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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Die Erfindung betrifft die Analyse
einer Desoxyribonukleinsäure
(„DNA'') und einer Ribonukleinsäure („RNA"), die Bestimmung
des Vorhandenseins einer vorbestimmten spezifischen DNA- und/oder
RNA-Nukleotidsequenz und die exponentielle Amplifikation einer solchen
Sequenz.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Die Fähigkeit zum Nachweis des Vorhandenseins
eines Nukleinsäuremoleküls, das
eine spezielle vorher festgelegte Sequenz aufweist, ist in einer
Vielzahl von Gebieten, wie zum Beispiel die Gerichtsmedizin, Medizin,
Epidemiologie und in der allgemeinen Gesundheit und in der Krankheitsvorhersage
und -diagnose von wesentlicher Bedeutung. Eine solche Fähigkeit
kann bei strafrechtlichen Untersuchungen helfen, indem fälschlich
angeklagte Personen ausgeschlossen werden oder indem strafbare Parteien
hinzugezogen werden. Sie kann so genutzt werden, dass die Identifikation
des verursachenden Mittels einer Infektionskrankheit oder die Charakterisierung
von Tumoren und Gewebeproben gestattet wird, oder daß sie die
Gesundheit der Blutprodukte garantiert.
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Eine Fähigkeit zum Nachweis des Vorhandenseins
einer speziellen Nukleinsäuresequenz
in einer Probe ist für
die Vorhersage der Wahrscheinlichkeit, dass zwei Personen miteinander
verwandt sind, oder dass eine Person an einer genetischen Krankheit
leidet, von Bedeutung. Eine solche Fähigkeit kann ebenfalls in Assays
zur Bestimmung der Reinheit von Trinkwasser, Milch oder anderen
Nahrungsmitteln verwendet werden.
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In vielen interessierenden Fällen ist
die gewünschte
Nukleinsäuresequenz
in einer sehr geringen Konzentration in der Probe vorhanden. In
solchen Fällen
kann das Vorhandensein des gewünschten
Moleküls
dem Nachweis entgehen, außer
die Assayempfindlichkeit kann durch die Verwendung komplizierter
Markierungen erhöht
werden. Die Assayempfindlichkeit kann durch Veränderung der Art, auf die der
Nachweis an den Beobachter berichtet oder signalisiert wird, erhöht werden.
Daher kann zum Beispiel die Assayempfindlichkeit durch die Verwendung
von nachweisbar markierten Reagenzien erhöht werden. Für diese
Zwecke sind eine große
Vielfalt solcher Markierungen verwendet worden: Enzymmarkierungen
(Kourilsky et al., U.S. Patent 4,581,333), Radioisotopmarkierungen
(Falkow et al., U.S. Patent 4,358,535, Berninger, U.S. Patent 4,446,237),
Fluoreszenzmarkierungen (Albarella et al.,
EP 144914 ), chemische Markierungen
(Sheldon III et al., U.S. Patent 4,582,789, Albarella et al., U.S.
Patent 4,563,417), modifizierte Basen (Miyoshi et al.,
EP 119448 ) usw.
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Obwohl die Verwendung hoch nachweisbarer
markierter Reagenzien die Empfindlichkeit von Nukleinsäurenachweisassays
verbessern kann, bleibt die Empfindlichkeit solcher Assay durch
praktische Probleme beschränkt,
die besonders mit unspezifischen Reaktionen zusammenhängen, die
das Hintergrundsignal erhöhen,
das in Abwesenheit der Nukleinsäure
erzeugt wird, zu deren Nachweis der Assay bestimmt ist. Für manche
Anwendungen wird daher die erwartete Konzentration des gewünschten
Nukleinsäuremoleküls zu gering sein,
um dessen Nachweis durch irgendeines der vorstehend beschriebenen
Verfahren zu gestatten.
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Ein Verfahren zur Überwindung
der Empfindlichkeitsbeschränkung
der Nukleinsäurekonzentration
ist die selektive Amplifizierung des Nukleinsäuremoleküls, dessen Nachweis vor dem
Durchführen
des Assays erwünscht
ist. In vivo rekombinante DNA-Methodologien, die zur Amplifizierung
von Nukleinsäurefragmenten in
der Lage sind, sind schon lange erkannt worden (Cohen et al., U.S.
Patent 4,237,224, Sambrook, J. et al., in: Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, NY (1989)). Solche Methodologien betreffen typischerweise
die Einführung
des Nukleinsäurefragments
in einen DNA- oder RNA-Vektor,
die klonale Amplifikation des Vektors und die Rückgewinnung des amplifizierten
Nukleinsäurefragments.
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In letzter Zeit sind in vitro Amplifikationsverfahren
entwickelt worden. Die Wirkung solcher Verfahren war phänomenal – ohne eine
solche Amplifikation wären
die meisten der vorhergehenden beispielhaften Gebiete nicht möglich. In
den Bereichen, in die sich die DNA-Amplifikation ausbreitete, haben
sich die Erfordernisse geändert,
die an die verschiedenen Amplifikationsverfahren gestellt wurden.
Dementsprechend besteht ein sehr ernster und fortlaufender Bedarf
an hoch spezifischen Amplifikationstechniken.
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Das wahrscheinlich am meisten verbreitete
von diesen praktizierten Verfahren ist die „Polymerasekettenreaktion" („PCR") (Mullis, K. et
al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51: 263–273 (1986),
Erlich H. et al.,
EP 50, 424 ,
EP 84,796 ,
EP 258,017 ,
EP 237,362 , Mullis, K.,
EP 201,184 , Mullis K. et al., U.S.
4,683,202, Erlich, H., U.S. 4,582,788 und Saiki, R. et al., U.S.
4,683,194), auf deren Offenbarungsgehalt hier vollumfänglich Bezug
genommen wird).
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Die PCR erreicht die Amplifikation
einer spezifischen Nukleinsäuresequenz
unter Verwendung von zwei Oligonukleotidprimern, die zu Regionen
der zu amplifizierenden Sequenz komplementär sind. Die Verlängerungsprodukte
mit den eingebauten Primern werden dann Template für anschließende Replikationsschritte. Das
Verfahren erhöht
selektiv die Konzentration eines gewünschten Nukleinsäuremoleküls, sogar
wenn dieses Molekül
vorher nicht gereinigt worden war und nur in einer einzigen Kopie
in einer speziellen Probe vorhanden ist. Das Verfahren kann zur
Amplifikation von entweder einzelsträngiger oder doppelsträngiger DNA
verwendet werden.
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Das Verfahren betrifft die Verwendung
einer DNA-Polymerase zur Lenkung der templatabhängigen Verlängerung eines Oligonukleotidprimerpaars.
Die Primerverlängerungsprodukte
werden dann Template für die
nachfolgenden Replikationsschritte.
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Die präzise Beschaffenheit der zwei
Oligonukleotidprimer des PCR-Verfahrens ist für den Erfolg dieses Verfahrens
entscheidend. Wie gut bekannt ist, besitzt ein DNA- oder RNA-Molekül eine Ausrichtung,
die ihm durch die 5' 3' Bindung des Zucker-Phosphatgrundgerüsts des
Moleküls
verliehen wird. Zwei DNA- oder RNA-Moleküle können durch die Bildung einer
Phosphodiesterbindung zwischen der endständigen 5'-Phosphatgruppe eines Moleküls und der
endständigen
3'-Hydroxylgruppe
des zweiten Moleküls
miteinander verknüpft
werden. Die Polymerase abhängige
Amplifikation eines Nukleinsäuremoleküls verläuft durch
die Addition eines 5'-Nukleosidtriphosphats
an das 3'-Hydroxylende
eines Nukleinsäuremoleküls. Daher
verlängert
die Funktion einer Polymerase das 3'-Ende eines Nukleinsäuremoleküls. Die Oligonukleotidsequenzen
der zwei PCR-Primer werden so ausgewählt, dass sie Sequenzen enthalten,
die zu Sequenzen identisch oder komplementär sind, die die Sequenz des
speziellen Nukleinsäuremoleküls flankieren,
dessen Amplifikation erwünscht ist.
Insbesondere wird die Nukleotidsequenz der „ersten" Primers so ausgewählt, dass er in der Lage ist,
an eine Oligonukleotidsequenz zu hybridisieren, die bezüglich der
Sequenz des gewünschten
Nukleinsäuremoleküls 3' ständig ist,
wohingegen die Nukleotidsequenz des „zweiten" Primers so ausgewählt wird, dass er eine Nukleotidsequenz
enthält,
die bezüglich
der Sequenz des gewünschten
Nukleinsäuremoleküls bei 5' vorhanden ist. Beide
Primer besitzen die 3' Hydroxylgruppen,
die für
die Enzym-vermittelte Nukleinsäuresynthese
notwendig sind.
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Die PCR-Reaktion ist zur exponentiellen
Amplifikation spezifischer Nukleinsäuresequenzen befähigt, weil
das Verlängerungsprodukt
des „ersten" Primers eine zu
einer Sequenz des „zweiten" Primers komplementäre Sequenz
enthält
und somit als ein Templat für
die Herstellung eines Verlängerungsprodukts
des „zweiten" Primers dient. Entsprechend
enthält
das Verlängerungsprodukt
des „zweiten" Primers gezwungenermaßen eine
Sequenz, die zu einer Sequenz des „ersten" Primers komplementär ist und daher als ein Templat
für die Herstellung
eines Verlängerungsprodukts
des „ersten" Primers dient. Durch
das Gestatten von Zyklen aus Hybridisierung, Polymerisation und
Denaturierung kann eine geometrische Zunahme in der Konzentration
des gewünschten
Nukleinsäuremoleküls erreicht
werden.
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Die PCR-Technologie ist brauchbar,
weil sie die schnelle und umfassende Amplifikation eine Polynukleotidmoleküls erreichen
kann (Mullis, K. B., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51: 263–273 (1986),
Saiki, R. K., et al., Bio/Technology 3: 1008– 1012 (1985), Mullis, K. B.,
et al., Met. Enzymol. 155: 335–350
(1987), auf deren Offenbarungsgehalt hier vollumfänglich Bezug
genommen wird). Nichtsdestotrotz gibt es mit der PCR mehrere praktische
Probleme. Erstens können
zusammen mit den zwei Templaten fremde Sequenzen mit den Primern
hybridisieren, was aufgrund solcher unspezifischen Hybridisierung
zu einer Coamplifikation führt.
Mit zunehmendem Grad der Amplifikation nimmt ebenfalls die Stärke einer
solchen Coamplifikation zu. Zweitens führt, aufgrund der Fähigkeit
der PCR zur einfachen Erzeugung von Millionen von Kopien für jedes anfängliche
Templat, eine zufällige
Einführung
des Endproduktes einer vorhergehenden Reaktion in andere Proben
leicht zu falsch-positiven Ergebnissen. Drittens gestattet die PCR
nicht, in oder von ihr Veränderungen einer
einzelnen Base nachzuweisen, das heißt, dass innerhalb des Protokolls
kein Unter schied zwischen einer „normalen" Sequenz und einer allelen Sequenzvariante
gemacht wird.
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Das Aufkommen der PCR führte zur
Entwicklung zusätzlicher
Amplifikationsverfahren. Ein solches alternatives Verfahren ist
die „Ligase
Kettenreaktion" („LCR") (Barany, F., Proc.
Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88: 189–193 (1991). Die LCR verwendet
zur exponentiellen Amplifikation eines speziellen Ziels zwei Paare
von Oligonukleotidsonden. Die Sequenzen jedes Oligonukleotidpaares
wird so ausgewählt,
dass dem Paar die Hybridisierung an angrenzende Sequenzen desselben
Strangs des Ziels gestattet wird. Eine solche Hybridisierung bildet
ein Substrat für
eine templatabhängige
Ligase. Daher gestattet die Hybridisierung des ersten Oligonukleotidpaars
an einen „ersten" Strang des Ziels
die Verknüpfung
der Oligonukleotide. Die Sequenz des zweiten Oligonukleotidpaars
wird so ausgewählt,
daß die
Oligonukleotide an angrenzende Sequenzen dieses Verknüpfungsprodukts
unter Bildung eines zweiten Substrats für die Verknüpfung hybridisieren können. Das Verknüpfungsprodukt
des zweiten Strangs besitzt daher eine Sequenz, die im wesentlichen
zu derjenigen des „ersten" Strangs des Ziels
identisch ist.
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Wie bei der PCR dienen daher die
resultierenden Produkte als Template in nachfolgenden Zyklen und eine
exponentielle Amplifikation der gewünschten Sequenz wird erhalten.
Vorteilhafterweise kann die LCR zum Nachweis von Mutationen und
insbesondere von einzelnen Nukleotidmutationen verwendet werden.
Die Primer können
daher so ausgelegt werden, dass sie nur dann miteinander verknüpft werden,
wenn das Zielmolekül
eine vorher festgelegte Mutationsstelle entweder enthält oder
diese fehlt.
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Ein mit der LCR zusammenhängendes
Problem ist per Definition, dass das Verfahren vier Oligonukleotide
und eine Ligase benötigt
und zu der unspezifischen „Verknüpfung stumpfer
Enden" der Oligonukleotide führen kann.
Eine solche unspezifische „Verknüpfung stumpfer
Enden" wird, falls
sie auftritt, zu einer Ziel unabhängigen exponentiellen Amplifikation
der Oligonukleotide führen.
Dies kann zu einem hohen Hintergrundsignal oder falsch-positiven
Ergebnissen führen.
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Dieser Mangel kann in mancher Beziehung
unter Verwendung von Oligonukleotiden angegangen werden, die an
naheliegende, jedoch nicht angrenzende Sequenzen hybridisieren (PCT
Anmeldung WO 90/01069). Wie bei der LCR betrifft ein solches Verfahren
die Verwendung von zwei Sätzen
von Primern. Da jedoch die Primer dazu bestimmt sind, an nicht angrenzende
Sequenzen des Zielmoleküls
zu hybridisieren, enthält
das Hybridisierungsprodukt eine „Lücke", die die hybridisierten Oligonukleotide
trennt. Diese Lücken werden
dann mit komplementären
dNTPs (entsprechend der Vermittlung durch die DNA-Polymerase) oder durch
ein zusätzliches
Paar von Oligonukleotiden gefüllt.
Somit weist am Ende eines jeden Zyklus jeder Einzelstrang ein Komplement
auf, das in der Lage ist, als Ziel während des nächsten Zyklus zu dienen und
eine exponentielle Amplifikation der gewünschten Sequenz wird erhalten.
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Obwohl dieses Protokoll das LCR-Problem
der unspezifischen Verknüpfung
stumpfer Enden vermeidet, geht dies auf Kosten der LCR-Leistungsfähigkeit
zum Nachweis von Mutationsveränderungen
einer einzelnen Base und es erfordert, dass die Sequenz der gesamten „Lücke" vorher bekannt ist.
Zusätzlich
ist eine entscheidende Schwierigkeit zur Verwendung dieser Technik
die Erfordernis, die Oligonukleotidprimer so auszulegen, dass die „Lücke" mit nur einem Untersatz
der dNTPs „repariert" werden kann. Das
heißt,
die Lücke kann
nicht alle vier Basen umfassen, so dass nur maximal drei der vier
dNTPs zu dem Reaktionsbehälter
gegeben werden können.
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Andererseits beschreibt das Journal
of Pathology, Band 162: 99–117
(1990) ein exponentielles Nukleinsäureamplifikationsverfahren,
das die Verwendung von nur zwei Oligonukleotidsequenzen (Primer)
und einem Polymeraseenzym betrifft. Von den Primerverlängerungsreaktionen
wird ein Produktmolekül
gebildet, wobei die zwei Primersequenzen, von denen jede zu den
5' Enden der antiparallelen
unteren und oberen Zielstränge
in 1 komplementär ist, durch
eine Polymerase vermittelte Reaktion entlang der Stränge verlängert werden.
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Der „Oligonucleotide Verknüpfungsassay" („OLA") (Landegreen, U.
et al., Science 241: 1077–1080 (1988))
hat mit der LCR gewisse Ähnlichkeiten.
Das OLA-Protokoll verwendet zwei Oligonukleotide, die so ausgelegt
sind, dass sie in der Lage sind, an angrenzende Sequenzen eines
Ziel-Einzelstrangs zu hybridisieren. Ebenso wie LCR ist OLA besonders
zum Nachweis von Punktmutationen geeignet. Im Gegensatz zu LCR führt OLA
jedoch vielmehr zu einer „linearen" als zu einer exponentiellen
Amplifikation der Zielsequenz. Ein mit OLA zusammenhängendes
Problem ist daher das Fehlen der exponentiellen Amplifikation.
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Nickerson, D. A. et al., haben einen
Nukleinsäurenachweisassay
beschrieben, der Merkmale der PCR und des OLA kombiniert (Nickerson,
D. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 87: 8923: 2927 (1990).
In diesem Verfahren wird PCR zum Erreichen der exponentiellen Amplifikation
der Ziel-DNA verwendet, die dann unter Verwendung von OLA nachgewiesen
wird. Zusätzlich
dazu, dass mehrfache und getrennte Verfahrenschritte erforderlich
sind, ist ein mit solchen Kombinationen verbundenes Problem, dass
sie alle Probleme erben, die mit PCR und OLA zusammenhängen.
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Andere bekannte Nukleinsäureamplifikationsverfahren
umfassen auf Transkription basierende Amplifikationssysteme (Kwoh
D et al., Proc Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86: 1173 (1989), Gingeras,
T. R. et al., PCT Anmeldung WO 88/10315 (Priorität: U.S. Patent Anmeldungen
mit den amtlichen Aktenzeichen 064,141 und 202,978)). Es sind ebenfalls
Schemata bekannt, die auf der Verknüpfung zweier (oder mehrerer)
Oligonukleotide in Gegenwart einer Nukleinsäure, die die Sequenz des resultierenden „Dioligonukleotids" aufweist, basieren
und dadurch das Dioligonukleotid amplifizieren. (Wu, D. Y. et al.,
Genomics 4: 560 (1989)).
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Miller, H. I. et al., PCT Anmeldung
WO 89/06700 (Priorität:
U.S. Patent Anmeldung mit dem amtlichen Aktenzeichen 146,462, angemeldet
am 21. Januar 1988) offenbart ein Nukleinsäuresequenzamplifikationsschema,
das auf der Hybridisierung einer Promotor/Primer Sequenz an eine
einzelsträngige
Ziel-DNA („ssDNA"), gefolgt von der
Transkription vieler RNA-Kopien der Sequenz basiert. Dieses Schema
war nicht zyklisch, das heißt,
es wurden keine neuen Template von den resultierenden RNA-Transkripten hergestellt.
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Malek. L. T. et al., U.S. Patent
5,130,238 und Davey, C. et al., (europäische Patentanmeldung Nr. 329,822)
offenbart ein Nukleinsäureamplifikationsverfahren,
das die zyklische Synthese von einzelsträngiger RNA („ssRNA"), ssDNA und doppelsträngiger DNA
(dsDNA) betrifft. Die ssRNA ist ein erstes Templat für ein erstes
Primeroligonukleotid, das durch die reverse Transkriptase (RNA-abhäöngige DNA- Polymerase) verlängert wird.
Die RNA wird dann von dem resultierenden DNA: RNA Duplex durch Wirkung
von Ribonuklease H (RNase H, eine RNase, die für RNA in einem Duplex mit entweder
DNA oder RNA spezifisch ist) entfernt. Die resultierende ssDNA ist
ein zweites Templat für
einen zweiten Primer, der ebenfalls die Sequenz eines RNA-Polymerasepromotors
(am Beispiel der T7 RNA-Polymerase erläutert) 5'-zu
dessen Homologie an dessen Templat umfaßt. Dieser Primer wird dann
durch DNA-Polymerase (am Beispiel des großen „Klenow" Fragments von E. coli DNA-Polymerase 1 erläutert) verlängert, was
zu einem doppelsträngigen
DNA- („dsDNA") Molekül führt, das
eine Sequenz aufweist, die zu derjenigen der ursprünglichen
RNA zwischen den Primern identisch ist und zusätzlich an einem Ende eine Promotorsequenz
aufweist. Diese Promotorsequenz kann durch die geeignete RNA-Polymerase
zur Herstellung vieler RNA-Kopien der DNA verwendet werden. Diese Kopien
können
dann in den Zyklus wieder eintreten, was zu einer sehr schnellen
Amplifikation führt.
Mit der richtigen Wahl der Enzyme kann diese Amplifikation isothermisch
ohne die Zugabe von Enzymen bei jedem Zyklus durchgeführt werden.
Aufgrund der zyklischen Natur dieses Verfahrens kann die Startersequenz
so gewählt
werden, dass sie entweder in DNA- oder RNA-Form vorhanden ist. Eine
Verbesserung dieses Verfahrens wurde von Schuster et al. (U.S. Patent
5.169,766) entwickelt, der zeigt, dass die von Malek (U.S. Patent 5,130,238)
gelehrte Primerverlängerung
nicht notwendig ist.
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Alle vorstehenden Amplifikationsverfahren
hängen
von dem Prinzip ab, dass ein Endprodukt eines Zyklus zu einem Startermaterial
funktional identisch ist. Durch die Wiederholung von Zyklen wird
die Nukleinsäure
daher exponentiell amplifiziert.
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Es wurde ein isothermes Amplifikationsverfahren
beschrieben, in dem Restriktionsendonukleasen und Ligasen dazu verwendet
werden, die Amplifikation von Zielmolekülen zu erreichen, die in einem
Strang einer Restriktionsstelle 5'-[α-thio]triphosphate
enthalten (Walker, G. T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.)
89: 392–396
(1992)).
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Verfahren, die Temperaturwechsel
verwenden, zum Beispiel PCR oder Wu, D. Y. et al., Genomics 4: 560
(1989)) weisen eine theoretische maximale Produktzunahme um das
2-fache pro Zyklus auf, weil in jedem Zyklus von jedem Templat ein
einziges Produkt hergestellt wird. In der Praxis ist die Zunahme
immer geringer als das 2- fache.
Eine weitere Verlangsamung der Amplifikation ist die Zeit, die zum
Wechseln der Temperatur gebraucht wird. Eine weitere Verzögerung wird
ebenfalls durch die Notwendigkeit hervorgerufen, dass in einem Zyklus
allen Molekülen
genügend
Zeit bewilligt wird, damit ein Schritt beendet ist. Moleküle, die
einen Schritt schnell beendet haben, müssen auf die Beendigung ihrer
langsameren Gegenstücke „warten", bevor sie zum nächsten Schritt
in dem Zyklus voranschreiten; eine Verkürzung der Zykluszeitdauer würde zum Überspringen
eines Zyklus durch die „langsameren" Moleküle führen, was
zu einem geringeren Exponenten der Amplifikation führt.
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Verfahren, die einen Transkriptionsschritt
umfassen, zum Beispiel dasjenige der vorliegenden Erfindung oder
von Malek, L. T. et al. (U.S. Patent 5,130,238) oder Davey, C. et
al. (veröffentlichte
europäische
Patentanmeldung Nr. 329,822) können
das Produkt um mehr als einen Faktor von 2 bei jedem Zyklus erhöhen. Da
100 oder mehr Transkripte von einem einzelnen Templat hergestellt
werden können,
sind tatsächlich
für die Zunahme
Faktoren von 100 oder mehr theoretisch erreichbar. Werden alle Schritte
unter identischen Bedingungen durchgeführt, braucht weiterhin kein
Molekül,
das einen speziellen Schritt beendet hat, zu „warten", bevor es zum nächsten Schritt voranschreitet.
Daher sind Amplifikationen, die auf Transkription basieren und keinen
Temperaturwechsel erfordern potentiell viel schneller, als Amplifikationen
mit Temperaturwechsel, wie zum Beispiel PCR.
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Zusammengefaßt ist, obwohl eine Vielfalt
von Amplifikationsverfahren entwickelt worden sind, ein streng Ziel-abhängiges Verfahren
höchst
erwünscht,
das in der Lage ist, die exponentielle Amplifikation eines Zielmoleküls zu vermitteln,
und das die Fähigkeit
besitzt, eine einzelne allele Nukleotidveränderung nachzuweisen. Die vorliegende
Erfindung stellt ein solches Verfahren zur Verfügung.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Die vorliegende Erfindung stellt
daher ein verbessertes Verfahren zum Amplifizieren einer gewünschten
in einem Zielmolekül
vorhandenen Sequenz zur Verfügung.
Die Methodologie stützt
sich im allgemeinen auf die Hybridisierung eines Blockierungs-Oligonukleotids an
ein Zielmolekül.
Die Hybridisierungspositionen des Blockierungs-Oligonukleotids sind derart, dass es
an ein Primermolekül
oder an ein Verlänge rungsprodukt des
Primer-Oligonukleotids angrenzt, das ebenfalls an das Ziel hybridisiert
ist. Das Ergebnis einer solchen Positionierung ist, dass das Primer-Oligonukleotid (oder
dessen Verlängerungsprodukt)
und das Blockierungs-Oligonukleotid
miteinander verknüpft
werden können.
Eine solche Verknüpfung
stellt ein Substrat für
die Polymerase vermittelte templatabhängige Verlängerung eines End-Run-Oligonukleotids
zur Verfügung,
das in der Lage ist, an das Blockierungs-Oligonukleotid zu hybridisieren. Da
das Verlängerungsprodukt
des End-Run-Oligonukleotids
zu den Primer-Oligonukleotid- und Blockierungs-Oligonukleotidsequenzen komplementär ist, ist
die Reaktion in der Lage, die exponentielle Amplifikation des Zielmoleküls zu vermitteln.
Das Verfahren ist bezeichnenderweise in der Lage zwischen allelen
Varianten zu unterscheiden, die sich um so wenig, wie ein einzelnes
Nukleotid unterscheiden.
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Im einzelnen stellt die Erfindung
ein Verfahren zur Amplifizierung der Konzentration eines Ziel-Nukleinsäuremoleküls zur Verfügung, umfassend
die Schritte:
- (A) des Hybridisierens eine Blockierungs-Oligonukleotids
an das Ziel-Nukleinsäuremolekül zur Bildung
eines Doppelstrang-Nukleinsäuremoleküls;
- (B) des Hybridisierens eines Primer-Oligonukleotids an das Ziel-Nukleinsäuremolekül des Doppelstrang-Nukleinsäuremoleküls, so dass
das 3' Ende des
Primer-Oligonukleotids entweder an das 5' Ende des hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotids
angrenzt oder in einer Polymerase vermittelten templatabhängigen Primerverlängerungsreaktion
verlängert
werden kann, damit es an das 5' Ende
des hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotids angrenzt;
- (C) (1) wobei das 3' Ende
des hybridisierten Primer-Oligonukleotids an das 5' Ende des hybridisierten
Blockierungs-Oligonukleotids angrenzt und des Ausführens von
Schritt (D); oder
- (2) wobei das 3' Ende
des hybridisierten Primer-Oligonukleotids nicht an das 5' Ende des hybridisierten
Blockierungs-Oligonukleotids angrenzt, was dazu führt, dass
das 3' Ende des
hybridisierten Primer-Oligonukleotids in einer Polymerase vermittelten
templatabhängigen
Primerverlängerungsreak tion
verlängert
wird, um dadurch ein Primerverlängerungsprodukt
zu bilden, dessen 3' Ende
an das 5' Ende des
hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotids
angrenzt und anschließendem
Ausführen
von Schritt (D);
- (D) des Verknüpfens
des angrenzenden 3' Endes
des hybridisierten Primer-Oligonukleotids
aus Schritt (C) (1) oder des Verknüpfens des angrenzenden 3' Endes des hybridisierten
Primerverlängerungsprodukts
aus Schritt (C) (2) mit dem 5' Ende
des hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotids zur Bildung eines
Verknüpfungsprodukts,
das die Sequenz des Primer-Oligonukleotids oder des Primerverlängerungsprodukts
und die Sequenz des Blockierungs-Oligonukleotids
aufweist;
- (E) des Hybridisierens eines End-Run-Oligonukleotids an die
Sequenz des Blockierungs-Oligonukleotids des Verknüpfungsprodukts
und
- Verlängerns
des 3' Endes des
hybridisierten End-Run-(F) des Oligonukleotids in einer Polymerase
vermittelten, templatabhängigen
Primerverlängerungsreaktion
zur Bildung eines End-Run Verlängerungsprodukts
und zur Amplifizierung der Konzentration des Zielmoleküls;
wobei
der Schritt (A) die Gruppe von Schritten (B), (C) und (D) und die
Gruppe von Schritten (E) und (F) untereinander in jeder beliebigen
Reihenfolge durchgeführt
werden können.
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Die Erfindung stellt ebenfalls die
Ausführungsform
des vorstehenden Verfahrens zur Verfügung, weiterhin umfassend die
Schritte des:
- (G) Hybridisierens eines Blockierungs-Oligonukleotids
an das End-Run-Verlängerungsprodukt
zur Bildung eines Doppelstrang-Nukleinsäuremoleküls;
- H) des Hybridisierens eines Primer-(Oligonukleotids an das End-Run-Verlängerungsprodukt
des Doppelstrang-Nukleinsäuremoleküls aus Schritt
(G) zur Bildung eines Doppelstrang-Nukleinsäuremoleküls, wobei das 3' Ende des Primer-Oligonukleotids
entweder an das 5' Ende
des hybridisierten Blockie rungs-Oligonukleotids angrenzt oder in
einer Polymerase vermittelten templatabhängigen Primerverlängerungsreaktion verlängert werden
kann, damit es an das 5' Ende
des hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotids angrenzt;
- (I) (1) wobei das 3' Ende
des hybridisierten Primer-Oligonukleotids aus Schritt H) an das
5' Ende des hybridisierten
Blockierungs-(Oligonukleotids angrenzt und des Ausführens von
Schritt (J); oder
- (2) wobei das 3' Ende
des hybridisierten Primer-Oligonukleotids aus Schritt H) nicht an
das 5' Ende des
hybridisierten Blockierungs-(Oligonukleotids angrenzt, was dazu
führt,
dass das 3' Ende
des hybridisierten Primer-Oligonukleotids
in einer Polymerase vermittelten templatabhängigen Primerverlängerungsreaktion verlängert werden
kann, um dadurch ein Primerverlängerungsprodukt
zu bilden, dessen 3' Ende
an das 5' Ende des
hybridisierten Blockeriungs-Oligonukleotids angrenzt und anschließendem Ausführen von
Schritt (J);
- (J) des Verknüpfens
des angrenzenden 3' Endes
des hybridisierten Primer-Oligonukleotids
aus Schritt (1) (1) oder des Verknüpfens des angrenzenden 3' Endes des hybridisierten
Primerverlängerungsprodukts
aus Schritt (1) (2) mit dem 5' Ende
des hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotids zur Bildung und
Amplifikation des Verknüpfungsprodukts;
- K) des Hybridisierens eines End-Run-(Oligonukleotids an die
Sequenz des Blockierungs-Oligonukleotids des Verknüpfungsprodukts
aus Schritt (J) und
- Verlängerns
des 3' Endes des
hybridisierten End-Run-(L) des Oligonukleotids in einer Polymerase
vermittelten templatabhängigen
Primerverlängerungsreaktion
zur Bildung und Amplifikation eines End-Run-Verlängerungsprodukts.
