DE69026449T2

DE69026449T2 - Verfahren zur Diagnose und zur Amplifikation, das das Problem einer Fehlpaarung zwischen Primer und Zielsequenz am 3'-Ende des Primers überwindet

Info

Publication number: DE69026449T2
Application number: DE69026449T
Authority: DE
Inventors: Lynn Bergmeyer; John Bruce Findlay
Original assignee: Johnson and Johnson Clinical Diagnostics Inc
Current assignee: Ortho Clinical Diagnostics Inc
Priority date: 1989-09-12
Filing date: 1990-09-06
Publication date: 1996-09-19
Anticipated expiration: 2010-09-07
Also published as: EP0417842B1; DK0417842T3; KR910006497A; CA2024459A1; JPH07102139B2; IE903310A1; ATE136591T1; EP0417842A3; DE69026449D1; SG96532A1; EP0417842A2; JPH0398586A; FI904494A0; US5196305A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren für die Amplifikation einer vorbestimmten Nukleinsäure. Sie ist insbesondere auf ein Verfahren für die Amplifikation und den Nachweis dieser Nukleinsäure unter Verwendung eines bestimmten Primers und der Polymerase-Kettenreaktion gerichtet. Die Erfindung kann zum Nachweis von Nukleinsäuren verwendet werden, die im Zusammenhang mit bakterieller oder viraler DNA oder RNA auftreten.
Die Technologie der Nukleinsäure-Gensonden hat sich in den letzten Jahren rasch entwickelt, da die Forscher ihren Wert für den Nachweis verschiedener Erkrankungen, Organismen oder genetischer Merkmale entdeckt haben, die in sehr geringen Mengen in einer Testprobe vorliegen. Die Verwendung von Gensonden beruht auf dem Konzept der Komplementarität. Bei der DNA sind die beiden Stränge durch Wasserstoffbrükkenbindungen zwischen komplementären Nukleotiden (auch als Nukleotidpaare bezeichnet) aneinander gebunden.
Der DNA-Komplex ist normalerweise stabil, die Stränge können jedoch durch Bedingungen, die die Wasserstoffbrückenbindungen aufbrechen, aufgetrennt (oder denaturiert) werden. Die freigesetzten Einzelstränge reassoziieren nur mit einem anderen Strang, der eine komplementäre Nukleotidsequenz aufweist. Dieser Hybridisierungsprozeß kann in Lösung oder auf einem festen Substrat stattfinden. RNA ist normalerweise einzelsträngig. Sie kann ebenfalls mit einem anderen Strang oder einem Teil davon hybridisieren, der eine komplementäre Sequenz von Nukleotiden aufweist. Hybridisierungstests sind beispielsweise in der GB 2,202,328 beschrieben.
Eine Targetnukleinsäuresequenz einer DNA oder RNA eines Targetorganismusses oder -zelle kann nur ein kleiner Teil des gesamten Stranges sein, so daß es sehr schwierig ist, sein Vorliegen mittels der meisten bekannten markierten DNA-Sonden nachzuweisen. Es sind viele Untersuchungen durchgeführt worden, um dieses Problem zu überwinden, einschließlich Verbesserungen der Sondenempfindlichkeit und der Synthese von Nukleinsäuren.
Ein bedeutender technischer Fortschritt ist in der US-A-4,683,195 und der US-A-4,683,202 beschrieben. Ohne zu sehr ins Detail zu gehen: Diese Patente beschreiben ein Amplifikationsverfahren, bei dem Primer an Nukleinsäurematrizen in Gegenwart eines Polymerisationsmittels (wie beispielsweise einer Polymerase) und vier Nukleotidtriphosphaten an Nukleinsäurematrizen hybridisiert werden, und von den Primern Extensionsprodukte gebildet werden. Diese Produkte werden denaturiert und als Matrizenstränge in einem Reaktionszyklus verwendet, wobei die Anzahl und die Menge vorliegender Nukleinsäuren amplifiziert wird, um ihren nachfolgenden Nachweis zu erleichtern. Das Amplifikationsverfahren kann zyklisch so oft wie gewünscht durchgeführt werden, um eine größere Menge eines nachweisbaren Materials aus einer geringen Menge von Targetnukleinsäuresequenz zu bilden.
In dem zuvor beschriebenen Amplifikationsverfahren werden zwei Primer für die zu amplifizierende Targetnukleinsäure verwendet. Die Gestaltung eines effizienten Diagnosetests, der auf der Polymerase- Kettenreaktion beruht, hängt in großem Maß von der Effizienz ab, mit der die Primer mit der Targetnukleinsäure hybridisieren. Im besten Fall für die Amplifikation ist die zu amplifizierende Nukleinsäuresequenz mit dem Primer vollständig komplementär, zumindest nahe dem 3'-Ende der Targetsequenz, wo die Extension stattfindet. Auf diese Weise wird für eine wirksame Amplifikation lediglich ein Primer pro Strang benötigt. Aus dem Stand der Technik ist bekannt, daß, wenn die Targetsequenz nicht vollständig bekannt ist, zumindest beim 3'-Ende, eine Kollektion von Primern verwendet werden kann, die sämtliche möglichen Codon-Variationen aufweisen, damit zumindest ein Primer vorliegt, der vollständig komplementär ist.
Die Verwendung einer Kollektion von Primern kann eingesetzt werden, um das gewünschte Amplifikationsverfahren zu erreichen, ist jedoch aufgrund seiner Kosten unpraktisch und kann in vielen Fällen uneffizient oder unwirksam sein. Die Herstellung der Kollektion irgendwelcher Primer ist unwirtschaftlich und führt zur Verwendung von konkurrierenden, nicht-verlängernden Primern. Darüber hinaus ist, je größer die Ungewißheit über die Targetnukleotidsequenz ist, die Kollektion von Primern, die benötigt wird, viel größer.
Mutationen in genomischer DNA werden mittels Fehlpaarungen zwischen Primer und Target in Untersuchungen nachgewiesen, über die von Newton et al., Nucl. Acids Res., 17(7), S. 2503 - 2516 (1989), berichtet wird. In ähnlicher Weise wird der Nachweis von genomischen Mutationen durch allelenspezifische Amplifikationen von Okayama et al., J. Lab. Clin. Med., 114, S. 105 - 113 (1989), beschrieben.
Virale Genome, insbesondere diejenigen von RNA-Viren und Retroviren, enthalten mehrere Ädderungen, Additionen, Duplikationen und Deletionen von Basen. Die Variabilität dieser Viren wird der geringen Genauigkeit und fehlenden Korrekturlese-Funktionen von Polymerasen zugeschrieben, die für die Replikation verantwortlich sind (siehe Steinhauer et al., Ann. Rev. Microbiol., 41, S. 409 - 433, 1986). Wiederholte Infektionszyklen erhöhen darüber hinaus die Variabilität. Die Wirkungen solcher Variationen in der natürlichen Infektionsgeschichte eines gegebenen Virus beginnt man erst zu verstehen.
Beim Nachweis heterogener DNA von Retroviren ist daher die Targetnukleinsäure sehr variabel und die vollständige Identität nicht immer bekannt. Bei HIV-I beispielsweise bildet eine Varietät von Sequenzen in dem Genom einen lebensfähigen Virus. Es ist bekannt, daß Basensubstitutionen über das gesamte Genom in zufälligen und häufigen Intervallen stattfinden. Verschiedene Isolate weisen daher wahrscheinlich eine virale DNA mit verschiedenen Nukleinsäuresequenzen auf, die mit Primern, von denen angenommen wird, daß sie komplementär sind, zu Fehlpaarungen führen können.
Derartige Fehlpaarungen vermindern die Effizienz der Amplifikation mittels Primern, insbesondere, wenn die Fehlpaarung zwischen Target und Primer beim oder nahe dem 3'-Ende des Primers eintritt. Mit anderen Worten, Fehlpaarungen führen zu einer Verlangsamung des Amplifikationsprozesses, da die Genetik des Primens und der Primerextension verändert wird (siehe z. B. Tinoco, Jr., Proc. Nat. Acad. Sci. (USA), 85, 6252, 1988). Im schlimmsten Fall tritt gar keine Amplifikation ein, da der Primer nicht an das Target bindet, oder falls er bindet, die Bildung eines Extensionsproduktes inhibiert wird (d. h. der Primer "zündet nicht" bzw. "versagt").
