DE69019770T2

DE69019770T2 - Verfahren zur Reinigung, Vervielfachung und zum Nachweis einer Nukleinsäure.

Info

Publication number: DE69019770T2
Application number: DE69019770T
Authority: DE
Inventors: Brent Arthur Burdick; Chu-An Chang; Janet Linn Fyles; Fred Terry Oakes
Original assignee: Cetus Corp; Eastman Kodak Co
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc; Eastman Kodak Co
Priority date: 1989-03-17
Filing date: 1990-03-14
Publication date: 1995-11-30
Anticipated expiration: 2010-03-15
Also published as: KR900014593A; ATE123315T1; JPH0341087A; DE69019770D1; CA2011818A1; EP0388171A3; JP2609738B2; KR920007664B1; HK58397A; EP0388171A2; EP0388171B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung einer vorbestimmten Nukleinsäure in einer biologischen Probe. die betrifft auch ein Verfahren zum Amplifizieren der gereinigten Nukleinsäure sowie ihren Nachweis in analytischen Verfahren.
Der Fortschritt in der Biochemie, der Molekularbiologie, der Gentechnik und verschiedene diagnostischen Verfahren machen oftmals rasche und einfache Techniken zum Reinigen und Auftrennen von Nukleinsäuren erforderlich. Beispielsweise ist es in der Gentechnik häufig erwünscht, daß man in der Lage ist, ein reines Nukleinsäuresegment aus einem komplexen Gemisch vieler verschiedener Nukleinsäuren zu erhalten. Bei der Diagnose, ob bestimmte infektiöse Erkrankungen vorliegen, können die Target-DNA oder Fragmente davon in derart geringen Konzentrationen vorliegen, daß vor dem Nachweis eine Reinigung erwünscht ist. Eine einzelne Nukleinsäure ist im allgemeinen durch Nukleotidsequenz, Molekulargewicht, Größe und Form charakterisiert
Die Technologie der Nukleinsäuresonden hat sich in den letzten Jahren rasch entwickelt, da Forscher ihren Wert für den Nachweis verschiedener Erkrankungen, Organismen oder genetischer Merkmale, die in sehr geringen Mengen in einer Testprobe vorliegen, herausgefunden haben. Die Verwendung von Sonden beruht auf dem Konzept der Komplementarität. Beispielsweise ist DNA doppelsträngig, wobei die Stränge durch Wasserstoffbindungen zwischen komplementären Nukleotiden (die auch als Nukleotidpaare bekannt sind) aneinander gebunden sind.
Der DNA-Komplex ist normalerweise stabil, jedoch können die Stränge unter Bedingungen, bei denen die Wasserstoffbindungen brechen, aufgetrennt (oder denaturiert) werden. Die freigesetzten Einzelstränge reassoziieren sich nur mit einem anderen Strang, der eine komplementäre Sequenz von Nukleotiden aufweist. Dieser Hybridisierungsprozeß kann in Lösung oder auf einem festen Substrat eintreten. RNA ist üblicherweise einzelsträngig. Sie hybridisiert ebenfalls mit einem anderen Strang oder einem Teil davon, der eine komplementäre Nukleotidsequenz aufweist.
Eine Targetnukleinsäuresequenz der DNA oder RNA oder ein Targetorganismus oder -zelle kann nur ein geringer Teil des gesamten Stranges sein, so daß es sehr schwierig ist, seine Gegenwart unter Verwendung der bekanntesten markierten Sonden nachzuweisen. Es sind viele Untersuchungen durchgeführt worden, um dieses Problem zu überwinden, einschließlich Verbesserungen bei der Empfindlichkeit der Sonden und der Synthese von Nukleinsäuren.
Ein beträchtlicher Fortschritt des Stands der Technik ist das in der US-A-4,683,202 beschriebene Verfahren. Ohne auf nähere Einzelheiten hinsichtlich dieses Verfahrens einzugehen, ist es eine Amplifizierungstechnik, bei der Primer in Gegenwart eines Polymerisierungsmittels (wie beispielsweise einer Polymerase) und vier Nukleotidtriphosphaten an Nukleinsäurematrizenstränge anhybridisiert werden, und aus den Primern Extensionsprodukte gebildet werden. Diese Produkte werden denaturiert und als Matrizenstränge in einer Zyklisierungsreaktion verwendet, die die Anzahl und Menge vorliegender Nukleinsäuren amplifiziert, um ihren darauf folgenden Nachweis zu erleichtern. Das Amplifikationsverfahren kann cyclisch so oft wie gewünscht durchgeführt werden, um eine größere Menge nachweisbares Material aus einer geringen Menge einer Targetnukleinsäuresequenz zu erzeugen.