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Die Erfindung richtet sich ebenfalls
an die Ausführungsform
der vorstehenden Verfahren, umfassend nach Schritt (F) die folgenden
weiteren Schritte:
- (G) des Hybridisierens eines
zweiten Blockierungsoligonukleotids an das End-Run-Verlängerungsprodukt zur
Bildung eines Doppelstrang-Nukleinsäuremoleküls, wobei das zweite Blockierungs-Oligonukleotid
an das End-Run-Verlängerungsprodukt
an einer Stelle hybridisiert, an die das Blockierungsoligonukleotid
aus Schritt (A) oder das Primer-Oligonukleotid aus Schritt (B) nicht
hybridisieren kann;
- H) des Hybridisierens eines zweiten Primer-(Oligonukleotids
an das End-Run-Verlängerungsprodukt
des Doppelstrang-Nukleinsäuremoleküls, so dass
das 3' Ende des
zweiten Primer-Oligonukleotids entweder an das 5' Ende des hybridisierten zweiten Blockierungs-Oligonukleotids
angrenzt oder in einer Polymerase vermittelten templatabhängigen Primer-Verlängerungsreaktion
verlängert
werden kann, so dass es an das 5' Ende
des hybridisierten zweiten Blockierungs-Oligonukleotids angrenzt;
- hybrdisierten zweiten Primer-(I) (1) wobei das 3' Ende des Oligonukleotids
an hybrdisierten zweiten Blockierungs-das 5' Ende des Oligonukleotids angrenzt und
des Ausführens
von Schritt (J); oder
- (2) wobei das 3' Ende
des hybridisierten zweiten Primer-Oligonukleotids nicht an das 5' Ende des hybridisierten
zweiten Blockierungs-Oligonukleotids angrenzt, was dazu führt, dass
das 3' Ende des
hybridisierten zweiten Primer-Oligonukleotids in einer Polymerase
vermittelten templatabhängigen
Primerverlängerungsreaktion
verlängert
wird, um ein zweites Primerverlängerungsprodukt
zu bilden, dessen 3' Ende
an das 5' Ende des
hybridisierten zweiten Blockeirungs-Oligonukleotids angrenzt und
anschließendem
Ausführen von
Schritt (J);
- (J) des Verknüpfens
des angrenzenden 3' Endes
des hybridisierten zweiten Primer-Oligonukleotids aus Schritt (I)
(1) oder des Verknüpfens
des angrenzenden 3' Endes
des hybridisierten zweiten Primer-Verlängerungsprodukts aus Schritt
I) (2) mit dem 5' Ende
des hybridisierten Blockierungs-(Oligonukleotids zur Bildung eines
zweiten Verknüpfungsprodukts,
das die Sequenz des zweiten Pri mer-Oligonukleotids oder des zweiten
Primer-Verlängerungsprodukts
und die Sequenz des zweiten Blockierungs-Oligonukleotids aufweist;
- (K) des Hybridisierens eines zweiten End-Run Oligonukleotids
an die Sequenz des zweiten Blockierungs-Oligonukleotids des zweiten
Verknüpfungsprodukts
und
- (L) des Verlängerns
des 3' Endes des
hybridisierten zweiten End-Run-Oligonukleotids
in einer Polymerase vermittelten templatabhängigen Primerverlängerungsreaktion
zur Bildung eines zweiten End-Run-Verlängerungsprodukts und damit
zur Amplifikation der Konzentration der Sequenz des Zielmoleküls.
-
Die Erfindung kann alternativ zu
den vorstehend beschriebenen Schritten (G) bis (H) die Ausführungsform
umfassen, die nach Schritt (F) die folgenden weiteren Schritte umfaßt:
- (G) des Hybridisierens eines zweiten Blockierungs-Oligonukleotids
an das Verknüpfungsprodukt
zur Bildung eines Doppelstrang-Nukleinsäuremoleküls, wobei das zweite Blockierungs-Oligonukleotid
an das Verknüpfungsprodukt
an einer Stelle hybridisiert, an die das Blockierungs-Oligonukleotid
aus Schritt (A) oder das Primer-Oligonukleotid aus Schritt (B) nicht
hybridisieren kann;
- H) des Hybridisierens eines zweiten Primer-(Oligonukleotids
an das Verknüpfungsprodukt
des Doppelstrang-Nukleinsäuremoleküls, so dass
das 3' Ende des
zweiten Primer-Oligonukleotids an das 5' Ende des hybridisierten zweiten Blockierungs-Oligonukleotids
angrenzt oder einer Polymerase vermittelten templatabhängigen Primerverlängerungsreaktion
verlängert
werden kann, damit es an das 5' Ende
des hybridisierten zweiten Blockierungs-Oligonukleotids angrenzt;
- I) (1) wobei das 3' Ende
des hybridisierten zweiten Primer-(Oligonukleotids an das 5' Ende des hybridisierten
zweiten Blockierungs-Oligonukleotids angrenzt und des Ausführens von
Schritt (J); oder
- (2) wobei das 3' Ende
des hybridisierten zweiten Primer-Oligonukleotids nicht an das 5' Ende des hybridisierten
zweiten Blockierungs-Oligonukleotids angrenzt, was dazu führt, dass
das 3' Ende des
hybridisierten zweiten Primer-Oligonukleotids in einer Polymerase
vermittelten templatabhängigen
Primerverlängerungsreaktion
verlängert
wird, um dadurch ein zweites Primerverlängerungsprodukt zu bilden,
dessen 3' Ende an das
5' Ende des hybridisierten
zweiten Blockierungs-Oligonukleotids angrenzt und anschließendem Ausführen von
Schritt (J);
- (J) des Verknüpfens
des angrenzenden 3' Endes
des hybridisierten zweiten Primer-Oligonukleotids aus Schritt (1)
(1) oder des Verknüpfens
des angrenzenden 3' Endes
des hybridisierten zweiten Primer-Verlängerungsprodukts aus Schritt
I) (2) mit dem 5' Ende
des hybridisierten Blockierungs-(Oligonukleotids zur Bildung eines
zweiten Verknüpfungsprodukts,
das die Sequenz des zweiten Primer-Oligonukleotids oder des zweiten
Primer-Verlängerungsprodukts
und die Sequenz des zweiten Blockierungs-Oliogonukleotids aufweist;
- (K) des Hybridisierens eines zweiten End-Run Oligonukleotids
an die Sequenz des zweiten Blockierungs-Oligonukleotids des zweiten
Verknüpfungsprodukts
und
- (L) des Verlängerns
des 3' Endes des
hybridisierten zweiten End-Run-Oligonukleotids
in einer Polymerase vermittelten templatabhängigen Primerverlängerungsreaktion
zur Bildung eines zweiten End-Run-Verlängerungsprodukts und damit
zur Amplifikation der Konzentration der Sequenz des Zielmoleküls.
-
Die Erfindung stellt ebenfalls Verfahren
zur Bestimmung zur Verfügung,
ob ein ausgewähltes
Nukleotid an einer vorbestimmten Stelle eines Ziel-Nukleinsäuremoleküls vorhanden
ist. Solche Nachweisverfahren können
von der Fähigkeit
der Blockierungs-Oligonukleotide und Primer-Oligonukleotide zum
Verknüpfen
und zur Bildung von Verknüpfungsprodukten,
von Primer-Oligonukleotiden zur Bildung von Verlängerungsprodukten, von End-Run-Oligonukleotiden
zur Bildung von Verlängerungsprodukten
und von jedem Oligonukleotid zur Hybridisierung an Teile des Ziel-Nukleinsäuremoleküls abhängen. Vorbestimmte
Stellen von Ziel-Nukleinsäuremolekülen umfassen
nahe an dem 5' Ende
des Blockierungs-Oligonukleotids
liegende oder daran angrenzende Stellen, nahe an dem 3' Ende des Primer-Oligonukleotids
liegende oder daran angrenzende Stellen und nahe an dem 3' Ende des End-Run-Oligonukleotids
liegende oder daran angrenzende Stellen.
-
Eine beispielhafte Ausführungsform
zur Bestimmung, ob ein ausgewähltes
Nukleotid vorhanden ist, umfaßt
die Schritte:
- (A) des Bereitstellens von Bedingungen
zur Hybridisierung eines Blockierungs-Oligonukleotids an das Ziel-Nukleinsäuremolekül zur Bildung
eines teilweisen Doppelstrang-Nukleinsäuremoleküls, wobei das 5' Ende des hybridisierten
Blockierungs-Oligonukleotids derart angeordnet ist, dass sein 5' endständiges Nukleotid
der vorbestimmten Stelle des Zielmoleküls gegenüberliegt und wobei es zum ausgewählten Nukleotid
komplementär
ist;
- (B) des Bereitstellens von Bedingungen zur Hybridisierung eines
Primer-Oligonukleotids
an das Ziel-Nukleinsäuremolekül des teilweisen
Doppelstrang-Nukleinsäuremoleküls, so dass
das 3' Ende des
Primer-Oligonukleotids entweder an das 5' Ende des hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotids
angrenzt oder in einer Polymerase vermittelten templatabhängigen Primerverlängerungsreaktion
verlängert
werden kann, damit es an das 5' Ende
des hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotids angrenzt;
- (C) (1) des Ausführens
von Schritt (D), wenn das 3' Ende
des Primer-Oligonukleotids
an das 5' Ende des Blockierungs-Oligonukleotids
angrenzt, oder
- (2) des Ausführens
von Schritt (D) im Anschluß an
die Verlängerung
des 3' Endes des
hybridisierten Primer-Oligonukleotids in einer Polymerase vermittelten
templatabhängigen
Primerverlängerungsreaktion
zur Bildung eines Primerverlängerungsprodukts,
dessen 3' Ende an
das 5' Ende des
Blockierungs-Oligonukleotids angrenzt, wenn das 3' Ende des Primer-Oligonukleotids nicht
an das 5' Ende des
Blockierungs-Oligonukleotids angrenzt;
- (D) des Inkubierens des angrenzenden 3' Endes des hybridisierten Primer-Oligonukleotids aus
Schritt (C) (1) oder des angrenzenden 3' Endes des hybridisierten Primerverlängerungsprodukts
aus Schritt (C) (2) und des 5' Endes
des hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotids in Gegenwart einer
Ligase und unter Bedingungen, die einer Nukleinsäureverknüpfung förderlich sind;
- (E) des Bestimmens, ob das ausgewählte Nukleotid an der vorbestimmten
Stelle vorhanden ist, in dem nachgewiesen wird, ob Schritt (D) in
der Bildung eines Verknüpfungsprodukts
resultiert, das die Sequenz des Primer-Oligonukleotids Primer-Verlängerungsprodukts
und des Blockierungs-oder des Oligonukleotids aufweist, wobei die
Bildung des Verknüpfungsprodukts
von der Fähigkeit
des 5' Nukleotids
des Blockierungs-endständigen
Oligonukleotids abhängt,
an das Nukleotid an der vorbestimmten Stelle zu hybridisieren, und
wobei der Nachweis durch die folgenden Unterschritte erreicht wird:
- (1) des Bereitstellens eines End-Run-Oligonukleotids für die Inkubation,
wobei das End-Run-Oligonukleotid in der Lage ist, an mindestens
einen Teil des Blockierungs-Oligonukleotids zu hybridisieren, und
des Aufrechterhaltens von Bedingungen, die ausreichend sind, um
eine Nukleinsäurehybridisierung
zu ermöglichen
und eine Polymerase vermittelte templatabhängige Primerverlängerung
stattfinden zu lassen und
- (2) des Bestimmens, ob das End-Run-Oligonukleotid so verlängert ist,
dass es eine Sequenz enthält,
die zu einer Sequenz des Primer-Oligonukleotids komplementär ist.
-
Ein weiteres erfindungsgemäßes Verfahren
zur Bestimmung, ob ein ausgewähltes
Nukleotid an einer vorbestimmten Stelle eines Ziel-Nukleinsäuremoleküls vorhanden
ist, umfaßt
die Schritte:
- (A) des Bereitstellens von Bedingungen
zur Hybridisierung eines Blockierungs-Oligonukleotids an das Ziel-Nukleinsäuremolekül zur Bildung
eines Doppelstrang-Nukleinsäuremoleküls, wobei
das 5' Ende des hybridisierten
Blockierungs-Oligonukleotids derart angeordnet ist, dass sein 5' endständiges Nukleo tid
an das direkt zur vorbestimmten Stelle des Zielmoleküls 3' ständige Nukleotid
hybridisiert;
- (B) des Bereitstellens von Bedingungen zur Hybridisierung eines
Primer-Oligonukleotids
an das Ziel-Nukleinsäuremolekül des teilweisen
Doppelstrang-Nukleinsäuremoleküls, so dass
das 3' Ende des
Primer-Oligonukleotids entweder an das 5' Ende des hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotids
angrenzt und wobei das 3' endständige Nukleotid
zum ausgewählten
Nukleotid komplementär
ist;
- (C) des Inkubierens des angrenzenden 3' Endes des hybridisierten Primer-Oligonukleotids und
des 5' Endes des
hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotids
in Gegenwart einer Ligase und unter Bedingungen, die einer Nukleinsäureverknüpfung förderlich
sind;
- (D) des Bestimmens, ob das ausgewählte Nukleotid an der vorbestimmten
Stelle vorhanden ist, in dem nachgewiesen wird, ob Schritt (C) in
der Bildung eines Verknüpfungsprodukts
resultiert, das die Sequenz des Primer-Oligonukleotids und des Blockierungs-Oligonukleotids
aufweist, wobei der Nachweis durch die folgenden Unterschritte erreicht
wird:
- (1) des Bereitstellens eines End-Run-Oligonukleotids für die Inkubation,
wobei das End-Run-Oligonukleotid in der Lage ist, an mindestens
einen Teil des Blockierungs-Oligonukleotids zu hybridisieren, und
des Aufrechterhaltens der Inkubation unter Bedingungen, die ausreichend
sind, um eine Nukleinsäurehybridisierung
zu ermöglichen
und eine Polymerase vermittelte templatabhängige Primerverlängerung
stattfinden zu lassen und
- (2) des Bestimmens, ob das End-Run-Oligonukleotid so verlängert ist,
dass es eine Sequenz enthält,
die zu einer Sequenz des Primer-Oligonukleotids komplementär ist.
-
Die Erfindung umfaßt ebenfalls
eine Ausführungsform
des vorstehenden Verfahrens, wobei die Bestimmung, ob ein End-Run-Oligonukleotid
verlängert
ist, um eine Se quenz zu erhalten, die zu einer Sequenz des Primer-Oligonukleotids
komplementär
ist, über
die Amplifikation jedes End-Run-Verlängerungsprodukts durchgeführt wird
und wobei ein Verfahren verwendet wird, das die folgenden Unterschritte
umfaßt:
- a) des Hybridisierens des Blockierungs-(Oligonukleotids
an jegliche End-Run-Verlängerungsprodukte,
die bei der Inkubation vorhanden sind, um dadurch Doppelstrang-Nukleinsäuremoleküle zu bilden;
- Hybridisierene des Primer-(b) des Oligonukleotids an das End-Run-Verlängerungsprodukt
jeglicher Doppelstrang-Nukleinsäuremoleküle in einer
Weise, dass das 3' Ende
des Primer-Oligonukleotids entweder an das 5' Ende des hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotids
angrenzt oder in einer Polymerase vermittelten templatabhängigen Primerverlängerungsreaktion
verlängert
werden kann, damit es an das 5' Ende
des hybridiserten Blockierungs-Oligonukleotids
angrenzt;
- (c) (1) wobei das 3' Ende
des hybridisierten Primer-Oligonukleotids an das 5' Ende des hybridisierten
Blockierungs-Oligonukleotids angrenzt und des Ausführens von
Schritt (d); oder
- (2) wobei das 3' Ende
des hybridisierten Primer-Oligonukleotids nicht an das 5' Ende des hybridisierten
Blockierungs-Oligonukleotids angrenzt, was dazu führt, dass
das 3' Ende des
hybridisierten Primer-Oligonukleotids in einer Polymerase vermittelten
templatabhängigen
Primerverlängerungsreaktion
verlängert
wird, um dadurch ein Primerverlängerungsprodukt
zu bilden, dessen 3' Ende
an das 5' Ende des
hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotids
angrenzt und des anschließenden
Ausführen
von Schritt (d);
- (d) des Verknüpfens
des angrenzenden 3' Endes
aller hybridisierten Primer-Oligonukleotide
aus Schritt (c) (1) oder des Verknüpfens aller angrenzenden 3' Enden der hybridisierten
Primerverlängerungsprodukte
aus Schritt (c) (2) mit dem 5' Ende
aller hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotide zur Bildung eines
Verknüpfungsprodukts,
das die Sequenz des Primer-Oligonukleotids oder des Primerverlängerungsprodukts
und die Sequenz des Blockierungs-Oligonukleotids
aufweist;
- (E) des Hybridisierens eines End-Run-Oligonukleotids an die
Sequenz des Blockierungs-Oligonukleotids jeglichen Verknüpfungsprodukts
und
- Verlängerns
des 3' Endes des
hybridisierten End-Run-(F) des Oligonukleotids in einer Polymerase
vermittelten, templatabhängigen
Primerverlängerungsreaktion
zur Bildung und Amplifikation des End-Run Verlängerungsprodukts.
-
Ferner ist ein weiteres erfindungsgemäßes Verfahren
zur Bestimmung, ob ein ausgewähltes
Nukleotid an einer vorbestimmten Stelle eines Ziel-Nukleinsäuremoleküls vorhanden
ist, von der Fähigkeit
eines End-Run-Oligonukleotids zur Verlängerung in einer Polymerase
vermittelten templatabhängigen
Reaktion abhängig.
Dieses Verfahren umfaßt
die Schritte:
- (A) des Hybridisierens eines
Blockierungs-Oligonukleotids an eine Nukleinsäuresequenz, die zum Ziel-Nukleinsäuremolekül komplementär ist, um
dadurch ein teilweises Doppelstrang-Nukleinsäuremolekül zu bilden;
- (B) des Hybridisierens eines Primer-Oligonukleotids an die Nukleinsäuresequenz,
die zum Ziel-Nukleinsäuremolekül des Doppelstrang-Nukleinsäuremoleküls komplementär ist, damit
das 3' Ende des
Primer-Oligonukleotids entweder an das 5' Ende des hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotids
angrenzt oder in einer Polymerase vermittelten templatabhängigen Primerverlängerungsreaktion
verlängert
werden kann, damit es an das 5' Ende
des hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotids angrenzt;
- (C) (1) wobei das 3' Ende
des hybridisierten Primer-Oligonukleotids an das 5' Ende des hybridisierten
Blockierungs-Oligonukleotids angrenzt und des Ausführens von
Schritt (D); oder
- (2) wobei das 3' Ende
des hybridisierten Primer-Oligonukleotids nicht an das 5' Ende des hybridisierten
Blockierungs-Oligonukleotids angrenzt, was da zu führt, dass
das 3' Ende des
hybridisierten Primer-Oligonukleotids in einer Polymerase vermittelten
templatabhängigen
Primerverlängerungsreaktion
verlängert
wird, um dadurch ein Primerverlängerungsprodukt
zu bilden, dessen 3' Ende
an das 5' Ende des
hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotids
angrenzt und anschließendem
Ausführen
von Schritt (D);
- (D) des Verknüpfens
des angrenzenden 3' Endes
des hybridisierten Primer-Oligonukleotids
aus Schritt (C) (1) oder des Verknüpfens des angrenzenden 3' Endes des hybridisierten
Primerverlängerungsprodukts
aus Schritt (C) (2) mit dem 5' Ende
des hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotids zur Bildung eines
Verknüpfungsprodukts,
das die Sequenz des Primer-Oligonukleotids oder des Primerverlängerungsprodukts
und die Sequenz des Blockierungs-Oligonukleotids
aufweist;
- (E) des Hybridisierens eines End-Run-Oligonukleotids an die
Sequenz des Blockierungs-Oligonukleotids des Verknüpfungsprodukts,
wobei das 3' Ende
des End-Run-Oligonukleotids
zu dem ausgewählten
Nukleotid komplementär
ist und das 3' endständige Nukleotid
des End-Run-Oliognukleotids der vorbestimmten Stelle des Zielmoleküls gegenüberliegen
kann;
- (F) des Bereitstellens von Bedingungen zur Verlängerung
des 3' Endes des
hybridisierten End-Run-Oligonukleotids in einer Polymerase vermittelten
templatabhängigen
Primerverlängerungsreaktion
zur Bildung eines End-Run-Verlängerungsprodukts;
- (G) des Bestimmens des Vorhandenseins des ausgewählten Nukleotids
an der vorbestimmten Stelle, indem nachgewiesen wird, ob Schritt
(F) in der Bildung eines End-Run-Verlängerungsprodukts resultiert.
-
Die vorliegende Erfindung betrachtet
ebenfalls alternative Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins
eines ausgewählten
Nukleotids an einer vorbestimmten Stelle eines Ziel-Nukleinsäuremoleküls. Solche
Nachweisverfahren können
von der Fähigkeit
eines Primer-Oligonukleotids zur Hybridisierung an das Ziel-Nukleinsäuremolekül und zur
Bildung eines Primer-Verlängerungsprodukts
abhängen.
Eine derartige Ausführungsform
umfaßt
die Schritte:
- (A) des Bereitstellens von Bedingungen
zur Hybridisierung eines Blockierungs-Oligonukleotids an das Ziel-Nukleinsäuremolekül zur Bildung
eines teilweisen Doppelstrang-Nukleinsäuremoleküls;
- (B) des Bereitstellens von Bedingungen zur Hybridisierung eines
Primer-Oligonukleotids
an das Ziel-Nukleinsäuremolekül des teilweisen
Doppelstrang-Nukleinsäuremoleküls, so dass
das 3' Ende des
Primer-Oligonukleotids der vorbestimmten Stelle des Zielmoleküls gegenüberliegt;
- (C) des Bereitstellens von Bedingungen zur Verlängerung
des 3' Endes des
hybridisierten Primer-Oligonukleotids in einer Polymerase vermittelten
templatabhängigen
Primer-Verlängerungsreaktion,
um dadurch ein Primer-Verlängerungsprodukt
zu bilden;
- (D) des Bestimmens, ob das ausgewählte Nukleotid an der vorbestimmten
Stelle vorhanden ist, in dem nachgewiesen wird, ob Schritt (C) in
der Bildung eines Primerverlängerungsprodukts
resultiert, wobei der Nachweis durch die folgenden Unterschritte
erreicht wird:
- (1) des Inkubierens des Primer-Verlängerungsprodukts und des 5' Endes des hybridisierten
Blockierungs-Oligonukleotids in Gegenwart einer Ligase unter Bedingungen,
die einer Nukleinsäureverknüpfung förderlich
sind.;
- (2) des Nachweisens, ob Schritt (1) in der Bildung eines Verknüpfungsprodukts
resultiert, das die Sequenz des Primer-Oligonukleotidverlängerungsprodukts und des Blockierung-Oligonukleotids
aufweist, wobei der Nachweis durch die folgenden Schritte erreicht
wird:
- a) des Bereitstellens eines End-Run-(Oligonukleotids für die Inkubation,
wobei das End-Run-Oligonukleotid mit wenigstens einem Teil des Blockierungs-Oligonukleotids
hybridisieren kann und des Beibehal tens der Inkubation unter Bedingungen,
die ausreichend sind, um eine Nukleinsäurehybridisierung zu ermöglichen und
eine Polymerase vermittelte templatabhängige Primer-Verlängerung
stattfinden zu lassen; und
- (b) des Bestimmens, ob das End-Run-Oligonukleotid verlängert ist,
so dass es eine Sequenz enthält,
die zu einer Sequenz des Primer-Oligonukleotids
komplementär
ist.
-
Die vorliegende Erfindung zeichnet
sich dadurch aus, dass die hier gelehrten Verfahren erstens zum Amplifizieren
der Konzentration einer beliebigen Nukleinsäure verwendet werden können, gefolgt
von ebenfalls hier gelehrten Verfahren zur Bestimmung, ob ein ausgewähltes Nukleotid
an einer vorbestimmten Stelle der amplifizierten Nukleinsäure vorhanden
ist.
-
Die Erfindung richtet sich ebenfalls
auf „Kits" und insbesondere
auf ein Kit, das Reagenzien zur Amplifikation von wenigstens einer
Zielsequenz umfaßt,
die wenigstens eine Region umfaßt,
die eine definierte Nukleinsäuresequenz
aufweist, wobei der Kit mindestens einen Behälter umfaßt und der Behälter wenigstens eine
Blockierungseinheit, wenigstens eine Primereinheit und wenigstens
eine End-Run-Einheit umfaßt,
wobei die Blockierungseinheit in der Lage ist, an einen Teil der
Nukleinsäuresequenz
zu hybridisieren, die Primereinheit in der Lage ist, an einen unterschiedlichen
Teil der Nukleinsäuresequenz
zu hybridisieren und die End-Run-Einheit eine Sequenz umfaßt, die
zu wenigstens einem Teil der Blockierungseinheit komplementär ist.
-
Die Kits können optional Reagenzien, Enzyme
und/oder Puffer umfassen, die so ausgelegt sind, dass sie die End-Run-Amplifikation
erleichtern.
-
KURZE BESCHREIBUNG
DER FIGUREN
-
1 stellt
eine schematische Darstellung der Positionierung und Merkmale der „End-Run-", „Blockierungs-" und „Primer-" Oligonukleotide
zur Verfügung,
die zum Amplifizieren eines Doppelstrang-Zielmoleküls in der
ERA Ausführungsform „ohne Lücke" der vorliegenden
Erfindung verwendet werden. In der Figur werden „End- Run-", „Blockierungs-" und „Primer-" Oligonukleotide
als A, B beziehungsweise C bezeichnet.
-
2 stellt
eine schematische Darstellung der Positionierung und Merkmale der „End-Run-", „Blockierungs-" und „Primer-" Oligonukleotide
zur Verfügung,
die zum Amplifizieren eines Doppelstrang-Zielmoleküls in der
ERA Ausführungsform „mit Lücke" der vorliegenden
Erfindung verwendet werden.
-
3 erläutert die
Verwendung der ERA Ausführungsform
ohne „Lücke" des End-Run-Amplifikationsverfahrens
zur Amplifizierung eines gewünschten
Doppelstrang-Zielmoleküls. Die
Oligonukleotide sind wie in 1 definiert.
-
4 erläutert die
Verwendung der ERA Ausführungsform „mit Lücke" des End-Run-Amplifikationsverfahrens
zur Amplifizierung eines gewünschten
Doppelstrang-Zielmoleküls. Die
Oligonukleotide sind wie in 1 definiert.
-
5A stellt
eine schematische Darstellung der Positionierung und Merkmale der „End-Run-", „Blockierungs-" und „Primer-" Oligonukleotide
zur Verfügung,
die in der ERA Ausführungsform „ohne Lücke" der vorliegenden
Erfindung in Bezug auf ein Einzelstrang-Zielmolekül verwendet
werden. 5B erläutert die
Verwendung der ERA Ausführungsform „ohne Lücke" zum Amplifizieren
eines gewünschten
Einzelstrang-Zielmoleküls.
Die 5C und 5D erläutern die Amplifikation eines
Einzelstrang-Zielmoleküls,
wenn das End-Run-Oligonukleotid vor der Verknüpfung der Blockierungs- und
Primer-Oligonukleotide verlängert
worden ist. Die Moleküle
sind wie in 1 definiert.
-
6A stellt
eine schematische Darstellung der Positionierung und Merkmale der
End-Run-, Blockierungs- und Primer-Oligonukleotide zur Verfügung, die
in der ERA-Ausführungsform „mit Lücke" der vorliegenden
Erfindung in Bezug auf ein Einzelstrang-Zielmolekül verwendet
werden. 6B erläutert die
Verwendung der ERA-Ausführungsform „mit Lücke" zum Amplifizieren
eines gewünschten
Einzelstrang-Zielmoleküls. Die 6C und 6D erläutern die Amplifikation eines
Einzelstrang-Zielmoleküls, wenn
das End-Run-Oligonukleotid vor der Verknüpfung der Blockie rungs- und
Primer-Oligonukleotide verlängert
wird. Die Moleküle
sind wie in 1 definiert.
-
7 erläutert die
Verwendung der „verschachtelten" ERA Ausführungsform
(„NERA") der Erfindung zum
Amplifizieren eines Doppelstrang-Zielmoleküls. Die Oligonukleotide sind
wie in 1 definiert.
-
8 erläutert die
Verwendung der „verschachtelten" ERA Ausführungsform
(„NERA") der Erfindung zum
Amplifizieren eines Einzelstrang-Zielmoleküls. Die Oligonukleotide sind
wie in 1 definiert.
-
9 stellt
eine schematische Darstellung der „Schleifen" ERA Ausführungsform („LERA") der vorliegenden
Erfindung zu Verfügung. 9A erläutert die Anbindung von Blockierungs-
und Primer-Oligonukleotiden. 9B stellt
eine schematische Darstellung der an eine Zielsequenz hybridisierten
Schleife von 9A zur Verfügung. 9C stellt eine schematische
Darstellung einer End-Run-Verlängerungsreaktion
entlang der verknüpften
Blockierungs-Oligonukleotid- und Primer-Oligonukleotidregionen der Schleife
von 9A zur Verfügung. 9D stellt eine schematische
Darstellung des von 9C stammenden
resultierenden Ziels zur Verfügung.
-
10 stellt
eine schematische Anordnung des Ziels mit den Blockierungs-, Primer- und End-Run-Oligonukleotiden
zur Verfügung,
die in den Beispielen I und II verwendet werden.
-
11 stellt
eine schematische Darstellung der Elektrophoreseergebnisse der Amplifikationsreaktionen
zur Verfügung,
die entsprechend der Beschreibung in Beispiel 1 durchgeführt wurden.
Spur 1 zeigt die Ergebnisse der ERA-Reaktion in Gegenwart von Primer-Oligonukleotid
(Pr), End-Run-Oligonukleotid (ER), Polymerase (P) und Ligase (L),
jedoch in Abwesenheit eines Blockierungs-Oligonukleotids (B). Spur
2 zeigt die Ergebnisse der ERA Reaktion in Gegenwart von Blockierungs-
und Primer-Oligonukleotiden, Polymerase und Ligase, jedoch in Abwesenheit
des End-Run-Oligonukleotids.
Spur 3 zeigt die Ergebnisse der ERA Reaktion, wenn Blockierungs-,
Primer-, End-Run-Oligonukleotide, Polymerase und Ligase gemeinsam
vor handen sind. Spur 4 zeigt die Ergebnisse der ERA Reaktion in
Gegenwart von Blockierungs-, Primer-, End-Run-Oligonukleotiden und
Polymerase, jedoch in Abwesenheit von Ligase. Spur 5 zeigt die Ergebnisse
der ERA Reaktion in Gegenwart der Blockierungs-, Primer- und End-Run-Oligonukleotide
und Ligase, jedoch in Abwesenheit von Polymerase.
-
12 stellt
eine schematische Wiedergabe der Elektrophoreseergebnisse der Amplifikationsreaktion zur
Verfügung,
die entsprechend der Beschreibung in Beispiel II durchgeführt wurde
und wobei Ziel-Molekülkonzentrationen
von 10–12 M
(A) oder 10–15 M
(12B) verwendet wurden.
