DE69114023T2

DE69114023T2 - Wasserunlösbares Reagenz, Nukleinsäure-Sonde, Testsatz und Verfahren zur Diagnose und Isolierung.

Info

Publication number: DE69114023T2
Application number: DE69114023T
Authority: DE
Inventors: John Bruce Findlay; Marlene Marie King; Harold Chester Warren
Original assignee: Johnson and Johnson Clinical Diagnostics Inc
Current assignee: Ortho Clinical Diagnostics Inc
Priority date: 1990-01-26
Filing date: 1991-01-17
Publication date: 1996-04-18
Anticipated expiration: 2011-01-18
Also published as: IE910264A1; FI910396A0; JPH0746999A; ATE129526T1; US5328825A; EP0439222A3; HK38196A; DE69114023D1; EP0439222B1; FI910396A; EP0439222A2; KR910014701A; CA2031659A1

Description

Die Erfindung betrifft ein wasserunlösliches Reagenz, das zusammengesetzt ist aus einem an ein Teilchen kovalent gebundenes Protein oder Kohlenhydrat mit niedrigem pI und daraus hergestellte Nukleinsäuresonden. Sie betrifft ebenfalls Verfahren zum Isolieren und Einfangen von Zielnukleinsäuren oder diagnostische Verfahren. Die Erfindung ist in der genetischen Forschung und Entwicklung, in diagnostischen Test, bei der DNA-Sequenzierung und der Synthese von Nukleinsäuren und Strukturgenen brauchbar.
Eine wichtige Eigenschaft von Nukleinsäuren, die das genetische Material sämtlicher lebenden Organismen bilden, ist ihre Fähigkeit, mit einer Nukleinsäure, die eine komplementäre Nukleotidsequenz aufweist, sequenzspezifische Wasserstoffbindungen zu bilden (d. h. zu hybridisieren). Diese Fähigkeit der Nukleinsäuren, mit komplementären Strängen von Nukleinsäuren zu hybridisieren, ist mit Erfolg in den als Hybridisierungstests bekannten Tests und in DNA-Reinigungstechniken verwendet worden.
In einem Hybridisierungstest wird eine Nukleinsäure mit einer bekannten Sequenz als eine Sonde in einer Testprobe verwendet, um mit einer "Ziel"- Nukleinsäure, die eine komplementäre Nukleinsäuresequenz aufweist, zu hybridisieren. Markieren der Sonde ermöglicht den Nachweis des Hybrids und dementsprechend auch der Zielnukleinsäure. Einige Hybridisierungstests sind als "Sandwich"-Tests bekannt und umfassen die Verwendung von zwei Sonden, von denen eine wie zuvor angegeben markiert ist, und eine zweite "Fänger"- Sonde auf irgendeine Weise auf einem Substrat (wie beispielsweise einem Filter, einem Blatt oder einem Teilchen) immobilisieret ist.
Da sämtliche Stämme eines bestimmten Organismusses oder einer virusinfizierten Zelle eine genetische Komponente in Form von Nukleinsäuren teilen, sind Hybridisierungstests wertvolle Forschungs- und Diagnosewekzeuge zum Nachweis und zur Diagnose verschiedener Erkrankungszustände in menschen, Tieren und Pflanzen. Darüber hinaus ist die Fähigkeit, eine spezifische Nukleotidsequenz zu sondieren, von potentiellem Wert bei der Identifizierung und der Diaganose von genetischen Störungen beim Menschen.
Auf dem Gebiet der Biochemie und der molekularen Biologie ist für die Untersuchung und die Synthese von genetischem Material oftmals die Reinigung oder Isolierung von Nukleinsäuren in einem Gemisch davon wichtig. Es ist eine Reihe von Verfahren entwickelt worden. bei denen Nukleinsäuren mittels Affinitätschromatographie isoliert werden, indem komplementäre Stränge verwendet werden, die an feste Träger gebunden sind.
Die Bindung von Oligonukleotiden an Träger verschiedener Arten ist auf eine Reihe von Wegen erreicht worden. Bei den meisten dieser Techniken ist es erforderlich, den Träger oder das Oligonukleotid oder beide zu modifizieren, um eine geeignete kovalente Bindung zu erreichen.
In der US-A-4,713,326 wird das Binden von Nukleinsäuren an feste Träger mittels einer photochemisch reaktiven Einlagerungsverbindung beschreiben, so daß bei Bestrahlung die Nukleinsäure an den Träger chemisch gebunden wird. Andere Linkergruppen, sowohl photochemische als auch nicht-photochemische, sind ebenfalls verwendet worden, um Oligonukleotide mit festen Trägern, beispielsweise Parktikeln, zu verbinden.
Proteine wie Avidin sind an carboxylierte Partikel kovalent gebunden worden, wie in der EP-A-0 138 297 beschreiben ist.
In einigen Fällen können Nukleinsäuren direkt an Parktikel gebunden werden, um Sonden herzustellen, beispielsweise wenn die Partikel an ihrer Oberfläche Carbonsäuregruppen aufweisen. Dies ist jedoch weder immer einfach noch bequem. Darüber hinaus werden aufgrund der hydrophoben Natur der Partikel, die solche reaktiven Gruppen aufweisen, und der Natur der Oligonukleotide Moleküle der Oligonukleotide an die Partikel adsorbiert, nachdem sie an diese kovalent gebunden sind. Eine solche Adsorption verhindert eine wirksame Hybridisierung des Oligonukleotids mit komplementären Nukleinsäuren.
Es wäre daher erwünscht, ein wirksames Mittel zur Hybridisierung oder Reinigung von Nukleinsäuren Mittels einer wasserunlöslichen Sonde zu besitzen.
Die zuvor angesprochenen Probleme bezüglich bekannter Sonden werden mit einer wasserunlöslichen Nukleinsäuresonde überwunden, die ein Oligonukleotid umfaßt, das an ein wasserunlösliches Teilchen gebunden ist, das oberflächenreaktive Gruppen aufweist,
wobei die Sonde dadurch gekennzeichnet ist, daß die Bindung durch eine Linkergruppe stattfindet, die ein chemisch modifiziertes Protein oder ein chemisch modifiziertes Kohlenhydrat ist, wobei das Protein oder Kohlenhydrat einen pI von 6 oder weniger aufweist,
das chemisch modifizierte Protein von einem Protein abgeleitet ist, an dem Aminogruppen hängen, die nach der Bindung an das wasserunlösliche Teilchen mit einem Acrylierungs-, Alkylierungs- oder Sulfonierungsmittel modifiziert worden sind, um Carbonsäuregruppen für eine kovalente Reaktion mit dem Oligonukleotid hereitzustellen,
das chemisch modifizierte Kohlenhydrat daran hängende Carbonsäuregruppen für eine kovalente Reaktion mit dem Oligonukleotid aufweist und
das chemisch modifizierte Protein oder Kohlenhydrat an die oberflächenreaktiven Gruppen des Teilchens kovalent gebunden ist, wobei weniger als 5 % der Fläche der Teilchenoberfläche von anderen Proteinen oder Kohlenhydraten bedeckt sind.
Darüber hinaus umfaßt ein Verfahren zum Einfangen und Isolieren einer Zielnukleinsäure:
A. das In-Kontakt-Bringen einer Testprobe, von der angenommen wird, daß sie eine Zielnukleinsäure enthält, mit der zuvor beschreibenen wasserunlöslichen Nukleinsäuresonde,
wobei das Oligonukleotid der Sonde zu der Zielnukleinsäure im wesentlichen komplementär ist,
wobei das In-Kontakt-Bringen unter Hybridisierungsbedingungen durchgeführt wird, so daß Hybridisierung der Zielnukleinsäure und des Oligonukleotids erreicht wird, wobei ein wasserunlösliches Hybridisierungsprodukt gebilet wird, und
B. Isolieren des hybridisierten Produkts vom Rest der Testprobe.
Darüber hinaus umfaßt ein Verfahren zum Nachweis der Zielnukleinsäure:
A. das In-Kontakt-Bringen einer Testprobe, von der angenommen wird, daß sie eine Zielnukleinsäure enthält, mit der zuvor beschriebenen wasserunlöslichen Nukleinsäuresonde,
wobei das Oligonukleotid der Sonde zu der Zielnukleinsäure im wesentlichen komplementär ist,
das In-Kontakt-Bringen unter Hybridisierungsbedingungen durchgeführt wird, so daß Hybridisierung der Zielnukleinsäure und des Oligonukleotids erreicht wird, wobei ein wasserunlösliches Hybridisierungsprodukt gebildet wird, und