Obwohl das zuvor beschriebene Amplifikationsverfahren äußerst empfindlich ist, ist in vielen Fällen die Menge an interessierendem DNA-Material in einer Probe sehr gering. Ein beträchtlicher Hintergrund durch nicht spezifische Nukleinsäuren oder Zelltrümmer kann die Empfindlichkeit des Assays verinindern. Dennoch kann es unmöglich sein, derartige Materialien ohne beträchtlichen Aufwand und Zeit zu entfernen, wodurch der Test verzögert wird und jede gewünschte Diagnose und Behandlung ebenfalls verzögert wird.
Um unerwünschte Zelltrümmer und Nukleinsäuren zu eliminieren und somit die Amplifikation und den Nachweis vorbestimmter Nukleinsäuren zu verbessern, kann eine Reihe bekannter Verfahren verwendet werden, einschließlich der von Blin et al, Nucleic Acid Res., 3, S. 2302 - 2308 (1976), Marmur, J. Mol. Biol., 3, S. 208 - 218 (1961), Birnboin et al, Nucleic Acid Res., 7, S. 1513 - 1523 (1979), Bowtell, Anal. Biochem, 162, S. 463 - 456 (1987) , Beji et al, Anal. Biochem., 162, S. 18 - 32 (1987), Buffone et al, Clin. Chem., 31, S. 164 - 165 (1985) beschriebenen, und andere, die zu zahlreich sind, um genannt zu werden.
Die Reinigung von Nukleinsäuren unter Verwendung von Oligonukleotiden, die kovalent an polymere Partikel gebunden sind, ist beispielsweise in der EP-A-0 296 557, der EP-A-0 200 113, der EP-A-0 265 244 und der GB-A-2,202, 328 beschrieben.
In der US-A-4,672,040 ist die Verwendung von magnetischen Partikeln zum Abtrennen von Molekülen, Makromolekülen oder Nukleinsäuren von anderem Material in Proben beschrieben. Obwohl dieses Verfahren für anspruchsvolle klinische Bereiche brauchbar sein kann, wäre es bevorzugt, ein rasches und einfaches Reinigungsverfahren zu besitzen, das die Nukleinsäuretrennung in Arztpraxen, Kliniken oder anderen Situationen ermöglicht, und zwar vor der Amplifikation, wenn ein diagnostisches Ergebnis rasch und effizient erwünscht ist. Im Hinblick auf derartige Probleme und Merkmale ist die vorliegende Erfindung vorteilhaft.
Die zuvor angemerkten Probleme werden überwunden mit einem Verfahren zum Amplifizieren von mindestens einer einzelsträngigen Target- bzw. Zielnukleinsäure in einer biologischen Probe, von der angenommen wird, daß sie ein Gemisch von Nukleinsäuren enthält, wobei eine Polymerasekettenreaktion verwendet wird und wobei das Verfahren umfaßt:
A. In-Kontakt-Bringen der Probe mit einem Reinigungsreagenz, das ein nicht poroses, nicht magnetisches Teilchen umfaßt, das direkt daran gebunden ein Nukleinsäurefragment aufweist, das zu einer Nukleinsäuresequenz der Zielnukleinsäure komplementär ist, unter Bedingungen, die zum Bilden eines unlöslichen Hybrids geeignet sind,
B. Abtrennen des Hybrids vom Rest der Probe und
C. Amplifizieren der interessierenden Nukleinsäuresequenz unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion mit oder ohne Denaturierung von dem unlöslichen Hybrid.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren bereit zum Nachweis von mindestens einer Zielnukleinsäure, die zwei komplementäre Stränge aufweist und in einer biologischen Probe vorliegt, von der angenommen wird, daß sie ein Gemisch von Nukleinsäuren enthält, wobei das Verfahren umfaßt:
A. Denaturieren der komplementären Stränge in der Probe,
B. In-Kontakt-Bringen der Probe mit einem Reinigungsreagenz, das ein nicht poröses, nicht magnetisches Teilchen umfaßt, das direkt daran gebunden ein Nukleinsäurefragment aufweist, das komplementär zu einer Nukleinsäuresequenz der Zielnukleinsäure ist, unter Bedingungen, die zum Bilden eines unlöslichen Hybrids geeignet sind,
C. Abtrennen des Hybrids von dem Rest der Probe, um eine gereinigte Zielnukleinsäure bereitzustellen,
D. Denaturieren des Hybrids und Abtrennen des unlöslichen komplementären Fragments von der Zielnukleinsäure,
E. In-Kontakt-Bringen einer Probe der denaturierten Zielnukleinsäure mit ersten und zweiten Primern, von denen einer komplementär zu der interessierenden Nukleinsäuresequenz ist und der andere komplementär zu dem anderen Strang der Zielnukleinsäure ist, um hybridisierte Produkte der ersten und zweiten Primer und der komplementären Nukleinsäurestränge zu bilden,