Spur M erläutert
die relative Position der End-Run- und Primer-Oligonukleotide und
des Ziels auf dem Gel. Die relative Position des Blockierungs-Oligonukleotids
ist in Spur 2 gezeigt. Spur 1 zeigt die Position des Primers. Spur
2 zeigt die Ergebnisse der ERA Reaktion in Gegenwart der Blockierungs-
und Primeroligonukleotide, Polymerase und Ligase, jedoch in Abwesenheit
des End-Run-Oligonukleotids. Spur 3 zeigt die Ergebnisse der ERA
Reaktion in Gegenwart des Primer- und End-Run-Oligonukleotids, Polymerase
und Ligase, jedoch in Abwesenheit des Blockierungs-Oligonukleotids.
Spur 4 zeigt die Ergebnisse der ERA Reaktion in Gegenwart von Blockierungs-,
Primen- und End-Run-Oligonukleotiden
und Polymerase, jedoch in Abwesenheit von Ligase. Spur 5 zeigt die
Ergebnisse der ERA Reaktion, wenn Blockierungs-, Primer- und End-Run-Oligonukleotide,
Polymerase und Ligase gemeinsam vorhanden sind. Spur 6 zeigt die
Ergebnisse der ERA Reaktion in Gegenwart von Blockierungs-, Primer-,
End-Run-Oligonukleotiden
und Ligase, jedoch in Abwesenheit von Polymerase.
-
13 stellt
Balkendiagramm zur Verfügung,
das die Wirkung verschiedener 3' Enden
des End-Run-Oligonukleotids auf den Einbau eines markierten Primer-Oligonukleotids und
eines markierten End-Run-Oligonukleotids in Verknüpfungs-
und Verlängerungsprodukten
zeigt. Weist das End-Run-Oligonukleotid einen „Überhang" von 1 oder 2 Basen auf, bauen sowohl
die Verknüpfungs-
als auch die Verlängerungsreaktionen
signifikant mehr markiertes Oligonukleotid ein, als bei Verwendung
eines End-Run-Oligonukleotid, das ein „stumpfes" 3' Ende
aufweist.
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14 stellt
ein Balkendiagramm zur Verfügung,
das die Fähigkeit
des Amplifikationsverfahrens der vorliegenden Erfindung zur Unterscheidung
einzelner Basen er läutert.
Die Ergebnisse zeigen, dass nach 20 ERA Amplifikationszyklen, es
einen deutlichen Unterschied zwischen einem Wildtyp-Zieloligonukleotid
und einer Zieloligonukleotidmutante gibt, die sich durch eine einzelne
Base von dem Wildtyp-Oligonukleotid
unterscheidet.
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15 stellt
ein Balkendiagramm zur Verfügung,
das die Fähigkeit
des Amplifikationsverfahrens der vorliegenden Erfindung zur Unterscheidung
einzelner Basen erläutert.
Die Reaktionen sind zu den in 14 ausgeführten Reaktionen
identisch, abgesehen davon, dass sich die Daten auf 40 ERA Zyklen
beziehen.
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16 stellt
ein Schaubild der verwendeten Zieloligonukleotidkonzentration gegen
den Grad an eingebautem markiertem Oligonukleotid und gegen die
Amlifikationsmenge für
ERA Verlängerungsprodukte
zur Verfügung.
Die Daten zeigen, dass in der vorliegenden Erfindung Zielkonzentrationen
in dem Bereich verwendet werden können, der zum Nachweis eines
einzelnen Gens notwendig ist, damit Amplifikations- und Verlängerungsprodukte
erhalten werden.
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17 stellt
ein Schaubild der verwendeten Zieloligonukleotidkonzentration gegen
den Grad an eingebautem markiertem Oligonukleotid und gegen die
Amplifikationsmenge für
ERA Verknüpfungsprodukte
zur Verfügung.
Die Daten zeigen, dass in der vorliegenden Erfindung Zielkonzentrationen
in dem Bereich verwendet werden können, der zum Nachweis eines
einzelnen Gens notwendig ist, damit Amplifikations- und Verlängerungsprodukte
erhalten werden.
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BESCHREIBUNG
DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
-
I. Amplifikation
von Nukleinsäuremolekülen
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Die vorliegende Erfindung stellt
ein Verfahren – „End-Run-Amplifikation" oder „ERA" – zum Amplifizieren eines gewünschten
in einer Probe vorhandenen Nukleinsäuremoleküls zur Verfügung. Somit stellt sie sowohl
ein Mittel zur Bestimmung, ob ein spezielles gewünschtes Molekül in einer
Probe vorhanden ist, und ein Mittel zum Erhalten von Mengen der
gewünschten
Sequenz zur Verfügung,
die ausreichend sind, um deren Sequenz- oder Strukturanalyse zu
gestatten.
-
Die Moleküle, die durch Verwendung des
vorliegenden Verfahrens erzeugt werden können, können eine Länge im Bereich weniger Nukleotide
bis zu mehreren Kilobasen aufweisen. Die „gewünschten" Moleküle der Erfindung sollen eine
Sequenz aufweisen, die zu der Sequenz eines „Ziel"-Strangs eines Nukleinsäuremoleküls „komplementär" oder im wesentlichen
dazu komplementär
ist.
-
Wie hier verwendet wird, sollen zwei
Sequenzen in der Lage sein, aneinander zu „hybridisieren", wenn sie in der
Lage sind, eine antiparallele Doppelstrang-Nukleinsäurestruktur zu bilden. Zwei
Nukleinsäuremoleküle sollen „komplementär" sein, wenn sie aneinander
mit einer Stabilität
hybridisieren können,
die ausreicht, um ihnen zu gestatten, dass sie aneinander unter
zumindest üblichen „wenig
strengen" Bedingungen
annealed bleiben (siehe Sambrook, J., et al., (in: Molecular Cloning,
a Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Press, Cold
Spring Harbor, New York (1989)) und Haymes, B. D., et al. (in: Nucleic
Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington,
DC (1985)), auf deren Offenbarungsgehalt hier vollumfänglich Bezug genommen
wird). Zwei komplementäre
Moleküle
müssen
somit keine genaue Komplementarität aufweisen, sondern sie müssen in
einer Sequenz nur eine Komplementarität aufweisen, die ausreichend
ist, damit sie eine stabile Doppelstrang-Struktur bilden können. Abweichungen
von einer vollständigen
Komplementarität
sind daher zulässig,
so lange solche Abweichungen nicht dazu ausreichen, eine Hybridisierung
zur Bildung einer Doppelstrangstruktur zu verhindern.
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Die „Amplifikation", die durch die Verfahren
der vorliegenden Erfindung erreicht wird, bezeichnet eine Zunahme
in der Menge der in einem Reaktionsbehälter vorhandenen Nukleinsäuremoleküle. Eine „beträchtliche
Amplifikation" bezieht
sich auf eine Amplifikation um mehr als das 100 fache.
-
Die Nukleinsäuresequenz, die durch die Verfahren
der vorliegenden Erfindung amplifiziert werden kann, kann eine DNA
oder RNA sein. Ist die Sequenz anfänglich als DNA vorhanden, so
muß eine
solche DNA weder transkribiert noch translatiert werden. Die vorliegende
Erfindung kann somit zur Identifikation und/oder zur Amplifikation
nicht transkribierter DNA oder nicht translatierter DNA sowie auch
einer DNA, die transkribiert oder translatiert ist, verwendet werden.
Wenn die gewünschte
Sequenz anfänglich
in einem RNA-Molekül
vorhanden ist, muß ebenso
eine solche RNA nicht translatiert werden.
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Die Moleküle, die amplifiziert werden
können,
umfassen jede natürlich
vorkommenden prokaryotischen (zum Beispiel krankheitsauslösende oder
nicht krankheitsauslösende
Bakterien, Escherichia, Salmonella, Clostridium, Agrobacter, Staphylococcus
und Streptomyces, Streptococcus, Rickettsiae, Chlamydia, Mycoplasma,
usw.), eukaryotischen (zum Beispiel Protozoen und Parasiten, Pilze,
Hefe, höhere
Pflanzen, niedere und höhere
Tiere, einschließlich
Säugetiere
und Menschen) oder viralen zum Beispiel Herpes Viren, HIV, Influenza
Virus, Epstein-Barr Virus, Hepatitis Virus, Polio Virus, usw.) oder
Viroid-Nukleinsäuren.
Das Nukleinsäuremolekül kann ebenfalls
jedes Nukleinsäuremolekül sein,
das chemisch synthetisiert worden ist oder synthetisiert werden
kann. Daher kann die Nukleinsäuresequenz
in der Natur gefunden oder nicht gefunden werden. Zusammengefaßt sind
die Verfahren der vorliegenden Erfindung in der Lage, jedes Nukleinsäuremolekül zu identifizieren
oder zu amplifizieren und erfordern nicht, dass die zu amplifizierenden
Moleküle
irgendeine spezielle Sequenz oder einen speziellen Ursprung aufweisen.
-
Obwohl das Nukleinsäuremolekül, das amplifiziert
werden soll, entweder in einer Doppelstrang- oder Einzelstrangform
vorliegen kann, wird die Nukleinsäure, wenn sie am Beginn der
Amplifikationsreaktion doppelsträngig
ist, vorteilhafterweise zuerst behandelt, um die zwei Stränge in Einzelstrangform
oder teilweise Einzelstrangform zu bringen. Es sind Verfahren zur Überführung von
Doppelstrang-Nukleinsäuren
in Einzelstrangnukleinsäuren
oder teilweise Einzelstrangformen, wie zum Beispiel durch Erhitzen
oder Alkalibehandlung oder durch enzymatische Verfahren (wie zum
Beispiel durch die Wirkung von Helikase, usw.) oder durch Bindungsproteine
usw. bekannt. Allgemeine Verfahren zum Ausführen dieser Behandlung werden
von Sambrook, J. et al., in: Molecular Cloning: A Laboratory Manual,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989))
und von Haymes, B. D., et al. (in: Nucleic Acid Hybridization, A
Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985)) zur Verfügung gestellt,
auf deren Offenbarungsgehalt hier vollumfänglich Bezug genommen wird.
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Es ist bezeichnend, dass die Erfindung
keine Einschränkungen
in Bezug auf die Natur der zu bewertenden Probe macht. Solche Proben
können
zum Beispiel von einem Tier (wie zum Beispiel von einem Mensch oder
einem anderen Säugetier)
oder von einer Pflanze stammen, oder sie können synthetisch abgeleitet
werden.
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Insbesondere kann die Erfindung zur
Identifizierung und Amplifizierung von Nukleinsäuremolekülen verwendet werden, die in
Blut (und Blutprodukten, wie zum Beispiel Serum, Plasma, Blutplättchen),
Stuhl, Sputum, Schleim, Serum, Urin, Speichel, Tränen, Biopsieproben,
histologische Gewebsproben, PAP Abstriche und andere Vaginalabstriche,
Hautabschabungen, Sperma, Muttermale, Warzen, usw. vorhanden sind.
Sie kann entsprechend zur Identifizierung und Amplifzierung von
Nukleinsäuremolekülen verwendet
werden, die in pflanzlichem Gewebe vorhanden sind.
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Die Nukleinsäuren solcher Proben können von
jeglicher anderen Komponente, die auf natürliche Weise zu Probe gehört, vollständig ungereinigt,
teilweise gereinigt oder vollständig
gereinigt sein. Typischerweise wird die Probe jedoch zu einem Grad
behandelt worden sein, der ausreicht, damit nicht dazu gehörende Materialien,
entfernt sind, die ansonsten die Amplifikation der Nukleinsäuren stören könnten. Die
Präparation
von Nukleinsäuren
von zum Beispiel einer Serumprobe kann im allgemeinen die folgenden
Schritte umfassen: Inkubieren des Serums während 1 Stunde bei 70°C mit Proteinase
K (Boehringer Mannheim) mit 2,5 mg/ml in 25 mM MOPS (pH-Wert 6,5),
2,5 mM EDTA und 0,5% SDS. Danach folgen die folgenden Extraktionen:
Phenolextraktion und Etherextraktion. Danach folgt eine Ethanolfällung. Siehe
zum Beispiel Larzul, et al. J. Heptol. 5: 199–204 (1987). Wie angemerkt
ist, sind andere Protokolle und Techniken für eine solche Reinigung leicht verfügbar.
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Da die Erfindung in Bezug auf die
Natur der zu identifizierenden und/oder amplifizierenden Nukleinsäuresequenz
keine Einschränkungen
macht, ist die Erfindung in der Lage, Nukleinsäuremoleküle zu identifizieren, die natürlicherweise
in der Probe vorgefunden werden (wie zum Beispiel Insulin mRNA-Sequenzen
in pankreatischem β-Zellgewebe), sowie
auch Sequenzen zu identifizieren, die durch die Erzeugung von einer tierischen
oder pflanzlichen Quelle auf eine Krankheit hinweisen (zum Beispiel
eine Gensequenz, die eine Hämoglobinhistopathologie
kodiert, oder ein Onkogenprodukt, das ausschließlich oder vorzugsweise von
neoplastischen Zellen expri miert wird). Überdies kann die Erfindung
jedoch ebenfalls zur Bestimmung verwendet werden, ob Gensequenzen
von krankheitsauslösenden
Bakterien, Schimmel, Pilzen oder Viren in einer Gewebeprobe vorhanden
sind.
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Daher können die Verfahren der vorliegenden
Erfindung zur Diagnose einer Krankheit oder zum Nachweis der Herkunft
und Identität,
sowie zur Bewertung der Reinheit von Agrarprodukten (Milch, verarbeitete Nahrungsmittel,
usw.) Abwasser, Trinkwasser, Luft, usw. verwendet werden.
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Besonders bevorzugt werden die zu
amplifizierenden RNA- oder DNA-Sequenzen über eine DNA-Polymerase oder
eine reverse Transkriptase zur Bildung eines DNA-Amplifikationsprodukts amplifiziert,
jedoch kann in Ausführungsformen,
in denen ein RNA-Amplifikationsprodukt erwünscht ist, eine RNA-Polymerase verwendet
werden. Eine „Polymerase" ist ein Enzym, das
in der Lage ist, Nukleotidtriphosphate zur Verlängerung einer 3' Hydroxylgruppe eines
Nukleinsäuremoleküls einzubauen,
falls dieses Molekül
an ein geeignetes Templatnukleinsäuremolekül hybridisiert hat. Ein Oligonukleotid
oder Polynukleotid, dessen 3' Ende
durch eine Polymerase verlängert
werden kann, ist ein „Primer".
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Da DNA-Polymerasen Nukleinsäuremoleküle in 5' 3' Richtung polymerisieren,
verlängern
sie folglich das 3' Ende
eines komplementären
Primers auf „templatabhängige Weise". Wie hier verwendet
wird, bezieht sich der Ausdruck „templatabhängige Weise" auf eine RNA- oder
DNA-Nukleinsäuresynthese,
wobei die Sequenz des neu synthetisierten Nukleinsäurestrangs
durch die komplementäre
Basenpaarung vorgeschrieben ist. In einer solchen Reaktion dient
das Zielmolekül
als ein „Templat" zur Verlängerung
des Primers derart, dass das Primerverlängerungsprodukt eine Sequenz
aufweist, die zu derjenigen des Templats komplementär ist. Eine
solche Polymerisation erfordert typischerweise das Vorhandensein
von Nukleotidtriphosphaten („dNTP"), das heißt, Desoxyadenosin-5'-triphosphat („dATP"), Desoxycytidin-5'-triphosphat („dCTP"), Desoxyguanosin-5'-triphosphat („dGTP") und Desoxythymidin-5'-triphosphat
(typischerweise mit „TTP" abgekürzt, jedoch wird
es hier zum Zwecke der Konsistenz mit „DTTP" abgekürzt). Nukleosidtriphosphatanaloga,
usw. (Piccirilli, J. A. et al., Nature 343: 33–37 (1990) kann an die vorstehend
spezifizierten Verbindungen substituiert oder addiert werden, vorausgesetzt,
dass die Basenpaarung, Polymerase- und Strangverdrängungsfunktionen
nicht derart beeinflusst werden, dass die Amplifikation nicht bis
zu dem erwünschten
Ausmaß verläuft. Insbesondere können Desoxyinosintriphosphate
(dl) und Dexoxyuridintriphosphate (dUTP) verwendet werden.
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Polymeraseenzyme werden in Watson,
J. D., in: Molecular Biology of the Gene, 4. Ausgabe, W. A. Benjamin,
Inc., Menlo Park, CA (1987), auf dessen Offenbarungsgehalt hier
vollumfänglich
Bezug genommen wird, und ähnlichen
Texten besprochen. Beispiele geeigneter DNA-Polymerasen umfassen
das große
proteolytische Fragment der DNA-Polymerase 1 des Bakteriums E. coli,
das im allgemeinen als „Klenow" Polymerase bekannt
ist, E. coli DNA-Polymerase 1 und die Bakteriophagen T7 DNA-Polymerase.
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Auf Wunsch können „wärmebeständige Enzyme" verwendet werden.
Entsprechend der Verwendung hier, ist ein „wärmebeständiges Enzym" ein Enzym, das eine
Reaktion bei Temperaturen zwischen ungefähr 50°C bis ungefähr 100°C katalysieren kann. Beispielhafte
wärmebeständige Polymerasen
sind in der europäischen
Patentanmeldung 0258017 beschrieben, auf deren Offenbarungsgehalt
hier vollumfänglich
Bezug genommen wird. Die wärmebeständige „Tag" DNA-Polymerase ist
von Cetus, Corp. beziehbar.
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Beispiele geeigneter RAN-Polymerasen
umfassen E. coli RNA-Polymerase, T7 RNA-Polymerase, usw. Reverse Transkriptasen
werden von Sambrook, J. et al. (in: Molecular Cloning: A Laboraton
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
NY (1989)) und von Noonan, K. F. et al. (Nucleic Acids Res. 16:
10366 (1988)) diskutiert.
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Die Ausführungsformen der offenbarten
Verfahren erfordern ein Verknüpfungsereignis,
um die Amplifikation der gewünschten
Sequenz zu erreichen. Zum Zwecke der Identifikation einer speziellen
Nukleinsäuresequenz
ist jedoch ein gleichwertig bedeutendes Ziel, dass das Probenmaterial
nicht amplifiziert wird. Das heißt, für die Identifikation von zum
Beispiel einer spezifischen Mutation einer einzelnen Base sind zwei
Oligonukleotideinheiten, die eine zu der nicht mutierten Version
der Zielsequenz komplementäre
Sequenz aufweisen und so ausgelegt sind, dass sie die Mutations region
flankieren, einem Verknüpfungsereignis
nicht zugänglich,
wenn die Zielsequenz die Einzelbasenmutation enthält. Somit
kann in dem vorangegangenen nicht einschränkenden Beispiel die Abwesenheit
von Amplifikation als ein Indikator für das Vorhandensein einer Mutation
gesehen werden. Wie offensichtlich ist, kann die offenbarte Erfindung
unter anderem zum Amplifizieren einer Zielsequenz und/oder zum Identifizieren
des Vorhandenseins einer Zielsequenz verwendet werden.
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Die für die Amplifikation des gewünschten
Moleküls
benötigte
Verknüpfungsreaktion
wird besonders bevorzugt ein „Ligase" Enzym anwenden,
das in der Lage ist, das 3' Ende
eines Oligonukleotids mit dem 5' PO4 Ende eines zweiten Oligonukleotids zu verbinden.
Die Kinetik einer derartigen Verknüpfung wird stark erhöht, wenn
das Verknüpfungssubstrat
doppelsträngig
ist (wie es der Fall ist, wenn beide Oligonukleotide an dasselbe
Ziel-DNA- oder Ziel-RNA-Molekül
hybridisiert sind). Signifikanterweise kann eine Ligase zwei Oligonukleotide
nicht verbinden, die bei der Hybridisierung an ihr entsprechendes
Zielmolekül
nicht aneinander grenzende Enden aufweisen. Obwohl eine Ligase einen „Bruch" in einem Strang „reparieren" kann, kann sie daher
nicht eine „Lücke" „auffüllen". In alternativen Ausführungsformen
können
nicht enzymatische Verknüpfungsverfahren,
wie zum Beispiel chemische Reaktionen, photochemische Reaktionen
(zum Beispiel Photokopplung; siehe zum Beispiel die PCT Patentanmeldung
WO 90/01069, auf deren Offenbarungsgehalt hier vollumfänglich Bezug
genommen wird), thermochemische, Redoxreaktionen, usw. verwendet
werden.
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Für
die Ziele der vorliegenden Erfindung ist es vorteilhaft, dass die
Kinetik, mit der eine Ligase die Verknüpfung zweier Oligonukleotide
vermitteln kann, stark erhöht
ist, wenn die zu verbindenden Enden eine richtige Basenpaarung mit
dem Zielmolekül
aufweisen. Obwohl die Verknüpfung
bei Enden mit fehlender Übereinstimmung
stattfinden kann, ist daher die Leistungsfähigkeit einer solchen Verknüpfung signifikant
geringer, als diejenige von Oligonukleotiden, die Enden mit richtiger
Basenpaarung aufweisen. Bevorzugte Ligasen umfassen E. coli Ligase,
T4 Ligase und T7 Ligase (Life Technologies, Inc. Gaithersburg, MD).
Auf Wunsch können wärmebeständige Ligasen
verwendet werden, wie zum Beispiel die in der PCT Patentanmeldung
WO 91/17239 beschriebenen, auf deren Offenbarungsgehalt hier vollumfänglich Bezug
genommen wird.
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Alle Enzyme, die in den Amplifikationsreaktionen
der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können in Gegenwart eines geeigneten
Puffers derart kombiniert werden, daß das Amplifikationsverfahren
der vorliegenden Erfindung in einem einzelnen Reaktionsvolumen ohne
Veränderung
der Bedingungen, wie zum Beispiel die Zugabe von Reaktanden, durchgeführt werden
kann.
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Die ERA Reaktion findet vorzugsweise
in einer gepufferten wässrigen
Lösung
statt, die vorzugsweise einen pH-Wert zwischen ungefähr 6,0 und
ungefähr
9,0 aufweist. Der Reaktionspuffer umfaßt vorzugsweise verschiedene
Komponenten, die das wirksame und spezifische zyklische Durchlaufen
der ERA Reaktion gestatten. Eine besonders bevorzugte Pufferlösung ist
20 mM Trishydroxymethylaminomethansalzsäure („Tris-HCl"), pH-Wert 7,8. Zu dem Reaktionspuffer
werden vorzugsweise zusätzliche
Materialen gegeben; diese Materialien werden so ausgewählt, dass
das zyklische Durchlaufen der Reaktion mit großer Leistungsfähigkeit
(zum Beispiel ist die höchste
Produktmenge pro Zielmolekül
vorzugsweise größer als
das 2x, bevorzugter xy und besonders bevorzugt
ungefähr
x2, wobei x die Zahl der Zieltemplate ist,
die während
jedem Zyklus verfügbar
sind, und Y größer als
1,0 aber weniger als ungefähr
2 ist) und großer
Spezifität
erfolgt (das heißt,
die Richtigkeit der Genauigkeit der Ligase- und Polymeraseenzyme,
wobei „Polymerasegenauigkeit" als die Priorität des Enzyms
zum Einbau des richtigen Nukleotids definiert ist, und die „Ligasegenauigkeit" dadurch definiert
ist, dass die Ligaseaktivität
durch die Bruchschließungsaktivität eingeschränkt ist,
zum Beispiel die Verknüpfung
zweier komplementärer
Oligonukleotideinheiten, die zueinander benachbart sind, wenn sie
an eine Zielsequenz hybridisiert werden); der Verfahrensablauf wird
maximiert; die katalytische Stabilität des Enzyms (der Enzyme) wird
aufrechterhalten und die Reaktionsstabilität (das heißt die Reaktionskomponenten
werden in Lösung
gehalten; unspezifische Aktivität
wird verringert; Haftung der Reaktionskomponenten an der Oberfläche des
Reaktionsbehälters
wird minimiert, usw.) wird aufrechterhalten. Für das hier offenbarte ERA Protokoll
wurde festgestellt, dass die folgenden Komponenten und Mengen (Endkonzentration)
diese Ziele erreichen: 20 mM Kaliumchlorid; 2,0 mM Magnesiumchlorid;
5,0 mM Dithiothreitol („DTT"); 50 um Nicotinamidadenindinukleotid
(„NAD+");
50 μg/ml
Rinderserumalbumin und 0,1% eines nicht ionischen Detergenz (zum
Beispiel Triton × 100TM). Diese Materialien können in Abhängigkeit von den verwendeten
spe zischen Enzymen leicht variiert und angepasst werden; dem Fachmann
wird zugetraut, dass er solche Materialien leicht auswählen und
optimieren kann.
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Andere Materialien, wie zum Beispiel
Konservierungsstoffe und dergleichen können optional zu dem Reaktionspuffer
gegeben werden. Es wird besonders bevorzugt, dass zweifach entionisiertes
Wasser zum Erreichen eines gewünschten
Endvolumens des Reaktionspuffers verwendet wird.
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Die Temperatur des Behälters wird
typischerweise zwischen ungefähr
30°C und
90 °C, besonders
bevorzugt bei ungefähr
65°C gehalten.
Wird von der Denaturierung durch Wärme Gebrauch gemacht, so kann die
Temperatur während
des Denaturierungsschritts auf einen Wert oberhalb dieser Werte
erhöht
werden. Wird von der Denaturierung durch Wärme Gebrauch gemacht (wie bevorzugt
wird), werden vorzugsweise Temperaturwechsler verwendet, die in
der Lage sind, in dem Reaktionsbehälter eine Umgebung mit einer
Temperatur zur Verfügung
zu stellen, die innerhalb eines zyklischen Bereichs von Temperaturen
geregelt ist. Ein Beispiel dafür
ist der Perkin Elmer 480TM Temperaturwechsler.
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Obwohl dieses Verfahren auf molekularer
Ebene mehrere Schritte aufweist, kann es im Betrieb einen einzigen
Schritt aufweisen. Sobald die Reaktanden zusammengemischt sind,
braucht man weder etwas hinzuzufügen
noch die Bedingungen zu verändern,
bis die Amplifikationsreaktion eine oder mehrere Komponenten verbraucht
hat. Während
dieser Zeit wird die Nukleinsäuresequenz,
die amplifiziert wird, um ein Vielfaches zugenommen haben. Der Gehalt
der Zunahme wird für
viele Zwecke ausreichend sein; jedoch kann für manche Zwecke die Reaktion
mit frischen Komponenten wiederholt werden müssen, um einen höheren gewünschten
Amplifikationsgrad zu erhalten.
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II. „ERA:" Die „End-Run-Amplifikations"-Reaktion
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In ihrer einfachsten Ausführungsform
verwendet das Verfahren der vorliegenden Erfindung drei Oligonukleotide
zur Amplifikation der Zielsequenz. Das erste und zweite dieser Oligonukleotide
ist so ausgelegt, dass ihre Sequenzen zu einem Teil der Zielsequenz
komplementär
sind. Das dritte Oligonukleotid ist so ausgelegt, dass es in der
Lage ist, an ein Nukleinsäuremolekül zu hybridisieren,
das die Sequenz des zweiten Oligonukleotids aufweist. Das erste
Oligonukleotid (in den Figuren mit „C" bezeichnet) wird als das „Primer-Oligonukleotid" bezeichnet. Das
zweite Oligonukleotid (in den Figuren mit „B" bezeichnet) wird als das „Blockierungs-Oligonukleotid" bezeichnet. Das
dritte Oligonukleotid (in den Figuren mit „A" bezeichnet) wird als „End-Run-Oligonukleotid"-Primer bezeichnet.
Die Art und Strukturen dieser Oligonukleotide wird nachstehend genau
diskutiert. Auf Wunsch kann mehr als ein Satz von Blockierungs-Oligonukleotiden,
Primer-Oligonukleotiden und/oder End-Run-Oligonukleotiden verwendet werden, vorausgesetzt
diese sind in der Lage, verschiedene spezifische Nukleinsäuresequenz(en)
zu amplifizieren.
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Im allgemeinen umfassen die Oligonukleotide
jedoch jedes beliebige synthetische, halb-synthetische oder natürliche Nukleinsäurefragment
oder jede beliebige chemische Einheit, die in der Lage ist, an eine
spezifische Nukleinsäuresequenz
in einer spezifischen Art zu binden und als ein Substrat, zum Beispiel
für eine Verlängerungsreaktion
oder für
ein Verknüpfungsereignis
zu dienen; beispielhafte chemische Einheiten sind die sogenannten „Peptidnukleinsäuren" (siehe Egholm, M.
et al., J. Am. Chem. Soc. 114: 1895–1897 (1992) und Nielsen, P.
E. et al., Science 254: 1497–1500
(1991), auf deren Offenbarungsgehalt hier vollumfänglich Bezug
genommen wird). Ein Oligonukleotid umfaßt typischerweise weniger als
150 Nukleotide und/oder chemische Einheiten. Die Nukleinsäure kann
eine Desoxyribonukleinsäure,
Desoxyribonukleinsäurederivate,
Ribonukleinsäure
oder Ribonukleinsäurederivate
sein.
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Blockierungs-, Primer- und End-Run-Oligonukleotide
können
unter Verwendung eines beliebigen geeigneten Verfahrens unter Verwendung
von zum Beispiel den in Beaucage, S. et al., Tetrahedron Letters
22: 1859–1862
(1981) beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Zur Erzeugung
von Oligonukleotideinheiten werden handelsübliche Geräte bevorzugt, da diese weithin
verwendet werden und typischerweise zeit- und kostengünstig sind.
Beispielhafte Geräte,
die zur Erzeugung definierter Oligonukleotide in der Lage sind umfassen,
sind aber nicht beschränkt
auf den OLIGO 1000TM (Beckman Instruments,
Inc., Fullerton, CA); Gene AssemblerTM (Pharmacia,
Uppsala, Schweden), Biosearch 8750TM (Milligen
Biosearch, San Rafael, CA) und den ABI PCR MateTM (ABE,
Foster City, CA).
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Ein beliebiges oder alle Oligonukleotide
können
für viele
Zwecke markiert werden, es ist wünschenswert,
dass mindestens eines der Oligonukleotide markiert ist. Zusätzlich können die
dNTPs markiert werden. Bei Markierung des Blockierungs-Oligonukleotids kann
vorteilhafterweise die Markierung an dessen 3' Stelle so konjugiert werden, dass das
Blockierungs-Oliognukleotid mit dem Ziel hybridisieren kann, wobei
eine Verlängerung
von dessen 3' Ende
nicht möglich
ist; der Grund dafür
wird nachstehend beschrieben. Alternativ dazu kann das 5' Ende des End-Run-Oligonukleotids markiert
werden. Beispielhafte Markierungsprotokolle sind gut bekannt, siehe,
zum Beispiel die europäische
Patentanmeldung 292128, auf deren Offenbarungsgehalt hier vollumfänglich Bezug
genommen wird.
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Solche Markierungen können entweder
den direkten Schnellnachweis oder den indirekten Nachweis und/oder
das Auffangen des amplifizierten Produkts erleichtern. Weiterhin
können
zwei der Einheiten derart Teil einer Einheitsstruktur sein, dass
in der Amplifikationsreaktion nur zwei Oligonukleotideinheiten verwendet werden.