B. Nachweisen des hybridisierten Produkts als eine Indikation für das Vorliegen der Zielnukleinsäure in der Testprobe.
Ein diagnostischer Testkit umfaßt:
(a) die zuvor beschreibene wasserunlösliche Nukleinsäuresonde und
(b) ein oder mehrere wasserlösliche Primer oder Sonden, die zu einer Zielnukleinsäure im wesentlichen komplementär sind, wobei die Zielnukleinsäure zu dem Oligonukleotid der Sonde der Komponente (a) ebenfalls im wesentliche komplementär ist.
Die vorliegende Erfindung stellt brauchbare wasserunlösliche Nukleinsäuresonden bereit, die aus Teilchen gebildet werden, die in einer Vielzahl von Untersuchungs- und diagnostischen Verfahren verwendet werden können, einschließlich Nukleinsäurereinigung, Amplifikation mittels Polymerasekettenreaktion und Hybridisierungstests. Diese Sonden sind äußerst effizient, da eine minimale Adsorption des Oligonukleotids an die Teilchenoberfläche vorliegt. Dennoch wird das Oligonukleotid wirksam mit den Teilchen verknüpft.
Diese Vorteile erreicht, indem das Oligonukleotid an die Teilchen durch ein Protein oder Kohlenhydrat gebunden wird, das einen pI von weniger als oder gleich 6 aufweist. Diese Linkergruppe wird durch kovalentes Binden eines Proteins oder Kohlenhydrats an das Teilchen erhalten, gefolgt von einer Modifizierung des Proteins oder Kohlenhydrats, um die Aminogruppen, die an ihm hängen, in Carbonsäuregruppen umzuwandeln, wodurch ihr pI auf 6 oder weniger gesenkt wird. Das Oligonukleotid wird dann an das modifizierte Protein oder Kohlenhydrat gebunden.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung bestimmter Sonden für die Reinigung, Amplifikation oder den Nachweis einer oder mehrerer Zielnukleinsäuren in einer Testprobe. Solche Proben können zelluläres oder virales Material, Haar, Körperflüssigkeiten oder andere Materialien, die genetische DNA oder RNA enthalten, umfassen. Während es das primäre Ziel der Reinigung sein kann, Materialien für diagnostische Verfahren herzustellen, können gereinigte Nukleinsäuren auch zur Verbesserung der Effizienz der Klonierung von DNA oder messenger-RNA verwendet werden oder um große Mengen der gewünschten Säure aus einem Gemisch von Nukleinsäuren zu erhalten, die bei chemischer Synthese erhalten werden. Andere Verwendungen gereinigter Zielnukleinsäuren sind dem Fachmann ohne weiteres ersichtlich.
Nukleinsäuren könne aus verschiedenen Quellen erhalten werden, einschließlich Plasmiden, natürlich vorkommender DNA oder RNA beliebiger Quellen (wie Bakterien, Hefen, Viren, Pflanzen und höhere Tiere und Menschen). Sie können aus verschiedenen Geweben extrahiert werden, einschließlich Blut, Gewebematerial oder anderen in der Technik bekannten Quellen, wobei bekannte Verfahren verwendet werden. Die vorliegende Erfindung ist besonders brauchbar zum Nachweis von Nukleinsäuresequenzen, die in Viren oder Zellen beliebiger Organismen gefunden werden, wie in genomischer DNA, bakterieller DNA, viraler RNA oder DNA oder RNA, die in mit Bakterien oder Viren infizierten Zellen gefunden werden. Diese Erfindung ist besonders brauchbar zum Nachweis von DNA aus Zellen, die mit HIV-I oder anderen Retroviren infiziert sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die erfindungsgemäße Sonde verwendet, nachdem eine Zielnukleinsäure in einer Kettenreaktion amplifiziert worden ist, bei der relativ zur Anzahl der beteiligten Reaktionsschritte exponentielle Mengen mindestens einer spezifischen Nukleinsäure gebildet werden. Das Produkt ist ein diskreter Nukleinsäureduplex mit Termini entsprechend den Enden der verwendeten spezifischen primer. Als Ausgangsmaterial kann jede Nukleinsäurequelle verwendet werden, vorausgesetzt, sie enthält die spezifische Nukleinsäure, die nachgewiesen werden soll, oder es wird angenommen, daß sie diese enthält. Mit "Nukleinsäure" ist ein Fragment oder ein ganzes Nukleinsäuremolekül gemeint. Darüber hinaus Können mehr als eine Nukleinsäure gleichzeitig gereinigt oder nachgewiesen werden, indem für jede Zielnukleinsäure ein spezielles Set wasserunlöslicher Sonden, Primer undmarkierter Sonden (im folgenden beschreiben) verwendet wird.
Der hier in Bezug auf Primer, Sonden oder nachzuweisenden Nukleinsäuren verwendete Begriff "Oligonukleotid" betrifft ein Molekül, das zwei oder mehr Dexoyribonukleotide oder Ribonukleotide, und vorzugsweise mehr als drei, umfaßt. Die genaue Größe ist nicht entscheidend, hängt jedoch von vielen Faktoren ab, einschließlich der letztendlichen Verwendung oder Funktion des Oligonukleotids. Das Oligonukleotid kann synthetisch oder duch Klonen erhalten werden.
Der Begriff "Primer" betrifft ein Oligonukleotid, gleichgültig, ob natürlich vorkommend oder synthetisch hergestellt, das in der Lage ist, als ein Initiationspunkt der Synthese zu wirken, wenn es unter Bedingungen eingesetzt wird, bei denen eine Synthese eines zu einem Nukleinsäurestrang komplementären Primerextensionsproduktes induzieret wird. Solche Bedingungen umfassen das Vorliegen von Nukleotiden (wie den vier Standard-Desoxyribonukleosidtriphosphaten) und einem Polymerisationsmittel, wie einer DNA- Polymerase, und geeignete Temperatur und pH.
Der hier verwendete Begriff "Sonde" betrifft Fänger- oder Nachweissonden, von denen jede ein Oligonukleotid umfaßt, das zu einer Targetnukleinsäure komplementär ist. Eine "Fängersonde" ist eine wasserunglösliche Sonde mit einem Oligonukleotid, das an ein wasserunlösliches Substrat gebunden ist. Die erfindungsgemäße wasserunlösliche Sonde kann als eine "Fängersonde" angesehen werden. Eine Nachweissonde ist üblicherweise wasserlöslich, obwohl eine Fängersonde ebenfalls zum Nachweis verwendet werden kann, falls dies gewünscht ist. Normalerweise enthalten wasserlösliche Nachweissonden jedoch ein Oligonukleotid, das auf irgendeine Weise nachweisbar markiert ist (wie beispielsweise mit einem Radioisotop, Enzym, fluoreszierenden Marker, chromogenen Marker oder einer anderen brauchbaren Nachweisgruppe).
Bei der Durchführung dieser Erfindung sind Primer, Sonden und Fragmente im wesentlichen komplementär zu einer spezifischen Nukleinsäuresequenze der Zielnukleinsäuresequenz. Mit "im wesentlichen komplementär" ist gemeint, daß eine ausreichende Anzahl von Basen auf komplementären Materialien vorliegen, die zueinander passen, so daß Hybridisierung stattfindet. Dies bedeutet jedoch nicht, daß jedes Basenpaar sich paart.
Die Sonden der vorliegenden Erfindung können in Hybridisierungstests verwendet werden, wie sie aus dem Stand der Technik bekannt sind. Normalerweise umfassen solche Tests die Hybridisierung einer Sonde mit einer Zielnukleinsäure und anschließenden Nachweis des Hybridprodukts auf irgendeine Weise. In einigen Ausführungsform ist die Sonde wasserunlöslich und nachweisbar Markiert, beispielsweise mit einem nachweisbaren Marker, der mit der Sonde verbunden ist (entweder als Teil des Oligonukleotids oder als Teil des wasserunlöslichen Teilchens). Das Hybrid wird von nicht hybridisierten Materialien abgetrennt und auf geeignete Weise nachgewiesen. In anderen Ausführungsformen, die allgemein als Sandwich-Hybridisierungstests bekannt sind, werden zwei Sonden verwendet, eine zum Einfangen der Zielnukleinsäure und die andere zum Nachweis. Das "Sandwich"-Hybrid wird auf geeignete Weise nachgewiesen. Die verschiedenen Details solcher Tests sind in der Technik einschließlich der zuvor angegebenen Literaturstellen gut bekannt.