F. Bilden von ersten und zweiten Extensionsprodukten der Primer in dem hybridisierten Produkts, wobei die Extensionsprodukte, wenn sie von ihren Komplementen getrennt werden, als Matrizenstränge zur Synthese der Extensionsprodukte der Primer dienen können,
G. Abtrennen der Primerextensionsprodukte von den Matrizensträngen, auf denen sie synthetisiert wurden,
H. In-Kontakt-Bringen der abgetrennten Extensionsprodukte und der Zielnukleinsäure mit zusätzlichen ersten und zweiten Primern, wobei die spezifische Nukleinsäuresequenz unter Bildung komplementärer Produkte amplifiziert wird,
I. Abtrennen der Primerextensionsprodukte von den komplementären Produkten, die in Schritt H gebildet wurden,
J. In-Kontakt-Bringen von mindestens einem Primerextensionsprodukt, das in Schritt I abgetrennt wurde, mit einer Oligonukleotidsonde, die zum Nachweis markiert ist und komplementär dazu ist, um ein komplementäres Produkt der Sonde und des Primerextensionsprodukts zu bilden, und
K. Nachweisen des komplementären, in Schritt I gebildeten Produkts als eine Indikation für das Vorliegen der Zielnukleinsäure in der Probe.
Die vorliegende Erfindung stellt ein vorteilhaftes Mittel bereit zum Reinigen eines gewünschten Nukleinsäuregemischs von Säuren, ohne daß poröse oder magnetische Teilchen, wie im Stand der Technik beschrieben ist, oder andere komplizierte Ausrüstungen oder Reagentien verwendet werden. Obwohl Abtrennungen mittels Affinität für Nukleinsäuren bekannt sind, sind diese bislang nicht verwendet worden, um die Amplifikation sehr geringer Mengen von Zielnukleinsäuren unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion zu verbessern. Daher wird mit der vorliegenden Erfindung ein bereits äußerst brauchbares Verfahren sogar noch weiter verbessert und empfindlicher gemacht. Diese gewünschten Ergebnisse werden erreicht, indem ein Reinigungsreagenz verwendet wird, das aus einem komplementären Nukleinsäurefragment zusammengesetzt ist, das direkt an ein nicht poröses, nicht magnetisches Teilchen geeigneter Form und Größe gebunden ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Amplifikation und den Nachweis von einer oder mehreren Zielnukleinsäuren (d. h. vorbestimmte) in einer Testprobe. Solche Proben können zelluläres oder virales Material, Haar, Körperflüssigkeiten oder anderes Material umfassen, das genetische DNA oder RNA enthält, die nachgewiesen werden kann.
Nukleinsäuren können aus verschiedenen Quellen erhalten werden, einschließlich Plasmiden, natürlich vorkommender DNA oder RNA aus beliebigen Quellen (beispielsweise Bakterien, Hefe, Viren, Pflanzen und höhere Tiere, Menschen). Sie können unter Verwendung bekannter Verfahren aus verschiedenen Geweben extrahiert werden, einschließlich Blut, Gewebematerial oder anderen aus dem Stand der Technik bekannten Quellen. Die vorliegende Erfindung ist besonders brauchbar zum Nachweis von Nukleinsäuresequenzen, die in Viren oder Zellen beliebiger Organismen, wie in genomischer DNA, bakterieller DNA, viraler RNA oder DNA oder RNA, die in bakteriell oder viral infizierten Zellen gefunden wird, gefunden werden. Diese Erfindung ist besonders brauchbar zum Nachweis von proviraler DNA aus Zellen, die mit HIV-I oder anderen Retroviren infiziert sind.
Erfindungsgemäß wird die gereinigte Nukleinsäure in einer Kettenreaktion zur Herstellung von mindestens einer spezifischen Nukleinsäure in exponentiellen Mengen relativ zur Anzahl der beteiligten Reaktionsschritte verwendet. Das Produkt ist ein diskreter Nukleinsäureduplex mit Termini, die den Enden der spezifischen, verwendeten Primer entspricht. Als das Ausgangsmaterial kann jede beliebige Nukleinsäurequelle verwendet werden, vorausgesetzt, sie enthält die spezifische Zielnukleinsäure, die nachgewiesen werden soll, oder es wird angenommen, daß sie diese enthält. Mit "Nukleinsäure", die zu reinigen und zu duplizieren ist, ist ein Fragment oder die gesamte Nukleinsäure gemeint.