Wie hier verwendet wird, erzeugt eine direkt nachweisbare Markierung
ein Signal, das entweder direkt oder durch dessen Wechselwirkung
mit einer Substanz, wie zum Beispiel ein Substrat (im Fall eines
Enzyms), einer Lichtquelle (im Fall einer Fluoreszenzverbindung)
oder einem Photovervielfacher (im Fall einer radioaktiven oder Chemolumineszenzverbindung)
nachweisbar ist.
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Beispiele bevorzugter direkter Markierungen
umfassen Radiosiotopmarkierungen, zum Beispiel die Verwendung von
Oligonukleotiden mit eingebautem 32P, 35S, 125I, 3H und 14C. Eine
besonders bevorzugte Methode zur direkten Markierung von Oligonukleotiden
ist die „Endmarkierungs-" Methode, wobei T4
Polynukleotidkinase zur Einführung
einer Markierung in das 5' Ende
des Oligonukleotids verwendet wird (siehe zum Beispiel Richardson,
C. C., The Enzymes, Bd. XIV, Nucleic Acids Part A, Hrsg. Boyer,
P. D., Acad. Press, S. 299 (1981)). Alternativ dazu kann endständige Desoxynukleotidyltransferase
zum Hinzufügen
einer Reihe bereitgestellter Desoxynukleotiden an das 3' Ende des Oligonukleotids
verwendet werden; es können
ebenfalls Markierungsverfahren für
ein einzelnes Nukleotid verwendet werden (siehe zum Beispiel Bollum,
F. J. The Enzymes, Bd. X, Hrsg. Boyer, P. D. Acad. Press, (1974);
Yousaf, S. I. et al., Gene 27: 209 (1984) und Wahl, G. M. et al.
Proc. Natl. Acad. Sci.
-
U.S.A.) 76: 3683–3687 (1979). Es können ebenfalls
markierte ddNTPs, zum Beispiel [α32P] ddATP verwendet werden.
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In einer Forschungsumgebung, in der
die Zielamplifikation nicht immer auf fortlaufender Basis durchgeführt wird,
kann die Verwendung von radioaktiven Markierungen bevorzugt sein.
In einer Umgebung, in der keine Forschung durchgeführt wird,
zum Beispiel in einem klinischen Aufbau, kann es sein, dass solche
Markierungen aufgrund von Entsorgungsproblemen und verwandten Risiken,
die mit der fortlaufenden Aussetzung gegenüber radioaktiven Markierungen
zusammenhängen,
nicht bevorzugt sind. In diesen Aufbauten können daher indirekte Markierungen
bevorzugt sein. Eine Markierung, die indirekt nachweisbar ist, liefert
nicht selbst oder von sich selbst ein nachweisbares Signal, jedoch
kann sie zur Identifizierung eines Oligonukleotids verwendet werden,
an das die indirekt nachweisbare Markierung gebunden ist. Beispiele
von indirekt nachweisbaren Markierungen umfassen Biotin, Antikörper, Enzyme,
Ferritin, Antigene, Haptene usw, wenn sie an dNTP oder ddNTP konjugiert
werden. Bevorzugte nicht radioaktive direkte Markierungen, die Fluorescein-11-dUTP (siehe
Simmonds, A. C. et al Clin. Chem. 37: 1527–1528 (1991), auf dessen Offenbarungsgehalt
hier vollumfänglich
Bezug genommen wird) und Digoxigenin-11 dUTP (siehe Muhlegger, K.
et al. Nucleosides & Nucleotides
8: 1161–1163
(1989), auf dessen Offenbarungsgehalt hier vollumfänglich Bezug
genommen wird, umfassen, können
als Markierungen verwendet werden. Weiterhin können nicht radioaktiv markierte
Oligonukleotide verwendet werden (siehe zum Beispiel Adams, C. W.,
PCT Patent Anmeldung WO 91/19729), auf deren Offenbarungsgehalt
hier vollumfänglich
Bezug genommen wird. Ein Nachweisschema, das solche Haptenmarkierungen
betrifft, umfasst die Verwendung von Antikörpern an dem Hapten, wobei
die Antikörper
markiert sind.
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Biotin ist eine besonders bevorzugte
indirekte Markierung, wobei der Nachweis von biotinylierten Nukleinsäuremolekülen unter
Verwendung von markiertem oder unlöslich gemachtem Avidin, Strepatavidin,
Antibiotin Antikörpern,
usw. ausgeführt
wird. Biotinylierte Moleküle
können
ebenfalls leicht von nicht biotinylierten Molekülen getrennt werden, indem
die Moleküle
mit unlöslichem
oder immobilisiertem Avidin in Kontakt gebracht werden.
-
In dieser Hinsicht kann zum Beispiel
Biotin-11-dUTP anstatt von dTTP, oder Biotin-14-dATP anstatt von dATP verwendet werden
(siehe allgemein Langer, P. R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.)
78: 6633–6637
(1981), auf dessen Offenbarungsgehalt hier vollumfänglich Bezug
genommen wird). Biotinylierte Phosphoramidite können ebenfalls verwendet werden
(Misiura, K. et al. Nucl. Acids. Res. 18: 4345–4354 (1990), auf dessen Offenbarungsgehalt
hier vollumfänglich
Bezug genommen wird. Solche Phosphoramidite gestatten deren genauen
Einbau an den gewünschten
Stellen längs
der wachsenden Oligonukleotideinheit während deren Synthese.
-
Chemolumineszenzsubstrate können ebenfalls
als indirekte Markierung verwendet werden. Es können Enzyme verwendet werden,
wie zum Beispiel Meerrettichperoxidase („HRP"), alkalische Phosphatase („AP"), usw., die direkt
an Nukleinsäuren
vernetzt werden (siehe Renz, M. und Kurz, C. Nucl. Acids Res. 12: 3435–3444 (1964),
auf dessen Offenbarungsgehalt hier vollumfänglich Bezug genommen wird).
Luminal, ein Substrat für
HRP und substituierte Dioxetane, Substrate für AP, können als Chemolumineszenzsubstrate
verwendet werden. Ein Beispiel für
das HRP Markierungsprotokoll ist das von Amersham (Arlington Heights,
Illinois, USA) erhältliche
ECL System.
-
Ein weiteres Mittel zum Nachweis
eines amplifizierten Produkts umfaßt die Verwendung von Nukleinsonden,
die zu dem amplifizierten Produkt komplementär sind. Für diese Art des Nachweises
ist keine Markierung der Oligonukleotideinheiten notwendig. Ist
das Ziel vorhanden, wird dessen Amplifikation in Mengen des Ziels
resultieren, die ausreichen, damit die markierten Nukleinsonden
zum Nachweis verwendet werden können.
Es können
einzelne Sonden, die direkt oder indirekt nachweisbare Markierungen
umfassen, oder Mehrfachsonden, die eine direkt oder indirekt nachweisbare
Markierung umfassen, und Einfangeinheiten verwendet werden. Siehe
zum Beispiel die U.S. Patentanmeldung mit dem amtlichen Aktenzeichen
07/576,137 „Solution Phase
Nucleic Acid Hybridization and Solid Phase Capture For Detection
of Target Nucleic Acid, and Kit Therefore", auf deren Offenbarungsgehalt hier
vollumfänglich
Bezug genommen wird.
-
Anstelle von direkten oder indirekten
Markierungen kann eine Proximitätsmarkierung
verwendet werden. Eine derartige Markierung ist eine chemische Einheit,
die nur in Gegenwart einer zweiten Markierung, die mit ihr wechselwirkt,
ein Signal erzeugt. Eine erste Proximitätsmarkierung wird typischerweise
in Kombination mit einer entsprechenden zweiten Proximitätsmarkierung
verwendet.
-
Die Moleküle der Reaktanden werden entsprechend
den nachstehend beschriebenen Verfahren zur Erzeugung des Amplifikationsprodukts
verwendet. Das Amplifikationsprodukt wird typischerweise doppelsträngig sein
und umfaßt
sowohl die gewünschte
Sequenz, als auch deren Komplement. Es ist bezeichnend, dass, abhängig von
den Sequenzen der Blockierungs- und der End-Run-Oligonukleotide,
es möglich
ist, Doppelstrangmoleküle
zu erzeugen, die zueinander vollständig komplementär sind oder
die nicht komplementäre Regionen
aufweisen. Es ist weiterhin möglich,
Doppelstrangmoleküle
zu erzeugen, die entweder ein herausragendes 3' Ende oder ein herausragendes 5' Ende aufweisen.
-
Ist die Herstellung einer Nukleinsäure gewünscht, die
die gewünschte
Sequenz enthält,
ohne dass ein komplementäres
Nukleinsäuremolekül hergestellt
wird, können
die Verfahren der vorliegenden Erfindung entsprechend nachstehender
Ausführung
so angepasst werden, dass nur solche Einzelstrangmoleküle erzeugt werden.
-
A. Das „Primer-Oligonukleotid" der vorliegenden
Erfindung
-
Das erste Oligonukleotid der Erfindung,
das heißt
das „Primer-Oligonukleotid", ist ein Primermolekül und muß daher
ein 3' Ende besitzen,
das durch eine DNA-Polymerase
verlängert
werden kann. Das Oligonukleotid kann von beliebiger Länge im Bereich
von ungefähr
5 bis zu mehreren hundert Nukleotiden sein. Das Primer-Oligonukleotid wird
vorzugsweise eine Länge
von mehr als 10 Nukleotiden und bevorzugter eine Länge von
ungefähr
12–50
Nukleotiden aufweisen. Die Länge
des Primer-Oligonukleotids muß ausreichen,
um dem Primer-Oligonukleotid zu gestatten, dass es zur Hybridisierung
an das Zielmolekül
in der Lage ist.
-
Die Sequenz des Primer-Oligonukleotids
wird so ausgewählt,
dass sie zu einer vorbestimmten Sequenz des Zielmoleküls komplementär ist. Diese
vorbestimmte Sequenz kann eine vorher bestimmte Sequenz sein (wie
zum Beispiel ein Gen, eine Regulationssequenz, usw.) oder sie kann
eine hypothetische Sequenz sein (wie zum Beispiel die Erkennungsstelle
einer Restriktionsendonuklease, eine Kombination solcher Stellen,
usw.).
-
Die Zielsequenz ist vorzugsweise
ein Teil einer kodierenden Region in einem Gen, die mit einer genetischen
Krankheit zusammenhängt,
und die Primer-Oligonukleotidsequenz
wird so ausgewählt,
dass deren Verlängerung
eine gewünschte
Sequenz bildet, die die genetische Mutation enthält, die die Krankheit charakterisiert.
Wie nachstehend beschrieben ist, ist es durch eine geeignete Kontrolle
der Sequenzen der Oligonukleotide der vorliegenden Erfindung möglich, eine
genetische Krankheit in Personen zu diagnostizieren oder vorherzusagen,
deren Gensequenzen sich um einige wenige Nukleotide von den entsprechenden
Sequenzen der Personen unterschieden, die diese Krankheit nicht
haben.
-
In den grundlegenderen Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung bestimmt die Sequenz des Primer-Oligonukleotids
der Erfindung die Sequenz von einem Ende des Amplifikationsprodukts,
das durch die Erfindung erhalten wird. Wird somit das Primer-Oligonukleotid
so ausgewählt,
dass es zu einer gewünschten Sequenz
komplementär
ist, so gestatten die Verfahren der vorliegenden Erfindung die Amplifikation
dieser Gensequenz. Ist entsprechend die Primer-Oligonukleotidsequenz
zu einer Restriktionsstelle, einer Kombination von Restriktionsstellen,
einer Promotorstelle oder zu einer Regulationsproteinbindungsstelle
komplementär,
so erlauben die Verfahren der Erfindung die Amplifikation der Zielsequenzen,
die diese Stellen enthalten. In einer alternativen Ausführungsform
(„blinde
ERA") erlauben daher
die Verfahren der vorliegenden Erfindung zum Beispiel die Amplifikation
aller Promotorsequenzen, die zusätzlich
Schilddrüsenhormonbindungsstellen enthalten.
-
B. Das „Blockierungs-Oligonukleotid" der vorliegenden
Erfindung
-
Das zweite Oligonukleotid der Erfindung,
das heißt
das „Blockierungs-Oligonukleotid" kann von beliebiger
Länge sein
und ist so ausgewählt,
dass es zu einem Teil eines Zielmoleküls komplementär ist. Obwohl es
für die
Ausführung
der vorliegenden Erfindung nicht wesentlich ist, ist in einer Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung das Blockierungs-Oligonukleotid im wesentlichen
nicht in der Lage, als Primer zu dienen. Das 3' Ende des Blockierungs-Oligonukleotids
ist daher vorzugsweise so modifiziert, dass es eine „Blockierungsgruppe" enthält. Jede
Verbindung, die dieses Ziel erreicht, kann als „Blockierungsgruppe" dienen". Beispielhafte Blockierungsgruppen
sind Biotin, Didesoxynukleotidtriphosphate („ddNTPs"), die ebenfalls als „Ketten
beendende" ddNTPs
bezeichnet werden. In mehreren nachstehend diskutierten bevorzugten
Ausführungsformen
ist die Blockierungsgruppe nachweisbar markiert. Weiterhin ist es
möglich,
ein Blockierungs-Oligonukleotid zu verwenden, das über den
Verknüpfungspunkt
mit dem Primer-Oligonukleotid „hängt", so dass zum Beispiel
das Blockierungs-Oligonukleotid einer „zurück geschleuderten" Reaktion zugänglich ist
(siehe zum Beispiel Holland et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.)
88: 7276–7280
(1991)).
-
Das Blockierungs-Oligonukleotid weist
vorzugsweise zwischen ungefähr
10 bis ungefähr
40 Nukleotiden, bevorzugter zwischen ungefähr 15 und ungefähr 35 Nukleotiden
und besonders bevorzugt ungefähr
23 Nukleotide auf. Das Blockierungs-Oligonukleotid kann jedoch eine so kleine
Länge wie
von zwei Nukleotiden aufweisen (wobei das Nukleotid am 3' Ende eine Blockierungseinheit
umfaßt);
daher kann die Länge
des Blockierungs-Oligonukleotids in Abhängigkeit von den experimentellen
Bedürfnissen
der untersuchenden Person und dem Erkennen, dass bei Abnehmendem „Tm" die
Länge abnimmt
(das heißt
eine bevorzugte Hybridisierung kann nicht sichergestellt werden),
variieren. „Tm" ist
die Temperatur, bei der 50% der Basenpaarung zwischen zwei Strängen einer
Nukleinsäure
gespalten wird. Tm ist eine Funktion der
Länge einer
Einzelstrang-DNA und deren Basenzusammensetzung. Im allgemeinen
ist für
kurze Oligonukleotideinheiten (das heißt weniger als ungefähr 25 Nukleotide)
ein Näherungswert
von Tm gleich dem 4 fachen der Zahl der
G/C Basenpaare plus 2 mal die Zahl der A/T Basenpaare (das heißt 4(G/C)
+ 2(A/T)).
-
Alternativ dazu kann die Länge und/oder
Sequenz des Blockierungs-Oligonukleotids so angepasst werden, dass
der Tm Wert des Blockierungs-Oligonukleotids
zwischen ungefähr
37°C und
ungefähr
98°C, bevorzugter
zwischen ungefähr
70°C und
ungefähr
90°C und
besonders bevorzugt bei ungefähr
85°C liegt.
-
Die Primer-Oligonukleotideinheit
ist so ausgelegt, dass sie stromaufwärts des Blockierungs-Oligonukleotids
hybridisiert (das heißt,
in einer solchen Ausrichtung, dass das 3' Ende des Primer-Oligonukleotids an das
5' Ende des Blockierungs- Oligonukleotids angrenzt
oder verlängert
werden kann, damit es an das 5' Ende des
Blockierungs-Olignokleotids angrenzt, wenn beide Moleküle an (denselben
Strang des) Zielmoleküls
hybridisiert werden. In einigen Ausführungsformen der Erfindung
ist das 5' Ende
des Blockierungs-Oligonukleotids so ausgelegt, dass bei Hybridisierung
das 5' endständige Nukleotid
des Blockierungs-Oligonukleotids einer vorbestimmten Stelle in einem
anderen Nukleinsäuremolekül „gegenüberliegt". Wie hier verwendet
wird, liegt ein Nukleotid eines hybridisierten Oligonukleotids einem
anderen Nukleotid „gegenüber", wenn die zwei Nukleotide
in dem hybridisierten Produkt einander gegenüberliegen (das heißt, sie
sind so positioniert, dass sie miteinander eine Basenpaarung eingehen
würden,
wenn sie komplementär
wären).
Eine zweite Funktion des Blockierungs-Oligonukleotids ist es, die
Verlängerung
des 3' Ende des „Primer-Oligonukleotids" bis hinter das 5' Ende des Blockierungs-Oligonukleotids
zu blockieren.
-
Das blockierte 3' Ende des Blockierungs-Oligonukleotids
definiert das 3' Ende
von einem Strang des Amplifikationsprodukts. Das 3' Ende des Blockierungs-Oligonukleotids wird
typischerweise in der Lage sein, an das Zielmolekül zu hybridisieren.
Wie das 5' Ende
des End-Run-Oligonukleotids, braucht das 3' Ende des Blockierungs-Oligonukleotids
jedoch nicht zu einer solchen Hybridisierung in der Lage zu sein.
Daher kann eines von beiden oder beide dieser Enden so ausgelegt
werden, dass sie andere erwünschten
Nukleinsäuresequenzen
enthalten, wie zum Beispiel Restriktionsstellen, Bindungssequenzen,
usw.
-
Wurde die Sequenz des Zielmoleküls vorher
bestimmt, ist es möglich
die Primer- und Blockierungs-Oligonukleotide so auszulegen, dass
bei Hybridisierung an das Zielmolekül das 3' Ende des Primer-Oligonukleotids und
das 5' Ende des
Blockierungs- Oligonukleotids aneinander angrenzen. In dieser Ausführungsform
kann zwischen den Blockierungs- und Primer-Oligonukleotiden ein
Verknüpfungsereignis
stattfinden, ohne dass eine Primerverlängerung stattfinden muß.
-
Bezeichnenderweise ist eine derartige
a priori Zielsequenzinformation nicht erforderlich. Die Zielsequenz
kann daher teilweise oder vollständig
undefiniert sein. In dieser Ausführungsform
sind die Primer- und Blockierungs-Oligonukleotide so ausgelegt,
dass bei Hybridisierung an das Zielmolekül das 3' Ende des Primer-Oligonukleotids und
das 5' Ende des
Blockierungs-Oligonukleotids durch eine „Lücke" getrennt sind (die entweder bekannte
oder unbekannte Sequenzen oder eine Kombination von bekannten und
unbekannten Sequenzen enthält).
Eine solche Lücke
kann eine Länge
von 1 bis ungefähr
10000 Nukleotiden aufweisen. In einer derartigen Ausführungsform
findet eine Verknüpfung
nicht statt, außer
die „Lücke" ist „aufgefüllt", vorzugsweise durch
die Polymerase vermittelte templatabhängige Verlängerung des 3' Endes des Primer-Oligonukleotids,
bis ein solches Ende das 5' Ende
des Blockierungs-Oligonukleotids erreicht; an dieser Stelle kann
ein Verknüpfungsereignis
zwischen dem Blockierungs-Oligonukleotid und dem verlängerten
Primer-Oligonukleotid stattfinden. 1 (Doppelstrang-Ziel)
und 5 (Einzelstrang-Ziel)
erläutern
die relativen Anordnungen der Blockierungs- und Primer-Oligonukleotide
in der ERA Ausführungsform,
in der die Oligonukleotide aneinandergrenzen. 2 (Doppelstrang-Ziel) und 6 (Einzelstrang-Ziel) erläutern die
relativen Anordnungen von Blockierungs- und Primer-Oligonukleotiden
in der ERA Ausführungsform,
in der die Oligonukleotide durch eine Lücke getrennt sind.
-
Zur Herstellung der gewünschten
Amplifikation in Abhängigkeit
von der Verknüpfung
des Blockierungs-Oligonukleotids und des Primer-Oligonukleotids
(oder dessen Verlängerungsprodukts)
ist es unentbehrlich, dass das Blockierungs-Oligonukleotid an eine
Zielsequenz hybridisiert, bevor das Primer-Oligonukleotid oder bevor
das Primerverlängerungsprodukt
zu einer Stelle hin verlängert
worden ist, die jenseits der Stelle liegt, an die das 5' Ende des Blockierungs-Oligonukleotids
hybridisieren kann. Tritt irgendeines dieser Ereignisse zuerst auf,
so kann das hybridisierte Primer-Oligonukleotid
längs der
Region des Ziels verlängert
werden, an die das Blockierungs-Oligonukleotid ansonsten hybridisieren
würde,
und sogar in Abwesenheit eines Verknüpfungsereignisses würde ein
falsch-positiver Nachweis und Amplifikation resultieren.
-
Damit dieses Szenario vermieden werden
kann, wird bevorzugt, dass die Länge
des Primer-Oligonukeotids ungefähr
weniger als 75% der Länge
des Blockierungs-Oligonukleotids,
bevorzugter weniger als ungefähr
60% der Länge
des Blockierungs-Oligonukleotids und besonders bevorzugt weniger
als ungefähr
50% der Länge
des Blockierungs-Oligonukleotids beträgt. Alternativ dazu wird bevorzugt,
dass die Tm des Primer-Oligonukleotids weniger
als ungefähr
75% der Tm des Blockie rungs-Oligonukleotids,
bevorzugter weniger als ungefähr
60% der Tm des Blockierungs-Oligonukleotids
und besonders bevorzugt weniger als ungefähr 50% der Tm des
Blockierungs-Oligonukleotids beträgt. Indem dafür gesorgt
wird, daß das
Primer-Oligonukleotid „kürzer" als das Blockierungs-Oligonukleotid
ist, gibt es eine erhöhte
Wahrscheinlichkeit, dass die Hybridisierung des Blockierungs-Oligonukleotids
vor der Hybridisierung des Primer-Oligonukleotids stattfindet. Eine gleichwertige
Methode, um das Ziel der Hybridisierung des Blockierungs-Oligonukleotids
an das Ziel vor dem Primer-Oligonukleotid zu erreichen, ist die
Einheiten auf serielle Weise hinzuzufügen, wobei das Blockierungs-Oligonukleotid
vor dem Primer-Oligonukleotid der Reaktionsmischung zugegeben wird.
Alternativ dazu sollte beachtet werden, dass die Reihenfolge de
Bindung ebenfalls gesteuert werden kann, indem das Verhältnis und/oder
die Konzentration der Reaktanden verändert wird. Im „Schleifen
ERA" (nachstehend
diskutiert) wird eine bevorzugte Bindung durch Verwendung von Tm und Proximität gesteuert.
-
Dem Fachmann ist klar, dass die Länge einer
Olginukleotideinheit, die für
deren Tm in Anbetracht einer Hybridisierung
an einen komplementäre
Sequenz Bedeutung ist, manipuliert werden kann, um die „Geschwindigkeit" der Hybridisierung
der Einheit an die komplementäre
Sequenz zu erhöhen.
Ist beispielsweise eine Zielsequenz vorgegeben, die zwei Regionen
mit definierter Sequenz, X und Y aufweist; wobei ein erstes Oligonukleotid
eine Länge
X' aufweist, die
zu einer Region X komplementär
ist; und wobei ein zweites Oligonukleotid eine Länge Y' aufweist, die zu einer Region Y komplementär ist, so
hybridisiert typischerweise das erste Oligonukleotid unter schärferen Bedingungen „schneller" an das Ziel, als
das zweite Oligonukleotid, wenn X' > Y' ist. Dieser Aspekt
der Oligonukleotidhybridisierung ist einer wirkungsvollen Verwertung
für das
offenbarte Amplifikationsverfahren zugänglich.
-
C. Das „End-Run-Oligonukleotid" der vorliegenden
Erfindung
-
Das dritte Oligonukleotid der Erfindung,
das heißt
der „End-Run"-Primer ist ein Primermolekül und muß daher
ein 3' Ende besitzen,
das durch eine DNA-Polymerase verlängert werden kann.
-
Die Sequenz des End-Run-Oligonukleotids
ist so ausgewählt,
dass dessen 3' Ende
zu einer vorbestimmten Sequenz des Blockierungs-Oligonukleotids
oder weniger bevorzugt zu einer Sequenz komplementär ist, die
durch Verlängerung
des Primer-Oligonukleotids
erzeugt wird. Die vorbestimmte komplementäre Sequenz des Blockierungs-Oligonukleotids
umfaßt
das 5' endständige Nukleotid
des Blockierungs-Oligonukleotids,
jedoch kann ebenfalls eine innere Sequenz geeignet sein.
-
Die komplementäre 3' endständige Sequenz des End-Run-Oligonukleotids
muß eine
Länge aufweisen,
die ausreichend ist, um die Hybridisierung zwischen der 3' endständigen Sequenz
des End-Run-Oligonukleotids und einer komplementären Sequenz des Blockierungs-Oligonukleotids
zu erlauben. Die einzige Einschränkung
des End-Run-Oligonukleotids ist, dass dessen 3' Ende im wesentlichen nicht in der Lage
ist, mit dem Primer-Oligonukleotid zu hybridisieren. Vorzugsweise
wird jedoch das 3' Ende
des End-Run-Oligonukloetids sich nicht jenseits des 5' Endes des Blockierungs-Oligonukleotids
erstrecken, wenn die beiden aneinander hybridisieren. In der Ausführungsform
der Erfindung, entsprechend der Darstellung in 1, und in Situationen, in denen ein
Verknüpfungsereignis
nicht stattfinden kann, könnte
ein End-Run-Oligonukleotid,
dessen 3' Ende sich über das
5' Ende des Blockierungs-Oligonukleotids hinaus
erstreckt, ebenfalls mit einer Region des 3' Endes des Primer-Oligonukleotids (oder
dessen Verlängerungsprodukt)
hybridisieren und sich somit längs
des Primer-Oligonukleotids erstrecken; Im Fall einer Ausführungsform
der Erfindung, wie sie in 2 dargestellt
ist, kann eine unechte PCR-Reaktion sogar in Abwesenheit des definierten
Ziels stattfinden, was zu falsch positiven Ergebnissen führt. Das
heißt,
dieses Ereignis könnte
dem Primer-Oligonukleotid das „Primer" einer Verlängerungsreaktion
gestatten, die zu der Herstellung eines Produkts führt, das
eine „Kopie" des End-Run-Oligonukleotids
umfaßt,
wenn das 3' Ende
des End-Run-Oligonukleotids überhängt und
mit dem 3' Ende
des Primer-Oligonukleotids hybridisiert und eine Verknüpfung zwischen
Primer- und Blockierungs-Oligonukleotiden
könnte
unabhängig
von der Gegenwart eines spezifischen Ziels stattfinden.
-
Die Länge des End-Run-Oligonukleotids
kann kleiner, gleich oder größer als
die Länge
des Blockierungs-Oligonukleotids sein. Somit wird bevorzugt, dass
die Gesamtlänge
des End-Run-Oligonukleotids zwischen ungefähr 50% und ungefähr 100 der
Länge des
Blockierungs-Oligonukleotids, bevorzugter zwischen ungefähr 75 und
ungefähr
95% der Länge
des Blockierungs-Oligonukleotids und besonders bevorzugt ungefähr 80% der
Länge des
Blockierungs-Oligonukleotids beträgt. Alternativ dazu wird bevorzugt,
dass die Tm des End-Run-Oligonukleotids
zwischen ungefähr
50% und ungefähr
100% der Tm des Blockierungs-Oligonukleotids,
bevorzugter zwischen ungefähr
75% und ungefähr
95% der Tm des Blockierungs-Oligonukleotids und
besonders bevorzugt ungefähr
80% der Tm des Blockierungs-Oligonukleotids beträgt. Weiterhin
wird besonders bevorzugt, dass das 3' Ende des End-Run-Oligonukleotids mit
dem 5' Ende des
Blockierungs-Oligonukleotids so weggespült wird, dass die Folgen eines
End-Run-„Überhangs", wie vorstehend
beschrieben wurde, wirksam vermieden werden. Es wird angemerkt,
dass das 5' Ende
des End-Run-Oligonukleotids nicht mit dem 3' Ende des Blockierungs-Oligonukleotids
weggespült
werden muß.
-
Obwohl das 3' Ende des End-Run-Oligonukleotids in
der Lage sein muß,
an das Blockierungs-Oligonukleotid zu hybridisieren, ist es nicht
notwendig, dass die inneren oder 5' endständigen Sequenzen des End-Run-Oligonukleotids
zu den Sequenzen des Blockierungs-Oligonukleotids entsprechend komplementär sind.
Während
in einer bevorzugten Ausführungsform
das gesamte End-Run-Oligonukleotid zur Hybridisierung an das Blockierungs-Oligonukleotid
in der Lage ist, ist somit in dazu alternativen Ausführungsformen
das End-Run-Oligonukleotid so ausgelegt, dass es innere oder 5' endständige Sequenzen
enthält,
die im wesentlichen nicht zur Hybridisierung mit dem Blockierungs-Oligonukleotid
in der Lage sind. Eine solche Fähigkeit weist
einen großen
Nutzen auf, da wie nachstehend genau beschrieben ist, sie ein einfaches
Mittel zur Reinigung eines Strangs des Amplifikationsprodukt von
einem anderen zur Verfügung
stellt. Entsprechend gestattet sie die Sequenzen von beiden Strängen eines
Doppelstrang-Amplifikationsprodukts gleichzeitig abzuleiten.
-
III. Überblick über die „End-Run-Amplifikations-" Reaktion
-
Obwohl die folgende Diskussion durch
Bezugnahme auf die Amplifikation einer Doppelstrang-DNA (oder DNA-RNA-Hybride)
erläutert
wird, ist verständlich,
dass die Diskussion genauso auf die Amplifikation einer RNA, Einzelstrang-DNA
oder auf Mischungen von beliebigen vorstehenden Nukleinsäuretypen
anwendbar ist.
-
Die einfachste Ausführungsform
der „End-Run-Amplifikations-" („ERA") Reaktion der vorliegenden
Erfindung umfaßt
das Inkubieren des Zielmoleküls
in Gegenwart des Blockierungs-Oligonukleotids, so dass das Blockierungs-Oligonukleotid
an eine komplementäre
Sequenz des Ziels hybridisiert. Nachdem dieses ausgeführt worden
ist, kann entweder das Primer-Oligonukleotid oder das End-Run-Oligonukleotid
zugegeben werden. Die besonders bevorzugte Reihenfolge der Oligonukleotidhybridisierung
an die Zielsequenzstränge
ist die folgende: Blockierungs-Oligonukleotid, dann End-Run-Oligonukleotid,
anschließend
Primer-Oligonukleotid. In bevorzugten Ausführungsformen kann die Reihenfolge
Blockierungs-, dann Primer-Oligonukleotid, anschließend End-Run-Oligonukleotid
und Blockierungs-Oligonukleotid oder End-Run-Oligonukleotid und Primer-Oligonukleotid
sein. Wie offensichtlich ist, wird bevorzugt, dass das Blockierungs-Oligonukleotid
das erste Oligonukleotid ist, das an das Ziel hybridisiert. Derartige
Reihenfolgen der Zugabe sind erläuternd
und schränken keineswegs
die Erfindung ein. Wie offensichtlich ist, sind alle Reaktanden
in jeder Stufe jeder nachfolgenden Amplifikationsrunde unmittelbar
verfügbar,
es sei denn nicht gebrauchte Reaktanden werden aus der Reaktion entfernt.