In sämtlichen der Verfahren, bei denen die erfindungsgemäße Sonde verwendet wird, ist die Hybridisierung des Sondenoligonukleotids und der Zielnukleinsäure entscheidend. Hybridisierung findet normalerweise unter Bedingungen statt, die aus dem Stand der Technik gut bekannt Sind, wie beispielsweise Kontakt für mindestens 1 Minute, mäßiges Bewegen, ein pH- Bereich von 5 bis 9 und eine Temperatur von 0 bis 75 ºC, je nach der Tm der Sonde. Wie in der Technik bekannt ist, wird als Tm die Temperatur bezeichnet, bei der die Hälfte der Sondenmoleküle hybridisiert sidn und die Hälfte nicht.
In einer bevorzugten Ausfführungsform die erfindungsgemäße Sonde beim Nachweis einer Zielnukleinsäure verwendet, wobei Amplifikationstechniken eingesetzt werden, die nun verbreitet als Polymerasekettenreaktionen bekannt sind. Die Details derartiger Techniken sind in der US- A-4,683,195, der US-A-4,683,202 und der EP-A-0 258 017 beschreiben.
Insbesondere können für die Amplifikation und den Nachweis einer Zielnukleinsäure brauchbare Primer aus einer Reihe von Quellen erhalten werden oder mittels bekannter Techniken und Ausrüstung hergestellt werden, einschließlich z.B. eines ABI DNA-Synthesizers (erhältlich von Applied Biosystems) oder einer Synthesevorrichtung der Serien Biosearch 8600 oder 8800 (erhältlich von Milligen-Biosearch, Inc.) und bekannter Verfahren zu ihrer Verwendung. Aus biologischen Quellen isolierte, natürlich vorkommende Primer sind ebenfalls brauchbar (wie Restriktionsendonuklease-Verdauungen).
In einigen Ausführungsformen ist mindestens einer der in dem Nachweisverfahren verwendetem Primer (oder Sätze davon) miteinem spezifisch bindenden Liganden markiert. Der Begriff "markiert" bezieht sich auf die Tatsache, daß der Ligand an diesen Primer auf eine solche Weise gebunden ist, daß er nicht ohne weiteres abgelöst wird. Der spezifisch bindende Ligand kann Biotin oder ein Derivat davon sein, Avidin oder ein Derivat davon, ein Lectin, ein Zucker, ein Protein, ein Hapten, ein Arzneistoff oder eine immunologische Spezies, wie ein Antikörper oder ein antigenes Material.
Die vorliegende Erfindung ist zur Amplifikation oder zum Nachweis einer gereinigten Zielnukleinsäure geeignet, die zwei komplementäre Stränge aufweist. Die meisten interessierenden Nukleinsäuresequenzen sind bereits doppelsträngig, wie beispielsweise diejenigen, die in DNA gefunden werden. Einzelsträngige Nukleinsäuresequenzen, wie mRNA, können jedoch auf ähnliche Weise amplifiziert und nachgewiesen werden.
Eine spezifische Nukleinsäuresequenz wird gebildet, indem die Nukleinsäure, die diese Sequenz enthält, als ein Matrizenstrang verwendet wird. Wenn die Säure zwei Stränge enthält, ist es notwendig, die Stränge zu trennen (als Denaturierung bezeichnet), und zwar entweder als einen separaten Schritt oder gleichzeitig mit der Bildung von Primerextensionsprodukten.
Das Denaturieren wird mittels beliebiger geeigneter physikalischer, chemischer oder enzymatischer Mittel erreicht, wie im Stand der Technik beschrieben ist. Erwärmen auf eine geeignete Temperatur ist ein bevorzugtes Mittel.
Wenn die aufgetrennten Stränge zur Verwendung verfügbar sind, kann die Synthese zusätzlicher Nukleinsäurestränge mittels zwei oder mehr Primern (von denen mindestens einer wie zuvor beschrieben markiert ist) in einer gepufferten wäßrigen Lösung bei einem pH von 7 bis 9 durchgeführt werden. Vorzugsweise wird ein molarer Überschuß der beiden Primer zu der gepufferten Lösung zugegeben. Spezifische Mengen sind im Stand der Technik beschrieben. Die Desoxyribonukleotidtriphosphate dATP, dCTP, dGTP und dTTP werden zu dem Synthesegemisch ebenfalls in adäquaten Mengen zugegeben, und die erhaltene Lösung wird bis zu 10 Minuten lang auf 90 - 100 ºC erhitzt, vorzugsweise 1 bis 4 Minuten lang. Enzymcofaktoren, wie Magnesium- oder Manganionen, liegen ebenfalls bevorzugt in molarem Überschuß zu den Triphosphaten vor. Nach diesem Erwärmen wird die Lösung vorzugsweise auf Raumtemperatur abgekühlt, und ein geeignetes Mittel zum Induzieren (oder Katalysieren) der Bildung von Primerextensionsprodukten wird eingeführt. Dieses Induktionsmittel ist in der Technik allgemein als Polymerisationsmittel bekannt. Die Reaktion zum Bilden dieser Produkte wird unter bekannten Bedingungen durchgeführt (normalerweise von Raumtemperatur bis zu derjenigen Temperatur, bei der keine Polymerisation mehr stattfindet).
Das Polymerisationsmittel kann jede Verbindung oder Kombination von Reagen zien sein, die bewirken, daß die Synthese von Primerextensionsprodukten erreicht wird, einschließlich Enzymen (z. B. E. coli-DNA-Polymerase I, T4-DNA-Polymerase, Klenow-Polymerase, reverse Transkriptase und andere in der Technik bekannte). Besonders brauchbare Enzyme sind thermisch stabile Enzyme, geklont oder natürlich vorkommend, wie diejenigen, die aus verschiedenen Thermus-Bakterienarten erhalten werden. Andere Polymerisationsmittel sind im US-Patent 4,683,202 beschrieben.
Bevorzugte thermisch stabile Enzyme sind DNA-Polymerasen aus Thermus aquaticus, wie diejenigen, die in der EP-A-0 258 017 beschrieben sind. Andere brauchbare Enzyme sind von Rossi und anderen, Syst. Appl. Microbiol. 7 (2-3), S. 337 - 341, 1986, beschrieben worden. Viele brauchbare Polymerasen sind im Handel erhältlich. Normalerweise wird die Synthese von Extensionsprodukten am 3'-Ende eines jeden Primers initiiert und schreitet in der 5'- zur 3'-Richtung entlang des Matrizenstranges fort, bis die Synthese beendet ist. Einige Polymerisationsmittel (z. B. reverse Transkriptase) können in der 3'- zur 5'-Richtung entlang des Matrizenstranges fortschreiten.
Die neu gibildeten Primerextensionsprodukte, die die neu synthetisierten Stränge und ihre jeweiligen Primer umfassen, bilden mit den ursprünglichen Zielsträngen doppelsträngige Moleküle, die in den nachfolgenden Verfahrensschritten verwendet werden. Diese Stränge werden dann durch Denaturieren wie zuvor beschrieben getrennt, um einzelsträngige Moleküle bereitzustellen, auf denen wie zuvor beschrieben neue Nukleinsäuren synthetisiert werden. Es können zusätzliche Reagenzien notwendig sein, um das Amplifikationsverfahren am Laufen zu halten, nachdem die meisten Extensionsprodukte aus der spezifischen Nukleinsäuresequenz bestehen, die durch die beiden Primer gebunden ist (d. h. komplementäre Produkte).
Die Schritte der Trennung des Stranges und der Synthese von Extensionsprodukten können so oft wie notwendig wiederholt werden, um die gewünschte Menge der zum Nachweis benötigten spezifischen Nukleinsäure zu erzeugen. Normalweise wird die Schrittfolge mindestens einmal und vorzugsweise mindestens 10 bis 50 mal wiederholt.
Wenn mehr als eine gereinigte Zielnukleinsäure hergestellt werden soll, wird in dem zuvor beschriebenen allgemeinen Verfahren die geeignete Anzahl an Primersätzen verwendet.