Es wäre wünschenswert, ein wirksames Mittel zum Amplifizieren und Nachweisen von Nukleinsäuren zu besitzen, selbst wenn eine Fehlpaarung zwischen einer Targetsequenz der Nukleinsäure und einem Primer beim oder nahe des 3'-Endes des Primers vorliegt.
Das zuvor angesprochene Problem mit Fehlpaarungen, die beim 3'-Ende des Primers auftreten, wird mittels eines Verfahrens für den Nachweis einer bakteriellen oder viralen Nukleinsäure überwunden, das umfaßt:
A. Das In-Kontakt-Bringen einer Probe, die eine bakterielle oder virale Nukleinsäure umfaßt, mit einer Primerzusammensetzung, die einen Satz von Primern für die bakterielle oder virale Nukleinsäure enthält,
um so hybridisierte Produkte der Primer und des Stranges der bakteriellen oder viralen Nukleinsäure zu bilden,
B. das Bilden von Primerextensionsprodukten in den hybridisierten Produkten, Primen, Verlängern und Amplifizieren der Primerextensionsprodukte,
C. das Abtrennen der erhaltenen Primerextensionsprodukte und In-Kontakt-Bringen derselben mit einer Nachweis- oder Fängeroligonukleotidsonde, um ein komplementäres Produkt zu bilden, und
D. das Nachweisen des Vorliegens der komplementären Produkte als eine Indikation für das Vorliegen der bakteriellen oder viralen Targetnukleinsäure in der Probe,
dadurch gekennzeichnet, daß der Satz von Primern der Primerzusammensetzung im wesentlichen aus mindestens einem Primer besteht, der zu einer Sequenz der Nukleinsäure in jeder Position komplementär ist, mit Ausnahme einer einzelnen Position beim 3'-Ende des Primers oder bis zu vier Nukleotiden von diesem, was zu einer einzelnen Fehlpaarung an der einzelnen Position zwischen dem Primer und der bakteriellen oder viralen Nukleinsäuresequenz führt, wobei der Primer ein Nukleotid mit einer Thyminbase an der Position der Fehlpaarung aufweist und mindestens ein Primer in dem Satz von Primern biotinyliert ist.
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zum raschen und genauen Amplifizieren oder Nachweisen von Nukleinsäuren bereit, die in einer Testprobe in sehr geringen Mengen vorliegen. Darüber hinaus kann dieses Verfahren effizienter durchgeführt werden, wenn eine einzelne Fehlpaarung in der Komplementarität beim oder nahe des 3'-Endes eines Primers und einer Targetsequenz einer vorbestimmten bakteriellen oder viralen Nukleinsäure vorliegt. Die Gesamtproduktausbeute bei der Durchführung dieser Erfindung wird durch eine solche Fehlpaarung nicht nennenswert vermindert. Die Amplifikation ist daher beträchtlich effizienter bei der Replikation von Sequenzen, die von Isolat zu Isolat variieren, wie beispielsweise bei Retroviren.
Diese Vorteile werden erreicht, indem ein Primer verwendet wird, der ein Nukleotid mit einem Thymin an der Position der Fehlpaarung beim oder nahe des 3'-Endes aufweist. Mit anderen Worten, wenn eine Fehlpaarung zwischen Targetnukleinsäure und Primer bis zu vier Nukleotiden vom 3'-Ende eintritt, weist der Primer an dieser Nukleotidposition eine Thyminbase auf. Es ist gefunden worden, daß die Verwendung eines solchen Primers eine derartige Fehlpaarung ohne weiteres überwindet und ein effizientes Primen und Amplifizieren der Targetnukleinsäure aufrechterhält. Zusätzlich ist derselbe oder ein anderer Primer biotinyliert, um die Amplifikationsprodukte schließlich nachzuweisen. Diese Erfindung ist insbesondere beim Nachweis von Retroviren, wie HIV-I, brauchbar, bei denen innerhalb und unter infizierten Individuen eine beträchtliche Heterogenität vorliegt.
Zum besseren Verständnis der vorliegenden Erfindung wird, lediglich als Beispiel, auf die beigefügten Figuren Bezug genommen, in denen:
Figur 1 eine Zusammenfassung der Amplifikationsergebnisse unter Verwendung verschiedener Fehlpaarungen beim 3'-Ende in Form einer Matrix, wobei eine hohe Salzkonzentration und eine hohe Hybridisierungstemperatur bei der Amplifikationsreaktion verwendet wurden. Im folgenden Beispiel 1 wird darauf Bezug genommen.
Figur 2 eine Matrix wie Figur 1 ist für die Ergebnisse des folgenden Beispiels 2, wobei die Amplifikationsreaktion mit einer niedrigen Salzkonzentration durchgeführt wurde.
Figur 3 eine Matrix wie Figur 1 ist für die Ergebnisse des folgenden Beispiels 3, wobei die Amplifikationsreaktion mit einer hohen Salzkonzentration und einer niedrigen Hybridisierungsgeschwindigkeit durchgeführt wurde.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Amplifikation oder den Nachweis einer oder mehrerer spezifischer Nukleinsäuresequenzen, die in einer oder mehreren vorbestimmten (d. h. gesuchten) Nukleinsäuren in einer Testprobe vorliegen. Solche Proben können zelluläres oder virales Material, Haar, Körperflüssigkeiten oder andere Materialien, die bakterielle oder virale DNA oder RNA enthalten, die nachgewiesen werden können, umfassen. Obwohl das primäre Ziel des Nachweises diagnostischer Natur ist, kann die Erfindung auch zur Verbesserung der Effizienz der Klonierung von DNA oder messenger-RNA verwendet werden oder um große Mengen der gewünschten Sequenz aus einem Gemisch von Nukleinsäuren, die von einer chemischen Synthese herrühren, zu erhalten.
Die Erfindung ist ganz besonders brauchbar, wenn sie mit einer Kettenreaktion zur Bildung von, relativ zur Anzahl der beteiligten Reaktionsschritte, exponentiellen Mengen mindestens einer vorbestimmten Nukleinsäuresequenz kombiniert wird. Das Produkt ist ein diskreter Nukleinsäureduplex mit Termini, die den Enden der verwendeten spezifischen Primer entsprechen. Jede Nukleinsäurequelle, gleichgültig, ob sie gereinigt ist oder nicht, kann als das Ausgangsmaterial verwendet werden, vorausgesetzt, sie enthält die spezifische Nukleinsäure, die zur Amplifikation oder zum Nachweis bestimmt ist, oder es wird angenommen, daß sie diese enthält. Falls gewünscht, kann auch ein Gemisch von Nukleinsäuren verwendet werden. Die zu duplizierende Sequenz kann ein Fragment oder die gesamte Nukleinsäure sein. Darüber hinaus kann mehr als eine Nukleinsäuresequenz gleichzeitig amplifiziert werden, indem ein Satz von Primern für jede zu amplifizierende Sequenz verwendet wird. Die Sequenzen können in derselben oder in verschiedenen Nukleinsäuren vorliegen.
Nukleinsäuren können aus verschiedenen Quellen erhalten werden, einschließlich Plasmiden, natürlich vorkommender DNA oder RNA aus beliebigen pflanzlichen, tierischen oder menschlichen Quellen. Sie können aus verschiedenen Geweben extrahiert werden, einschließlich Blut, peripheren mononukleären Blutzellen, Geweben oder anderen aus der Technik bekannten Quellen. Diese Erfindung ist insbesondere brauchbar für die Amplifikation und den Nachweis von viraler DNA, wie beispielsweise von Papilloma-Viren des Menschen, RNA-Viren und Retroviren (z. B. HIV-I), die aus mit dem Virus infizierten Flüssigkeiten und Zellen extrahiert werden, wenn die Heterogenität innerhalb und unter infizierten Individuen vorherrscht bzw. überwiegt.