Darüber hinaus kann mehr als eine Nukleinsäure gleichzeitig gereinigt und amplifiziert werden, indem ein spezielles Set von Reinigungsreagentien, Primern und markierten Sonden (im folgenden beschrieben) für jede Zielnukleinsäure verwendet wird.
Der hier in Bezug auf Primer, Sonden oder nachzuweisende Nukleinsäurefragmente verwendete Begriff "Oligonukleotid" bezeichnet ein Molekül, das zwei oder mehr Desoxyribonukleotide oder Ribonukleotide, und vorzugsweise mehr als drei, umfaßt. Die exakte Größe ist nicht entscheidend, hängt jedoch von vielen Faktoren ab, einschließlich der letztendlichen Verwendung oder Funktion des Oligonukleotids. Das Oligonukleotid kann synthetisch oder durch Klonen erhalten werden.
Der Begriff "Primer" bezeichnet ein Oligonukleotid, gleichgültig, ob natürlich vorkommend oder synthetisch hergestellt, das in der Lage ist, als ein Initiationspunkt der Synthese zu wirken, wenn er unter Bedingungen eingesetzt wird, unter denen die Synthese eines Primerextensionsprodukts, das komplementär zu einem Nukleinsäurestrang ist, induziert wird. Derartige Bedingungen umfassen das Vorliegen von Nukleotiden (wie den vier Standard-Desoxyribonukleosidtriphosphaten) und einem Polymerisierungsagens, wie einer DNA-Polymerase, und einer geeigneten Temperatur und pH.
Bei der Durchführung dieser Erfindung sind Primer, Sonden und Fragmente im wesentlichen zu einer spezifischen Nukleinsäuresequenz der Zielnukleinsäure komplementär. Mit "im wesentlichen komplementär" ist gemeint, daß eine ausreichende Anzahl von Basen auf komplementärem Material vorliegt, die sich paaren, so daß Hybridisierung eintritt. Dies bedeutet jedoch nicht, daß sich jedes Basenpaar paart.
Die erfindungsgemäß verwendbaren Reinigungsreagentien umfassen ein Nukleinsäurefragment, das im wesentlichen zu mindestens einer Nukleinsäuresequenz der Zielnukleinsäure komplementär ist. Dieses Fragment kann eine beliebige geeignete Länge aufweisen, die eine geeignete Komplementarität und Hybridisierung mit dem Target ermöglicht. Üblicherweise weist das Fragment eine Länge von mindestens 10 Basen und vorzugsweise von 15 bis 50 Basen auf. Die Fragmente sind für mindestens eine Sequenz der Zielnukleinsäure maßgeschneidert. Es ist also möglich, daß ein Gemisch aus Reinigungsreagentien vorliegt, wobei jedes Reagenz ein besonderes Fragment aufweist, jedoch jedes Fragment in dem Gemisch in der Lage ist, mit derselben oder einer verschiedenen Sequenz der Zielnukleinsäure zu hybridisieren. Brauchbare Fragmente können aus einer Reihe von Quellen erhalten werden oder mittels bekannter Techniken und Ausrüstung hergestellt werden, wie den im folgenden für die Primerherstellung beschriebenen.
Die soeben beschriebenen Nukleinsäurefragmente sind auf geeignete Weise an polymere Teilchen (im folgenden beschrieben) direkt gebunden. Die Bindung kann durch chemische oder physikalische Mittel erfolgen (d. h. Adsorption oder kovalente Reaktion) und liegt direkt von Nukleotid zu Träger vor. Das heißt, es ist kein verknüpfendes Material zwischen dem Partikel und dem Fragment zwischengeschaltet. In einer Ausführungsform werden die Nukleinsäuren auf der Oberfläche der polymeren Teilchen adsorbiert. Es ist jedoch bevorzugt, das Nukleinsäurefragment chemisch zu modifizieren, um reaktive Gruppen bereitzustellen, die mit korrespondierenden reaktiven Gruppen auf dem festen Träger kovalent binden. Aus dem Stand der Technik sind viele derartige Verfahren bekannt, einschließlich der in der WO-A-89/02931 beschriebenen. Weitere Einzelheiten über dieses Verfahren sind in dem folgenden Beispiel 1 angegeben.
Brauchbare Teilchen zum Herstellen des Reinigungsreagenzes können aus beliebigem geeigneten Material hergestellt sein, einschließlich Cellulosematerialien, Glas, Keramiken, natürlich vorkommenden oder synthetischen Polymeren, Metallen und anderen, die dem Fachmann ohne weiteres ersichtlich sind. Diese Teilchen sind jedoch nicht magnetisch oder magnetisierbar, da diese die Polymeraseaktivität inhibieren könnten. Sie können beliebige zweckmäßige Form und Größe aufweisen, einschließlich Kugel-, Ellipsoid-, Würfel-, unregelmäßige oder flache Form und eine Durchschnittsgröße von 0,3 bis 3 um aufweisen.