Wird jedoch eine sequentielle Zugabe in solchen nachfolgenden Amplifikationsrunden
gewünscht, können nicht
gebrauchte Oligonukleotide am Schluß eines Amplifikationszyklus
aus der Reaktion entfernt oder davon abgetrennt werden und dann
später
in der gewünschten
Sequenz für
eine nachfolgende Amplifkationsrunde wieder zugegeben werden.
-
Besonders bevorzugt beträgt das Verhältnis von
Blockierungs-Oligonukleotid zu Primer-Oligonukleotid zu End-Run-Oligonukleotid
innerhalb des Reaktionsbehälters
1 : 1 : 1. Jedoch sind auch Abweichungen möglich. Das Blockierungs-Oligonukleotid
sollte vorzugsweise mit einer Konzentration vorhanden sein, die gleich
oder größer als
die Konzentration des Primer-Oligonukleotids ist, zum Beispiel I,5
: 1 oder mehr. Dementsprechend wird besonders bevorzugt, dass die
Menge an Primer-Oligonukleotid
die Menge an Blockierungs-Oligonukleotid nicht überschreitet, denn eine derartige
Situation könnte
die Tendenz des Primer-Oligonukleotids zur Hybridisierung mit dem
Ziel vor dem Blockierungs-Oligonukleotid erhöhen, was ein Szenario ist, das
vermieden werden muß,
wie nachstehend genau ausgeführt
wird. Das Verhältnis
von Blockierungs-Oligonukleotid zu End-Run-Oligonukleotid kann von
dem bevorzugten Verhältnis
1 : 1 abweichen, ohne das ERA Protokoll zu beeinflussen.
-
Das zu vermeidende Szenario ist die
Titration des Blockierungs-Oligonukleotids durch das End-Run-Oligonukleotid,
so dass das Blockierungs-Oligonukleotid nicht ausreichend verfügbar ist,
wenn das Primer-Oligonukleotid an die Zielsequenz hybridisiert.
Dieses Szenario kann durch Anpassen der Zykluszeit, Reaktionstemperatur,
Tm, Oligonukleotidlängen, Konzentration des Ziels
oder durch Anpassen des Verhältnisses
von Blockierungs-Oligonukleotid zu End-Run-Oligonukleotid vermieden
werden. Es wird bevorzugt, dass von diesen Faktoren zur Vermeidung
des vorstehenden Szenarios das Verhältnis von Blockierungs-Oligonukleotid
zu End-Run-Oligonukleotid
angepasst wird, da dieser Faktor im Vergleich zu den anderen einfacher
zu steuern ist. Dieses Verhältnis
beträgt
vorzugsweise 1 : 1.
-
Gibt es eine Lücke, die das hybridisierte
Primer-Oligonukleotid von dem hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotid
trennt, wird zusammen mit den dNTPs eine Polymerase zugegeben und
die Reaktion wird unter Bedingungen aufrechterhalten, die zum Katalysieren
der Polymerase vermittelten, templatabhängigen Verlängerung des Primer-Oligonukleotids
geeignet sind. Die „Lücke" zwischen dem hybridisierten
Blockierungs-Oligonukleotid und dem hybridisierten Primer-Oligonukleotid
kann von beliebiger Nukleotidlänge
sein. Bei einer großen
Länge wird
die Zeiteinteilung des Amplifikationszyklus so gesteuert, daß für eine Zeitdauer gesorgt
ist, die ausreicht, um die Verlängerung
des Primer-Oligonukleotids und dessen Verknüpfung mit dem Blockierungs-Oligonukleotid
zu gestatten. Weil es jedoch im allgemeinen bevorzugt ist, die Zeitdauer
von jedem Amplifikationszyklus zu verringern, um die Produktion
des amplifizierten Produkts innerhalb einer vernünftigen Zeitdauer zu maximieren,
beträgt
der Abstand zwischen dem 5' Ende
des Blockierungs-Oligonukleotids und dem 3' Ende des Primer-Oligonukleotids, wenn
beide an das Ziel hybridisiert werden, vorzugsweise zwischen ungefähr 2 bis
ungefähr
10000 Basen, bevorzugter zwischen ungefähr 2 bis ungefähr 1000
Basen und besonders bevorzugt zwischen ungefähr 2 bis ungefähr 200 Basen.
Es ist natürlich
offensichtlich, dass mehr als ein Primer-Oligonukleotid verwendet werden kann,
das heißt
es können
weitere Primer-Oligonukleotid(e) verwendet
werden, die an eine Region mit definierter Sequenz innerhalb der
Lücke hybridisieren.
Wie aufgezeigt wurde, betrachtet die vorliegende Erfindung die Verknüpfung der
zwei Oligonukleotide miteinander, sobald das Primer-Oligonukleotid derart
verlängert
worden ist, dass dessen 3' Ende
an das 5' Ende des
Blockierungs-Oligonukleotids angrenzt.
-
Sind die Primer- und Blockierungs-Oligonukleotide
so ausgelegt, dass bei Hybridisierung an das Ziel ihre entsprechenden
3' und 5' Enden aneinanderangrenzen,
können
die Oligonukleotide ohne den Primerverlängerungsschritt miteinander
verknüpft
werden.
-
In diesem Stadium werden die Reaktionsbedingungen
so geändert,
dass eine Strangtrennung auftritt. Eine Strangtrennung kann unter
Verwendung eines beliebigen geeigneten Denaturierungsverfahrens
ausgeführt
werden; diese umfassen die Verwendung physikalischer, chemischer
oder enzymatischer Mittel. Ein physikalisches Verfahren für die Strangtrennung
betrifft die Erwärmung
der Nukleinsäure,
bis sie vollständig
denaturiert ist; die Wärmedenaturierung
erfordert typischerweise die Verwendung von Temperaturen im Bereich von
ungefähr
80°C bis
ungefähr
105°C (vorzugsweise
ungefähr
95°C) während zwischen
ungefähr
1 bis 10 Minuten (vorzugsweise ungefähr 4–5 Minuten). Ein weiteres physikalisches
Verfahren zur Strangtrennung betrifft die Änderung des pH-Werts des Mediums,
in dem sich die Doppelstränge
befinden; die pH-Wert-Denaturierung erfordert typischerweise die
Verwendung eines pH-Wertbereichs von ungefähr pH-Wert 11 bis ungefähr pH-Wert
14 während
zwischen ungefähr
1 Sekunden bis ungefähr
10 Minuten. Ein enzymatisches Verfahren zur Strangtrennung kann
auf die Verwendung von Enzymen, die als Helikase bezeichnet werden,
oder das Enzym RecA angewiesen sein, das Helikaseaktivität aufweist
und von dem berichtet wurde, dass es in Gegenwart von ATP zu doppelsträngiger DNA
denaturiert. Reaktionsbedingungen, die zur Trennung der Nukleinsäurestränge mit
Helikase geeignet sind, sind in Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative
Biology, Bd. XLIII, "DNA
Replication and Recombination (New York: Cold Spring Harbor Laboraton,
1978), B. Kuhn et al., „DNA Helicases", Seiten 63–67 ausgeführt, auf
deren Offenbarungsgehalt hier vollumfänglich Bezug genommen wird.
Bei Verwendung von Wärmedenaturierung
(wie bevorzugt ist) sind die in dem ERA-Protokoll verwendeten Enzyme
besonders bevorzugt wärmebeständige Enzyme.
-
Hat die Verknüpfung stattgefunden, dann ist
das Blockierungs-Oligonukleotid und das Primer-Olignukleotid (oder
dessen Verlängerungsprodukt)
kovalent in einem einzigen Molekül
miteinander verbunden (das heißt
das „gewünschte Molekül").
-
Wie aufgezeigt wurde, weist das End-Run-Oligonukleotid
ein 3' Ende auf,
dessen Sequenz zu einer Sequenz des Blockierungs-Oligonukleotids
komplementär
ist. Das aus der Verknüpfung
des Primer-Oligonukleotids (oder dessen Verlängerungsprodukts) und Blockierungs-Oligonukleotids
resultierende einzelne Molekül
kann daher als die Templat für
die Polymerase vermittelte templatabhängige Verlängerung des End-Run-Oligonukleotids
dienen. Damit dies erreicht wird, werden die Reaktionsbedingungen
so geändert, dass
die Zwischenstranghybridisierung stattfinden kann.
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Die Verlängerung des End-Run-Oligonukleotids
erzeugt ein Molekül,
dessen Sequenz die Zielsequenz umfaßt. Daher können die Blockierungs- und
Primer-Oligonukleotide
an das End-Run-Verlängerungsprodukt hybridisieren
und dadurch ein neues „gewünschten
Moleküls" bilden.
-
Wie klar ist, kann der vorstehend
beschriebene Zyklus so oft wie gewünscht wiederholt werden, um den
gewählten
Grad der Amplifikation des gewünschten
Moleküls
herzustellen. Da ein Produkt von einem Schritt ein Substrat eines
anderen wird, führt
die durch die Reaktionszyklen gesteuerte Amplifkation zu einer exponentiellen
Amplifikation der gewünschten
Sequenz.
-
Die vorliegende Erfindung ist dementsprechend
besonders zum Amplifizieren von entweder bekannten oder unbekannten
Sequenzen verwendbar, die zum Beispiel eine genetische Störung anzeigen;
insbesondere richtet sich die vorliegende Erfindung auf die Bestimmung
des Vorhandenseins eines einzelnen Basendefekts in einer Polynukleotidsequenz.
Weiterhin kann die vorliegende Erfindung zur Amplifikation von Polynukleotiden
verwendet werden, die eine bekannte Sequenz oder eine teilweise
unbekannte Sequenz aufweisen, was die Analyse (zum Beispiel Sequenzierung)
des amplifizierten Produkts gestattet.
-
Nach Durchführung einer Amplifikationsreaktion,
kann jede aus einer Vielfalt von aus dem Stand der Technik bekannten
Techniken angepasst werden, um einen solchen Nachweis ohne übermäßiges Experimentieren
zu erlauben oder zu vereinfachen. In machen Situationen ist es besonders
vorteilhaft, die RNA-Amplifikationsprodukte durch ein DNA-Oligonukleotid
einzufangen, das zu einer durch die Zielsequenz be stimmten RNA-Sequenz
komplementär
ist, wobei das Oligonukleotid an einen festen Träger, wie zum Beispiel eine
magnetische Mikroperle oder ein Harzträger gebunden ist. Diese Oligonukleotidsequenz überlappt
vorzugsweise nicht mit derjenigen irgendeines Oligonukleotids, das
zur Reinigung des Ziels vor der Amplifikation verwendet wird. Somit
gebildete RNA : DNA Hybride können
dann durch vorzugsweise markierte Antikörper (oder deren Fragmente)
nachgewiesen werden, die an RNA : DNA Duplexe binden. Der Nachweis
der Bindung solcher Antikörper
kann durch eine Anzahl gut bekannter Verfahren aus dem Stand der
Technik durchgeführt
werden.
-
Alternativ dazu kann die amplifizierte
Nukleinsäure
durch Gelelektrophorese, Hybridisierung oder einer Kombination aus
den beiden Verfahren nachgewiesen werden, wie im Stand der Technik
gut verstanden ist. Der Fachmann wird feststellen, dass die vorliegende
Erfindung so angepasst werden kann, dass sie viele Nachweisschemata
einschließt.
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Sequenzen, die entsprechend den Verfahren
der Erfindung amplifiziert wurden, können gereinigt werden (zum
Beispiel durch Gelelektrophorese, durch Säulenchromatographie, durch
Affinitätschromatographie, durch
Hybridisierung, usw.) und die die gereinigten Produkte enthaltenden
Fraktionen können
einer weiteren Amplifikation entsprechend den Verfahren der Erfindung
unterzogen werden.
-
IV. Bevorzugte allgemeine
Verfahren zur Durchführung
der „End-Run-Amplifikations-" Reaktion
-
Entsprechend der vorstehend beschriebenen Übersicht über das
allgemeine Verfahren der Erfindung wurden bestimmte besonders zu
bevorzugende Verfahren festgestellt.
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Allgemeine Parameter hinsichtlich
der bevorzugten Längen
und Tm der Blockierungs-Primer- und End-Run-Oligonukleotide
sind vorstehend genau offenbart. In einer besonders bevorzugten
Ausführungsform sind
die Längen
(in den Nukleotiden) folgende: Blockierungs-Oligonukleotid – 23, Primer-Oligonukleotid – 10, End-Run-Oligonukleotid – 18. In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
sind die Tm (in °C) folgende: Blockierungs-Oligonukleotid – 85, Primer-Oligonukleotid – 45, End-Run-Oligonukleotid – 75.
-
Besonders bevorzugt wird, dass in
dem Verfahren die Blockierungs-Oligonukleotid-, Primer-Oliognukleotid-
und der End-Run-Oligonukleotidreaktanden gleichzeitig in den Reaktionsbehälter gegeben
werden. Die Reaktanden können
jedoch nacheinander oder gruppenweise zugegeben werden. Werden die
Oligonukleotide nacheinander zugegeben, so wird die Verwendung folgender
Reihenfolgen bevorzugt. Blockierungs-, End-Run-, Primeroligonukleotid;
Blockierungs-, Primer-, End-Run-Oligonukleotid;
Blockierungs-, End-Run- und Primeroligonukleotid; Blockierungs-
und Primer-, End-Run-Oligonukleotid; oder Blockierungs- und End-Run-,
Primer-Oligonukleotid.
Alternativ dazu können
die Einheiten in jeder beliebigen Reihenfolge oder als einzelne
Beimischung zugegeben werden, wenn der Reaktionsbehälter (umfassend
die Zielsequenz) bei ungefähr
4°C gehalten
wird – denn
wie dem Fachmann klar ist, ist bei dieser Temperatur die Hybridisierung und
enzymatische Aktivität
im wesentlichen und typischerweise vollständig verhindert.
-
Da die Längen (und/oder Tm)
der Oligonukleotideinheiten so ausgelegt sind, dass sie die Wahrscheinlichkeit
erhöhen,
dass das Ziel zuerst mit dem Blockierungs-Oligonukleotid, anschließend mit
dem Primer-Oligonukleotid und zuletzt mit dem End-Run-Oligonukleotid
hybridisiert, werden die Oligonukleotide typischerweise so zugegeben,
dass die Konzentration des Blockierungs-Oligonukleotids größer oder
gleich der Konzentration von entweder dem Primer-Oligonukleotid
oder dem End-Run-Oliognukleotid
ist. Jede Einheit ist in einer Konzentration im Bereich von ungefähr 10 nM
(nanomolar) bis ungefähr
400 nM, vorzugsweise von ungefähr 50
nM bis ungefähr
300 nM und besonders bevorzugt von ungefähr 100 nM vorhanden. Die für jede Reaktion verwendete
optimale Sondenmenge variiert ebenfalls in Abhängigkeit von der Anzahl der
Amplifikationszyklen, die durchgeführt werden. Optimale Konzentrationen
können
leicht von dem Fachmann bestimmt werden.
-
Wie dem Fachmann im allgemeinen klar
ist, ist die Strenge der Bedingungen von der Temperatur, dem Puffer
(den Puffern) und damit zusammenhängenden Parametern abhängig; der
Temperaturparameter ist jedoch typischerweise am einfachsten zu
steuern und ist daher ein bevorzugter einschränkender Parameter, der bei
Variation zur Optimierung der Leistungsfähigkeit der ERA verwendet werden
kann. Wie angemerkt wurde, hängt
die Oligonukleotidlänge
direkt mit der durch die Temperatur gesteuerte Schärfe der
Bedingungen zusammen – somit
können
die verschärfenden
Bedingungen leicht durch den Fachmann optimiert werden in Übereinstimmung
mit den Zielen, dass das Blockierungs-Oligonukleotid mit dem Ziel
vor dem Primer-Oliognukleotid
hybridisiert und das Primer-Oligonukleotid und die Zielmoleküle aneinander
hybridisieren.
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Sofern die Primer- und Blockierungs-Oliogonukleotide
nicht so ausgelegt wurden, dass sie aneinandergrenzen, wird eine
Polymerase zur Verlängerung
des Primers in Richtung des Blockierungs-Oligonukleotids verwendet,
bis ein verknüpfbares
Substrat erhalten wird. Falls eine Verlängerung des Primer-Oligonukleotids
benötigt
wird, wird bevorzugt, dass das Polymeraseenzym in Verbindung mit
dNTPs in dem Reaktionsbehälter
vorhanden ist, bevor, während
oder nachdem die Einheiten zu der Zielsequenz gemischt werden. Besonders
bevorzugt ist, daß das
Polymeraseenzym ein wärmebeständiges Polymeraseenzym
ist. Ein weiterer besonders bevorzugter Schritt betrifft die Beimischung
der Polymerase zu dem Reaktionsbehälter, der schon die Zielsequenz,
dNTPs und die Oligonukleotidreaktanden enthält. Anstatt solcher aufeinanderfolgender
Zugaben können
alle Reagenzien in einem Reaktionsbehälter gemischt werden, dessen
Temperatur bei ungefähr 4°C gehalten
wird, um im wesentlichen Hybridisierung und enzymatische Aktivität zu verhindern.
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Da das Amplifikationsstadium der
ERA von einem Verknüpfungsereignis
sowie auch von einem Verlängerungsereignis
abhängt,
wird bevorzugt, dass der nächste
Schritt in dem Verfahren die Verknüpfung der an das Ziel hybridisierten
Blockierungs- und Primer-Oligonukleotide ist. Daher sind die Mittel
zur kovalenten Kopplung der zwei Moleküle, vorzugsweise ein Ligaseenzym
und besonders bevorzugt ein wärmebeständiges Ligaseenzym,
in dem Reaktionsbehälter
vor, während
oder nach der Beimischung der Moleküle zu der Zielsequenz vorhanden.
Besonders bevorzugt wird die Ligase zu dem Reaktionsbehälter zugegeben,
nachdem die Oligonukleotideinheiten dazu gegeben wurden.
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Der nächste bevorzugte Schritt in
der Reaktion ist die Polymerase vermittelte templatabhängige Verlängerung
des End-Run-Oliognukleotids, das entweder an einen Ziel strang oder
an ein verknüpftes
Blockierungs-Primer-Oligonukleotid hybridisiert ist. Falls eine
Polymerase nicht vorher zu dem Reaktionsbehälter gegeben worden ist, wird
eine solche Polymerase vorzugsweise unter denselben Erwägungen hinsichtlich
der Zugabe der Polymerase zugegeben, wie vorstehend diskutiert ist.
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Eine besonders bevorzugte Reihenfolge
der Zugabe der Reaktandenkomponenten ist folgende: Reaktionspuffer,
Zielsequenz, dNTPs, Oligonukleotide, wärmebeständiges Ligaseenzym, wärmebeständiges Polymeraseenzym.
Besonders bevorzugt wird das wärmebeständige Polymeraseenzym
nach einem „Heißstart" zugegeben, das heißt ein erster „Denaturierungszyklus" wird vor der Zugabe
des Polymeraseenzyms zu dem Rektionsbehälter durchgeführt. Wie
angegeben wurde, werden diese Komponenten besonders bevorzugt bei näherungsweise
4°C gehalten,
bis die Einleitung des Amplifikationsverfahrens gewünscht wird.
Die Reaktionskomponenten können
zu dem Reaktionsbehälter
manuell oder mittels eines automatisieren Laborroboterarbeitsplatzes
zugegeben werden, der in der Lage ist, eine Vielfalt von Reaktionskomponenten
automatisch zu einem (mehreren) Reaktionsbehälter(n) zuzugeben. Ein besonders
bevorzugter automatisierter Laborroboterarbeitsplatz ist das Biomek® 1000
(Beckman Instruments, Inc., Fullterton, CA.).
-
Falls, wie besonders bevorzugt ist,
der Reaktionsbehälter
bei 4°C
gehalten wurde, wird nach der Zumischung der Reaktionskomponenten
der Reaktionsbehälter
einem „Heißstart" unterzogen, das
heißt
die Temperatur wird während
ungefähr
5 Min. auf ungefähr
95°C erhöht, um vor
Einleitung der ERA durch Zugabe des Polymeraseenzyms die Zielsequenz
vollständig
zu denaturieren. Danach folgen vorzugsweise die Amplifikationszyklen.
In jedem speziellen Zyklus wird gewünscht, dass mindestens ein
Verknüpfungsereignis
zwischen einem Blockierungs-Oligonukleotid und einem Primer-Oligonukleotid,
die an ein Ziel hybridisiert sind, stattfindet und mindestens eine
Verlängerung
eines an ein Ziel und/oder an Blockierungs-Oligonukleotid-Primer-Oligonukleotidverknüpfungsprodukt
hybridisierten End-Run-Oliognukleotids stattfindet, da bei einer
im wesentlichen exponentiellen Amplifikation die Zahl solcher Ereignisse
nach jedem Zyklus dramatisch zunimmt.
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Ein Zyklus erfordert das Annealing
der Oligonukleotide an ihre entsprechenden Ziele und davon die Denaturierung.
Wird somit die Denaturierung durch die Temperatur vermittelt (wie
besonders bevorzugt ist), werden die Zyklen durch Anpassung der
Temperatur des Reaktionsbehälters
reguliert. Bei Verwendung nicht wärmebeständiger Enzyme kann die enzymatische
Aktivität
der Enzyme im wesentlichen zerstört
sein, wenn die zur Denaturierung der Stränge notwendige Temperatur erreicht
ist; und somit kann nach jedem Zyklus die Zugabe von frischem Enzym
notwendig sein. Aus diesem Grund werden vorzugsweise hauptsächlich wärmebeständige Enzyme
verwendet.
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Die innerhalb eines jeden Zyklus
verwendete Temperatur hängt
hauptsächlich
von der Tm der Oligonukleotideinheiten ab.
Oligonukleotide mit einer Länge
von ungefähr
6 bis ungefähr
10 Basen weisen ein Tm von ungefähr 40°C auf, wobei
bei dieser Temperatur wärmeempfindliche
(das heißt
nicht wärmebeständige) Enzyme
aktiv sind. Bei Verwendung längerer
Oligonukleotide nimmt die Tm zu und erfordert
die Verwendung wärmebeständiger Enzyme
oder die Zugabe von wärmeempfindlichen
Enzymen nach jedem Zyklus. Für
die besonders bevorzugten Oligonukleotidlängen (Blockierungs-Oliognukleotid – 23 Basen,
Primer-Oligonukleotid – 10
Basen, End-Run-Oligonukleotid – 18 Basen)
ist jeder Zyklus vorzugsweise durch die folgenden Parameter definiert:
95°C – 1 Minute,
70°C – 4 Minuten,
40°C – 4 Minuten.
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Die Anzahl der Zyklen hängt hauptsächlich von
den Bedürfnissen
des Forschers ab. Typischerweise können nachweisbare Ergebnisse
schon nach wenigen Zyklus wie ungefähr 10 bis ungefähr 20 erreicht
werden. Mehr als 20 Zyklen können
jedoch verwendet werden, wenn die Reaktion nicht durch die Konzentration der
in dem Reaktionsbehälter
vorhandenen Oligonukleotide, dNTPs und Enzym eingeschränkt ist.
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Nach der Durchführung einer geeigneten Anzahl
von Zyklen kann die Reaktion beendet werden. Die Kann wirksam durch
Inaktivierung des Enzyms durchgeführt werden und kann besonders
bevorzugt durch Erniedrigung der Temperatur des Reaktionsbehälters auf
4°C erreicht
werden. Jedoch können
auch andere Methoden, zum Beispiel EDTA und ein Harnstoff „Stopp-" Farbstoff verwendet
werden. Weiterhin können
die Enzyme unter Verwendung von Verfahren, die dem Fachmann bekannt
sind, chemisch inaktiviert werden oder die Verbindungen können: zum
Beispiel auf SephadexTM Säulen, durch
Filtration, durch Zentrifugation oder durch Gelelektrophorese getrennt
werden.
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Ein mit jedem Amplifizierungsprotokoll
zusammenhängendes
möglicherweise
verhängnisvolles
Problem ist die Verunreinigung; dieses Problem ist besonders akut,
wenn das Amplifikationsprotokoll für diagnostische Zwecke verwendet
wird. Zum Beispiel kann sogar eine geringe Verunreinigung eines
Reaktionsbehälters
zu falsch positiven Ergebnissen führen, das heißt, ein
gewünschtes
Ziel, das in einem ersten Behälter, aber
nicht in einem zweiten Behälter
vorhanden ist, kann versehentlich von dem ersten Behälter zu
dem zweiten Behälter übertragen
werden – folglich
wird der zweite Behälter
eine Amplifikation des gewünschten
Ziels zeigen, wenn dieses Ziel tatsächlich nicht ursprünglich in
dem zweiten Behälter
vorhanden war. Verschiedene Methoden zur wesentlichen Verringerung
der Möglichkeit
einer solchen Verunreinigung sind vorgebracht worden. Eine derartige
Methode betrifft die Verwendung des Enzyms Uracil-N-glycosylase
(„UNG"). UNG baut Uracil
so ab, dass Uracil enthaltende Oligonukleotide in Gegenwart von
UNG wirksam abgebaut werden. Weiterhin kann UNG mit Wärme (das
heißt
ungefähr
80°C) inaktiviert
werden. Eine bevorzugte Lösung,
die Sorgen hinsichtlich einer Verunreinigung zu mildern, ist die
Ersetzung von dTTP gegen UTP in der Reaktionsmischung, so dass die
amplifizierten Produkte Uracil anstatt Thymidin eingebaut haben.
Nach der Amplifikation des Ziels in dem ersten Behälter, wird
UNG zu dem zweiten Behälter
gegeben; falls irgendein amplifiziertes Produkt vom ersten Behälter den
zweiten Behälter
verunreinigt hat, wird UNG die Verunreinigung wirksam abbauen. Danach
wird der zweite Behälter
durch Erhitzen des Behälters
auf ungefähr
80°C „heiß-gestartet", wobei das UNG inaktiviert
wird. Danach können
die dNTPs und/oder Enzyme zu dem zweiten Reaktionsbehälter zur
Einleitung des ERA Protokolls zugegeben werden.
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V. Die beispielhaften
Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung und deren bevorzugte Verwendungen
-
Wie dem Fachmann ohne weiteres klar
ist, werden die hauptsächlichen
Unterschiede zwischen den verschiedenen nachstehend erläuterten
Ausführungsformen
von den Bedürfnissen
des Untersuchers bestimmt.
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1. ERA „ohne Lücke"
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Die ERA Ausführungsform „ohne Lücke" ist eine, bei der das 3' Ende des hybridisierten
Primer-Oligonukleotids unmittelbar zu (das heißt angrenzend) dem 5' Ende des hybridisierten
Blockierungs-Oligonukleotids benachbart ist. In dieser Ausführungsform
ist die templatvermittelte Verlängerung
des Primer-Oligonukleotids nicht erforderlich. Dieser Aspekt der
Erfindung wird entsprechend den vorstehend beschriebenen allgemeinen ERA
Verfahren durchgeführt
und ist in 1 und 3 (Doppelstrang-Nukleinsäure) und
in 5 (Einzelstrang-Nukleinsäure) erläutert.
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Da in dieser Ausführungsform die hybridisierten
Primer- und Blockierungs-Oligonukleotide
aneinandergrenzen müssen,
erfordert die Ausübung
dieser Ausführungsform
die a priori Bestimmung von mindestens einem Teil der Zielnukleinsäuresequenz.
Eine derartige Information wird gebraucht, um die Sequenzen der Blockierungs-
und Primer-Oligonukleotide zu definieren. Die Blockierungs- und
Primer-Oligonukleotide
brauchen notwendigerweise nicht so ausgelegt sein, dass sie vollständig längs des
Ziels hybridisieren, vielmehr müssen
ausreichend Einzelheiten im Hinblick auf die Zielsequenz bekannt
sein, so dass das 5' Ende
des Blockierungs-Oligonukleotids
und das 3' Ende
des Primer-Oligonukleotids unter verschärfenden Bedingungen daran hybridisieren
können.
Alternativ dazu kann die Zielsequenz in ausreichender Menge isoliert
sein, um die Erzeugung von ausreichend Oligonukeotid-komplementären Paaren
zur Verwendung in dem offenbarten Verfahren zu ermöglichen.
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Diese Ausführungsform der Erfindung ist
besonders zur Identifikation einer genetischen Mutation oder von
polymorphen Stellen geeignet. Im Hinblick darauf wird die Sequenz
des Primer-Oligonukleotids besonders bevorzugt so ausgewählt, dass
deren 3' endständiges Nukleotid
entweder dem „normalen" oder dem „mutierten" Allel entspricht,
das identifiziert werden soll. Wie klar ist, wird, falls das Primer-Oligonukleotid mit
der „normalen" Base endet, diese
Base nicht an eine Zielsequenz hybridisieren, die von einem Individuum
mit einer Mutation an dieser Stelle stammt. Dementsprechend wird
die Amplifikation durch ERA nur stattfinden, wenn die Probe von
einem „normalen" Individuum stammt.
Umgekehrt ist es durch Verwendung eines Primers, der in der „mutierten" Base oder in einer „promiskuitiven" Base, wie zum Beispiel
Inosin endet, möglich,
die Reaktion so anzupassen, dass die Amplifikation nur stattfindet,
wenn die Probe von einer „mutierten" Gensequenz stammt.
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2. ERA „mit Lücke"
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Wie vorstehend aufgezeigt wurde,
werden in einer zweiten bevorzugten Ausführungsform Blockierungs- und
Primer-Oligonukleotide verwendet, die bei Hybridisierung an ein
Zielmolekül
durch eine Lücke
zwischen 1 und 10000 Basen getrennt sind. Bezeichnenderweise erlaubt
das Vorhandensein dieser Lücke
die Verwendung dieser Ausführungsform
der Erfindung sogar in Situationen, in denen eine minimale Sequenzinformation
verfügbar
ist. Insbesondere kann die Sequenz der Lücke unbekannt sein, hingegen
ist notwendig, dass genügend
Einzelheiten hinsichtlich des Teils (der Teile) auf beiden Seite
der Lücke
bekannt müssen,
so dass komplementäre
Blockierungs- und Primer-Oligonukleotide erzeugt werden können.
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Die ERA Ausführungsform „mit Lücke" der vorliegenden Erfindung ist in 2 und 4 für
Doppelstrang-Nukleinsäuremoleküle und in 5 für Einzelstrang-Nukleinsäuremoleküle erläutert.