DNA wird aus den Zellen in einer Probe mittels jeder beliebigen geeigneten Technik isoliert, von denen viele aus dem Stand der Technik bekannt sind, solange die DNA durch die Technik nicht abgebaut wird. Beispielsweise kann sie aus Zellen mittels einer gepufferten Protease- oder Proteinase K-Zusammensetzung bei einer Temperatur und einem pH extrahiert werden, die die Wahrscheinlichkeit vermindern, daß die DNA abgebaut wird, wie beispielsweise von Kan et al., New Eng. J. Med., 297, S. 1080 - 1084 (1977) und in Nature, 251, S. 392 - 393 (1974), beschrieben ist. Andere Extraktionstechniken sind in der EP-A-0 145 356 (veröffentlicht am 19. Juni 1985), in der EP-A-0 240 191 (veröffentlicht am 7. Oktober 1987) und in der EP-A-0 245 945 (veröffentlicht am 19. November 1987) und von Nunberg et al., Proc. Nat. Acad. Sci. (USA), 75(11), S. 5553 - 5556, 1978, und Saiki et al., Bio/Technology, 3, S. 1008 - 1012 (1985), beschrieben.
Die extrahierte DNA kann durch Dialyse, Chromatographie, durch Affinitätsbindung mittels komplementärer Nukleinsäuren oder durch jede beliebige andere geeignete Technik, die dem Fachmann ohne weiteres ersichtlich ist, gereinigt werden.
Hat man isolierte DNA erhalten, wird sie einem Amplifikationsverfahren unterzogen, das, relativ zu der Anzahl der beteiligten Schritte, exponentielle Mengen des Moleküls bildet. Es ist ersichtlich, daß, wenn mehrere DNA-Moleküle von Interesse sind, das Amplifikationsverfahren dazu verwendet werden kann, alle davon zu multiplizieren. Das Endergebnis ist eine große Anzahl nachweisbarer Nukleinsäuren, die dann Typisierungsverfahren für die Bewertung unterzogen werden können.
Das üblicherweise verwendete Amplifikationsverfahren ist ziemlich ausführlich in der US-A-4,683,195 und der US-A-4,683,202 (zuvor angegeben) beschrieben.
Der hier in Bezug auf Primer oder Sonden verwendete Begriff "Oligonukleotid" bezeichnet ein Molekül, das zwei oder mehr Desoxyribonukleotide oder Ribonukleotide, und vorzugsweise mehr als drei, umfaßt. Die exakte Größe ist nicht entscheidend (mit Ausnahme der im folgenden beschriebenen Sonde), hängt jedoch von vielen Faktoren ab, einschließlich der letztendlichen Verwendung oder Funktion des Oligonukleotids. Das Oligonukleotid kann synthetisch oder durch andere aus dem Stand der Technik bekannte Verfahren erhalten worden sein.
Der Begriff "Primer" bezeichnet ein Oligonukleotid, gleichgültig, ob natürlich vorkommend oder synthetisch hergestellt, das in der Lage ist, als ein Initiationspunkt der Synthese zu wirken, wenn er unter Bedingungen eingesetzt wird, bei denen die Synthese eines Primerextensionsprodukts, das zu einem Nukleinsäurestrang komplementär ist, induziert wird. Solche Bedingungen umfassen das Vorliegen von Nukleotiden (wie beispielsweise die vier Standarddesoxyribonukleotidtriphosphate) und ein Agens für die Polymerisation, wie beispielsweise eine DNA- Polymerase, geeignete Temperatur und pH und andere geeignete Reagenzien, wie eine Quelle für Magnesium- oder Manganionen.
Gemäß der Erfindung können ein oder mehrere Primer bei der Amplifikation verwendet werden, wobei jeder Primer für eine spezielle Nukleinsäure spezifisch ist, es wird jedoch mindestens ein Primer verwendet, der zu der Targetnukleinsäure komplementär ist, mit Ausnahme einer einzelnen Fehlpaarung beim oder nahe des hier definierten 3'-Endes. Dieser entscheidende Primer weist eine Thyminbase an der Position der Fehlpaarung auf. Der Vorteil dieser Erfindung ist daher, daß es mit der Verwendung eines solchen Primers wahrscheinlicher ist, daß eine Fehlpaarung zwischen der Targetnukleinsäuresequenz und dem Primer überwunden wird und die Amplifikation in effizienter Weise fortschreitet. Bei idealen Bedingungen lägen zwar sämtliche Primer vollständig komplementär zu der vorbestimmten Nukleinsäure vor, es ist jedoch insbesondere bei bestimmten viralen DNAs wahrscheinlicher, daß Fehlpaarungen vorliegen, und daher besteht offensichtlich ein Bedürfnis für die folgende Erfindung. Mit dem Begriff "bei oder nahe dem 3'-Ende des Primers" ist gemeint, daß die Fehlpaarung innerhalb von vier Nukleotiden des 3'-Endes des Primers auftritt. Vorzugsweise weist der Primer eine Thyminbase auf, die sich beim 3'-Ende oder eine Nukleotidposition davon entfernt befindet. Am meisten bevorzugt ist sie beim 3'-Ende.
Obwohl mindestens ein Primer das Nukleotid mit der Thyminbase wie zuvor definiert aufweisen muß, ist es nicht notwendig, daß sämtliche Primer, die in der Amplifikationsreaktion verwendet werden, so konstruiert sind. Mit anderen Worten, bei der Amplifikation von DNA werden beide Stränge mit Primern und dem Amplifikationsverfahren amplifiziert. Es ist möglich, daß eine Fehlpaarung mit lediglich einem der Stränge oder mit beiden Strängen eintritt. Die Primer können daher so gestaltet sein, daß sie so viele Fehlpaarungen, wie vorliegen können, akkommodieren bzw. ausgleichen. Wenn zwischen einem Strang und einem Primer keine Fehlpaarung auftritt, braucht der Primer beim oder nahe dem 3'-Ende kein Thymin aufzuweisen, außer es liegt aufgrund der normalen Komplementarität vor.
Primer sind üblicherweise einzelsträngig. Die exakte Länge eines jeden Primers hängt von der beabsichtigten Verwendung, der Komplexität der Targetsequenz, der Reaktionstemperatur und der Quelle des Primers ab. Üblicherweise weisen die erfindungsgemäß verwendeten Primer 15 bis 50 Nukleotide, und vorzugsweise weisen sie 20 bis 30 Nukleotide auf.
Hier brauchbare Primer können von einer Reihe von Quellen erhalten werden oder mittels bekannter Techniken und Ausrüstung hergestellt werden, einschließlich z. B. einem ABI-DNA-Synthesizer (erhältlich von Applied Biosystems) oder einem Biosearch Serie 8600, Serie 8700 oder Serie 8800 Synthesizer (erhältlich von Milligen-Biosearch, Inc.) und bekannter Verfahren für ihre Verwendung. Natürlich vorkommende Primer, die aus biologischen Quellen isoliert werden, sind ebenfalls brauchbar (wie beispielsweise Restriktionsendonuklease-Verdauungen).
Wenn die Target-DNA extrahiert (falls notwendig) und denaturiert worden ist, werden ihre Stränge mit der hier beschriebenen Primerzusammensetzung unter solchen Bedingungen in Kontakt gebracht, daß ein Gemisch hybridisierter Produkte von Primern und Target-DNA-Strängen gebildet wird. Derartige Bedingungen sind solche, die normalerweise für die Amplifikation verwendet werden, wie in der US-A-4,683,202 beschrieben ist (zuvor angegeben). Primerextensionsprodukte werden dann mit mindestens einem der hybridisierten Produkte gebildet, gefolgt von weiterem Primen und Bildung von Extensionsprodukten. Nach Denaturierung (d. h. Auftrennung von komplementären Produkten) kann die replizierte Targetnukleinsäure von dem Reaktionsgemisch mittels Standardverfahren und -ausrüstung isoliert werden. Vorzugsweise ist mindestens eine der replizierten Nukleinsäuren biotinyliert.
Die vorliegende Erfindung ist auch für den Nachweis einer spezifischen Nukleinsäure brauchbar, die zwei komplementäre Stränge aufweist. Die meisten interessierenden Nukleinsäuresequenzen sind bereits doppelsträngig, wie die, die in DNA gefunden werden. Einzelsträngige Nukleinsäuresequenzen, wie m-RNA, können jedoch auf ähnliche Weise nachgewiesen werden, nachdem sie mittels reverser Transkriptase zu einer doppelsträngigen Sequenz umgewandelt wurden.