Für eine kovalente Bindung weisen bevorzugte polymere Teilchen, die bei der Herstellung des Reinigungsreagenzes verwendet werden, vorteilhafterweise reaktive Oberflächengruppen auf, mit denen das Fragment (modifiziert oder unmodifiziert) reagieren kann. Brauchbare reaktive Gruppen umfassen Carboxy, Amino, Sulfhydryl, Aldehyd, aktiviertes 2-substituiertes Ethylsulfonyl, Vinylsulfonyl, aktive Halogenatome, Nitroaryl, Ester und andere, die dem Fachmann ohne weiteres ersichtlich sind. Besonders brauchbare Gruppen umfassen Carboxy, Ester, aktive Halogenatome, Vinylsulfonyl und aktiviertes 2-substituiertes Ethylsulfonyl als Teil von ethylenisch ungesättigten, polymerisierbaren Monomeren, die ausführlich in der EP-A-0 302 715 beschrieben sind.
Das hier beschriebene Reinigungsreagenz wird verwendet, um die Zielnukleinsäure zu hybridisieren und dadurch die Nukleinsäure unlöslich zu machen und von dem Rest der Probe abtrennbar zu machen. Dieser Kontakt von Probe und Reagenz wird unter Hybridisierungsbedingungen durchgeführt, die aus dem Stand der Technik gut bekannt sind, und dauert üblicherweise mindestens eine Minute, erfordert mäßiges Rühren, einen pH-Bereich von 5 bis 9 und eine Temperatur von 0 bis 75 ºC. Ein Fachmann ist in der Lage, die Bedingungen für eine optimale Hybridisierung einzustellen. Ein repräsentatives Verfahren ist im folgenden Beispiel 1 beschrieben.
Nach der Hybridisierung ist es normalerweise erwünscht, die unlöslich gemachte Zielnukleinsäure von der Probe abzutrennen, wobei eine geeignete Abtrennungstechnik, wie Zentrifugieren, Filtrieren, selektive Adsorption an eine unlösliche Matrix, Sedimentation oder Waschen gebundener Spezies, verwendet wird. Zentrifugieren oder Filtrieren ist bevorzugt.
Bei den erfindungsgemäßen Amplifikations- und Nachweisverfahren können brauchbare Primer aus einer Reihe von Quellen erhalten werden oder unter Verwendung bekannter Techniken und Geräte hergestellt werden, einschließlich beispielsweise einer ABI-DNA-Synthesevorrichtung (erhältlich von Applied Biosystems) oder Synthesevorrichtungen der Serie Biosearch 8600 oder der Serie 8800 (erhältlich von Milligen-Biosearch, Inc.) und bekannter Verfahren für ihre Verwendung. Natürlich vorkommende Primer, die aus biologischen Quellen isoliert werden, sind ebenfalls brauchbar (wie beispielsweise Restriktionsendonukleaseverdauungen).
In einigen Ausführungsformen ist mindestens einer der Primer (oder Sätze davon), die in dem Nachweisverfahren verwendet werden, mit einem spezifisch bindenden Liganden markiert. Der Begriff "markiert" bezieht sich auf die Tatsache, daß der Ligand an diesen Primer auf solche Weise gebunden ist, daß er nicht ohne weiteres abgelöst bzw. entfernt werden kann. Der spezifisch bindende Ligand kann Biotin oder eines seiner Derivate, Avidin Streptavidin oder eines ihrer Derivate, ein Lectin, ein Zucker, ein Protein, ein Hapten, ein Arzneistoff oder eine immunologische Spezies, wie beispielsweise ein Antikörper oder ein antigenes Material, sein.
Die vorliegende Erfindung ist zur Amplifikation oder zum Nachweis einer gereinigten Zielnukleinsäure mit zwei komplementären Strängen brauchbar. Die meisten interessierenden Nukleinsäuresequenzen sind bereits doppelsträngig, wie die in DNA gefundenen. Einzelsträngige Nukleinsäuresequenzen jedoch, wie beispielsweise mRNA, können auf ähnliche Weise amplifiziert und nachgewiesen werden.
Eine spezifische Nukleinsäuresequenz wird erzeugt, indem die Nukleinsäure, die diese Sequenz enthält, als ein Matrizenstrang verwendet wird. Wenn die Nukleinsäure zwei Stränge enthält, ist es notwendig, die Stränge aufzutrennen (als Denaturierung bezeichnet), und zwar entweder als einen separaten Schritt oder gleichzeitig mit der Bildung von Primerextensionsprodukten. Das Denaturieren kann unter Verwendung beliebiger geeigneter physikalischer, chemischer oder enzymatischer Mittel erreicht werden, wie im Stand der Technik beschrieben ist. Erwärmen auf eine geeignete Temperatur ist ein bevorzugtes Mittel.
