei die Detektion über den folgenden Schritt errreicht wird: (a) das Bereitstellen eines End-Run-Oligonukleotids für die Inkubierung, wobei das End-Run-Oligonukleotid mit wenigstens einem Teil des Blockierungs-Oligonukleotids hybridisieren kann, und das Beibehalten der Inkubierung unter Bedingungen, die ausreichend sind, um eine Nukleinsäurehybridisierung zu ermöglichen und eine polymerasegesteuerte, templatabhängige Primerverlängerung stattfinden zu lassen; und (b) das Bestimmen, ob das End-Run-Oligonukleotid verlängert ist, so dass es eine Sequenz enthält, die zu einer Sequenz des Primer-Oligonukleotids komplementär ist.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei in Schritt (b) die Bestimmung, ob das End-Run – Oligonukleotid verlängert ist, so dass es eine Sequenz enthält, die komplementär zu einer Sequenz des Primer-Oligonukleotids ist, durch Amplifikation jedes End-Run-Verlängerungsproduktes durchgeführt wird, wobei ein Verfahren verwendet wird, umfassend die Unterschritte: (a*) das Hybridisieren des Blockierungs-Oligonukleotids an jegliche End-Run-Verlängerungsprodukte, die bei der Inkubierung vorhanden sind, um dadurch Doppelstrang-Nukleinsäuremoleküle zu bilden; (b*) das Hybridisieren des Primer-Oligonukleotids an das End-Run Verlängerungsprodukt jeglicher Doppelstrang-Nukleinsäuremoleküle, so dass das 3' Ende des Primer-Oligonukleotids entweder an das 5' Ende des hybridisierten Blockierungs Oligonukleotids angrenzt oder in einer Polymerase vermittelten, templatabhängigen Primerverlängerungsreaktion verlängert werden kann, damit es an das 5' Ende des hybridisierten Blockierungs Oligonukleotids angrenzt; (c*) (1) wobei das 3' Ende des hybridisierten Primer-Oligonukleotids aus Schritt (b*) an das 5' Ende des hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotid angrenzt, und das Ausführen von Schritt (d*); oder (2) wobei das 3' Ende des hybridisierten Primer-Oligonukleotids aus Schritt (b*) nicht an das 5' Ende des 5' hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotid angrenzt, was dazu führt, daß das 3' Ende des hybridisierten Primer-Oligonukleotids in einer Polymerase vermittelten, templatabhängigen Primerverlängerungsreaktion verlängert wird, um dadurch ein Primerverlängerungsprodukt zu bilden, dessen 3' Ende an das 5' Ende des hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotids angrenzt, und anschließendes Ausführen von Schritt (d*), (d*) das Verknüpfen des angrenzenden 3' Endes des hybridisierten Primer-Oligonukleotids aus Schritt (c*) (1) oder das Verknüpfen des angrenzenden 3' Endes des hybridisierten Primerverlängerungsprodukts aus Schritt (c*) (2) mit dem 5' Ende des hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotids zur Bildung eines Verknüpfungsproduktes, das die Sequenz des Primer-Oligonukleotids oder des Primerverlängerungsprodukts und die Sequenz des Blockierungs-Oligonukleotids aufweist; (e*) das Hybridisieren eines End-Run Oligonukleotids an die Sequenz des Blockierungsoligonukleotids jeglichen Verknüpfungsprodukts; und (f*) das Verlängern des 3' Endes des hybridisierten End-Run-Oligonukleotids in einer polymerasevermittelten, templatabhängigen Primerverlängerungsreaktion zur Bildung und Amplifikation des End-Run-Verlängerungsprodukts.
Verfahren nach Anspruch 9 oder 14 oder 20 oder 22, wobei vor der Ausführung der jeweiligen Schritte (AA) oder (A') oder (A'') oder (A*) die Konzentration des Zielmoleküls nach dem Verfahren gemäß Anspruch 1 amplifiziert wird.,
Kit zur Amplifikation von wenigstens einer Zielsequenz, die wenigstens eine Region aufweist, die eine definierte Nukleinsäuresequenz aufweist, wobei der Kit einen Behälter aufweist und wenigstens einen Satz Reagenzeinheiten, wobei der Satz oder jeder Satz aus einer Blockierungseinheit, einer Primereinheit und einer End-Run-Einheit besteht, wobei bei normalem Gebrauch eines derartigen Satzes von Reagenzeinheiten mit geeigneten Polymerisations- und Verknüpfungsmitteln die Blockierungseinheit in der Lage ist, an einen Teil der Nukleinsäuresequenz zu Hybridisieren, die Primereinheit in der Lage ist, an einen unterschiedlichen Teil der Nukleinsäuresequenz zu Hybridisieren, und die End-Run-Einheit eine Sequenz umfaßt, die zu wenigstens einem Teil der Blockierungseinheit komplementär ist.
Kit nach Anspruch 25, weiter umfassend wenigstens einen Puffer, der befähigt ist, eine Pufferkapazität für die Amplifikation bereitzustellen.
Kit nach Anspruch 25, weiter umfassend mindestens ein Enzym, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Polymerase und Ligase.
Kit nach Anspruch 26, wobei die Pufferverbindung Trishydroxymethylaminomethansalzsäure ist.
Kit nach Anspruch 25, weiter umfassend Zusatzstoffe, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Kaliumchlorid, Magnesiumchlorid, Dithiothreitol, Nikotinamidadenindinukleotid, Bovines Serumalbumin und nicht-ionischem Detergenz.
Verwendung von Trishydroxymethylaminomethansalzsäure in dem Verfahren nach Anspruch 1.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das End-Run-Oligonukleotid ein 3' Ende aufweist, so dass es sich beim Hybridisieren an die Sequenz des Blockierungs-Oligonukleotids über das 5' Ende des Blockierungs-Oligonukleotids erstreckt.
Verfahren nach Anspruch 32 oder 14 oder 20 oder 22, wobei das End-Run-Oligonukleotid ein 3' Ende aufweist, so daß es sich beim Hybridisieren unter Bedingungen, die eine Nukleinsäurehybridisierung des End-Run-Oligonukleotids an einen Teil der Blockierungsoligonukleotidsegenz erlauben, über das 5' Ende des Blockierungsoligonukleotids erstreckt.