An jedem beliebigen Punkt des erfindungsgemäßen Verfahrens kann nach der Bildung von mindestens einem Primerextensionsprodukt dieses Produkt mit einer Nachweissonde hybridisert werden (im folgenden beschrieben).
Normalweise wird, wenn eine gewünschte Menge der interessierenden Nukleinsäuresequenz erzeugt worden ist und die Primerextensionsprodukte zum letzten Mal aufgetrennt worden sind, das erste Primerextenionsprodukt mit einer wasserlöslichen Nachweissonde in Kontakt gebracht, die zum Nachweis markiert ist und dazu komplementär ist, um ein Produkt zu bilden. Die Sonde ist ein Oligonukleotid, das mit der Zielnukleinsäuresequenz komplementär ist. Das Oligonukleotid kann jede beliebige geeignete Länge an Nukleinsäuren aufweisen, weist jedoch vorzugsweise von 15 bis 40 Nukleinsäuren auf. Es ist mit einem beliebigen geeigneten, nachweisbaren Material markiert (üblicherweise am 5'-Ende). Verfahren zum Anbringen von Markern und zum Herstellen von Sonden sind in der Technik gut bekannt, wie z. B. bei Agrawal und anderen, Nucleic Acid Res., 14, S. 6227 - 45 (1986), beschrieben ist. Brauchbare Marker umfassen Radioisotope, elektronendichte Reagenzien, Chromogene, Fluorogene, phosphoreszierende Gruppen, Ferritin und andere magnetische Teilchen, Biotin, Avidin, chemilumineszierende Gruppen und Enzyme (welche bevorzugt sind). Brauchbare Enzyme umfassen Glucoseoxidase, Peroxidase, Uricase, alkalische Phosphatase und andere in der Technik bekannte. Substrate und farbstoffbildende Zusammensetzungen für solche Enzyme sind gut bekannt.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der Marker Peroxidase, und an einem Punkt des Tests werden Wasserstoffperoxid und geeignete farbstoffbildende Zusammensetzungen zugegeben, um einen nachweisbaren Farbstoff bereitzustellen. Brauchbare farbstoffbildende Reagenzien umfassen z. B. Tetramethylbenzidin und Derivate und Leukofarbstoffe, wie Triarylimidazol-Leukofarbstoffe (wie in der US-A-4,089,747 beschrieben) oder andere Verbindung, die in Gegenwart von Peroxidase und Wasserstoffperoxid unter Bildung eines Farbstoffs reagieren. Eine besonders brauchbare farbstoffbildende Zusammensetzung ist in den folgenden Beispielen und in der EP-A-0 380 236 angegeben.
Der Nachweis des Vorliegens der Sonde, die in dem komplementären Produkt, vorliegt, kann mittels geeigneter und bekannter Nachweisausrüstungen und -verfahren erreicht werden. Bestimmte Sonden können ohne die Verwendung von Nachweisausrüstung für das Auge sichtbar sein. Es ist ebenfalls hilfreich, das Verfahren in einem geeigneten Behälter durchzuführen. Der einfachste Behälter wäre ein Teströhrchen Kolben oder Becherglas, es sind jedoch raffinieretere Behälter entwickelt worden, um automatisierte Verfahren zur Durchführung des Verfahrens zu erleichern.
In einer anderen Ausführungsform wird die amplifizierte Zielnukleinsäure nachgewiesen, indem ein Primer verwendet wird, an den ein spezifisch bindender Ligand wie Biotin oder Avidin konjugiert ist. Dieser Ligand kann mit seinem Rezeptormolekül (d. h. dem korrespondierenden reaktiven Material) umgesetzt werden, der wie zuvor beschrieben geeignet markiert ist. Beispielsweise kann ein biotinylierter Primer mittels eines enzymmarkierten Streptavidinmoleküls nachgewiesen werden. Andere spezifisch bindende Paare, wie Antikörper-Antigen, Antikörper-Hapten, Zucker-Lectin, können auf ähnliche Weise verwendet werden.
Damit das amplifizierte Zielnukleinsäureprodukt nachgewiesen werden kann, wird es mit einer Fängersonde (wie zuvor angegeben) hybridisiert. Das erhaltene, unlöslich gemachte, komplexierte Produkt kann von nicht-komplexierten Materialien mittels Filtration, Zentrifugation, Waschen oder anderen geeigneten Trenntechniken abgetrennt werden.
Besonders brauchbare Trennmittel sind mikroporöse Filtermembranen, wie die von Pall Corp. auf den Markt gebrachten Polyamidmembranen (z. B. als LoProdyne - oder Biodyne -Membranen). Sie können unbeschichtet oder mit Surfactants oder anderen Materialien vorbeschichtet verwendet werden, die die analytischen Verfahren erleichtern.
Die Membranen können als ein separates Substrat mit geeigneten Behältern zum Durchführen anderer Schritte in dem Test verwendet werden. Vorzugsweise werden sie jedoch in Testvorrichtungen angebracht. In der Technik sind verschiedene Testvorrichtungen bekannt, einschließlich der in der US- A-3,825,410, der US-A-3,888,629, der US-A-3,970,429 und der US-A-4,446,232 beschriebenen. Bsonders brauchbare Vorrichtungen sind in der EP-A-0 308 231 beschrieben.
Somit umfaßt das Verfahren in einer bevorzugten Ausführungsform für den Nachweis einer Zielnukleinsäure:
A. Das Amplifizieren einer Zielnukleinsäure in einer Testprobe in Gegenwart von komplementären Primern, Desoxyribonukleotidtriphosphaten und einem Polymerisationsmittel,
B. In-Kontakt-Bringen der amplifizierten Zielnukleinsäure mit einer wasserunlöslichen Nukleinsäuresonde, die ein Oligonukleotid umfaßt, das durch eine Linkergruppe, die ein Protein oder Kohlenhydrat mit einem pI von 6 oder weniger ist, an ein wasserunlösliches Teilchen gebunden ist,
wobei das Protein oder Kohlenhydrat mit einem Acrylierungsmittel, Alkylierungsmittel oder Sulfonylierungsmittel chemisch modifiziert worden ist, um Gruppen zur kovalenten Reaktion mit dem Oligonukleotid bereitzustellen, und kovalent an die Teilchenoberfläche gebunden worden ist, die im wesentlichen frei von anderen Proteinen oder Kohlenhydraten ist,
wobei ein immobilisiertes, hybridisiertes Produkt aus Zielnukleinsäure und der wasserunlöslichen Sonde gebildet wird,
C. Abtrennen des immobilisierten Produkts von nicht immobilisierten Materialien, und
D. Nachweisen des immobilisierten Produkts als eine Indikation für die Menge der Zielnukleinsäure in der Probe.
Das erfindungsgemäße wasserunlösliche Reagenz, das zum Herstellen der erfindungsgemäßen Sonde verwendet werden kann, umfaßt ein Protein oder Kohlenhydrat mit einem pI von 6 oder weniger, das an wasserunlösliche Partikel kovalent gebunden ist. Brauchbare Teilchen können aus jedem beliebigen geeigneten, synthetisch oder natürlich vorkommenden Material hergestellt werden, das sich in Wasser nicht löst oder merklich quillt. Geeignete teilchenförmige Materialien umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Cellulosematerialien, Glas, Keramiken, Metalle und verschiedene Polymere. Sie können jede geeignete brauchbare Form und Größe aufweisen, einschließlich Kugelform, ellipsoide, kubische, unregelmäßige oder flache Form und eine durchschnittliche Größenabmessung (z. B. Durchmesser) von 0,1 bis 10 um aufweisen, obwohl in bestimmten Fällen größere oder kleinere Größen brauchbar sein können.