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Die ERA Ausführungsform „mit Lücke" der vorliegenden Erfindung wird entsprechend
den vorstehend beschriebenen allgemeinen ERA Verfahren durchgeführt, jedoch
wird für
Lücken,
deren Länge
ungefähr
200 Nukleotide überschreitet,
bevorzugt, dass die Reaktionszeit für jeden Zyklus erhöht ist;
jeder Zyklus sollte länger
als ungefähr
10 Minuten sein, das heißt
länger
als ungefähr
12–15
Minuten sein. Mit einer derartigen Zunahme wird die Zunahme der
zyklischen Durchlaufleistung beabsichtigt. Der zeitliche Verlauf
der Reaktion wird vorzugsweise minimiert, um die Geschwindigkeit
der Amplifikation so weit wie möglich
zu erhöhen,
ohne die Leistungsfähigkeit
der Reaktion zu beeinflussen.
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Für
Lücken,
die größer als
10000 Basen sind, können
ein oder mehrere zusätzlichen
Primer-Oligonukleotide verwendet werden (solche optionalen zusätzlichen
Primer-Oligonukleotide
werden als „Primer.A", „Primer.B", „Primer.C", usw. bezeichnet).
Soll ein Primer.A verwendet werden, so ist dieser so ausgelegt,
dass er eine Sequenz enthält,
die an einen Teil der Lücke
(deren Sequenz bekannt oder teilweise bekannt ist) hybridisieren
kann. Falls daher die Lücke äußerst groß ist (das
heißt,
größer als
ungefähr
10000 Nukleotide), kann es erwünscht
sein, einen Primer.A (oder weitere Primer-Oligonukleotidspezies)
zur Hybridisierung an eine Stelle, vorzugsweise an die ungefähre Mittel
der Lücke
(oder an eine Vielfalt von Stellen bei Verwendung mehrfacher Primer)
zu verwenden, um die Verlängerung
des Primer-Oliognukleotids durch Primer.A (und beliebigen anderen
Primer-Oligonukleotiden) an das 5' Ende des Blockierungs-Oligonukleotids
zu erleichtern. Bei der Verknüpfung
werden das Primer-Oliognukleotid,
Primer.A und das Blockierungs-Oligonukleotid kovalent miteinander
verbunden, wodurch das Templat in der Reaktion für das End-Run-Oliognukleotid
gebildet wird. Die Verfahrensschritte der ERA Ausführungsform „ohne Lücke" sind genauso auf
die ERA Ausführungsform „mit Lücke" anwendbar. Diese
Ausführungsform
der Erfindung ist besonders zur Amplifikation von Zielsequenzen) geeignet,
die eine (mehrere) Regionen) mit völlig oder teilweiser unbekannter
Sequenz umfassen, das Verknüpfungsereignis
findet nach der Verlängerung
des Primer-Oligonukleotids (der Primer-Oligonukleotide) bis zu einem
Punkt statt, der zu dem Blockierungs-Oligonukleotid unmittelbar benachbart
liegt, daraufhin kann ein Verknüpfungsereignis
stattfinden.
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Obwohl die vorstehend beschriebenen
Nachweisverfahren auf diese Ausführungsform
der Erfindung gleichwertig anwendbar sind, wird bei der Ausübung dieser
Ausführungsform
bevorzugt, die Amplifikation unter Verwendung von Nukleinsäuresonden
nachzuweisen, die zu einem (oder mehreren) der Oligonukleotide komplementär sind;
dies würde
das „Ziehen" von Amplikonen aus
dem Reaktionsbehälter
gestatten, wobei deren Sequenzierung ausgeführt werden kann.
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In diagnostischen Anwendungen sorgt
diese Ausführungsform
der Erfindung für
die Gelegenheit eine Vielfalt markierter Sonden zu verwenden, die
auf spezifische Mutationen gerichtet sind, die zu einem oder mehreren
Allelen führen.
Das heißt,
für eine
Vielfalt von Mutationen, von denen bekannt ist, dass sie innerhalb einer
speziellen Region eines Gens vorkommen, können Blockierungs-Oligonukleotid(e)
und Primer-Oligonukleotid(e)
so ausgelegt werden, dass sie diese Region flankieren; die Amplifikation
des Ziels wird dann Amplikonen mit undefinierten Mutationen erzeugen.
Anschließend
können
spezifische auf die bekannten Mutationssequenzen gerichtete Sonden
zum Screenen der Amplikonen verwendet werden, so dass in Abhängigkeit
davon, welche Sonde mit den Amplikonen hybridisiert, die Identifikation
der Mutation erreicht werden kann.
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Diese Ausführungsform der Erfindung kann
ebenfalls zur Vereinfachung des Nachweises und der Amplifikation
von Genen verwendet werden, die mit genetischen Krankheiten zusammenhängen. Im
Gegensatz zu der Ausführungsform „ohne Lücke" der Erfindung brauchen
in dieser Ausführungsform
die Blockierungs- und Primer-Oligonukleotide
nach Hybridisierung an das Ziel nicht unmittelbar zu einander benachbart
sein. Somit kann die Ausführungsform
zum Beispiel im Fall einer genetischen Krankheit verwendet werden,
die durch eine Vielfalt von Allelen (wie zum Beispiel Deletionen,
Einschübe,
Umordnungen, so wie auch Punktmutationen) charakterisiert ist, die
durch eine Vielfalt von Mutationsveränderungen in definierten Regionen
des Gens verursacht werden, wobei die Blockierungs- und Primer-Oligonukleotide
so erzeugt werden können,
dass sie diese Region bei Hybridisierung an das Ziel flankieren.
Die Verlängerung
des Primer-Oligonukleotids und die Verknüpfung des Blockierungs-Oligonukleotids
mit dem Primer-Verlängerungsprodukt,
gestattet dem End-Run-Oligonukleotid
die Amplifikation der Zielsequenz, die der polymorphen Stelle entspricht.
Danach kann das amplifizierte Produkt sequenziert werden, oder Sonden
(die zum Beispiel auf jede der verschiedenen Mutationen gerichtet
sind, die in der „Lücken-„ Region
vorkommen können)
können
zum Screenen des amplifizierten Produkts verwendet werden, um zu
bestimmen, welche Mutation in einer speziellen Probe vorhanden oder
nicht vorhanden ist.
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Diese Ausführungsform der Erfindung ist
ebenfalls ideal zur Amplifikation genomischer oder cDNA-Sequenzen
geeignet, in denen nur fragmentarische Sequenzinformation verfügbar ist.
Ein Verfahren zum Amplifizieren von cDNA oder DNA unter Verwendung
dieser Ausführungsform
erfordert nur die Kenntnis der endständigen Aminosequenz des exprimierten
Proteins. Diese Information kann zum Definieren eines Blockierungs-Oligonukleotids,
das zur Hybridisierung an (alle oder einen Untersatz von) Codone(n)
in der Lage ist, die eine derartige Sequenz kodieren, und eines
End-Run-Oligonukleotids verwendet werden, das zur Hybridisierung
an das Blockierungs-Oligonukleotid in der Lage ist. Das Primer-Oligonukleotidmolekül in dieser
Ausführungsform
könnte
eine Poly-T Sequenz umfassen, so dass die Moleküle zusammen eine beliebige
cDNA oder DNA-Sequenz amplifizieren würden, die ein mit den spezifizierten
Codonen beginnendes Protein kodiert.
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3. „NERA" – „Verschachtelte" ERA
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Die „NERA" oder „verschachtelte ERA" Ausführungsform
des ERA Protokolls ist ein Hybrid der ERA „mit Lücke" und ERA „ohne Lücke". NERA wird vorzugsweise als eine zweistufige
Reaktion durchgeführt.
Die erste Stufe ist so ausgelegt, dass eine Zielsequenz amplifiziert
wird, die eine „quasi
Lücke" umfaßt, das
heißt wobei
die „Lücke" eine Region umfaßt, deren
Sequenz im wesentlichen definiert worden ist. Die zweite Stufe ist
so ausgelegt, dass die quasi Lücke
der ersten Stufe amplifiziert wird, wobei besonders bevorzugt Moleküle verwendet
werden, die in Bezug auf die Reaktandenmoleküle der ersten Stufe ein „verschachteltes" Blockierungs-Oligonukleotid und
ein „verschachteltes" Primer-Oligonukleotid
umfassen, die aneinander angrenzend hybridisieren.
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Die NERA Ausführungsform stellt daher ein
Protokoll zur Bestimmung zur Verfügung, ob oder ob nicht eine
unechte Amplifikation stattfand (infolge Verunreinigung, falschen
Hybridisierungsreaktionen oder anderen Gründen). Das NERA Protokoll ist
schematisch in 7 für Doppelstrang-Zielmoleküle und in 8 für Einzelstrang-Zielmoleküle ausgeführt.
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In der ersten Stufe der NERA werden
Blockierungs-, Primer- und End-Run-Oligonukleotide auf dieselbe Weise verwendet,
wie für
ERA „mit
Lücke" beschrieben ist – das heißt, Blockierungs-
und Primer-Oligonukleotide sind so ausgelegt, dass sie einen Lückenabschnitt
flankieren, das Primer-Oligonukleotid ist derart verlängert, dass
es an das Blockierungs-Oligonukleotid angrenzt und die Moleküle werden über eine
Ligase miteinander verknüpft.
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Das Amplifikationsprodukt der ersten
Stufe der Reaktion wird als das Ziel für die zweite Stufe der Reaktion
verwendet. Somit können
in der zweiten Stufe die Blockierungs-, Primer- und End-Run-Oligonukleotide in
Bezug auf ihre Gegenstücke
in der ersten Stufe als „verschachtelt" betrachtet werden.
Die Reaktanden der zweiten Stufe werden zu dem amplifizierten Produkt
aus der ersten Stufe (unter anderem zusammen mit Ligase- und Polymeraseenzymen
und dNTPs) gemischt. Die verschachtelten Blockierungs- und Primer-Oligonukleotide
sind so ausgelegt, dass sie mit dem „aufgefüllten" Teil der Lücke des ursprünglichen
Ziels hybridisieren. Ein solcher Ent wurf löst jedes Problem, das durch
unechte Amplifikation aus der ersten Stufe verursacht worden ist.
Unechte Amplifikation könnte
in der ersten Stufe stattfinden, wenn zum Beispiel die Blockierungs-
und Primer-Oligonukleotide aus der ersten Stufe während der
Reaktion der ersten Stufe an nicht spezifische „Pseudo-Ziel-" Regionen hybridisiert
hätten.
Bei einem solchen Vorfall würde
die aufgefüllte
Lücke nicht
der gewünschten „Ziel-" Lücke entsprechen
und könnte
daher nicht durch die verschachtelten Blockierungs- und Primer-Oligonukleotide
in der zweiten Stufe der Reaktion amplifiziert werden. Die NERA
Ausführungsform
verringert daher die Möglichkeit
einer unechten Amplifikation.
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Die NERA Ausführungsform vereinfacht den
Nachweis der unechten Amplifikation. Falls keine derartige unechte
Amplifikation stattgefunden hat, das heißt, falls die Blockierungs-
und Primer-Oligonukleotide der ersten Stufe an die wahre Zielsequenz
hybridisiert hatten, kann das resultierende amplifizierte Produkt
als eine Zielsequenz für
die verschachtelten Reaktanden der zweiten Stufe dienen und wird
durch diese Reaktion entsprechend amplifiziert.
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In der NERA Ausführungsform werden ebenfalls
die allgemeinen ERA Verfahren verwendet. Die vorstehend diskutierten Überlegungen,
Merkmale und Charakteristika der ERA „mit Lücke" sind genauso auf die erste NERA Stufe
anwendbar, abgesehen davon, dass, wie angemerkt ist, obwohl für NERA eine „Lücke" verwendet wird,
die Sequenz innerhalb der Lücke
ausreichend definiert sein muß,
so dass das verschachtelte Blockierungs-, Primer und End-Run-Oligonukleotid
so erzeugt werden können,
dass sie an den aufgefüllten
Teil des amplifizierten Produkts aus ersten Stufe hybridisieren
können.
-
Da ein bevorzugtes Ziel der ersten
Stufe die Erzeugung von genügend
Ziel für
die zweite Stufe ist, ist in der ersten Stufe Markieren nicht erforderlich – da, wie
offensichtlich ist, der Nachweis oder das Einfangen unter diesen
Parametern als solches nicht notwendig ist. Ein Markieren wird jedoch
für die
zweite Stufe bevorzugt.
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Nach ausreichenden Zyklen in der
ersten Stufe (das heißt
zwischen ungefähr
5–80 Zyklen)
kann die Reaktion vorzugsweise durch Steuerung der Temperatur (das
heißt
Absenken der Temperatur auf ungefähr 4°C) angehalten werden und die
zweite Stu fe beginnt. Das amplifizierte Produkt der ersten Stufe
braucht von den unverbrauchten Reaktanden, die in dem Reaktionsbehälter vorhanden
sein können,
nicht getrennt werden. Das heißt,
dass aufgrund Grads, bis zu dem die exponentielle Amplifikation
verlief, die Zugabe der verschachtelten Einheiten zu dem Reaktionsbehälter nicht
mit derartigen unverbrauchten Reaktanden konkurriert – entsprechend
der Definition, sind die verschachtelten Einheiten so ausgelegt,
dass sie an Regionen längs des
amplifizierten Produkts hybridisieren und somit unter verschärfenden
Bedingungen nicht mit den unverbrauchten Reaktanden hybridisieren.
Die amplifizierten Produkte aus der ersten Stufe können jedoch
von den unverbrauchten Reaktanden zum Beispiel durch Säulenchromatographie,
biospezifische Affinität
(zum Beispiel Biotin-Avidin),
Gelreinigung, usw. getrennt werden.
-
Die zweite NERA Stufe wird entsprechend
den vorstehend diskutierten Erwägungen,
Merkmalen und Charakteristika der ERA „ohne Lücke" ausgeführt. Wie angemerkt wurde, sind
die Amplifikationsprodukte der ersten Stufe vorzugsweise nicht markiert.
Im Gegensatz dazu sind die Amplifikationsprodukte der zweiten Stufe
vorzugsweise markiert und werden auf die vorstehend beschriebene
Weise nachgewiesen.
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4. „LERA" – „Schleifen" ERA
-
Die „Schleifen ERA" oder „LERA" Ausführungsform
der Erfindung unterscheidet sich von den vorher beschriebenen ERA
Ausführungsformen
dadurch, dass in der LERA die Blockierungs- und Primer-Oligonukleotide
vorzugsweise über
eine Oligonukleotidbrücke
aneinander gebunden sind. Insbesondere verbindet die Brücke das
3' Ende des Blockierungs-Oligonukleotids
mit dem 5' Ende
des Primer-Oligonukleotids, so dass das resultierende Molekül als ein
offen kreisförmiges,
oder „Schleifen-" Oligonukleotid beschrieben
werden kann.
-
Das Verbinden des Blockierungs-Oligonukleotids
an das Primer-Oligonukleotid kann durch beliebige Mittel erreicht
werden, die nicht die Hybridisierung der Blockierungs-Oligonukleotid- und
Primer-Oligonukleotidteile der Schleife an eine gewünschte Zielsequenz
unter sehr scharfen Bedingungen stören und die nicht die exponentielle
Amplifikation der Zielsequenz stören.
Das Verbinden wird unter Verwendung einer Sequenz mit „unspezifischen" Nukleotiden (das
heißt
eine Sequenz, die zu einem beliebigen Abschnitt der Zielsequenz nicht
komplementär
sein muß)
ausgeführt;
die Verwendung solcher unspezifischer Nukleotide gestattet vorteilhafterweise
die Synthese der Schleife während
der Herstellung der Oligonukleotide, das heißt ein einzelnes Oligonukleotid
wird hergestellt, das sowohl das Blockierungs-Oligonukleotid als
auch das Primer-Oligonukleotid und eine nicht spezifische Region
umfaßt.
-
Die LERA Ausführungsform ist in 9 erläutert. Besonders bevorzugt
kann die Schleife als ein Einzelstrang synthetisiert werden; wie
in 9A schematisch ausgeführt ist,
sind Blockierungs-Oligonukleotid- und Primer-Oligonukleotidregionen
der Schleife gekennzeichnet, wobei die gestrichelten Linien die
unspezifische Region (vorzugsweise Nukleotide) darstellen. Die Blockierungs-Oligonukleotid-
und Primer-Oligonukleotidregionen
der Schleife sind zu den vorstehend diskutierten Blockierungs- und
Primer-Oligonukleotiden funktional gleichwertig.
-
Da die Blockierungs-Oligonukleotid-
und Primer-Oligonukleotidregionen der Schleife in der Lage sein müssen, so
an ein Ziel zu hybridisieren, dass das 5' Ende der Blockierungs-Oligonukleotidregion
an das 3' Ende der
Primer-Oligonukleotidregion angrenzt oder so, dass zwischen diesen
Regionen eine Lücke
erzeugt wird, muß die
unspezifische Region der Schleife eine Länge aufweisen, die ausreichend
ist, um die Hybridisierung der Blockierungs-Oligonukleotid- und
Primer-Oligonukleotidregionen an die Zielsequenz in einer mit dieser
Forderung übereinstimmenden
Weise zu gestatten. 9B stellt
eine solche Hybridisierung schematisch dar und wie bei der Hybridisierung
der Blockierungs-Oligonukleotid- und Primer-Oligonukleotidregionen
an das Ziel ersichtlich ist, wird eine „Schleife'' gebildet,
die eine Öffnung
umfaßt.
-
Besteht die unspezifische Region
nur aus Nukleotiden (wie besonders bevorzugt ist), ist deren Länge vorzugsweise
größer als
ungefähr
40 Basen, bevorzugter größer als
ungefähr
50 Basen. Bei Verwendung von anderen Linkern, wie zum Beispiel hydrophile,
lineare oder verzweigte organische Moleküle, wie zum Beispiel hydrophile
aliphatische Linker, kann die Zahl an Basen entsprechend abnehmen.
Die funktionale Absicht der unspezifischen Region ist es, eine Verbindung
zur Verfügung
zu stellen, die ausreicht, um (a) die Bindung der Blockierungs-Oligonukleotidregion
an die Primer-Oligonukleotidregion und (b) die Hybridisierung der
Blockierungs- Oligonukleotidregion
und der Primer-Oligonukleotidregion an ihre entsprechenden komplementäre Regionen
auf der Zielsequenz (den Zielsequenzen) zu gestatten.
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Nach Hybridisierung der Schleife
an die Zielsequenzen) findet im Fall eines Einzelstrangziels ein
Verknüpfungsereignis
oder eine Primer-Oligonukleotidverlängerungsreaktion
mit anschließendem
Verknüpfungsereignis
statt (bei geeigneter Anordnung von Ziel und der definierten Sequenzen
der Blockierungs-Oligonukleotid-
und Primer-Oligonukleotidregionen der Schleife). Danach trennt sich
die vervollständigte
Schleife vom Ziel. Anschließend
ist das End-Run-Oligonukleotid, das in Übereinstimmung mit den allgemeinen
Merkmalen der ERA besonders bevorzugt zu einem Segment der Blockierungs-Oligonukleotidregion
komplementär
ist, in der Lage, an die vervollständigte Schleife zu hybridisieren,
und wird längs
der Schleife in einer Polymerase vermittelten templatabhängigen Verlängerungsreaktion
verlängert. 9C stellt eine schematische
Darstellung der Hybridisierung des End-Run-Oligonukleotids an die vervollständigte Schleife
und der Verlängerung des
End-Run-Oligonukleotids
zur Verfügung.
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Bezeichnenderweise kann das Vorhandensein
von Ligaseenzym innerhalb des Reaktionsbehälters ein Verknüpfungsereignis
zwischen dem 5' Ende
des End-Run-Oligonukleotids
und dem 3' Ende
von dessen Verlängerungsprodukt
katalysieren und dadurch ein kovalent geschlossenes kreisförmiges Doppelstrangmolekül erzeugen.
Da die Trennung der Stränge
eines solchen Moleküls
schwierig sein kann, kann die Bildung eines derartigen Moleküls die exponentielle
Amplifikation des Zielmoleküls
beeinträchtigen.
Damit diese Möglichkeit
vermieden wird, wird der Einbau einer Verknüpfungs-Blockierungsgruppe am
5' Ende des End-Run-Oligonukleotids
bevorzugt. Falls eine derartige Gruppe vorhanden ist, dann wird
unter Denaturierungsbedingungen das verlängerte End-Run-Oligonukleotid
als ein Templat dienen, das zu den Blockierungs-Oligonukleotid- und
Primer-Oligonukleotidregionen der Schleife komplementäre Regionen
umfaßt,
wodurch die exponentielle Amplifikation erleichtert wird. 9D stellt schematisch die
Trennung des End-Run-Verlängerungsprodukts von
der vervollständigten
Schleife dar.
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LERA kann ebenfalls verwendet werden,
wenn das Ziel ein Doppelstrangmolekül ist. Weiterhin findet eine
Verlängerung
des End-Run-Oligonukleotids längs
des Ziel strangs statt, da das End-Run-Oligonukleotid ebenfalls mit
einem Abschnitt eines der Zielstränge hybridisieren kann.
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In manchen LERA Unterausführungsformen
ist die nicht spezifische Brückenregion
der Schleife so modifiziert, dass sie Regionen einschließt, die
gewünschte
Merkmale besitzen. Zum Beispiel kann die Brücke eine oder mehrere Restriktionsstellen
enthalten, so dass das Klonieren oder Sequenzieren des amplifizierten Moleküls erleichtert
ist. Bezeichnenderweise kann eine derartige Restriktionsstelle anstatt
des Zugebens der Blockierungsgruppe verwendet werden, die erwünschterweise
zum 5' Ende des
Blockierungs-Oligonukleotids als ein alternatives Mittel zur Absicherung
gegen die Bildung kovalent geschlossener kreisförmiger Doppelstrangmoleküle zugegeben
wird. Die Brückenregion
kann ebenfalls modifizierte Basen enthalten, insbesondere Desoxyuridin
oder Ribonukleotide, so dass das resultierende Molekül dem Abbau,
durch zum Beispiel RNAse H, UDG und Endonuklease IV unterzogen werden
kann, so dass jede Verknüpfung
der 3' und 5' Enden des End-Run-Verlängerungsprodukts
die geschlossene Schleife „öffnen" wird, wodurch sich
ein Templat für
die weitere Amplifikation bildet. Vorteilhafterweise kann wärmebeständige RNAse
H verwendet werden. Siehe Itaya et al., Nuc. Acids Res. 19: 4443–4449 (1991),
auf dessen Offenbarungsgehalt hier vollumfänglich Bezug genommen wird.
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Die unpezifische Brückenregion
kann ebenfalls so ausgelegt werden, dass sie eine Vielfalt verschiedener
funktioneller Parameter enthält.
Zum Beispiel können
in die Region Hybridisierungseinfangregionen eingebaut werden, um
die Rückgewinnung
des amplifizierten Produkts zu erleichtern.
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Bezeichnenderweise kann die Brückenregion
den Ursprung der Replikationssequenzen enthalten, so dass das Amplifikationsprodukt
nach Transformation in einen geeigneten Wirt klonal repliziert werden
kann. In einer solchen Unterausführungsform
ist die Blockierung des 5' Endes
des Blockierungs-Oligonukleotids nicht notwendig. Die Brückenregion
kann ebenfalls Gensequenzen enthalten, besonders Gensequenzen, die
auswählbare
Markierungen kodieren.
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In noch einer anderen Unterausführungsform
kann die Brückensequenz
Promotor- oder Proto-Promotorsequenzen
enthalten (das heißt,
eine Sequenz, deren Komple ment ein Promotor ist), so dass nach Verlängerung
des End-Run-Oligonukleotids eine zur Transkription aktive Stelle
erzeugt wird, die zum Transkribieren der Zielsequenzen in der Lage
ist. Bevorzugte derartige Stellen umfassen die T7 und SP6 RNA-Polymerasebindungsstellen,
die die Transkription (in Gegenwart von zum Beispiel RNA-Polymerase
und Ribonukleotidtriphosphaten) gestatten. In dieser Unterausführungsform
ist keine Blockierungsgruppe erforderlich, da der Zusammenschluß des End-Run-Verlängerungsprodukts
nicht von Bedeutung ist.
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Vorteilhafterweise wird ein Strang,
der über
RNA-Polymerase vermittelte Transkription gebildet wurde, von der
Schleife verdrängt,
ohne dass zum Beispiel Wärmedenaturierung
benötigt
wird. Somit werden durch die Zugabe von RNA-Polymerase und Ribonukleotidtriphosphaten
vielfache Kopien eines Templats von nur einer einzigen geschlossenen
Schleife erzeugt. Dies führt
sogar zu einer größeren exponentiellen
Amplifikation (das heißt
Amplifikation mit einem höheren
Exponenten). Weiterhin können
die Zyklusreaktionen bei isothermen Temperaturen durchgeführt werden,
das heißt
bei ungefähr
37°C, weil
die durch die RNA-Polymerase vermittelten amplifizierten Stränge verdrängt werden,
ohne dass Denaturierung benötigt
wird. Wie klar ist, gestattet dies die Verwendung nicht wärmebeständiger Ligase
und Polymerase und vermeidet den Bedarf von Temperaturwechseln.
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Bei der Verwendung der RNA-Polymerase
vermittelten LERA wird bevorzugt, dass das Verhältnis von RNA-Polymerase zu
Ligase und/oder DNA-Polymerase mindestens ungefähr 5 : 1 oder mehr beträgt. Weiterhin
beträgt
das Verhältnis
der gesamten Rinonukleotidtriphosphate zu den gesamten Desoxyribonukleotidtriphosphaten
vorzugsweise mindestens ungefähr
5 : 1 oder mehr.
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Die Brückenregion kann ebenfalls eine
ortsspezifische Rekombinationsstelle, wie zum Beispiel att oder
loxP Stellen (Weisberg, R. et al., In: Lambda II, (Hendrix, R. et
al., Herausgeber), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor,
NY, Seiten 211– 250
(1983); Hoess, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A) 79: 3398–3402 (1982);
Sauer, B. L., U.S. Patent Nr. 4,959,317, auf deren Offenbarungsgehalt
hier vollumfänglich Bezug
genommen wird)) enthalten, um die Klonierung oder Multiplexsequenzierung
des Ziels zu erleichtern (PCT Patentanmeldung WO92/22650).
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Die LERA Ausführungsform kann auf dieselbe
Weise wie die ERA „mit
Lücke" oder die ERA „ohne Lücke" verwendet werden
und kann somit sowohl zu Identifizierung genetischer Mutationen
sowie auch zur Amplifizierung von Nukleinsäuremolekülen mit teilweise unbekannten
Sequenzen verwendet werden. Bezeichnenderweise wird die LERA Ausführungsform
jedoch besonders in Amplifikationsverfahren bevorzugt, die eine eventuelle
Klonierung des amplifizierten Zielmoleküls erfordern.
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5. „Zwillingsverknüpfungs" ERA
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Die „Zwillingsverknüpfungs" ERA ist eine ERA
Ausführungsform,
die insbesondere so angepasst ist, dass sie den Nachweis mehrfach
verbundener Mutationen in einem Zielmolekül gestattet.
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Das Verfahren unterscheidet sich
von anderen ERA Verfahren dadurch, daß es ein zusätzliches
Blockierungs-Oligonukleotid verwendet. Dieses zweite Blockierungs-Oligonukleotid ist
so gelegen und ausgerichtet, dass es die Verlängerung des End-Run-Oligonukleotids
an einer speziellen Stelle blockiert. So wie die Verknüpfung des
Primer-Oligonukleotids und des Blockierungs-Oligonukleotids zur
Amplifikation in ERA notwendig sind, so ist zusätzlich die Verknüpfung des
5' Endes des zweiten
Blockierungs-Oligonukleotids mit dem 3' Ende des End-Run-Verlängerungsprodukts
in der „Zwillingsverknüpfungs" ERA erforderlich.
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Da die Verknüpfungsreaktionen zur Herstellung
eines Amplifikationsprodukts auf jedem Strang stattfinden müssen, kann
das Verfahren zur Identifikation der Nukleotide verwendet werden,
die an zwei Positionen in der Zielsequenz vorhanden sind. Die Amplifikation
ist daher von der Fähigkeit
des 5' endständigen Nukleotids
von jedem Blockierungs-Oligonukleotid zur Hybridisierung an das
Ziel abhängig.
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In dieser Ausführungsform wird besonders bevorzugt,
das Blockierungs-Oligonukleotid
des End-Run-Oligonukleotids so auszulegen, dass es zur Hybridisierung
an eine Sequenz innerhalb oder in der Nähe der Primer-Oligonukleotid-Hybridisierungsstelle
in der Lage ist.
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Das Vorhandensein von stumpfen Doppelstrang-Oligonukleotiden
kann den Gehalt an unechter Verknüpfung stumpfer Enden erhöhen. Bei
der Ausübung
dieser Ausführungsform
ist daher die Verwendung von Blockierungsgruppen und Überhängen erwünscht.
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Wie klar ist, kann die Ausführungsform
so gegliedert werden, dass entweder für einen oder beiden Stränge das
Primer-Oligonukleotid oder das End-Run-Oligonukleotid und deren entsprechenden
Blockierungen aneinandergrenzen oder an das Ziel unter Bildung einer „Lücke" hybridisieren. Ähnlich kann
entweder einer der beiden oder beide Sätze von Primern und Blockierungen
unter Bildung einer „Schleifen" ERA Reaktion aneinander
gebunden werden. Ähnlich
kann die „Zwillingsverknüpfungs" Ausführungsform
mit jeder anderen ERA Ausführungsform
kombiniert werden.
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6. „Inverse" ERA
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Die meisten Nukleinsäureamplifikationsverfahren
vermitteln die Amplifikation einer Gensequenz nur dann, wenn die
flankierende Sequenzinformation bestimmt worden ist. In vielen Fällen stellt
die Erfordernis für die
Sequenzinformation von zwei Regionen eines Zielmoleküls ein unüberwindliches
Hindernis für
die Amplifikation dar. Die „inverse" ERA ist eine Variation
der ERA, die in solchen Umständen
mit Doppelstrang-DNA verwendet werden kann, um die exponentielle
Amplifikation der Zielsequenz zu erreichen. Die „inverse" ERA ist daher analog zur „inversen" PCR (U.S. Patent
4,994,370).
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Bei der Ausübung der „inversen" ERA ist somit eine vorherige Sequenzinformation
nur für
eine Region des Zielmoleküls
vorhanden. Die vorhandene Sequenzinformation wird vorzugsweise zur
Bestimmung der Identität
von mindestens einer Restriktionsendonuklease überprüft, die nicht zur Spaltung
innerhalb des sequenzierten Bereichs des Ziels in der Lage ist.
Sobald ein derartiges geeignetes Enzym identifiziert worden ist, wird
es zum Spalten des Zielmoleküls
angewandt. Alle dadurch erzeugten Fragmente werden Enden enthalten,
die entweder stumpf oder kohäsiv
sind. Bezeichnenderweise können
die Enden von jedem Fragment unter Bildung kovalent geschlossener
kreisförmiger
Doppelstrangmoleküle
miteinander verknüpft
werden.
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Eine derartige Verknüpfung ist
der nächste
Schritt in dem „inversen" ERA Protokoll. Besonders
bevorzugt werden die resultierenden kovalent geschlossenen kreisförmigen Doppelstrangmoleküle so eingeschnitten
sein, dass die Strangverdrängung
erleichtert ist. Besonders bevorzugt wird die Strangverdrängung so
ausgeführt,
dass kovalent geschlossene Einzelstrangmoleküle erhalten werden.