Wenn die aufgetrennten Stränge zur Verwendung verfügbar sind, kann die Synthese weiterer Nukleinsäurestränge durchgeführt werden, wobei zwei oder mehr Primer (von denen mindestens einer wie zuvor beschrieben markiert ist) in einer gepufferten wäßrigen Lösung bei einem pH von 7 bis 9 verwendet werden. Vorzugsweise wird ein molarer Überschuß der beiden Primer zu der gepufferten Lösung zugegeben. Spezifische Mengen sind im Stand der Technik angegeben. Die Desoxyribonukleosidtriphosphate dATP, dCTP, dGTP und dTTP werden ebenfalls zu dem Synthesegemisch in adäquaten Mengen zugegeben, und die erhaltene Lösung wird auf 90 - 100 ºC bis zu 10 Minuten lang, und vorzugsweise 1 bis 4 Minuten lang, erhitzt. Enzymcofaktoren, wie Magnesium- oder Manganionen, liegen ebenfalls vorzugsweise in molarem Überschuß zu den Triphosphaten vor. Nach dem Erwärmen wird die Lösung vorzugsweise auf Raumtemperatur abgekühlt, und ein geeignetes Mittel zum Tnduzieren (oder Katalysieren) der Bildung von Primerextensionsprodukten wird eingeführt. Dieses induzierende Mittel ist allgemein im Stand der Technik als ein Polymerisierungsmittel bekannt. Die Reaktion zum Bilden dieser Produkte wird unter bekannten Bedingungen durchgeführt (üblicherweise von Raumtemperatur bis zu der Temperatur, bei der keine Polymerisation mehr stattfindet).
Das Polymerisierungsmittel kann jede beliebige Verbindung, oder Kombination von Reagentien sein, die die Synthese von Primerextensionsprodukten bewirken, einschließlich Enzymen < beispielsweise E. coli-DNA-Polymerase I, T4-DNA-Polymerase, Klenow-Polymerase, reverse Transkriptase und andere aus dem Stand der Technik bekannte). Besonders brauchbare Enzyme sind thermisch stabile Enzyme, geklont oder natürlich vorkommend, wie diejenigen, die aus verschiedenen Thermus- Bakterienspezies erhalten werden. Andere Polymerisierungsmittel sind in der US-A-4,683,202 (zuvor angegeben) beschrieben.
Bevorzugte thermisch stabile Enzyme sind DNA-Polymerasen aus Thermus aquaticus, wie beispielsweise in der EP-A-0 258 017 beschrieben ist. Andere brauchbare Enzyme sind bei Rossi et al, Syst. Appl. Microbiol., 7 (2 - 3), S. 337 - 341, 1986, beschrieben. Viele brauchbare Polymerasen sind im Handel erhältlich. Üblicherweise wird die Synthese von Extensionsprodukten am 3'-Ende eines jeden Primers gestartet und in der 5'- zur 3'-Richtung entlang des Matrizenstrangs fortgesetzt, bis die Synthese beendet ist. Einige Polymerisierungsmittel (beispielsweise reverse Transkriptase) können in der 3'- zur 5'-Richtung entlang des Matrizenstranges wirken.
Die neu gebildeten Primerextensionsprodukte, die die neu synthetisierten Stränge und ihre jeweiligen Primer umfassen, bilden doppelsträngige Moleküle mit den ursprünglichen Zielsträngen, die in den folgenden Verfahrensschritten verwendet werden. Diese Stränge werden dann wie zuvor beschrieben mittels Denaturieren getrennt, wobei einzelsträngige Moleküle erhalten werden, auf die neue Nukleinsäuren wie zuvor beschrieben synthetisiert werden. Es können zusätzliche Reagentien benötigt werden, um das Amplifikationsverfahren, nach welchem die meisten der Extensionsprodukte aus der durch die beiden Primer gebundenen spezifischen Nukleinsäuresequenz bestehen (d. h. komplementäre Produkte), am Laufen zu halten.
Die Schritte der Strangtrennung und der Extensionsproduktsynthese können so oft wie nötig wiederholt werden, um die gewünschte Menge der für die Verwendung benötigten Nukleinsäure, beispielsweise zum Nachweis, herzustellen. Üblicherweise wird die Schrittfolge mindestens einmal wiederholt, und vorzugsweise mindestens 10 bis 50 mal.
Wenn mehr als eine gereinigte Zielnukleinsäure hergestellt werden soll, wird in der zuvor beschriebenen allgemeinen Vorgehensweise die geeignete Anzahl an Primersätzen verwendet.