Vorzugsweise sind die Teilchen kugelförmig und weisen einen durchschnittlichen Durchmesser von 0,1 bis 10 um auf und sind aus synthetischen Polymeren zusammengesetzt, die auf der Oberfläche Gruppen aufweisen, die mit Proteinen oder Kohlenhydraten reagieren. Brauchbare reaktive Gruppen umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Carboxy, Amino, Sulfhydryl, Aldehyd, aktiviertes 2-substituierete Ethylsulfonyl, Vinylsulfonyl, aktive Halogenatome, Vinylsulfonylalkylen, Nitroaryl, Ester und andere, die dem Fachmann ohne weiteres ersichtlich sind. Besonders brauchbare reaktive Gruppen umfassen Carboxy-, aktive Halogenatome-, Vinylsulfonyl-, Vinylsulfonylalkylen- und aktivierte 2-substituierte Ethylsulfonylgruppen. Monomere, die aktivierte 2-substituierte Ethylsulfonylgruppen aufweisen, sind am meisten bevorzugt. Einige dieser Materialien sind ausführlich in der EP-A-0 302 715 beschrieben. Solche Monomere sind entweder im Handel erhältlich oder können von einem Durchschnittschemiker ohne weiteres hergestellt werden.
Die Proteine oder Kohlenhydrate mit niedrigem pI sind an die zuvor angegebenen Teilchen kovalent gebunden. Normalerweise wird nur ein Protein oder Kohlenhydrat verwendet, obwohl Gemische verwendet werden können, falls dies gewünscht ist. Diese Materialien weisen einen pI von 6 oder weniger auf und sind wasserlöslich. Der Begriff pI (oder Isoelektrischer Punkt) ist bekannt als der pH, bei dem eine gleiche Anzahl positiver und negativer Ladungen in einem Molekül vorliegen, so daß das Molekül ladungsneutral ist. Der pI eines Proteins oder Kohlenhydrats kann mittels Standardmaterialien und -verfahren gemessen werden. Er kann beispielsweise durch isoelektrisches Fokussieren gemessen werden, wobei eine LKB-Ampholine PAG-Platte (erhältlich von LKB-Produkter AB, Bromma, Schweden), pH-Bereich 3,5 bis 9,5, und Standardeichmittel verwendet werden.
Die hier brauchbaren Proteine und Kohlenhydrate können immunologisch reaktive Materialien sein, d. h. Antikörper oder antigene Materialien, die in einem geeigneten Wirtssäuger eine Immunantwort hervorrufen und die an Antikörper-Antigen-Reaktionen teilnehmen. Vorzugsweise sind die Proteine und Kohlenhydrate jedoch nicht immunologisch reaktiv, d. h., daß sie an immunologischen Reaktionen nicht in einem nennenswerten Umfang teilnehmen.
Brauchbare wasserlösliche, nicht immunologisch reaktive Proteine umfassen Caseinderivate oder andere Proteinderivate, die negativ geladen sind, z. B. succinyliertes Casein, glutaryliertes Casein, succinyliertes Rinderserumalbumin, succinyliertes Kollagen und andere, die dem Fachmann ohne weiteres ersichtlich sind. Solche Derivate werden normalerweise durch Acylierung, Alkylierung oder Sulfonierung von Casein, Rinderserumalbumin, Kollagen und anderen Proteinen, die geeignete Amingruppen aufweisen, erhalten, wobei auf dem Protein oder Kohlenhydrat reaktive Carboxygruppen erhalten werden. Solche zu modifizierenden Protein und Kohlenhydrate sind normalerweise ohne weiteres im Handel erhältlich.
Acrylierungsmittel und -bedingungen sind z. B. in der US-A-4,591,571 beschrieben und umfassen Anhydride, Acylhalogenide und Ester, die von Dicarbonsäuren und Polycarbonsäuren abgeleitet sind. Succinanhydrid ist ein bevorzugtes Acylierungsmittel. Die Succinylierung von Casein ist im folgenden Beispiel 1 beschrieben.
Brauchbare Alkylierungs- und Sulfonierungsmittel umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Bromessigsäure, Chloressigsäure, Fluornitrobenzol, m-(Chlorsulfonyl)benzoesäure, Brommalonsäure, Brompropionsäure und p-(Chlorsulfonyl)benzoesäure.
Die Bedingungen zur Acylierung, Alkylierung oder Sulfonylierung eines Proteins umfassen normalerweise der Verwendung eines Boratpuffers (0,05 molar, pH 8,5) bei Raumtemperatur, wobei die dreifache Menge Modifizierungsmittel für die Menge (bezogen auf des Gewicht) des Proteins verwendet wird.
Das Protein zur Verwendung in dieser Erfindung wird nach seiner kovalenten Bindung an die zuvor angegebenen Teilchen modifiziert.
Brauchbare wasserlösliche Kohlenhydrate, die einen niedrigen pI aufweiseng, umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Carboxymethylcellulose, Carboxyethylcellulose und andere, die dem Fachmann ohne weiteres ersichtlich sind. Solche Materialien sind normalerweise im Handel erhältlich.
Eine Gruppe bevorzugter Proteine und Kohlenhydrate mit niedrigem pI umfassen succinyliertes Casein, succinyliertes Kollagen, glutaryliertes Casein, succinyliertes Rinderserumalbumin, Carboxymethylcellulose und Carboxyethylcellulose. Succinyliertes Casein ist besonders bevorzugt.
Das erfindungsgemäße wasserunlösliche Reagenz wird normalerweise hergestellt, indem zuerst das Protein oder Kohlenhydrat mit den oberflächenreaktiven Gruppen auf den Partikeln umgesetzt wird, um sie zu binden. Die Proteine können direkt mit den Oberflächengruppen oder mit Linkergruppen, die sich auf den Teilchen befinden, umgestzt werden. Bedingungen zum Binden der Proteine oder Kohlenhydrate werden allgemein durch In-Kontakt-Bringen der Teilchen und des Proteins (oder Kohlenhydrats) für einen Zeitraum (normalerweise mindestens sechs Stunden) bei einem pH und bei Temperaturbedingungen, die die Reaktion erleichtern, durchgeführt. Ein brauchbarer pH-Wert ist üblicherweise von 5 bis 9, und die Temperatur beträgt normalerweise 20 bis 40 ºC. Eine typische Vorgehensweise ist im folgenden Beispiel 1 beschrieben.
Wenn das Protein oder Kohlenhydrat modifiziert worden ist, um reaktive Carboxygruppen bereitzustellen, wird ein Oligonukleotid daran gebunden. Die zur Herstellung von Sonden verwendeten Oligonukleotide sind zuvor allgemein beschrieben worden. Sie weisen normalerweise eine Länge von 15 bis 50 Nukleotiden auf und sind zu einer Nukleinsäuresequenz der Zielnukleinsäure komplementär. Sie werden an das modifizierte Protein oder Kohlenhydrat normalerweise durch Carbodiimidaktivierung der Carbonylgruppe in 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäurepuffer (pH 6) gebunden. Eine typische Vorgehensweise zum Herstellen einer Sonde ist im folgenden Beispiel 2 angegeben.
Wie zuvor angemerkt, kann diese Sonde auch einen damit verbundenen nachweisbaren Marker aufweisen, was bedeutet, daß ein nachweisbarer Marker in gewisser Weise ein Teil der Sonde sein kann. Beispielsweise kann die Protein- oder Kohlenhydrat-Verknüpfung oder das Oligonukleotid markiert sein, beispielsweise mit einem Enzym oder Radioisotop mittels bekannter Chemie. Alternativ kann ein Marker in den Teilchen oder auf ihrer Oberfläche vorliegen, wie beispielsweise in einer Ausführungsform mit einem Teilchen, in dem ein Farbstoff aufgenommen ist.
Die Teilchen der Sonde weisen keine in irgendeiner anderen Weise an sie gebundene Proteine oder Kohlenhydrate auf als die hier beschriebenen Materialien mit niedrigem pI.
Die erfindungsgemäße Sonde kann als eine Komponente eines diagnostischen Testkits zusammen mit geeigneten Reagenzien, Testzubehör und Instruktionen, die für einen gegebenen diagnostischen Test benötigt werden, bereitgestellt werden. Brauchbare Reagenzien, die in dem Testkit enthalten sein können, umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt, wasserlösliche Sonden oder Primer, die auch zu der Zielnukleinsäure komplementär sind, Waschlösungen, farbstoffbildende Zusammensetzungen, Enzymsubstrate und Polymerase-Kettenreaktionsreagenzien.
Die folgenden Beispiele sollen die Durchführung der vorliegenden Erfindung veranschaulichen. Die Erfindung soll dadurch nicht eingeschränkt werden. Sämtliche Prozentangaben sind Gewichtsprozent, falls nicht anders angegeben.