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Der sequenzierte Bereich des Ziels
wird zur Definition der Sequenz des Primer-, Blockierungs- und End-Run-Oligonukleotids
verwendet. In der „inversen" ERA hybridisiert
das Blockierungs-Oligonukleotid an einer bezüglich der Primer-Oligonukleotidhybridisierungsstelle
5' befindlichen
Stelle. Daher sind in Bezug auf die vorhergehenden Ausführungsformen
die entsprechenden Positionen der Blockierungs- und Primer-Oligonukleotide
umgekehrt.
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In der „inversen" ERA sind die Primer- und Blockierungs-Oligonukleotide
so ausgelegt, dass das 3' Ende
des hybridisierten Blockierungs-Oligonukleotids an das 5' Ende des Primer-Oligonukleotids
angrenzt. Bei einer solchen Ausrichtung führt die Polymerase vermittelte
templatabhängige
Verlängerung
des Primer-Oligonukleotids zu einem Verlängerungsprodukt, das das kreisförmige Zielmolekül einkreist.
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Das End-Run-Oligonukleotid ist so
ausgelegt, dass es zur Hybridisierung an das Blockierungs-Oligonukleotid
in der Lage ist. Wie in der ERA Reaktionen wird daher eine exponentielle
Amplifikation des Ziels erreicht.
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Die „inverse" ERA weist daher die Fähigkeit
zur Amplifikation von Molekülen
auf, in denen nur eine Region sequenziert worden ist. Bezeichnenderweise
ist durch das Verlegen der 5' endständigen Base
des Blockierungs-Oligonukleotids an eine polymorphe Stelle, es möglich, die „inverse" ERA zur Bestimmung
zu verwenden, ob ein Individuum ein „normales" oder „mutiertes" Allel von einem speziellen Gen aufweist.
Somit kann die „inverse" ERA auf dieselbe
Weise wie die ERA „ohne
Lücke" zur Diagnose einer
genetischen Krankheit verwendet werden.
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7. „Blinde" ERA
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„Blinde" ERA ist eine Variation der ERA „mit Lücke" und ist besonders
für Forschungs-
und medizinische Anwendungen geeignet. „Blinde" ERA verwendet die Sequenz der Primer-
und Blockierungs-Oligonukleotide, um das Vorhandensein einer „hypothetischen" Zielsequenz in einer
Probe zu untersuchen. Sie wird auf dieselbe Weise wie die ERA „mit Lücke" durchgeführt, abgesehen
davon, dass in der „blinden" ERA die Reaktanden
zur Definition der „gewünschten" Zielsequenz verwendet
werden, wohingegen in anderen ERA Ausführungsformen die Zielsequenz
zur Definition der Sequenzen der Primer-, Blockierungs- und End-Run-Oligonukleotide
verwendet wird Wie klar ist, kann das Verfahren zur selektiven Amplifizierung
von Zielmolekülen
verwendet werden, die einen beliebigen Satz von Merkmalen besitzen.
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Ist zum Beispiel das Primer-Oligonukleotid
in der Lage, an eine gewünschte
DNA-Bindungsstelle
zu binden (wie zum Beispiel eine hormonale Rezeptorbindungsstelle,
eine Promotorstelle, usw.) und wird das Blockierungs-Oligonukleotid
so ausgewählt,
dass es in der Lage ist, an eine Restriktionsendonuklease-Erkennungsstelle
oder an eine Kombination solcher Stellen zu binden, so ist daher
das Verfahren der Erfindung in der Lage, alle Sequenzen zu amplifizieren,
die den Kriterien genügen,
eine Bindungsstelle und eine Restriktionsstelle zu besitzen.
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8. „Festphasen" ERA
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Die vorstehend diskutierten ERA Reaktionen
können
in Lösung
ausgeführt
werden. Alternativ dazu kann die Reaktion jedoch in einer festen
Phase unter Verwendung eines Zielmoleküls durchgeführt werden, das auf einem festen
Träger
immobilisiert worden ist. Alternativ dazu kann das 5' Ende des Primer-Oligonukleotids
oder das 3' Ende
des Blockierungs-Oligonukleotids immobilisiert werden.
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Verfahren zur Immobilisierung von
Nukleinsäuren
werden zum Beispiel von Ruth, J. L. (U.P. Patent 4.948,882), Gilham
et al. (J. Amer. Chem. Soc., 86: 4982 (1964)), Nickerson et al.
(Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 87: 8923–8927 (1990) und Kremsky et
al. (Nucleic Acids Research 15: 3131–3139 (1987)) diskutiert.
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Das Trägermaterial, auf das das Zielmolekül oder ein
Reaktand gebunden werden kann, kann einen beliebigen festen Träger (zum
Beispiel Glas, Polystyrol, Polypropy len, Polyethylen, Dextran, Nylon,
Amylasen, natürliche
und modifizierte Zellulosen, Polyacrylamide, Agarosen und Magnetit)
umfassen. Die Beschaffenheit des Trägers kann so sein, dass er
für die
Zwecke der vorliegenden Erfindung bis zu einem gewissen Ausmaß entweder
löslich
oder unlöslich
ist. Das Trägermaterial
kann praktisch jede mögliche
strukturelle Konfiguration aufweisen. Die Trägerkonfiguration kann somit
kugelförmig,
wie bei einer Perle, oder zylindrisch, wie die innere Oberfläche eines
Teströhrchens
oder die äußere Oberfläche eines
Stabes sein. Alternativ dazu kann die Oberfläche flach wie ein Blatt, Teststreifen,
usw. sein.
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9. „ERA Sequenzierung"
-
Die ERA Reaktionen sind zur Verwendung
für die
Bestimmung der Sequenz von Zielmolekülen besonders geeignet. Insbesondere
erleichtert die Erfindung die Verwendung von sowohl dem „Didesoxy
vermittelten Kettenabbruchverfahren", das ebenfalls als „Sanger Verfahren" der DNA-Sequenzierung
bekannt ist (Sanger, F., et al., J. Mol. Biol. 94: 441 (1975)),
als auch dem „Maxam-Gilbert
chemischen Abbauverfahren" (Maxam,
A. M., et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 74: 560 (1977)),
auf deren Offenbarungsgehalte hier vollumfänglich Bezug genommen wird.
-
A. Anwendung auf die Didesoxy-Sequenzierung
-
In dem Didesoxy vermittelten oder „Sanger" Kettenabbruchverfahren
der DNA-Sequenzierung,
wird die Sequenz eines DNA-Moleküls
durch die Verlängerung
eines Oligonukleotidprimers erhalten, der an das zu sequenzierende
Nukleinsäuremolekül hybridisiert
ist (das heißt,
das „Ziel"). In den einfachsten
Ausführungsformen
werden vier einzelne Primerverlängerungsreaktionen
durchgeführt.
Jede Reaktion wird in Gegenwart von DNA-Polymerase, dNTPs und einem
2',3' Didesoxyderivat
von A, T, C oder G Nukleotidtriphosphat durchgeführt. Der Einbau eines Didesoxynukleotids
führt zur
Beendigung der Verlängerungsreaktion.
Da die Didesoxyderivate in geringeren Konzentrationen vorhanden
sind, als ihre entsprechenden üblichen
Nukleotidtriphosphatanaloga, ist das Endergebnis von jeder der vier
Reaktionen, die Erzeugung eines Satzes verschachtelter Oligonukleotide,
von denen jedes durch das in der Reaktion verwendete spezielle Didesoxyderivat
beendet ist. Indem die Reaktionsprodukte von jeder der Verlängerungsreaktionen
der Elektrophorese unterzogen werden, ist es möglich eine Reihe von vier „Leitern" zu erhalten, die
leicht in die Sequenz des verlängerten Primers
translatiert werden können.
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Kürzlich
wurden verbesserte Verfahren der Didesoxy-Sequenzierung entwickelt,
die die Geschwindigkeit der Datengewinnung stark erhöhen. Durch
die Verwendung verschieden markierter Didesoxynukleotide wurde insbesondere
vermieden, dass die Durchführung
der vorstehend beschriebenen einzelnen Sequenzierungsreaktionen
erforderlich ist. Durch die Verwendung fluoreszierend markierter
Didesoxynukleotidderivate ist es möglich, das Verfahren zu Ableitung
der Nukleotidsequenzierung des Ziels vollständig zu automatisieren. Solche
Fortschritte in der Sequenzierungstechnologie sind zum Beispiel
von Prober, J. M. et al., Science 238: 336–340 (1987) beschrieben, auf
dessen Offenbarungsgehalt hier vollumfänglich Bezug genommen wird).
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Die vorliegende Erfindung vereinfacht
Didesoxy-Sequenzierungsverfahren, indem die Verfahren, die zum Trennen
der Stränge
der Amplifikationsprodukte befolgt werden, vereinfacht werden. In
einer Ausführungsform
wird dies durch Denaturierung des Doppelstrang-Amplifikationsprodukts
und durch anschließendes in
Kontakt bringen der Mischung der Einzelstrangmoleküle mit einer
immobilisierten Sonde erreicht, die in der Lage ist, spezifisch
an einen der Stränge
zu binden.
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Eine wesentliche Verbesserung in
der Didesoxy DNA-Sequenzierungstechnologie wurde kürzlich entwickelt
und mit „Multiplex
DNA-Sequenzierung" bezeichnet
(Church, G. M., et al., Science 240: 185–188 (1988); Church, G. M.
et al., U.S. Patent 4,942,124; auf deren Offenbarungsgehalte hier
vollumfänglich
Bezug genommen wird). Die Multiplex DNA-Sequenzierung verwendet
DNA-Bibliotheken, die in verschiedenen Vektoren einzeln so aufgebaut
werden, dass die zu bestimmende Sequenz von zwei verschiedenen vorher
definierten Oligonukleotid- „Markierungen" flankiert wird.
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Der Pool der Reaktionsprodukte wird
dann auf ein Sequenzierungsgel aufgetragen und die Oligonukleotide
in der DNA-Probe werden unter Verwendung von Gelelektrophorese getrennt.
Die somit erhaltenen DNA-Muster werden dann von den Ge len auf Nylonmembranen
elektrisch übertragen
und mit den Membranen unter Verwendung von UV-Licht vernetzt.
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Da jede Spur des Gels die Reaktionsprodukte
der Sequenzierung von vielen verschiedenen DNA-Molekülen enthält, enthält jede
Spur vielfach überlagerte
Leitern der Sequenzinformation. Jede einzelne Leiter kann jedoch
getrennt durch Hybridisierung einer markierten Sonde für eine spezielle
Markierung an die DNA sichtbar gemacht werden, die an die Membran
gebunden ist. Durch wiederholtes Testen der Membran mit verschiedenen
Sonden, kann die Sequenz jedes Zielmoleküls bestimmt werden.
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Die vorliegende Erfindung kann zur
Vereinfachung Anwendung der Multiplexsequenzierung verwendet werden.
In dieser Hinsicht können
die Primer- und Blockierungs-Oligonukleotide
(oder deren Komplemente) als „Markierungen" wirken, um die zu
verwendenden Multiplexanalyseverfahren zu gestatten.
-
B. Anwendung auf die Maxam-Gilbert
Sequenzierung
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Das Maxam-Gilbert Verfahren der DNA-Squenzierung
ist ein abbauendes Verfahren. In diesem Verfahren wird ein DNA-Fragment
an einem Ende markiert und in vier einzelnen chemischen Reaktionen
teilweise gespalten, von denen jede für das Spalten des DNA-Moleküls an einer
speziellen Base (G oder C) bei einem speziellen Basentyp (A/G, C/T
oder A > C) spezifisch
ist. Wie in dem vorstehend beschriebenen Didesoxy-Verfahren bewirken
solche Reaktionen die Erzeugung eines Satzes verschachtelter Moleküle, deren
Längen durch
die Stellen einer speziellen Base längs der Länge des zu sequenzierenden
DNA-Moleküls
bestimmt werden. Die verschachtelten Reaktionsprodukte werden dann
durch Elektrophorese zerlegt und die Sequenz wird abgeleitet.
-
10. Verwendung der „ERA" in amplifizierbaren
Nachweissystemen
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Die hier beschriebenen ERA Reaktionen
sind gut zur Verwendung in amplifizierbaren Nachweissystemen zum
Nachweis von praktisch allem geeignet, an das eine DNA oder RNA
chemisch oder physikalisch gebunden werden kann. ERA kann zur Be stimmung
des Vorhandenseins oder der Abwesenheit der DNA oder RNA verwendet
werden. In einer Ausführungsform
wird ERA in Techniken verwendet, die den Nachweis von Antigenen
in diagnostischen oder gerichtsmedizinischen Anwendungen betreffen.
In dieser Ausführungsform der
vorliegenden Erfindung wird ein bispezifisches Linkermolekül zur Bindung
eines DNA-Zielmoleküls
an einen Antigen-Antikörperkomplex
verwendet. Wurde das Zielmolekül
so angepasst, dass es biotinylierte Nukleotide enthält, kann
somit der DNA-Bindungsteil des Linker zum Beispiel Avidin, Streptavidin
oder ein Biotin-bindendes Protein umfassen. Der Antigen-Antikörperbindungsteil
des Linkers kann einen Antikörper
(der entweder mit dem Antigen oder mit dem Antikörper des Komplexes reaktiv
ist) oder ein Bindungsprotein umfassen. Solche Antikörper können polyklonal,
monoklonal oder synthetisch (das heißt aus rekombinanten oder synthetischen
Verfahren resultierend) sein. Antikörperfragmente (wie zum Beispiel
Fab- oder F(ab)2-Fragmente, usw.) können alternativ
dazu verwendet werden.
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In dieser Ausführungsform erleichtert die
Erfindung den Nachweis des Antigen-Antikörperkomplexes. Dies wird durch
Inkubieren des Antigen-Antikörperkomplexes
in Gegenwart der Ziel-DNA und des Linkermoleküls erreicht. Eine dieser molekularen
Spezies wird vorzugsweise so auf einen festen Träger immobilisiert, wie zum
Beispiel eine Mikrotiterplatte, ein Pegelstab, eine Membran, Papier
usw., dass die Trennung der nicht gebundenen Ziel-DNA von gebundener
Ziel-DNA vereinfacht ist.
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Die Verfahren der vorliegenden Erfindung
werden dann zur Amplifikation eines beliebigen Zielmoleküls angewandt,
das an den Antigen-Antikörperkomplex
gebunden oder damit assoziiert worden ist. Der Nachweis eines beliebigen
amplifizierten Zielmoleküls
zeigt somit das Vorhandensein des Antigen-Antikörperkomplexes an. Die Verwendung
von PCR zum Nachweis von Antigen-Antikörperkomplexen wurde von Sano
et al. (Science 258: 120–122
(1992), auf dessen Offenbarungsgehalt hier vollumfänglich Bezug
genommen wird) berichtet.
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Die vorliegende Erfindung umfaßt Herstellungsgegenstände, wie
zum Beispiel „Kits". Derartige Kits werden
typischerweise speziell so angepasst, dass sie Reagenzien (einschließlich Oligonukleotide),
Enzyme, Puffer, usw. zur Amplifikation von wenigstens einer Zielsequenz
enthalten, die wenigstens eine Region mit einer definierten Nukleinsäuresequenz
umfaßt.
Ein bevorzugtes Kit umfaßt
wenigstens einen Behälter,
der wenigstens ein Blockierungs-Oligonukleotid, wenigstens ein Primer-Oligonukleotid und
wenigstens ein End-Run-Oligonukleotid enthält. Diese Moleküle werden
einen oder mehrere Sätze
von Blockierungs-, Primer- und End-Run-Oligonukleotiden umfassen, wobei das
Blockierings-Oligonukleotid eines Satzes von Oligonukleotiden zur
Hybridisierung an einen Teil (das heißt eine Region oder Oligonukleotid-Untersatz)
einer Zielnukleinsäuresequenz
in der Lage ist, das Primer-Oligonukleotid
dieses Satzes zur Hybridisierung an einen unterschiedlichen Teil
derselben Zielnukleinsäuresequenz
in der Lage ist und das End-Run-Oligonukleotid dieses Satzes eine
Sequenz umfaßt,
die zu wenigstens einem Teil des Blockierungs-Oligonukleotids des Satzes komplementär ist.
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In einer Ausführungsform umfaßt das Kit
für jedes
oder einige der Reagenzien, Enzyme oder Puffer getrennte Behälter. Vorzugsweise
werden einige oder die gesamten Oligonukleotide des Kits zusammengemischt.
Tatsächlich
können
die gesamten Blockierungs-, Primer- und End-Run-Oligonukleotide
innerhalb eines einzigen Behälters
vorhanden sein.
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Ein besonders bevorzugtes Kit, das
Reagenzien zur Amplifikation von wenigstens einer Zielsequenz umfaßt, die
wenigstens eine Region umfaßt,
die eine definierte Nukleinsäuresequenz
aufweist, würde
ein Kit sein, das wenigstens einen Behälter umfaßt, wobei der Behälter wenigstens
eine Blockierungseinheit, wenigstens eine Primereinheit und wenigstens
eine End-Run-Einheit umfaßt
und wobei die Blockierungseinheit zur Hybridisierung an einen Teil
der Nukleinsäuresequenz
in der Lage ist, die Primereinheit zur Hybridisierung an einen unterschiedlichen
Teil der Nukleinsäuresequenz
in der Lage ist und die End-Run-Einheit eine Sequenz umfaßt, die
zu wenigstens einem Teil der Blockierungseinheit komplementär ist.
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Die Puffer, die optional in dem Kit
enthalten sein können,
können
so eingestellt werden, dass sie eine spezielle Reaktion (wie zum
Beispiel eine Verknüpfung
oder Polymerisation) auf Kosten anderer Reaktionen optimieren. Alternativ
dazu können
die Puffer so ausgelegt werden, dass sie einen Satz enzymatischer
Reaktionen (wie zum Beispiel eine Verknüpfung oder Polymerisation)
optimieren. Solche Puffer können
in konzentrierter Form vorliegen, so daß nach Verdünnung eine gewünschte Pufferka pazität erhalten
wird. In einem bevorzugten Kit enthalten die Behälter, die die Oligonukleotide
enthalten, ebenfalls Puffer. In einer alternativen Ausführungsform
können
die Behälter
derartige Oligonukleotide in einer gefriergetrockneten Form enthalten, die
mit Wasser oder einem geeigneten Puffer wiederhergestellt werden
können.
In einer Unterausführungsform
können
solche Behälter
ebenfalls Salze oder gefriergetrocknete Puffer enthalten, so dass
nach Wiederherstellung mit Wasser eine gepufferte Lösung erhalten
wird.
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Das Kit kann weiterhin Polymerase-
und/oder Ligaseenzyme, Gebrauchsanweisungen und dergleichen enthalten.
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In einer weiteren Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung werden Kits zur Verfügung gestellt, die wenigstens
einen geeigneten Puffer und optional Zusatzstoffe zur Optimierung
der Verlängerungs-,
Hybridisierungs- und Verknüpfungsreaktionen
der vorliegenden Erfindung umfassen. Solche Kits stellen alle oder
Teile von geeigneten Puffern, Enzymen und Zusatzstoffen zur Verfügung, damit
der Fachmann zur Ausübung
der hier beschriebenen ERA Verfahren in der Lage ist, und sie sind
besonders für
den Fachmann geeignet, der Blockierungs-, Primer- und End-Run-Oligonukleotide synthetisiert
oder anderweitig erhält.
Pufferkits können einen
einzigen geeigneten Puffer, wie zum Beispiel Trishydranrmethylaminomethansalzsäure in konzentrierter, gefriergetrockneter
oder verdünnter
Form umfassen. Kits können
optional Puffer und Zusatzstoffe, wie zum Beispiel Enzyme, Kaliumchlorid,
Magnesiumchlorid, Nikotinamidadenindinukleotid, Rinderserumalbumin
und nicht-ionisches Detergenz umfassen.
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Nach der jetzigen allgemein beschriebenen
Erfindung, wird die Erfindung leichter durch Bezugnahme auf die
folgenden zur Erläuterung
bereitgestellten Beispiele verständlich,
die keine Einschränkung
der vorliegenden Erfindung beabsichtigen, es sei denn, es ist angegeben.
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BEISPIEL I
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Zur Erläuterung der ERA wurde ein „Zielmolekül", und Primer-, Blockierungs-
und End-Run-Oligonukleotide hergestellt. Eine schematische Ausrichtung
der Blockie rungs-, Primer- und End-Run-Oligonukleotideinheiten,
gegenüber
dem Ziel ist in 10 dargestellt.
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Die Synthese der Oligonukleotideinheiten
(Blockierungs-, Primer-, End-Run-Oligonukleotid)
und des Einzelstrang-Ziels wurde auf einem Pharmacia LKB (Upsal-la, Sweden) Gen Assembler® plus
DNA-Synthesevorrichtung unter Verwendung von Beckman Instruments,
Inc. (Fullerton, CA) Phosphoramiditen (Produktnummern A:338231,
C:338232; G:338233; T:338234) durchgeführt. Für die Synthese, Entschützung und
Spaltung wurden die Anweisungen des Herstellers befolgt. dNTPs wurden
von einem Geneamp® PCR Reagenzkit (Perkin
Elmer, Kat.-Nr. N801-055) erhalten. Wie in den gesamten anschließenden Verfahren
waren die Chemikalien mindestens von ACS Qualität.
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Die Sequenzen wurden folgendermaßen erzeugt:
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Blockienings-Oligonukleotid
(SEQ ID Nr. 2)
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- CCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGddG
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Das 3' Ende des Blockierungs-Oliognukleotids
wurde durch Addition von ddGTP blockiert; daher war das Blockierungs-Oligonukleotid
während
der ERA Reaktion ein 24-mer.
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Primer (SEQ ID Nr. 3)
-
-
End-Run-Oligonukleotid
(SEQ ID Nr. 4)
-
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Die Primer- und End-Run-Oligonukleotide
wurden unter Verwendung von T4-Polynukleotidkinase
und y32P ATP (Amersham) entsprechend dem
in Sambrook J. et al. (in: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)) beschriebenen
Protokoll markiert. Die Reaktionsbedingung wurde modifiziert, wobei
die Markierungsreaktion bei 37°C
während
1 Stunde, mit anschließender
Zugabe von 0,5 Mm „kaltem" ATP (das heißt nicht
radioaktiv) durchgeführt
wurde, um sicherzustellen, dass alle mit Kinase behandelten" Enden, die kein
radioaktives PO4 eingebaut hatten, das kalte
PO4 einbauten. Das Blockierungs-Oligonukleotid
umfasste ein „kaltes" 5'-PO4 Ende.
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Die verschiedenen Komponenten wurden
zu Anfang in einem Reaktionsbehälter
auf Eis (4°C)
gemischt, um Hybridisierung und enzymatische Aktivität zu verhindern.
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Anfangs wurden 5 μl des 10 × Reaktionspuffers in einen
500 μl Behälter gegeben,
gefolgt von der Zugabe von 1 μl
Zielsequenz (dies sorgte für
eine Endkonzentration von 50 nM in einer Gesamtlösung von 20 μl). Danach
wurde jedes der vier dNTPs zugegeben, um für jedes dATP, dTTP, sCTP und
dGTP in einer Gesamtlösung
von 20 μl
eine Endkonzentration von 200 μM
zu erreichen. Zu dieser Mischung wurden die markierten Oligonukleotideinheiten
zugegeben, so dass eine Endkonzentration von 200 nM für das Blockierungs-Oligonukleotid,
200 nM für
das Primer-Oligonukleotid
und 150 nM für
das End-Run-Oligonukleotid in einer Gesamtlösung von 20 μl erreicht
wurde. Darauf folgte die Zugabe von 1 Einheit AMPLIGASETM wärmestabiler
DNA-Ligase (Epicentre Technologies, Madison, WI. Kat.-Nr A00101,
5000 Einheiten; wie definiert wurde, „katalysiert eine Einheit
die Verknüpfung
von 50 der cos Stellen in einem Mikrogramm Bakteriophagen lambda
DNA in 1 Minute bei 45°C
in einer Standard 50 μl
Reaktion". Das Enzym
weist eine angegebene Halbwertszeit von 48 Stunden bei 65°C und von
1 Stunde bei 95°C
auf) mit anschließender
Zugabe von 1 Einheit Amplitaq® DNA-Polymerase (Perkin
Elmer, Norwalk, Ct., Kat.-Nr. N801-0060). Anschließend wurde
ausreichend zweifach entionisiertes Wasser zugegeben, um ein Endvolumen
von 20 μl
zu erreichen. Die Konzentrationen der Verbindungen in einem 10x
Pufferkonzentrat in einem Endvolumen von 1,0 ml (angepasst mit zweifach
destilliertem Wasser) waren folgende: 100 mM Trishydroxymethylaminomethansalzsäure („Tris-HCl"), pH-Wert 7,8; 500
mM Kaliumchlorid, 150 mM Magnesiumchlorid, 25 mM Nad+ und
0,01% (w/v) Gelatine (Sigma, St. Louis, MO., Kat.-Nr. G2500).
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Nach dem Zusammenmischen der Komponenten
wurde der Reaktionsbehälter
auf 95°C
während
5 Min. auf einem Perkin Elmer Temperaturwechsler 480TM entsprechend
den Anweisungen des Herstellers erwärmt. Darauf wurden 20 Zyklen
durchgeführt,
wobei jeder Zyklus die folgenden Parameter aufwies: 95°C – 1 Min.,
75°C – 4 Min.,
45°C – 4 Min.
Nach 20 Zyklen wurden 3 μl
Harnstoff „Stopp-" Farbstoff (50 Harnstoff,
1% Xylolcyanol, 1% Bromphenolblau, 2x TBE) zugegeben, um Aliquoten
von 10 μl
abzusondern, die von jedem Reaktionsbehälter erhalten wurden, und die
Reaktionsbehälter
wurden dann bei 4°C
bis zur Analyse gehalten.
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Die Reaktionsbehälter wurden während 10
Min gekocht, gefolgt von dem Aufbringen auf ein Elektrophoreseplattengel
(15% Acrylamidgel, 19 : 1 Acrylamid : Bis-acrylamid in 7 M Harnstoff
und 1 × TBE).
Die Elektrophorese wurde unter Verwendung von 250 V (50 mA) während 2
Stunden durchgeführt.
Danach wurde die der Elektrophorese unterzogenen Aliquoten einem
Kodak X-OMATTM AR-Röntgenfilm (Eastman Kodak, Rochester,
N. Y. Kat.-Nr. 165-1512) während
90 Min ausgesetzt.
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11 stellt
eine photographische Wiedergabe der Elektrophoreseergebnisse der
Aliquoten zur Verfügung,
die von dem vorstehenden Experiment erhalten wurden. Wie aus den
belichteten dunklen Banden von Spur 3 in 11 offensichtlich ist, führte das
ERA Protokoll zu der Amplifikation der Zielsequenz und es wurde daher
festgestellt, dass es eine einzigartige und durchführbare Methode
zur Amplifikation einer Zielsequenz zur Verfügung stellte. Signifikanterweise
wurden in Spur 3 zwei Banden gefunden, wobei eine aus der Amplifikation
eines sogenannten „Verlängerungsprodukts" und eine aus der
Amplifikation eines sogenannten „Verknüpfungsprpdukts" resultierte. Solche
Banden sind voneinander unterscheidbar, weil das End-Run-Oligonukleotid „kürzer" als das Blockierungs-Oligonukleotid
ist und somit das End-Run-Verlängerungsprodukt
zu amplifizierten Produkten führt,
die „kürzer" als die amplifizierten
Produkte sind, die aus der Verknüpfung
der Blockierungs- und
Primer-Oligonukleotide folgen.
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Zur weiteren Bewertung der Leistungsfähigkeit
des ERA Protokolls wurden gemeinsam mit der vorstehenden ERA Reaktion
mehrere Kontrollexperimente durchgeführt.
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Die erste Kontrolle verwendete die
vorstehend beschriebenen Ziel, Primer-Oligonukleotid- und End-Run-Oligonukleotidreaktanden,
sie wurde jedoch in Abwesenheit des Blockierungs-Oligonukleotids durchgeführt. Daher
misst die Reaktion, mit welchem Ausmaß die Verknüpfung des Blockierungs-Oligonukleotids
und des Primer-Oligonukleotidverlängerungsprodukts das Amplifikationsprotokoll
beeinflusst.
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Als Kontrolle wurde das vorstehende
Verfahren in Abwesenheit des Blockierungs-Oligonukleotids durchgeführt. Unter
solchen Bedingungen findet die Amplifikation vielmehr über PCR
als ERA statt. Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Spur 1
von 11 gezeigt. Wie
für die
PCR charakteristisch ist, haben die Stränge der Amplifikationsprodukte
gleiche Größe. Die
Tatsache, dass eine PCR-Amplifikation stattfand, zeigte, dass die
ERA Amplifikation durch ein unterschiedliches Verfahren vermittelt
wurde und nicht durch einen Scheineingriff durch die PCR.
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Diese Ergebnisse weisen deshalb darauf
hin, dass die durch ERA vermittelte Amplifikation (in Gegenwart
von Primer-, Blockierungs- und End-Run-Oligonukleotiden) keine PCR
ist.
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Als weitere Kontrolle wurde das vorstehend
beschriebene ERA Verfahren in Abwesenheit von Ligase durchgeführt. Der
Zweck dieser Kontrolle war zu zeigen, dass die Amplifikation nicht
von einer PCR resultiert, die durch die Verdrängung des Blockierungs-Oligonukleotids
stattfindet. Spur 4 von 11 stellt
die Ergebnisse dieses Experiments zur Verfügung. Die Ergebnisse bestätigen die
Erwartung, dass wie erwartet in Abwesenheit von Ligase die Blockierungs-
und Primer-Oligonukleotide nicht in der Lage sind, kovalent aneinander zu
binden und es fand keine Amplifikation der Zielsequenz statt. Denn
ohne das Verknüpfungsereignis
(und aufgrund der Verwendung eine Einzelstrangziels) wird kein Templat
amplifiziert, das in der Lage ist, die Verlängerung des End-Run-Oligonukleotids
zu unterstützen.
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Als weitere Kontrolle wurde das ERA
Protokoll in Abwesenheit des End-Run-Oligonukleotids durchgeführt. Diese
Kontrolle untersucht, ob das End-Run-Oligonukleotid benötigt wird, um die exponentielle
Amplifikation des Ziels zu erhalten. Spur 2 von 11 zeigt, dass bei abwesendem End-Run-Oligonukleotid
nur eine lineare Amplifikation der Zielsequenz erhalten wird. Insbesondere
wird nur ein Strang (der Primer-Oligonukleotid – Blockierungs-Oligonukleotidstrang)
amplifiziert. Diese Kontrolle zeigt, dass in Abwesenheit des End-Run-Oligonukleotids
ein linearer „Oligonukleotid-Verknüpfungsassay" erhalten wird.
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Spur 5 von 11 stellt die Ergebnisse einer weiteren
Kontrolle zur Verfügung,
bei der die ERA Reaktion in Abwesenheit von DNA-Polymerase durchgeführt wird.
Wie offensichtlich ist, fand nur eine lineare Amplifikation statt.