Eine vorbestimmte Nukleinsäuresequenz wird mittels einer Nukleinsäure reproduziert, die diese Sequenz als eine Matrize enthält. Falls die Nukleinsäure zwei Stränge enthält, ist es notwendig, die Stränge aufzutrennen, und zwar entweder als einen separaten Schritt oder gleichzeitig mit der Bildung von Primerextensionsprodukten. Das Denaturieren kann mittels beliebiger geeigneter physikalischer, chemischer oder enzymatischer Mittel erreicht werden, wie im Stand der Technik beschrieben ist. Erwärmen auf eine geeignete Temperatur ist ein bevorzugtes Mittel.
Wenn die aufgetrennten Stränge zur Verwendung verfügbar sind, kann die Synthese weiterer Nukleinsäurestränge mittels der Primer in einer gepufferten wäßrigen Lösung bei einem pH von üblicherweise 7 bis 9 durchgeführt werden. Vorzugsweise wird ein molarer Überschuß an Primern zu der gepufferten Lösung zugegeben. Spezifische Mengen sind im Stand der Technik angegeben (z. B. in der US-A-4,683,202). Die Desoxyribonukleotidtriphosphate dATP, dCTP, dGTP und dTTP werden ebenfalls zu dem Synthesegemisch in adäquaten Mengen zugegeben, und die erhaltene Lösung wird bis zu 10 Minuten lang vorzugsweise 1 bis 4 Minuten lang, auf 90 - 100 ºC erhitzt. Nach diesem Erwärmen wird die Lösung vorzugsweise auf Raumtemperatur abgekühlt, und ein geeignetes Agens zum Induzieren (oder Katalysieren) der Bildung von Primerextensionsprodukten wird eingeführt. Dieses induzierende Agens ist im Stand der Technik allgemein als ein Polymerisationsmittel bekannt. Eine Reaktion zur Bildung dieser Produkte wird unter bekannten Bedingungen durchgeführt (üblicherweise von Raumtemperatur bis zu derjenigen Temperatur, bei der keine Polymerisation mehr stattfindet).
Das Polymerisationsmittel kann jede beliebige Verbindung oder Kombination von Reagenzien sein, die bewirken, daß die Synthese von Primerextensionsprodukten, einschließlich Enzymen (z. B. E. coli-DNA-Polymerase I, T4-DNA-Polymerase, Klenow-Polymerase, reverse Transkriptase und andere aus dem Stand der Technik bekannte) erreicht wird. Besonders brauchbare Enzyme sind thermisch stabile Enzyme, geklont oder natürlich vorkommend, wie diejenigen, die aus verschiedenen Thermus-Bakterienarten erhalten werden, wie Thermus aquaticus und Thermus thermophilus. Andere Polymerisationsmittel sind in der US- A-4,683,202 beschrieben.
Bevorzugte thermisch stabile Enzyme sind DNA-Polymerasen, die aus Thermus aquaticus isoliert werden oder durch Klonierungsverfahren, wie in der EP-A-0 258 017 beschrieben ist, synthetisch hergestellt werden. Diese Polymerasen weisen üblicherweise ein Molekulargewicht von 86 000 bis 90 000 Dalton auf. Andere bevorzugte Polymerasen werden aus Thermus thermophilus isoliert oder durch Klonierungsverfahren synthetisch hergestellt. Noch andere brauchbare Enzyme sind bei Rossi et al., Syst. Appl. Microbiol. 7(2-3), S. 337 - 341, 1986, beschrieben. Im allgemeinen wird die Synthese von Extensionsprodukten beim 3'-Ende eines jeden Primers initiiert und schreitet in der 5'- zur 3'-Richtung entlang des Matrizenstrangs fort, bis die Synthese beendet ist.
Die neu gebildeten Primerextensionsprodukte, die die neu synthetisierten Stränge und ihre jeweiligen Primer umfassen, bilden mit den ursprünglichen Targetsträngen doppelsträngige Moleküle, die in den folgenden Verfahrensschritten verwendet werden. Diese Stränge werden dann durch Denaturierung wie zuvor beschrieben aufgetrennt, um einzelsträngige Moleküle zu bilden, auf denen, wie zuvor beschrieben, neue Nukleinsäuren synthetisiert werden. Es können zusätzliche Reagenzien notwendig sein, um das Amplifikationsverfahren am Laufen zu halten, nach dem die meisten Extensionsprodukte aus der durch die Primer gebundenen spezifischen Nukleinsäuresequenz bestehen (d. h. komplementäre Produkte).
Die Schritte der Strangtrennung und Extensionsproduktsynthese können so oft wie notwendig wiederholt werden, um die gewünschte Menge der spezifischen Nukleinsäure zu bilden, die für die Verwendung benötigt wird, beispielsweise zum Nachweis. Normalerweise wird die Schrittfolge mindestens einmal wiederholt, und vorzugsweise mindestens 5 bis 50 mal.
Wenn mehr als eine spezifische Nukleinsäure aus der ersten Nukleinsäure oder einem Gemisch davon gebildet werden soll, wird die geeignete Anzahl von Sätzen von Primern in dem zuvor beschriebenen allgemeinen Verfahren verwendet.
Wenn eine gewünschte Menge der interessierenden Nukleinsäuresequenz gebildet worden ist und die Primerextensionsprodukte zum letzten Mal aufgetrennt werden, werden die Primerextensionsprodukte (einschließlich der biotinylierten) üblicherweise mit einer Oligonukleotidsonde in Kontakt gebracht, die entweder zum Einfangen oder Nachweisen der Produkte ausgelegt bzw. gestaltet ist.
In einer Ausführungsform ist die Sonde gestaltet, um die Produkte einzufangen oder unlöslich zu machen. Die Sonde wird daher immobilisiert oder ist in der Lage, auf einer festen Phase einer beliebigen Art, wie Membranen, Filter, Filme, Objektträger, Teilchen, Mikrotiterplatten oder beliebige andere geeignete feste Materialien, die dem Fachmann ohne weiteres ersichtlich sind, immobilisiert zu werden. Vorzugsweise ist die feste Phase ein polymeres Teilchen (wie im folgenden ausführlicher definiert wird). Das Oligonukleotid kann an die feste Phase mittels aus dem Stand der Technik bekannter Lehren für eine derartige Bindung kovalent gebunden sein oder adsorbiert sein. Ein Verfahren für die kovalente Bindung ist beispielsweise die Reaktion bestimmter Linkergruppen, die in der WO-A-89/02931 beschrieben sind.
Polymere Partikel, die als feste Fängerphasen brauchbar sind, können aus jedem beliebigen polymeren Material zusammengesetzt sein, das wasserunlöslich ist und das die notwendigen reaktiven Oberflächengruppen bereitstellt, um ein Oligonukleotid direkt oder indirekt zu binden. Die reaktiven Oberflächengruppen können daher beispielsweise Sulfhydryl, Amino, aktive Halogenatome, Epoxygruppen, Isocyanat, Aziridin, aktiviertes 2-substituiertes Ethylsulfonyl, Vinylsulfonyl, aktiver Aldehyd, 2-substituiertes Ethylcarbonyl, Carboxy und andere sein, die mit den jeweiligen Sulfhydryl-, Amino- oder Hydroxygruppen der Linkergruppe reagieren.
Besonders brauchbare Partikel sind aus einem Polymer zusammengesetzt, das aus ethylenisch ungesättigten, polymerisierbaren Monomeren hergestellt ist, von denen mindestens eines ein aktives Halogenatom, eine aktivierte, 2-substituierte Ethylsulfonylgruppe, Carboxy- oder Vinylsulfonylgruppe aufweist. Repräsentative Monomere sind aus dem Stand der Technik bekannt und dem Fachmann ohne weiteres ersichtlich. Besonders brauchbare Monomere umfassen diejenigen, die reaktive Carboxygruppen aufweisen, wie Acrylsäure und Methacrylsäure.
In der zuvor beschriebenen Ausführungsform ist einer der Primer biotinyliert, so daß er mit einem Avidin-Enzym-Konjugat für den nachfolgenden Nachweis umgesetzt werden kann. Das heißt, der Primer weist eine an ihn kovalent gebundene Biotingruppe auf. Solche Konjugate von Primer und Biotin können mittels bekannter Technologie ohne weiteres hergestellt werden.