Herstellung von wasserunlöslichem Reagenz

Ein bei der Durchführung der Erfindung brauchbares Reagenz wurde durch das folgende Verfahren hergestellt:
Polymere Teilchen, umfassend Poly[styrol-co-m- & p-(2-chlorethylsulfonylmethyl)-styrol] (Molverhältnis 95,5 : 4,5, durchschnittliche Größe 2,2 um) wurden durch die in der EP-A-0 323 692 beschriebenen Verfahren hergestellt.
Casein wurde an diese Teilchen auf folgende Weise gebunden: Eine Lösung von Casein (Sigma Chemical, 4,94 ml von 2,57 mg/ml in 0,05 molarem Boratpuffer, pH 8,5), Thimerosal (0,01 %) und die angegebene Suspension von polymeren Teilchen (17,7 ml in Boratpuffer, 0,0637 g/ml) wurde 16 Stunden lang bei Raumtemperatur einer sogenannten end-over-end-Rotation unterzogen. Das Gemisch wurde dann zentrifugiert, und die Pufferlösung wurde verworfen. Das erhaltene Pellet wurde in Glycinpuffer (0,1 molar, 50 ml, pH 8,5) und Thimerosal (0,01 %) resuspendiert. Dieses Gemisch wurde zentrifugiert, und das erhaltene Pellet wurde in Glycinpuffer (250 ml) zu einer Feststoffkonzentration von 0,45 % resuspendiert.
Eine Probe der Teilchensuspension (50 ml), die 2,54 g Teilchen enthielt, wurde dreimal mit Boratpuffer (10 ml, 0,05 molar, pH 8,5) gewaschen, mit Succinanhydrid (Sigma Chemical, 0,762 ml) in einer Lösung von Dimethylsulfoxid (10 mg/ml) gemischt und vier Stunden lang bei Raumtemperatur umgesetzt, um die Caseinmoleküle zu modifizieren, wobei Carboxygruppen erhalten wurden. Das Gemisch wurde zentrifugiert und die Lösung verworfen. Das erhaltene Pellet wurde dreimal mit Glycinpuffer (50 ml, 0,01 molar, pH 8,5) gewaschen und in Glycinpuffer zu einer Feststoffkonzentration von 0,45 % resuspendiert, wobei das gewünschte Reagenz erhalten wurde.

Beispiel 1: Herstellung einer wasserunlöslichen Nukleinsäuresonde

Eine Suspension des zuvor beschriebenen Reagenzes (15 ml, 0,0045 g/ml) in Glycinpuffer wurde zentrifugiert und des Pellet in 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäurepuffer (0,1 molar, pH 6) resuspendiert. Dieses Verfahren wurde zweimal wiederholt, und das erhaltene Pellet wurde mit 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarboiimid-Hydrochlorid (0,338 ml einer Lösung von 100 mg/ml in demselben Puffer) und dem Oligonukleotid mit der im folgenden angegebenen Sequenz (0,654 uml einer Lösung von 5,73 OD/ml Puffer) gemischt. Diese Suspension wurde 16 Stunden lang bei Raumtemperatur einer sogenannten end-over- end-Rotation unterzogen und zentrifugiert, und des Pellet wurde in nanoreinem Wasser (15 ml) resuspendiert. Dieses Zentrifugierverfahren wurde dreimal wiederholt, und das erhaltene Pellet wurde in Wasser suspendiert, wobei man eine Suspension der wasserunlöslichen Sonde mit 0,45 % Feststoffen erhielt.
Das Sondenoligonukleotid wies die Nukleinsäuresequenz auf:

SEQ. ID NO: 1

5'-ATCCTGGGAT TAAATAAAAT AGTAAGAATG T-3'

Beispiel 2: Diagnostischer Test, bei dem die Sonde verwendet wird

Die in Beispiel 1 hergestellte Sonde wurde auf die im folgenden beschriebene Weise zum Nachweis einer Zielnukleinsäure verwendet. Dieses Beispiel demonstriert den Nachweis von HIV-I-DNA mittels eines sogenannten "flow through"- Verfahrens, bei dem eine wasserunlösliche Sonde auf einer Filtermembran in einer Einweg-Testvorrichtung immobilisiert wird. Die Hybridisierung mit dem HIV-I-DNA-Target findet unter Bildung eines wasserunlöslichen Produktes statt, dann werden wasserlösliche Materialien durch die Filtermembran gewaschen. Das wasserunlösliche Produkt wird auf der Membranoberfläche nachgewiesen.