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Die Spuren 2 und 5 von 11 beweisen weiterhin,
dass das ERA Protokoll nicht zu einer exponentiellen Amplifikation
führt,
es sei denn die gesamten Einheiten werden verwendet. Spur 2, die
ein OLA Protokoll zur Verfügung
stellte, offenbart eine lineare Amplifikation der Zielsequenz (basierend
auf zum Beispiel der relativen Größe und Dichte der autographischen
Bande), wie zu erwarten ist. OLA führt nicht zu einer exponentiellen
Amplifikation, bei der nur zwei „Primer" und ein Ligaseenzym verwendet werden.
Auch wenn das End-Run-Oligonukleotid in Abwesenheit einer Polymerase
zu dem Reaktionsbehälter
gegeben wird (Spur 5) ist jedoch die resultierende Bande im wesentlichen
zu derjenigen von Spur 2 identisch.
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Beispiel II
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Zu weiteren Bewertung der ERA Leistungsfähigkeit
zur Amplifikation eines Zielmoleküls wurde eine weitere Reihe
von Experimenten unter Verwendung der Ziel-, Primen, Blockierungs-
und End-Run-Oligonukleotide entsprechend der Beschreibung in Beispiel
I durchgeführt.
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In dieser Reihe von Experimenten
wurde die Zielkonzentration um das eintausendfache oder Einmillionfache
bezüglich
der in Beispiel I verwendeten erniedrigt. In Beispiel 1 betrug die
Zielkonzentration ungefähr 10–9 M
(das heißt
1012 Moleküle pro Probe). In Beispiel
II wurden Zielkonzentrationen von ungefähr 10–12 M
(das heißt
109 Moleküle pro Probe) und 10–15 M
(106 Moleküle pro Probe) verwendet. Diese
Konzentrationen wurden so ausgewählt,
dass sie innerhalb des zum Nachweisen eines einzelnen Gens innerhalb
einer menschlichen Probe notwendigen Bereichs lagen.
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Für
Beispiel II wurden Ziel-, Primer- und End-Run-Oligonukleotide wie
in Beispiel I synthetisiert. Das Blockierungs-Oligonukleotid wurde
unter Verwendung einer Biosearch 8750TM Oligonukleotidsynthesevorrichtung
(Milligen Biosearch, Sam Rafael, CA) zur Erzeugung eines wie in
Beispiel I definierten Blockierungs-Oligonukleotids synthetisiert,
das jedoch an dessen 3' Ende
ein Biotinmolekül
enthielt. Für
die Blockierungs-Oligonukleotidsynthese wurde eine 3' Biotin-ON CPG Säule (Clontech
Labs, Inc., Palo Alto, CA. Kat.-Nr. 5225-1) verwendet.
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ERA wurde wie in Beispiel I durchgeführt, das
Polymeraseenzym war jedoch Amplitaq® DNA-Polymerase,
Stoffel Fragment (Exonuklease defiziente Version) (Perkin Elmer
Kat.-Nr. N808-0038). Die Konzentrationen der Komponenten in einem
10x Reaktionspufferkonzentrat in einem Endvolumen von 1,0 ml (angepasst mit
zweifach destilliertem Wasser) waren die folgenden: 200 mM TRIS-HCl,
pH-Wert 7,8; 200 mM Kaliumchlorid; 25 mM Ammoniumchlorid; 20 mM
Magnesiumchlorid; 50 mM Dithiothreitol; 500 μM NAD+;
500 μg/ml
Rinderserumablumin und 1% Triton X-100TM (Sigma,
Kat.-Nr. T6878).
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Die End-Run- und Primer-Oligonukleotide
wurden wie in Beispiel I markiert und das Blockierungs-Oligonukleotid
wurde entsprechend der Ausführung
für die
End-Run- und Primer-Oligonukleotide
in Beispiel I markiert (das heißt,
in das Blockierungs-Oligonukleotid
wurde eine radioaktive Markierung eingebaut).
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Die verschiedenen Komponenten wurden
zu Anfang in einem Reaktionsbehälter
auf Eis (4°C)
zusammen gemischt, um Hybridisierung und unspezifische Hybridisierung
im wesentlichen zu vermeiden.
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Zu Anfang wurden 5 μl des 10x
Reaktionspuffers in einen 500 μl
Behälter
gegeben, gefolgt von der Zugabe von 1 μl einer 1,0 nM Stammlösung der
Zielsequenz (Endkonzentration der Zielsequenz in 50 μl Gesamtlösung: 20
pikomolar) oder 1 μl
einer 1,0 pM Stammlösung
der Zielsequenz (Endzielsequenzkonzentration in 50 μl Gesamtlösung: 20
Femtomolar). Danach wurde jedes der vier dNTPs zugegeben, um für jedes dATP,
dCTP und dGTP eine Endkonzentration von 200 μM in 50 μl Gesamtlösung zu erreichen. Zu dieser
Mischung wurden die markierten Oligonukleotideinheiten gegeben,
so dass eine Endkonzentration von 120 nM für das Blockie rungs-Oligonukleotid,
40 nM für
das Primer-Oligonukleotid und 40 nM für das End-Run-Oligonukleotid (3 : 1 : 1 für Blockierungs-:
Primer-: End-Run-Oligonukleotid) in 50 μl Gesamtlösung erreicht wurde. Danach
wurden 10 Einheiten des vorstehend erwähnten Ligaseenzyms und anschließend ausreichend
zweifach entionisiertes Wasser zugegeben, damit ein Volumen von
49 μl erreicht
wurde.
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Nach der Mischung der Komponenten
wurde der Reaktionsbehälter
auf 95°C
während
5 Min. auf dem vorstehend erwähnten
Temperaturwechsler erwärmt,
um eine vollständige
Denaturierung der Ziel- und Oligonukleotideinheiten zu erreichen.
Danach wurden 2 Einheiten (1 μl)
des vorstehend erwähnten
Polymeraseenzyms zu dem Reaktionsbehälter gegeben. Darauf wurden
40 Zyklen durchgeführt,
wobei jeder Zyklus die folgenden Parameter aufwies: 95°C – 1 Min.,
70°C – 4 Min.,
40°C – 4 Min.
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Nach 40 Zyklen wurden 3 μl „Stopp-" Farbstoff (entsprechend
der Beschreibung in Beispiel I) zugegeben, um Aliquoten von 10 μl abzusondern,
die von jedem der Reaktionsbehälter
der Abschnitte II.G-I erhalten wurden. Danach wurden die Aliquoten
während
10 Min. gekocht und anschließend
auf ein Elektrophoreseplattengel aufgebracht. Die Elektrophorese
wurde durchgeführt
und die Belichtung wurde wie in Beispiel 1 erhalten.
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12A und 12B zeigen die Fähigkeit
von ERA zum Nachweis eines Zielmoleküls, auch wenn es mit einer
Konzentration von 10–12 M beziehungsweise
10–15 M
vorhanden ist. Spur 5 der 12A und 12B zeigt, dass die End-Run
Amplifikation der Zielsequenz erhalten wurde. Von besonderer Bedeutung
ist, dass 12B beweist,
dass der Nachweis und die Amplifikation einer Zielsequenz, die in
einer Konzentration, ähnlich
zu der interessierenden Gens vorhanden ist, unter Verwendung des
offenbarten ERA Protokolls erreicht werden kann.
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Verschiedene Kontrollen wurden durchgeführt, um
sicherzustellen, dass die beobachtete Amplifikation auf die ERA
Reaktionen zurückzuführen ist.
Insbesondere wurden die Reaktionen in Abwesenheit von Ligase durchgeführt, um
zu bestimmen, ob eine PCR Amplifikation stattgefunden hat. Spur
4 der 12A und 12B zeigt die Ergebnisse
der „Ligase
freien" ERA Kontrollreaktionen
und zeigt, dass in Abwe senheit einer Verknüpfung die Blockierungs- und
Primer-Oligonukleotide nicht in der Lage sind, kovalent aneinander
zu binden und es fand keine Amplifikation der Zielsequenz statt.
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Wie mit Beispiel I wird die Amplifikation
der Zielsequenz unter Verwendung eines PCR Protokolls aus den Ergebnissen
von Spur 3 der 12A und B offensichtlich; weil wiederum die gesamten
Bedingungen für jedes
Protokoll im wesentlichen identisch sind, weisen die Ergebnisse
von Spur 3 darauf hin, dass die verwendeten Parameter nicht in die
PCR Amplifikation der Zielsequenz eingriffen.
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In Übereinstimmung mit den in Beispiel
I gezeigten Ergebnissen ist ebenfalls, dass in Abwesenheit von Polymerase
(Spur 6, 12A und 12B) nur eine lineare Amplifikation
(von einem Strang) beobachtet wurde.
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Spur M stellt die aus End-Run-Oligonukleotid,
Primer-Oligonukleotid und Ziel resultierende Belichtung zur Verfügung. Spur
1 zeigt die Position des Primer-Oligonukleotids.
Die Position des Blockierungs-Oligonukleotids ist in Spur 2 gezeigt.
-
Beispiel III
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Das folgende ist eine Erläuterung
einer bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung, in der ein ERA Reaktionssystem ein End-Run-Oligonukleotid
einbaut, das so ausgelegt ist, dass es sich auf funktionelle Merkmale
bestimmter wärmestabiler
DNA-Polymerasen richtet. Insbesondere ist von wärmestabilen DNA-Polymerasen
ohne ausgeübte
Exonukleaseaktivität
bekannt, dass sie während
der Verlängerung
eine nicht Templat gesteuerte Addition einer extra Base an stumpfe
3' Enden von Doppelstrangmolekülen verursachen.
In mehr als 90% der Verlängerungsprodukte,
die diese nicht Templat gesteuerte Addition zeigen, ist die Addition
diejenige von dATP. Findet diese nicht Templat gesteuerte Addition
in ERA Reaktionssystemen statt, kann es eine fehlende Übereinstimmung
am 3' Ende zwischen
dem End-Run-Oligonukleotid
und dem Verknüpfungsprodukts
geben. Da die fehlende A : G Übereinstimmung
durch DNA-Polymerase kaum verlängert wird,
ist die Gesamtwirkung eine Verringerung in der Leistungsfähigkeit
der ERA Reaktion.
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In der nachfolgenden Beschreiung
werden ERA Reaktionen unter Verwendung von End-Run-Oligonukleotiden
ausgeführt,
die einen „Überhang" von 1 oder 2 Basen
aufweisen, die sich jenseits des 5' Endes des Blockierungs-Oligonukleotids
erstrecken. Hybridisiert dieses End-Run-Oligonukleotid mit einem
Blockierungs-Oligonukleotid,
so weist das resultierende teilweise doppelsträngige Molekül einen 3' Ende Überhang auf. Im Fall von ERA
Systemen ohne Lücke
ist der Überhang
zu dem 3' Ende des
Primer-Oligonukleotids komplementär. Wie nachstehend gezeigt
ist, eliminiert dieses eine nicht Templat gesteuerte Addition der
dNTPs durch DNA-Polymerase.
-
Doppelstrang-Zieloligonukleotid,
Primer-Oligonukleotid, Blockierungs-Oligonukleotid und End-Run-Oligonukleotide
wurden auf einer Pharmacia LKB Genmontagevorrichtung zuzüglich einer DNA-Synthesevorrichtung
synthetisiert, die von Pharmacia, Upsalla, Schweden erhältlich ist.
In der Synthese wurden Phosphoramidite (Produkt Nummern A:338231,
C:338232, G:338233, T:338234 von Beckman Instruments, Inc. Fullerton,
CA) verwendet. Die dNTPs wurden von einem ultrareinen dNTP Satz
mit 100 mM Stammlösungen
von 2'Desoxynukleoside-5'-triphosphat in Wasser
bei einem pH-Wert von 7,5, das von Pharmacia Kat.-Nr. 27-2035 zur
Verfügung
gestellt wurde, erhalten. Synthese, Enschützung und Spaltung wurde entsprechend
den Anweisungen des Herstellers ausgeführt. Alle verwendeten Chemikalien
waren wenigstens von ACS Qualität.
Das Ziel-Oligonukleotid, Primer-Oligonukleotid, Blockierungs-Oligonukleotid und End-Run-Oligonukleotid
waren die folgenden:
-
-
-
Primer-Oliponukleotid
(SEQ ID Nr. 3)
-
-
Blockierungs-Oligonukleotid
(SEQ ID Nr. 7)
-
- PO4-CCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGG-Biotin
-
End-Run-Oligonukleotid
(„stumpf") (SEQ ID Nr. 4)
-
-
End-Run („+1") (SEQ ID Nr. 8)
-
-
End-Run („+2") (SEQ ID Nr. 9)
-
-
Das Primer-Oliognukleotid und die
End-Run-Oligonukleotide wurden unter Verwendung von T4-Polynukleotidkinase
und [y32P]ATP, bezogen von Amersham, und
entsprechend dem in Sambrook J. Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
NY (1989) beschriebenen Protokoll markiert. Das Blockierungs-Oligonukleotid
umfasste ein „kaltes" 5'-PO4 Ende,
das während
der Synthese unter Verwendung von 5'-Phosphat-ON, bezogen von Clontech aus
Palo Alto, CA (Kat.-Nr. 5210-3) eingebaut wurde.
-
Drei getrennte Amplifikationsreaktionen
wurden durchgeführt.
Die erste verwendete das End-Run-Oligonukleotid SEQ ID Nr. 4 und
die zweite und dritte Reaktion verwendete das End-Run-Oligonukleotid
SEQ ID Nr. 8 beziehungsweise SEQ ID Nr. 9. Für jede Reaktion wurden 2,5 μl des vorstehend
beschriebenen 10x Reaktionspuffers, gefolgt von 1 μl der Zieloligonukleotide
(SEQ ID Nr. 5 und SEQ ID Nr. 6) in einen 200 μl Behälter gegeben. Dies führte zu
einer Endkonzentration von 40 pM in einer Gesamtlösung von
25 μl. Zu
dieser Mischung wurden das markierte Primer-Oligonukleotid und das End-Run-Oligonukleotid
gegeben, was zu einer Endkonzentration von 40 nM von Primer- und
End-Run-Oligonukleotiden führte.
Das Blockierungs-Oligonukleotid wurde mit einer Endkonzentration
von 800 nM zugegeben. Die vier dNTPs wurden mit einer Endkonzentration
von je 200 μM
für dATP,
dGTP, dCTP und dTTP zugegeben. Anschließend wurden 2 μg menschliche Plazenta-DNA
zur Erhöhung
der Komplexität
der Reaktionsmischung zugegeben. Danach wurden 40 Einheiten Taq
DNA-Ligase und 2,5 Einheiten Ampli-Taq DNA-Polymerase, Stoffel Fragment
(Perkin Elmer, Kat.-Nr. N808-0038) zu dem Reaktionsbehälter gegeben.
-
Nach der Beimischung der Komponenten
wurde der Reaktionsbehälter
auf 95°C
während
5 Minuten in einem Perkin Elmer 9600 Temperatunivechsler erwärmt. Anschließend wurde
die Reaktion durch Zugabe von 2,5 μl einer 10x Magnesiumchloridlösung bis
zu einer Endkonzentration von 15 mM eingeleitet. Die Reaktion wurde
mit 40 Zyklen durchgeführt,
wobei jeder Zyklus die folgenden Parameter aufwies: 95 °C während 30
Sek.; 55°C
während
30 Sek. Nach 40 Zyklen wurden 10 μl
Aliquoten der Reaktion mit einem gleichen Volumen des „Stopp-Farbstoffs" gemischt, der 50
Harnstoff, 1% Xylolcyanol, 1% Bromphenolblau und 0,2x TBE enthielt.
Die Proben wurden 10 Minuten gekocht und dann auf ein Elektrophoreseplattengel
aufgebracht. Das Gel wurde aus 15% Polyacrylamid, 19 : 1 Acrylamid
: Bisacrylamid in 7 M Harnstoff und 1x TBE hergestellt. Die Elektrophorese
wurde unter Verwendung von 250 Volt (50 mA) während 2 Stunden ausgeführt. Dann
wurden die Elektrophoreseplatten einen Kodak X-OMAT AR-Röntgenfilm
während
90 Minuten belichtet. Der Röntgenfilm
wurde von Eastman Kodak in Rochester, N. Y. bezogen und unter der
Kat.-Nr. 165-1512 angeboten.
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Die aus dem Verknüpfungsteil der Reaktionen und
aus dem Verlängerungsteil
der Reaktionen resultierenden einzelnen Reaktionsprodukte wurden
aus den belichteten Elektrophoresegelen geschnitten und unter Verwendung
von Szintillationszählverfahren
quantitativ bestimmt. Wie in 13 erläutert ist,
werden die Verknüpfungs-
und Verlängerungsamplifikationssignale
durch Verwendung eines End-Run-Oligonukleotids,
in dem das 3' Ende
einen 1 oder 2 Basen Überhang
enthält,
signifikant erhöht.
Die relative Bildung von Verknüpfungs-
gegenüber
Verlängerungsprodukten
basiert auf der Menge an Ligase gegenüber Polymerase, die in der Reaktionsmischung
zur Verfügung
gestellt wird. Schätzungen
der relativen Reaktionsleistungsfähigkeit weisen darauf hin,
dass DNA-Polymerase leistungsfähiger
als DNA-Ligase ist,
wobei 90% der Primerverlängerungsversuche
vollständig
ablaufen und 40 % aller Bruchverknüpfungsversuche erfolgreich
sind.
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Die Daten zeigen, dass die Exonuklease
defiziente Ampli-Taq DNA-Polymerase, Stoffel Fragment das teilweise
doppelsträngige
Molekül
des End-Run- Oligonukleotids
nicht erkennt, das einen 3' Überhang
aufweist und an ein Blockierungs-Oligonukleotid/Primer-Oligonukleotid-Verlängerungsprodukt
als Substrat für
die nicht Templat gesteuerte dATP Addition annealed ist. Das End-Run-Oligonukleotid ist
daher während
des Verlaufs der Amplifikationsreaktion nicht einschränkend. Weiterhin
wird die Möglichkeit
zur Primer-Dimer-Bildung durch das Vorhandensein von Blockierungs-Oligonukleotid
und des Aufrechterhaltens einer hohen Bodentemperatur (55°C) für die ERA
Reaktion eliminiert.
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Beispiel IV
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Zum Aufzeigen der Fähigkeit
des Verfahrens der vorliegenden Erfindung zur Unterscheidung einer Veränderung
einer einzelnen Base in einem Zieloligonukleotid (Bestimmung des
Vorhandenseins oder der Abwesenheit einer einzelnen Base in einem
Zieloligonukleotid) wurden zwei Doppelstrang-Zieloligonukleotide hergestellt,
wobei sich die beiden Doppelstrang-Zieloligonukleotide um ein einzelnes
Basenpaar voneinander unterschieden. Entsprechend wurden Primer-Oligonukleotide,
Blockierungs-Oligonukletide und End-Run-Oligonukleotide für jede Reaktion
hergestellt.
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Alle Oligonukleotide wurden auf einer
Pharmacia LKB Genmontagevorrichtung zuzüglich einer DNA-Synthesevorrichtung,
erhältlich
von Pharmacia in Upsalla, Schweden, synthetisiert. In der Synthese
wurden Phosphoramidite (Produktnummern A:338231, C:338232, G:338233,
T:338234), bezogen von Beckman Instruments, Inc. in Fullerton, CA
verwendet. Die dNTPs wurden von einem ultrareinen dNTP Satz mit
100 mM Stammlösungen
von 2'-Desoxynukleosid-5'-triphosphat in Wasser
bei einem pH-Wert von 7,5, das von Pharmacia Kat.-Nr. 27-2035 zur
Verfügung
gestellt wurde, erhalten. Synthese, Entschützung und Spaltung wurde entsprechend
den Anweisungen des Herstellers ausgeführt. Alle verwendeten Chemikalien
waren wenigstens von ACS Qualität.
Die synthetisierten Ziel-Oligonukleotide, Primer-Oligonukleotide,
Blockierungs-Oligonukleotid und End-Run-Oligonukleotide waren die
folgenden:
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Wildtyp
Ziel (SEQ ID Nr. 5)
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Wildtyp
Ziel (SEQ ID Nr. 6)
-
Mutantenziel
(SEQ ID Nr. 10)
-
Mutantenziel
(SEQ ID Nr. 11)
-
Wildtyp Primer (SEQ ID
Nr. 3)
-
-
Mutantenprimer (SEQ ID
Nr. 12)
-
-
Blockierungs-Oligonukleotid
(SEQ ID Nr. 7)
-
- PO4-CCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGG-Biotin
-
Wildtyp End-Run (SEQ ID
Nr. 8)
-
-
Mutanten-End-Run (SEQ
ID Nr. 13)
-
-
Das Primer-Oliognukleotid und die
End-Run-Oligonukleotide wurden unter Verwendung von T4-Polynukleotidkinase
und [y32P] ATP, bezogen von Amersham, und
entsprechend dem in Sambrook J. Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
NY (1989) beschriebenen Protokoll markiert. Das Blockierungs-Oligonukleotid
umfasste ein „kaltes" 5'-PO4 Ende,
das während der
Synthese unter Verwendung von 5'-Phosphat-ON,
bezogen von Clontech aus Palo Alto, CA (Kat.-Nr. 5210-3), eingebaut
wurde.
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Zwei Sätze von Reaktionen wurden ausgeführt. Eine
Reaktion verwendete die Wildtyp Zieloligonukleotide, Wildtyp Primer-Oligonukleotide
und Wildtyp End-Run-Oligonukleotide
und die zweite verwendete die mutierten Zieloligonukleotide, mutiertes
Primer-Oligonukleotid und mutiertes End-Run-Oligonukleotid. Für jede Reaktion
wurden 2,5 μl
des vorstehend beschriebenen 10x Reaktionspuffers in einen 200 μl Behälter gegeben, der
auf 4°C
gehalten wurde, um Hybridisierung zwischen Reaktanden und enzymatische
Aktivität
zu minimieren. Anschließend
wurde 1 μl
Zieloligonukleotid, markiertes Primer-Oligonukleotid, markiertes
End-Run-Oligonukleotid und Blockierungs-Oligonukleotid zu der Mischung
bei 4°C
gegeben. Zur Erhöhung
der Komplexität der
Reaktionsmischung wurde ebenfalls 1 μg menschliche Plazenta-DNA zugegeben. Danach
wurden 20 Einheiten Taq DNA-Ligase, bezogen von New England Biolabs,
Beverly, MA, Kat.-Nr. 208 zu dem kalten Reaktionsbehälter gegeben.
(Eine Einheit Taq DNA-Ligase katalysiert die Verknüpfung von
50% der 12-bp kohäsiven Enden
von einem Mikrogramm BstEII verdauter Bakteriophagen lambda DNA
in einem Gesamtreaktionsvolumen von 50 μl in 15 Minuten bei 45°C.) Anschließend wurden
5 Einheiten Deep Vent (exo-)DNA-Polymerase von New England Biolabs
(Kat,-Nr. 259) in den Reaktionsbehälter gegeben. Es wurde ausreichend
zweifach entionisiertes Wasser zugegeben, um ein Endvolumen von
25 μl zu
erhalten. Die Endkonzentration der Zielsequenz betrug 40 pM, während die
Endkonzentration des Primer-Oligonukleotids und End-Run-Oligonukleotids
jeweils 200 nM betrugen. Das Blockierungs-Oligonukleotid war in
einer Konzentration von 800 nM vorhanden. Das in diesem Beispiel
verwendete 10x Reaktionspufferkonzentrat, das auf ein Volumen von
1,0 ml angepasst wurde, wies die folgenden Komponentenkonzentrationen
auf: 200 mM Trishydroxymethylaminomethansalzsäure (Tris-HCl), pH-Wert 7,8;
100 mM Kaliumchlorid; 100 mM Ammoniumsulfat; 20 mM Magnesiumsulfat;
2 mM NAD+; 1% Triton X-100.
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Die Temperatur des Reaktionsbehälters wurde
von 4°C
auf 95°C
erhöht
und während
5 Minuten auf einem Perkin Elmer Temperaturwechsler 9600 entsprechend
den Anweisungen des Herstellers beibehalten. Zur Einleitung der
Reaktion wurden die vier dNTPs von einer 10x Stammlösung mit
je einer Endkonzentration von 200 μM für dATP, dGTP, dCTP und dTTP
zugegeben. Anschließend
wurden 40 Zyklen durchgeführt,
wobei jeder Zyklus 95°C
während
30 Sekunden und 55°C
während
30 Sekunden umfasste. Nach 20 Zyklen und nach 40 Zyklen wurden 10 μl Aliquoten
der Reaktion mit einem gleichen Volumen des in Beispiel III verwendeten „Stopp-Farbstoffs" verwendet. Die Proben
wurden 10 Minuten gekocht und dann auf ein Elektrophoreseplattengel
aufgebracht und durch Gelelektrophorese entsprechend der Beschreibung
in Beispiel III zerlegt.
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Die aus dem Verknüpfungsteil der Reaktionen und
aus dem Verlängerungsteil
der Reaktionen resultierenden einzelnen Reaktionsprodukte wurden
aus den belichteten Elektrophoresegelen geschnitten und unter Verwendung
von Szintillationszählverfahren
quantitativ bestimmt. Die in 14 und 15 erläuterten Balkendiagramme zeigen
die relativen Mengen, mit denen die Wildtyp Oligonukleotide und
die mutierten Oligonukleotide in das Wildtyp Ziel und das mutierte
Ziel in 20 Zyklen beziehungsweise in 40 Zyklen eingebaut wurden.
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14 und 15 zeigen deutlich, dass
für jeden
Zielsatz mit jedem Oligonukleotidsatz eine ausgezeichnete Unterscheidung
erhalten wird. Am Ende einer ERA Reaktion mit 20 Zyklen wird ein
durchschnittlich höherer
Einbau von mehr als das 50 fache mit dem richtigen Satz von Oligonukleotiden
erhalten und nach 40 Zyklen wird für den richtigen Satz von Oligonukleotiden
ein um das 3 bis 5 fache erhöhter
Einbau beobachtet. Die Kombination aus Wildtyp Primer-Oligonukleotid,
Wildtyp End-Run-Oligonukleotid
und Blockierungs-Oligonukelotid amplifiziert somit die Wildtyp Ziel-DNA-Sequenz in einer
ERA Reaktion. Entsprechend amplifizieren das mutierte Primer-Oligonukleotid,
das mutierte End-Run-Oligonukleotid und das Blockierungs-Oligonukleotid die
mutierte Zielsequenz.
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Beispiel V
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Zur weiteren Bewertung der Fähigkeit
des Amplifikationsverfahren der vorliegenden Erfindung zum Amplifizieren
von Ziel-Oligonukleotidsequenzen bei signifikant kleinen Konzentrationen,
wurde die Amplifikation von Ziel-Oligonukleotiden unter Verwendung
von Ziel-Oligonukleotidsequenzen im Bereich von 10–11 M
(108 Moleküle pro Probe) bis 10–17 M
(102 Moleküle pro Probe) durchgeführt. Diese
Konzentrationen wurden ausgewählt,
damit sie innerhalb des zum Nachweis eines einzelnen Gens innerhalb
einer menschlichen Probe notwendigen Bereichs liegen.
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Die in diesen Experimenten verwendete
Ziel-Oligonukleotidsequenz, das Primer-Oligonukleotid, Blockierungs-Oligonukleotid
und End-Run-Oligonukleotid waren SEQ ID Nr. 5, 6, 7 beziehungsweise
B. Die Oligonukleotide wurden entsprechend der Beschreibung in BEISPIEL
III hergestellt.
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Das Primer-Oliognukleotid und das
End-Run-Oligonukleotid wurden unter Verwendung von T4-Polynukleotidkinase
und [y32P] ATP, bezogen von Amersham, und
entsprechend dem in Sambrook J. Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
NY (1989) beschriebenen Protokoll markiert. Das Blockierungs-Oligonukleotid
umfasste ein „kaltes" 5'-PO4 Ende,
das während der
Synthese unter Verwendung von 5'-Phosphat-ON,
bezogen von Clontech aus Palo Alto, CA (Kat.-Nr. 5210-3), eingebaut
wurde.
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Jede dieser Reaktionen wurde wie
in Beispiel III durchgeführt.
Die Konzentrationen der Komponenten in dem 10x Reaktionspufferkonzentrat,
das auf ein Endvolumen von 1,0 ml verdünnt wurde, waren die folgenden:
200 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,8; 200 mM Kaliumchlorid; 50 mM Ammoniumchlorid;
50 mM Dithiothreitol; 500 μM
NAD+; 500 μg/ml Rinderserumalbumin und
1% Triton X-100.
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Für
jede untersuchte ERA Reaktion wurden 2,5 μl des 10x Reaktionspuffers in
einen 200 μl
Behälter gegeben,
anschließend
wurde die geeignete Menge an Ziel-Oligonukleotid zugegeben. Der Reaktionsbehälter wurde
auf 4°C
gehalten. Anschließend
wurde das markierte Primer-Oligonukleotid und das markierte End-Run-Oligonukleotid unter
Bildung einer Endreaktionskonzentration von je 40 nM zugegeben und
das Blockierungs-Oligonukleotid wurde mit einer Endkonzentration
von 600 nM zugegeben. Danach wurde 2 μg menschliche Plazenta-DNA zusammen
mit den vier dNTPs zugegeben, von denen jedes eine Konzentration von
200 μM aufwies.
Schließlich
wurden 30 Einheiten Taq DNA-Ligase und 2,5 Einheiten Stoffel DNA-Polymerase zugegeben.
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Der Reaktionsbehälter wurde in dem Perkin Elmer
Temperaturwechsler auf 95°C
während
5 Minuten erwärmt,
um eine vollständige
Denaturierung zu erreichen. Anschließend wurde die ERA Reaktion
durch Zugabe von 2,5 μl
der 10x Magnesium chlorid Stammlösung
eingeleitet. Man ließ die
Reaktion während
40 Zyklen verlaufen, wie in Beispiel III beschrieben ist.
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Die graphischen Darstellungen der
Zielkonzentration gegen Zählungen
(CPM) des eingebauten Oligonukleotids und gegen die Amplifikationsmenge
sind für
die Verlängerungsreaktion
beziehungsweise die Verknüpfungsreaktion
in 16 und 17 gezeigt. Diese graphischen
Darstellungen zeigen deutlich die Fähigkeit von ERA Amplifikationsreaktionen
zur Verlängerung
und Verknüpfung
von Zielnukleinsäuren
bei äußerst kleinen
Konzentrationen.
-
Obwohl die Erfindung in Zusammenhang
mit deren spezifischen Ausführungsformen
beschrieben ist, ist sie derart zu verstehen, dass sie weiter modifiziert
werden kann und diese Anwendung beabsichtigt beliebige Variationen,
Verwendungen oder Anpassungen der Erfindung zu umfassen, wobei im
allgemeinen die Prinzipien der Erfindung befolgt werden und solche
Abweichungen von der vorliegenden Offenbarung umfaßt werden,
die in der bekannten oder üblichen
Praxis innerhalb des Fachgebiets, zu dem die Erfindung gehört, auftreten
und die auf die hier vorstehend ausgeführten wesentlichen Merkmale
angewandt werden können
und die dem Umfang der beigefügten
Ansprüche
entsprechen.
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