Das unlösliche, hybridisierte Produkt aus Sonde und biotinyliertem Primerextensionsprodukt kann von löslichen Materialien mittels beliebiger geeigneter Trennungsmittel abgetrennt werden, einschließlich Zentrifugation, Filtration und Waschen. Vorzugsweise wird eine mikroporöse Filtrationsmembran verwendet. Besonders brauchbare mikroporöse Filtermembranen umfassen Polyamidmembranen (wie beispielsweise Ultipore , Loprodyne oder Biodyne ).
Die Membranen können mit geeigneten Behältern zum Auffangen von Flüssigkeit und anderen Materialien als ein separates Substrat verwendet werden. Vorzugsweise werden sie jedoch als Teil einer Testvorrichtung angebracht. Verschiedene Testvorrichtungen sind aus dem Stand der Technik bekannt, einschließlich der in der US-A-3,888,629, der US- A-3,970,429 und der US-A-4,446,232 beschriebenen. Besonders brauchbare Vorrichtungen sind in der EP-A-0 308 231 und in der EP-A-0 381 501 beschrieben.
Das gesammelte unlösliche Hybrid wird mit einem Peroxidase- Avidin-Konjugat in Kontakt gebracht, das mit dem biotinylierten Teil des Hybrides einen Komplex bildet. Brauchbare Konjugate sind im Handel von einer Reihe von Quellen erhältlich. Normalerweise dauert es einige Minuten, bis die Komplexbildung eintritt, und nicht-komplexgebundenes Konjugat läuft zusammen mit der anderen Flüssigkeit durch die Membran.
Darauf werden die Reaktionsprodukte mit einer Zusammensetzung in Kontakt gebracht, die in Gegenwart des verwendeten Enzymmarkers einen Farbstoff bereitstellt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird Avidin mit Peroxidase konjugiert, und es wird eine farbstoffbildende Zusammensetzung verwendet, die mit Peroxidase und Wasserstoffperoxid brauchbar ist.
Brauchbare Farbstoffe oder farbstoffbildende Reagenzien sind für ein gegebenes Enzym aus dem Stand der Technik bekannt. Brauchbare farbstoffbildende Reagenzien für Peroxidase umfassen beispielsweise Tetramethylbenzidin und Derivate davon und Leukofarbstoffe, wie Triarylimidazol-Leukofarbstoffe (wie in der US-A-4,089,747 beschrieben ist). Besonders brauchbare farbstoffbildende Zusammensetzungen umfassen Triarylimidazol-Leukofarbstoffe, die in Kombination mit bestimmten stabilisierenden Stoffen verwendet werden, wie beispielsweise in der EP-0 321 261 beschrieben ist.
Das Vorliegen des Farbstoffs in dem unlöslichen Material ist eine Indikation für das Vorliegen der Target-DNA in der getesteten Probe. Der Farbstoff kann häufig visuell ohne die Verwendung von Geräten beobachtet werden, in manchen Fällen jedoch kann die Intensität des Farbstoffs schwach sein oder außerhalb des sichtbaren Bereichs des elektromagnetischen Spektrums liegen und daher für eine adäquate Bestimmung eine geeignete Nachweisvorrichtung erforderlich machen (d. h. Spektrophotometer). Vorgehensweisen dazu sind aus dem Stand der Technik gut bekannt.
In einer anderen Ausführungsform kann ein biotinylierter Primer verwendet werden, der mit einer festen Phase einen Komplex bildet, die Avidin entweder adsorbiert oder kovalent an die feste Phase gebunden umfaßt. Der Avidin-Biotin-Komplex wird daher zum Einfangen anstatt zum Markieren verwendet. Andere spezifisch bindende Reaktionen können auf ähnliche Weise verwendet werden, wie in der EP-A-0 370 694 beschrieben ist. In dieser Ausführungsform wird eine Nachweissonde verwendet, um einen Marker zum Nachweis des erhaltenen unlöslichen Produktes bereitzustellen. Die Sonde ist zu einem der Primerextensionsprodukte komplementär und kann mit jedem beliebigen Marker markiert sein, einschließlich chromogener oder fluorogener Gruppen, chemilumineszenter Gruppen, Radiomarker, Enzyme, Ferritin, magnetisierbarer Partikel und anderer, die dem Fachmann ohne weiteres ersichtlich sind. Der Marker kann an die Sonde direkt gebunden sein oder durch eine Linkergruppe oder einen spezifisch bindenden Komplex indirekt gebunden sein. Obwohl eine Avidin-Biotin-Reaktion zum Einfangen in dieser Ausführungsform verwendet werden kann, kann eine Antikörper-Hapten-Reaktion brauchbar sein, um einen Marker an eine Sonde zu binden. Angesichts dieser Lehre liegen andere Ausführungsformen durchaus im Tätigkeitsbereich des Fachmanns.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann zum Amplifizieren oder Nachweisen von Nukleinsäuren verwendet werden, die mit Infektionskrankheiten verbunden sind. Verschiedene Infektionskrankheiten können durch das Vorliegen einer geringen Menge von DNA in einer klinischen Probe diagnostiziert werden, die für einen Organismus, wie beispielsweise ein Bakterium oder ein Virus, spezifisch ist. Retroviren werden mit der vorliegenden Erfindung vorteilhafterweise nachgewiesen, wobei HIV-I ein Retrovirus von besonderem Interesse ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt ein Verfahren für den Nachweis von mindestens einer vorbestimmten bakteriellen oder viralen Nukleinsäure, die zwei komplementäre Stränge aufweist:
A. das Denaturieren der komplementären Stränge einer doppelsträngigen Nukleinsäure in einer biologischen Probe,
B. das In-Kontakt-Bringen der Probe mit einer oder mehreren Primerzusammensetzungen, um hybridisierte Produkte der Primer und der Nukleinsäurestränge zu bilden,
C. in Gegenwart einer thermostabilen Polymerase und der Desoxyribonukleotidtriphosphate dATP, dCTP, dGTP und dTTP, wobei Extensionsprodukte der Primer in den hybridisierten Produkten gebildet werden, welche Extensionsprodukte, wenn sie von ihren Komplementen abgetrennt werden, als Matrizenstränge zur Synthese der Extensionsprodukte der Primer dienen können,
D. Abtrennen der Primerextensionsprodukte von den Matrizensträngen, auf denen sie synthetisiert wurden,
E. In-Kontakt-Bringen der abgetrennten Extensionsprodukte und der vorbestimmten Nukleinsäure mit zusätzlichen Primern, die zu den Strängen komplementär sind, was zur Amplifikation der Nukleinsäure unter Bildung komplementärer Produkte führt,
F. Abtrennen der Primerextensionsprodukte von den komplementären Produkten, die in Schritt E gebildet wurden,
G. In-Kontakt-Bringen von mindestens einem Primerextensionsprodukt, das in Schritt F abgetrennt wurde, mit einer Oligonukleotidsonde, die zum Nachweis oder Einfangen markiert ist und dazu komplementär ist, um ein komplementäres Produkt der Sonde und des Primerextensionsprodukts zu bilden, und
H. Nachweisen des in Schritt G gebildeten komplementären Produkts als eine Indikation für das Vorliegen der vorbestimmten Nukleinsäure in der Probe,
dadurch gekennzeichnet, daß eine Primerzusammensetzung im wesentlichen aus einem Primer besteht, der zu einer Sequenz eines der Nukleinsäurestränge in jeder Position komplementär ist, mit Ausnahme einer einzelnen Position bei oder nahe dem 3'-Ende des Primers, was zu einer einzelnen Fehlpaarung bei der einzelnen Position zwischen dem Primer und dem Nukleinsäurestrang führt, wobei der Primer ein Nukleotid mit einer Thyminbase in der Position der Fehlpaarung aufweist,
und daß die Probe gleichzeitig ebenfalls mit einem oder mehreren zusätzlichen Primern in Kontakt gebracht wird, die im wesentlichen komplementär sind zu einem anderen Strang der Nukleinsäure und die biotinyliert sind.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Durchführung der vorliegenden Erfindung, sollen jedoch nur als Beispiel dienen.