An jedem Punkt des erfindungsgemäßen Verfahrens kann nach der Bildung von mindestens einem Primerextensionsprodukt dieses Produkt mit einer nachweisbar markierten Sonde hybridisiert werden (im folgenden beschrieben).
Es können verschiedene Nachweisverfahren verwendet werden, um das Vorliegen des nachweisbaren Hybrids festzustellen, einschließlich Southern Blot, Gelelektrophorese, Färben und anderen aus dem Stand der Technik bekannten.
Ist eine gewünschte Menge der interessierenden Nukleinsäuresequenz erzeugt worden und sind die Primerextensionsprodukte ein letztes Mal getrennt worden, wird das erste Primerextensionsprodukt üblicherweise mit einer Oligonukleotidsonde in Kontakt gebracht, die zum Nachweis markiert ist und komplementär dazu ist, um ein Produkt zu bilden. Die Sonde ist eine Nukleinsäuresequenz, die mit der Zielnukleinsäuresequenz komplementär ist. Die Sonden können beliebige geeignete Nukleinsäurelängen aufweisen, bevorzugt sind jedoch 15 bis 40 Nukleotide. Sie ist mit einem beliebigen geeigneten nachweisbaren Material markiert (üblicherweise am 5'-Ende), das die Komplexierung des spezifisch bindenden Liganden und seines Rezeptors nicht stört. Verfahren zum Anbringen von Markern und zum Herstellen von Sonden sind aus dem Stand der Technik gut bekannt, wie beispielsweise von Agrawal et al, Nucleic Acid Res., 14, S. 6227 - 45 (1986), und in den zuvor angegebenen Literaturstellen für das Binden eines spezifisch bindenden Liganden an einen Primer beschrieben ist. Brauchbare Marker umfassen Radioisotope, elektronendichte Reagentien, Chromogene, Fluorogene, phosphoreszierende Gruppen, Ferritin und andere magnetische Teilchen, chemilumineszierende Gruppen und Enzyme (die bevorzugt sind). Brauchbare Enzyme umfassen Glucoseoxidase, Peroxidase, Uricase, alkalische Phosphatase und andere aus dem Stand der Technik bekannte. Substrate und farbstoffbildende Zusammensetzungen für solche Enzyme sind ebenfalls gut bekannt.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der Marker Peroxidase, und an einem bestimmten Punkt des Tests werden Wasserstoffperoxid und geeignete farbstoffbildende Zusammensetzungen zugegeben, um einen nachweisbaren Farbstoff zu bilden. Brauchbare farbstoffbildende Reagentien umfassen beispielsweise Tetramethylbenzidin und seine Derivate, und Leukofarbstoffe, wie Triarylimidazol- Leukofarbstoffe < wie in der US-A-4,089,747 beschrieben ist, oder andere Verbindungen, die in Gegenwart von Peroxidase und Wasserstoffperoxid unter Bildung eines Farbstoffes reagieren).
Der Nachweis auf die in dem komplementären Produkt vorliegende Sonne kann erreicht werden, indem geeignete und bekannte Nachweisgeräte und -verfahren verwendet werden. Bestimmte Sonden können ohne die Verwendung von Nachweisgeräten für das Auge sichtbar gemacht werden. Es ist auch zweckmäßig, das Verfahren in einem geeigneten Gefäß durchzuführen. Das einfachste Gefäß wäre ein Teströhrchen ein Kolben oder ein Becherglas, es sind jedoch ausgeklügeltere Behälter entwickelt worden, um eine Automatisierung des Verfahrens zu erleichtern. Beispielsweise ist in der EP-A-0 318 255 eine Küvette beschrieben, die so konstruiert ist, daß während des Verfahrens bestimmte Temperatureigenschaften bereitgestellt werden. Es können auch andere brauchbare Behälter für eine automatisierte oder einzelne Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens in geeigneter Weise gestaltet werden.
Damit die Sonde in dem komplementären Produkt nachgewiesen werden kann, ist es oftmals wichtig, daß das komplementäre Produkt von den anderen Materialien in dem Reaktionsmedium abgetrennt wird. Dies kann durch geeignete unlöslich machende Mittel geschehen, wie beispielsweise durch die Verwendung eines Primers oder einer Sonde, die an einem gewissen Punkt des Verfahrens an ein festes Material gebunden wird, oder das an ein solches gebunden werden kann. Das erhaltene unlöslich gemachte komplexierte Produkt kann von nicht komplexierten Materialien durch Filtration, Zentrifugation und andere geeignete Abtrennungstechniken abgetrennt werden.