Materialien:

Eine Leukofarbstofflösung, die 2-(4-Hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl)-4,5- bis(4-methoxyphenyl)imidazol enthielt, wurde wie folgt hergestellt: Fester Leukofarbstoff (zum Herstellen einer 0,1 %-igen Lösung) wurde in einer Lösung von 20 % Poly(vinylpyrrolidon) in Natriumphosphatpuffer (5 mmolar) aufgelöst. Diese Lösung wurde dann zu einer Lösung zugegeben, die Wasserstoffperoxid (10 mmolar), Elektronentransferagens 4'-Hydroxyacetanilid (5 mmolar) und Chelatbildner Diethylentriaminpentaessigsäure (10 umolar) in Natriumphosphatpuffer enthielt, wobei man eine Endkonzentration von 1 % Poly(vinylpyrrolidon) und 0,005 % Leukofarbstoff erhielt.
Succinyliertes Casein wurde hergestellt, indem Casein mit einem gleichen Gewicht Succinanhydrid vier Stunden lang bei 15 ºC umgesetzt wurde, dann wurde das Produkt durch Dialyse gereinigt.
Das Ziel-DNA-Fragment, daß in dem Beispiel nachgewiesen wurde, war ein 180-Nukleotid-Segment der gag-Region (Kernprotein) des HIV-I-Genoms, das in ein Derivat des M13-Vektors kloniert und mittels Standardverfahren hergestellt wurde.
Die bei der Amplifikation der vorbestimmten DNA-Stränge verwendeten Primer wiesen die folgenden Nukleotidsequenzen auf:

SEQ ID NO: 2

5'-N-TTTGGTCCTT GTCTTATGTC CAGAATGC-3'
und

SEQ ID NO: 3

5'-ATAATCCACC TATCCCAGTA GGAGAAAT-3'
wobei N für einen Biotintetraethylenglycol-Spacer steht, der nach den in der WO-A-89/02931 beschreibenen Verfahren hergestellt und gebunden wurde.
DNA-Polymerase wurde aus Thermus aquaticus gemäß den in der EP-A-0 258 017 beschriebenen Verfahren isoliert (1 Unit entspricht 10 mmol dNTP, die in das Primerextensionsprodukt in 30 Minuten bei 37 ºC eingebaut werden).
Ein Streptavidin-Meerrettichperoxidase-Konjugat wurde von Zymed Labs (San Francisco) erhalten und 1 : 8000 mit einer phosphatgepufferten Salzlösung verdünnt, die Casein (0,5 %), 3-(N-Morpholino)propansulfonsäurepuffer (100 mmolar, pH 7,5) und Konservierungsmittel (0,01 %) enthielt. Die Konjugatendkonzentration betrug 156 ng/ml. Die phosphatgepufferte Salzlösung enthielt Natriumphosphat (25 mmolar, pH 7,3) und Natriumchlorid (75 mmolar).
Die wasserunlösliche Sonde von Beispiel 2 (1 ul einer 0,45 %-igen Suspension) wurde auf einem definierten Bereich (weniger als etwa 2 mm²) einer jeden von mehreren mikroproösen Membranen (Biodyne A Nylonmembranen, die mit 1 g/m² succinyliertem Casein beschichtet waren) aufgebracht, die sich in Testvertiefungen von Surecell Eingweg-Testvorrichtungen (Eastman Kodak Co.) befanden. Man ließ die Sondensuspension etwa 30 Minuten lang bei Raumtemperatur trocknen. Die erhaltenen Testartikel wurden dann in dem im folgenden beschriebenen Test verwendet.

Testverfahren:

Zu einer Pufferlösung, die Tris(hydroxymethy)aminomethanpuffer (10 mmolar, pH 8), Kaliumchlorid (50 mmolar), Magnesiumchlorid (10 mmolar) und Gelatine (10 ug) enthielt, wurden die zuvor beschriebenen Primer (jeweils 100 pmole), dNTPs (jeweils 1,5 mmolar), die zuvor beschriebene Polymerase (7,5 Units) und DNA der menschlichen Plazenta (Signa, 1 ug) zugegeben. Zusätzlich wurde das zuvor beschriebene DNA-Target (10&supmin;¹&sup6; molar) zugegeben, und das Gesamtvolumen betrug 100 ul.
Es wurde eine Kontrolle (100 ul) hergestellt, die DNA der menschlichen Plazenta (10 ug/ml) enthielt, die das β-Globin-Gen als Target und die geeigneten für β-Globin-DNA spezifischen Primer, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, enthält, wobei ein Primer biotinyliert war.
Jede zuvor beschriebene Lösung wurde in ein Polypropylen-Mikrozentrifugenröhrchen gegeben, Primerextensionsprodukte wurden gebildet und die Amplifikation mittels 30 aufeinanderfolgender thermischer Zyklen wie folgt durchgeführt:
70 ºC ansteigend auf 95 ºC 1 Minute
95 ºC 0,5 Minuten (denaturieren)
95 ºC absinken auf 55 ºC 1,25 Minuten
55 ºC 0,5 Minuten (hybridisieren)
55 ºC ansteigend auf 70 ºC 0,75 Minuten
70 ºC 1 Minute (verlängern)
Nach Amplifikation über die 30 thermischen Zyklen wurden 5-ul-Aliquote eines jeden Gemischs zu einer Lösung (95 uml) zugegeben, die Tris(hydroxymethyl)aminomethanpuffer (10 mmolar, pH 8), Kaliumchlorid (50 mmolar), Magnesiumchlorid (10 mmolar) und Gelatine (1 umg/10 ml Lösung) enthielt, hitzedenaturiert (5 Minuten bei 95 ºC), dann zu den Testvertiefungen der zuvor beschriebenen Surecell -Testvorrichtungen zugegeben (etwa 95 ul einer jeden Lösung in jede Vertiefung).
Über jede Vertiefung wurde ein Band gegeben, um sie zu verschließen, und die Vorrichtungen wurden 5 Minuten lang bei 42 ºC inkubiert, um das amplifizierte HIV-I-DNA-Fragment mit der in den Testvertiefungen immobilisierten wasserunlöslichen Sonde zu hybridisieren. Das Band wurde dann von jeder Testvertiefung entfernt, anschließend wurde mit einer gepufferten Lösung (250 ul) gewaschen, die Phosphatpuffer (10 mmolar, pH 7,4), Natriumchlorid (150 mmolar), Ethylendiamintetraessigsäure (1 mmolar) und Natriumdecylsulfat (1 %) bei 55 ºC enthielt.
Das zuvor beschriebene Peroxidasekonjugat (50 ul, 7,8 ng) wurde zu jeder Testvertiefung zugegeben, und die Vorrichtungen wurden 2 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Ein zweiter Waschschritt (250 ul) wurde mittels der zuvor angegebenen gepufferten Lösung durchgeführt. Die Leukofarbstofflösung (100 ul) wurde zu jeder Testvertiefung zugegeben, und anschließend wurde bei Raumtemperatur nochmals 2 Minuten lang inkubiert. Die erhaltene farbstoffbildende Reaktion wurde durch die Zugabe von Natriumazid (100 ul von 0,1 %) gestoppt, und der erhaltene Farbstoff wurde auf den Membranen bestimmt.
Die Menge des auf der Membran in dem Test gebildeten Farstoffs wurde visuell auf einer Skala von 0 bis 5 bewertet (0 bedeutete keine Dichte und 5 bedeutete die Höchste Dichte). Der Hintergrundwert wurde aus einer Ablesung der Dichte auf dem Membranbereich erhalten, auf dem kein wasserunlösliche Sonde vorlag. Die Ablesung der Farbstoffdichte für den Test wurde mit etwa 4,8 bewertet, währen die Hintergrunddichte etwa 0,5 betrug.