Beispiel 1: Wirkung der Verwendung von Primern bei PCR-Amplifikation, die Fehlpaarungen beim 3'-Ende aufweisen, wenn bei der Amplifikation eine hohe Magnesiumsalzkonzentration verwendet wird

Dieses Beispiel veranschaulicht die Erfindung, wobei Primer, die Nukleotide mit einer Thyminbase beim 3'-Ende aufweisen, eine effiziente Amplifikation bewirken, verglichen mit Primern, die beim 3'-Ende andere Basen aufweisen, wenn Fehlpaarungen mit der Targetnukleinsäure vorliegen.

Primer:

Die Nukleotide in den Primern, der Gensonde und der Targetnukleinsäure werden mittels der Standardabkürzungen T für Thymin, A für Adenin, G für Guanin und C für Cytosin bezeichnet. Es gibt zwölf mögliche Fehlpaarungen zwischen Primer und Target, die beim 3'-Ende auftreten können. Vier davon sind symmetrisch (d. h. A-A, G-G, C-C und T-T), und acht sind asymmetrisch (A-C, C-A, C-T, T-C, G-A, A-G, T-G und G-T). Der erste Buchstabe bezeichnet das Nukleotid auf dem Primer, und der zweite Buchstabe bezeichnet das Nukleotid auf der Targetnukleinsäure.
Wir haben diese zwölf Fehlpaarungen sowie korrekte Paarungen mittels eines Satzes von Primern untersucht, die eine nahezu identische Sequenz von 28 Basen aufweisen, mit Ausnahme der Base beim 3'-Ende. Die Primer wurden mittels des Primers SK-38 als Basis für die Sequenz hergestellt, der routinemäßig für die Amplifikation von HIV-I-DNA (gag-Region) verwendet wird. Der Primer SK-38 wurde mittels einer automatischen Synthesevorrichtung und bekannter Phosphoramiditchemie hergestellt. Dieser Primer wurde zunächst beim 3'-Ende variiert, um drei der zwölf möglichen Fehlpaarungen mit der Targetnukleinsäure zu erzeugen. Er wurde dann eine Position nach rechts verschoben, was zu einem verschiedenen 3'-Ende führte, und dann wurden drei weitere Fehlpaarungsvariationen hergestellt, indem am Ende Substitutionen durchgeführt wurden. Dieses Verfahren wurde zweimal wiederholt, einmal durch Verschieben von SK-38 um eine Position nach links, und einmal, indem er vier Positionen nach links verschoben wurde. Die Sequenzen der erhaltenen Primer sind in der folgenden Tabelle angegeben. TABELLE Oligonukleotidsequenzen Oligonukleotid Nukleotidbasensequenz Primer 3'-Ende Korrespondierende Base auf dem Matrizenstrang Matrizenstrang Primer
Sämtliche der Primer wurden auf einer Synthesevorrichtung Biosearch 8700 mittels Standardphosphoramiditchemie synthetisiert. Sie wurden mittels Polyacylamid-Gelelektrophorese und Entsalzen gereinigt. Eine Analyse der Basenzusammensetzung wurde eingesetzt, um die Reinheit und Zusammensetzung der Primer festzustellen. Es wurden Vorratslösungen in TE-Puffer (im folgenden beschrieben) hergestellt, wobei Messungen der optischen Dichte zum Einstellen der Konzentration verwendet wurden.