SEQUENZPROTOKOLL DER PROBEN

SEQ. ID NO: 1

ART DER SEQUENZ: Nukleotid
LÄNGE DER SEQUENZ: 31 Basen
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: Gensonde
UNMITTELBARE QUELLE: synthetisch hergestellt
EIGENSCHAFTEN: Nukleinsäuresequenz in der gag-Region (Kernprotein) des HIV-I-Genoms, die in ein Derivat des M13-Vektors kloniert wurde
5'-ATCCTGGGAT TAAATAAAAT AGTAAGAATG T-3'

SEQ. ID NO; 2

ART DER SEQUENZ: Nukleotid
LÄNGE DER SEQUENZ: 28 Basen
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: Linear
ART DES MOLEKÜLS: Primer
UNMITTELBARE QUELLE: synthetisch hergestellt
EIGENSCHAFTEN: Komplementär zu der Nukleinsäuresequenz in der gag-Region von HIV-I-DNA
MERKMALE: Markiert mit Biotinderivat für die Reaktion mit Avidin-Enzym-Konjugat, das Derivat wurde nach den in der WO-A-89/02931 beschriebenen Verfahren hergestellt
5'-N-TTTGGTCCTT GTCTTATGTC CAGAATGC-3'

SEQ, ID NO: 3

ART DER SEQUENZ: Nukleotid
LÄNGE DER SEQUENZ: 28 Basen
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: Primer
UNMITTELBARE QUELLE: synthetisch hergestellt
EIGENSCHAFTEN: Komplementär zu Nukleinsäure in der gag-Region von HIV-I-DNA
5'-ATAATCCACC TATCCCAGTA GGAGAAAT-3'

Claims

1. Wasserunlösliche Nucleinsäuresonde, umfassend ein Oligonucleotid, das an ein wasserunlösliches Teilchen gebunden ist, das oberflächenreaktive Gruppen aufweist,

wobei die Sonde dadurch gekennzeichnet ist, daß die Bindung durch eine Linkergruppe stattfindet, die ein chemisch modifiziertes Protein oder ein chemisch modifiziertes Kohlenhydrat ist, wobei ein solches Protein oder Kohlenhydrat einen pI von 6 oder weniger aufweist,

wobei das chemisch modifizierte Protein von einem Protein abgeleitet ist, an dem Aminogruppen hängen, die nach der Bindung an das wasserunlösliche Teilchen mit einem Acylierungs-, Alkylierungs- oder Sulfonylierungsmittel modifiziert worden sind, um Carbonsäuregruppen für eine kovalente Reaktion mit dem Oligonucleotid bereitzustellen,

das chemisch modifizierte Kohlenhydrat daran hängende Carbonsäuregruppen für eine kovalente Reaktion mit dem Oligonucleotid aufweist und

das chemisch modifizierte Protein oder Kohlenhydrat an die oberflächenreaktiven Gruppen des Teilchens kovalent gebunden ist, wobei weniger als 5 % der Fläche der Teilchenoberfläche von anderen Proteinen oder Kohlenhydraten bedeckt sind.

2. Sonde nach Anspruch 1, wobei das Oligonucleotid eine Nucleinsäuresequenz ist, die mit einem Strang von HIV-I-DNA komplementär ist.

3. Sonde nach einem der Ansprüche 1 und 2, die einen damit verbundenen nachweisbaren Marker aufweist.

4. Sonde nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das wasserunlösliche Teilchen ein synthetisches polymeres Teilchen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 0,1 bis 10 um ist.

5. Sonde nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die polymeren Teilchen aus Monomeren hergestellt sind, reaktive Gruppen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus aktiven Halogenatomen, Carboxy-, aktivierten 2-substituierten Ethylsulfonyl-, Vinylsulfonyl- und Vinylsulfonylalkylengruppen aufweisen.

6. Sonde nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das chemisch modifizierte Protein oder Kohlenhydrat succinyliertes Casein, glutaryliertes Casein, succinyliertes Collagen, succinyliertes Rinderserumalbumin, Carboxymethylcellulose oder Carboxyethylcellulose ist.

7. Verfahren zum Einfangen und Isolieren einer Zielnucleinsäure, umfassend:

A. In-Kontakt-bringen einer Testprobe, von der angenommen wird, daß sie eine Zielnucleinsäure enthält, mit der wasserunlöslichen Nucleinsäuresonde nach einem der Ansprüche 1 bis 6,

wobei das Oligonucleotid der Sonde im wesentlichen komplementär zur der Zielnucleinsäure ist,

wobei das In-Kontakt-bringen unter Hybridisierungsbedingungen durchgeführt wird, so daß Hybridisierung der Zielnucleinsäure des Oligonucleotids erreicht wird, wobei wasserunlösliches Hybridisierungsprodukt gebildet wird, und

B. Isolieren des hybridisierten Produktes von dem Rest der Testprobe.

8. Verfahren zum Nachweis einer Zielnucleinsäure, umfassend:

wobei das Oligonucleotid der Sonde im wesentlichen zu der Zielnucleinsäure komplementär ist,

wobei das In-Kontakt-bringen unter Hybridisierungsbedingungen durchgeführt wird, so daß Hybridisierung der Zielnucleinsäure und des Oligonucleotids erreicht wird, wobei ein wasserunlösliches Hybridisierungsprodukt gebildet wird, und

B. Nachweisen des hybridisierten Produktes als eine Indikation für das Vorliegen der Zielnucleinsäure in der Testprobe.

9. Verfahren nach Anspruch 8, das als Sandwich- Hybridisierungsassay durchgeführt wird, wobei die wasserunlösliche Nucleinsonde eine unmarkierte Fang-Sonde ise und die Zielnucleinsäure noch mit einer wasserlöslichen, markierten Sonde hybridisiert wird.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 oder 9, wobei die Zielnucleinsäure unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion vor dem Kontakt in Schritt A amplifiziert wird.

11. Diagnostischer Testkit, umfassend:

a) die wasserunlösliche Nucleinsäuresonde nach einem der Ansprüche 1 bis 6 und

b) einen wasserlöslichen Primer oder Sonde, die im wesentlichen komplementär zu einer Zielnucleinsäure sind, wobei die Zielnucleinsäure ebenfalls im wesentlichen komplementär zu dem Oligonucleotid der wasserunlöslichen Nucleinsäuresonde ist.