Materialien:

Das verwendete Avidin-Bead-Reagenz wurde wie in der EP-A-0 302 715 beschrieben mittels Partikeln von Poly[styrol-co-m- & p-(2-chlorethylsulfonylmethyl)styrol] (Molverhältnis 95,5 : 4,5), die einen durchschnittlichen Durchmesser von etwa 2,0 µm aufweisen, hergestellt, und in einer Suspension (0,45 Gew.-% Feststoffe) in Glycinpuffer (0,1 molar, pH 8,5) aufbewahrt.
Die verwendete DNA-Polymerase wurde aus Thermus aquaticus mit einer Aktivität von etwa 4 Einheiten/µl isoliert.
Eine SSPE-Lösung enthielt nicht-ionisches Surfactant Triton X-100 (0,2 Gew.-%) und phosphatgepufferte Salzlösung (8,5 mmolar, pH 7), die Natriumchlorid (149 mmolar) und Ethylendiamintetraessigsäure (1 mmolar) enthielt.
Eine Verdünnungslösung umfaßte 360 mmolares Natriumchlorid, 20 mmolares Natriumdihydrogenphosphat (pH 7,4) und 2 mmolare Ethylendiamintetraessigsäure und nicht-ionisches Surfactant Triton X-100 (0,2 Gew.-%).
Der TE-Puffer enthielt Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Hydrochlorid- Puffer (10 mmolar) und Ethylendiamintetraessigsäure (1 mmolar), wobei der pH mittels Salzsäure auf 8 eingestellt wurde.
Der PCR-Puffer enthielt Tris(hydroxymethyl)aminomethan (10 mmolar, pH 8), Kaliumchlorid (50 mmolar) und Magnesiumchlorid (10 mmolar).
Ein als "Laufpuffer" (pH 8) bezeichneter Puffer, der zur Elektrophorese verwendet wurde, war aus Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Puffer (89 mmolar), Borsäure (89 mmolar) und Ethylendiamintetraessigsäure (2 mmolar) zusammengesetzt.
Eine Leukofarbstoff-Zusammensetzung zum Nachweis wurde hergestellt mit 2-(4-Hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl)-4,5-bis-(4-methoxyphenyl)imidazol wie folgt: fester Leukofarbstoff (zum Herstellen einer 0,1 gew.-%-igen Lösung) wurde in einer Lösung von Poly(vinylpyrrolidon) (20 Gew.-%) in Natriumphosphatpuffer (5 mmolar) aufgelöst. Diese Lösung wurde dann zu einer Lösung zugegeben, die Wasserstoffperoxid (10 mmolar), 4-Hydroxyacetanilid (5 mmolar) und Diethylentriaminpentaessigsäure (10 µmolar) in Natriumphosphatpuffer enthielt, um eine Endkonzentration von 1 Gew.-% Polymer und 0,005 Gew.-% Leukofarbstoff zu bilden.
Die in den Tests verwendeten Einweg-Testvorrichtungen Surecell (Eastman Kodak Co.) enthielten in jeder Testvertiefung eine mikroporöse Nylonmembran Biodyne (Pall Corp.). Die Membranen wurden vor der Verwendung mit succinyliertem Casein (1 g/m²) behandelt.
Die in den Tests verwendete Sonde wurde gemäß dem in der neuen europäischen Patentanmeldung Nr. 417841 beschriebenen Verfahren hergestellt, die gleichzeitig hiermit und entsprechend der USSN 406,224, eingereicht am 12. September 1989, eingereicht wurde. Diese Sonde wies die folgende Struktur auf:
in der X ein Rest von Meerrettichperoxidase ist und Y die Oligonukleotidkette ist, die die folgende Sequenz aufweist:
Das in den Tests nachgewiesene vorbestimmte DNA-Fragment war ein 180- Nukleotid-Segment der gag-Region (Core-Protein) des HIV-I-Genoms, das in ein Derivat des Vektors M13 geklont und mittels Standardverfahren hergestellt wurde.
Der in den Tests verwendete biotinylierte Primer wies die folgende Nukleotidsequenz auf:
in der X für einen Biotintetraethylenglycol-Spacerarm steht, der wie in der USSN 104,200 (zuvor angegeben) beschrieben ist, hergestellt und gebunden wurde.

Test:

Die Amplifikation wurde mittels eines Cetus/Perkin-Elmer-Thermocyclers in Microfuge-Röhrchen mittels 100-µl-Lösungen durchgeführt, die folgendes enthielten: Targetfragment (10&supmin;¹&sup6; molar), Primer (jeweils 1 µmolar), Polymerase (7,5 Einheiten/100 µl), dNTPs (insgesamt 6 mmolar), Magnesiumchlorid (10 mmolar) und PCR-Puffer.
Das thermische Profil für die Amplifikation war ein 5-Minuten-Zyklus, der 30 Zyklen lang wie folgt durchgeführt wurde:
70 ºC ansteigend auf 94 - 95 ºC 1 Minute
94 - 95 ºC 0,5 Minuten (Denaturierung)
94 - 95 ºC erniedrigen bis 55 ºC 1,25 Minuten
55 ºC 0,5 Minuten (Hybridisierung)
55 ºC bis 70 ºC 0,75 Minuten
70 ºC 1 Minute (Primerextension)
Der Nachweis des amplifizierten Targets wurde auf zwei verschiedene Arten erreicht. Agarosegelelektrophorese wurde verwendet, um nachzuweisen, daß ein Fragment der erwarteten Größe synthetisiert wurde. Die Sequenzinformation wurde durch Hybridisieren mit einer mit Meerrettichperoxidase markierten Oligonukleotidsonde bestätigt.
Gelelektrophorese wurde wie folgt durchgeführt: Aliquote (6 µl) des PCR-Reaktionsgemisches wurden entnommen und auf 4 %-ige Agarosegele (3 % NuSieve und 1 % SeaKem , erhältlich von FMC BioProducts) aufgetragen. Die Gele wurden mit einer Ethidiumbromid-Lösung (4 µl, 10 mg/ml) vorgefärbt. Der "Laufpuffer" (600 µl) enthielt ebenfalls Ethidiumbromid (24 µl). Die Gele wurden bei 160 Volt/cm eine Stunde lang einer Elektrophorese unterzogen, dann fotographiert, und die erhaltenen Banden wurden sichtbar gemacht.
Die Hybridisierung mit der Sonde wurde wie folgt durchgeführt:
PCR-Reaktionsprodukt (5 µl einer Verdünnung von 1:10 in Verdünnungslösung in einem 1,5 ml Mikrocentrifuge-Röhrchen) wurde 5 Minuten lang bei 95 ºC geschmolzen, kurz in dem Microfuge-Röhrchen zentrifugiert, dann mit dem Avidin-Bead-Reagenz (2 µl) und der Peroxidase-markierten Sonde (1 pmolar in 3 µl) gemischt und 5 Minuten lang bei 42 ºC inkubiert. Es wurde Verdünnungslösung (50 µl) zugegeben, gemischt, und die Lösungen wurden zu den Testvertiefungen von Surecell -Testvorrichtungen zugegeben, und man ließ die Flüssigkeit durch die Membranen in den Testvertiefungen durchfließen.
Die Testvertiefungen wurden mit einer Waschlösung (50 µl einer Verdünnungslösung einer Verdünnung von 1:10 in Phosphatpuffer (pH 7) gewaschen, die 30 Minuten lang auf 55 ºC vorgewärmt worden war. Das Waschen wurde viermal wiederholt.
Die Leukofarbstoff-Zusammensetzung (100 µl) wurde zugegeben, und nach zwei Minuten wurde der Farbstoff auf der Membran visuell mittels einer Farbkarte bewertet (Werte 1 bis 5, wobei 5 die höchste Dichte war). Figur 1 zeigt eine zusammenfassende Matrix der Ergebnisse sowohl der Gelelektrophorese als auch der Sondenhybridisierung für jeden Test bei Verwendung verschiedener Primer. Die Buchstaben "A", "C", "G" und "T" werden in sämtlichen Figuren verwendet, um Nukleotide in den Nukleinsäuren oder Primern darzustellen, wobei die Nukleotide Basen aufweisen, die Adenin, Cytosin, Guanin bzw. Thymin entsprechen.
Die Ergebnisse der Elektrophorese sind entweder als positiv (+) oder negativ (-) angegeben. Die Ergebnisse mit der Gensonde sind als Farbkartenwert entsprechend der beobachteten Farbstoffdichte angegeben. Sämtliche der Ergebnisse sind das Mittel aus zwei Wiederholungen.
Diese Daten zeigen, daß, wenn die Primer ein Nukleotid mit einer Thyminbase beim 3'-Ende aufweisen, die Effizienz der Amplifikation hoch bleibt, wie durch die positiven Elektrophoreseergebnisse und generell höhere Farbstoffdichten bewiesen wird. Wenn Primer mit Nukleotiden endeten, die Adenin-, Guanin- oder Cytosinbasen aufwiesen, war die Amplifikation schwach oder nicht vorhanden. Dies zeigt, daß die Verwendung der Primer gemäß der Erfindung Fehlpaarungen beim oder nahe dem 3'-Ende der Primer leichter als andere Primer überwinden.

Beispiel 2: Wirkung der Verwendung von Primern bei der PCR-Amplifikation, die Fehlpaarungen beim 3'-Ende aufweisen, unter Verwendung einer niedrigen Magnesiumsalzkonzentration bei der Amplifikation

Die Amplifikationsverfahren von Beispiel 1 wurden mit denselben Stoffen wiederholt, mit der Ausnahme, daß die Menge an Magnesiumchlorid, die bei der Amplifikationsreaktion verwendet wurde, 2,5 mmolar anstatt 10 mmolar war und die dNTPs in einer Gesamtmenge von 600 µmolar anstatt 6 mmolar vorlagen. Diese niedrigere Konzentration ist als eine "Niedrigsalz"-Konzentration bezeichnet worden, um verschiedene Amplifikationsreaktionsverfahren zu unterscheiden.
Figur 2 zeigt die Ergebnisse der Gelelektrophorese und Hybridisierung mit einer nachweisbaren Gensonde, wie in Beispiel 1 beschrieben ist. Diese Ergebnisse bestätigen wiederum die Vorteile der Erfindung, die zuvor betont worden sind, mit der Ausnahme, daß es ebenso offensichtlich ist, daß die Menge der Magnesiumchloridkonzentration die Ergebnisse nicht beeinflußte. Dieses Ergebnis war unerwartet, da die Konzentration von Magnesiumchlorid Amplifikationsreaktionen häufig beeinflußt.

Beispiel 3: Wirkung der Verwendung von Primern bei der PCR-Amplifikation, die Fehlpaarungen beim 3'-Ende aufweisen, unter Verwendung hoher Magnesiumsalzkonzentration und niedriger Hybridisierungstemperatur bei der Amplifikation

Dieses Beispiel wurde exakt wie Beispiel 1 durchgeführt, mit der Ausnahme, daß die Hybridisationstemperatur in den Amplifikationszyklen 40 ºC anstelle von 55 ºC betrug.
Die Ergebnisse sind in Figur 3 angegeben, wobei Agarosegelelektrophorese und Hybridisierung mit einer nachweisbaren Sonde zeigen, daß die Primer, die ein Nukleotid mit einer Thyminbase beim 3'-Ende aufweisen, für eine effiziente Amplifikation trotz Fehlpaarungen beim 3'-Ende, verglichen mit anderen Primern, äußerst brauchbar sind.

Claims

1. Verfahren zum Nachweis einer bakteriellen oder viralen Targetnucleinsäure, umfassend:

A. das In-Kontakt-bringen einer Probe, die eine bakterielle oder virale Nucleinsäure enthält, mit einer Primerzusammensetzung, die einen Satz von Primern für die bakterielle oder virale Nucleinsäure enthält,

um so hybridisierte Produkte der Primer und der Stränge der bakteriellen oder viralen Nucleinsäure zu bilden,

B. das Bilden von Primerextensionsprodukten in den hybridisierten Produkten, Primen, Verlängern und Amplifizieren der Primerextensionsprodukte,

C. das Abtrennen der erhaltenen Primerextensionsprodukte und in- Kontakt-bringen derselben mit einer Nachweis- oder Fängeroligonucleotidsonde, um ein komplementäres Produkt zu bilden, und

D. das Nachweisen des Vorliegens des komplementären Produktes als Indikation für das Vorliegen der bakteriellen oder viralen Targetnucleinsäure in der Probe,

dadurch gekennzeichnet, daß der Satz von Primern der Primerzusammensetzung im wesentlichen aus mindestens einem Primer besteht, der in jeder Position zu einer Sequenz der Nucleinsäure komplementär ist, mit Ausnahme einer einzelnen Position beim 3'-Ende des Primers oder bis zu 4 Nucleotiden von diesem, was zu einer einzelnen Fehlpaarung an der einzelnen Position zwischen dem Primer und der bakteriellen oder viralen Nucleinsäuresequenz führt, wobei der Primer ein Nucleotid mit einer Thyminbase an der Position der Fehlpaarung aufweist und mindestens ein Primer in dem Satz von Primern biotinyliert ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1,. bei dem ein Fängeroligonucleotid verwendet wird und wobei der Nachweis mittels eines Avidin-Enzym-Konjugats erreicht wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Konjugat Peroxidase umfaßt.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Polymerase aus Thermus aquaticus oder Thermus thermophilus isoliert wird oder ein synthetisch hergestelltes Äquivalent davon ist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Amplifikation oder zum Nachweis von HIV-I DNA.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die einzelne Fehlpaarung zwischen dem Primer und der amplifizierten oder nachgewiesenen Nucleinsäure am 3'-Ende des Primers oder eine Position entfernt davon vorliegt.