Besonders brauchbare Abtrennungsvorrichtungen sind mikroporöse Filtermembranen, wie die von Pall Corp. auf den Markt gebrachten Polyamidmembranen (beispielsweise als LoProdynet - oder Biodyne -Membranen). Sie können unbeschichtet oder vorbeschichtet mit Surfactantien oder anderen Materialien, die die analytischen Verfahren erleichtern, verwendet werden. In einer Ausführungsform kann die Membran selbst an sie gebundene Rezeptormoleküle aufweisen (durch Absorption oder kovalente Bindungen), um die ersten Primerextensionsprodukte einzufangen.
Die Membranen können als ein separates Substrat verwendet werden, mit geeigneten Behältern zum Durchführen der anderen Testschritte. Vorzugsweise sind sie jedoch als Teil einer Testvorrichtung befestigt. Im Stand der Technik sind verschiedene Testvorrichtungen bekannt, einschließlich der in der US-A-3,825,410, US-A-3,888,629, US-A-3, 970,429 und der US-A-4,446,232 beschriebenen. Besonders brauchbare Vorrichtungen sind in der EP-A-0 308 231 beschrieben.
Das hier beschriebene Verfahren kann dazu verwendet werden, den Nachweis oder die Charakterisierung spezifischer Nukleinsäuresequenzen zu ermöglichen, die mit infektiösen Krankheiten, genetischen Störungen oder zellulären Störungen, wie Krebs, verbunden sind. Es kann auch bei forensischen Untersuchungen und zur DNA-Typisierung verwendet werden. Im Rahmen dieser Erfindung umfassen genetische Erkrankungen spezifische Deletionen oder Mutationen in der genomischen DNA eines beliebigen Organismus, wie Sichelzellenanämie, zystische Fibrose, α-Thalassämie, β-Thalassämie und anderen, die dem Fachmann ohne weiteres ersichtlich sind. Verschiedene infektiöse Erkrankungen können durch das Vorliegen geringer Mengen von spezifischen DNA-Sequenzen, die für den Organismus charakteristisch sind, gleichgültig, ob es eine Hefe, ein Bakteriuin oder ein Virus ist, in einer klinischen Probe diagnostiziert werden. Bakterien, die nachgewiesen werden können, umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Salmonella, Chlamydia, Gonorrhea, Shigella und Listeria. Viren, die nachweisbar sind, umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Herpes, Cytomegalovirus, Epstein- Barr-Virus, Hepatitis und Retroviren wie HTLV-I und HIV-I. Protozoenparasiten, Hefen und Schimmel sind ebenfalls nachweisbar. Andere nachweisbare Spezies sind dem Fachmann ohne weiteres ersichtlich. Die Erfindung ist besonders brauchbar zum Nachweis des Vorliegens von Retroviren, wie HTV-I, in Testproben.
Die folgenden Beispiele sollen die Durchführung dieser Erfindung veranschaulichen.

Herstellung und Verwendung eines Reinigungsreagenzes

Ein bei der Durchführung dieser Erfindung brauchbares Reinigungsreagenz wurde unter Verwendung von polymeren Latexteilchen hergestellt, die unter Verwendung von Standardtechniken hergestellt wurden, und einem Nukleinsäurefragment, das komplementär ist zu menschlicher Leukozytenantigen-DNA (HLA-DNA), Regionen der Typen 2 und 3, das die folgende Sequenz aufweist:
5'-X-CCTCTGTTCCACAGACTTAGATTTG-3'
wobei X eine freie Aminogruppe ist, die durch einen Ethylenglycol-Spacerarm an das Oligonukleotid gebunden ist, die wie in der WO-A-89/02931 beschrieben hergestellt wurden.

Materialien:

Die Latexteilchen (2,9 % Feststoffe) umfaßten Poly(styrol-co-arylsäure) (Molverhältnis 90 : 10).
Methylimidazolpuffer (0,2 molar, pH 6), durch Zugabe von Perchlorsäure auf ph 6 eingestellt.
SSPE-Pufferlösung (2 %) umfaßte 43,5 g Natriumchlorid, 0,276 g Natriumphosphat und 0,074 g Ethylendiamintetraessigsäure in 1 Liter Wasser, und der pH war auf 7,4 eingestellt.
Es wurde eine Lösung aus 5'-Aminooligonukleotid (200 mmolar) in glasdestilliertem Wasser (40 OD/ml) verwendet.
EDC-Reagenz ist 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid-Hydrochlorid.

Vorgehensweise:

Die Latexlösung (1 ml, 29 mg Beads) wurde zentrifugiert (2,5 Minuten bei 13 000 x), um den Überstand zu entfernen. Die Beads wurden dann in glasdestilliertem Wasser (1 ml) durch kräftiges Verwirbeln resuspendiert.
Das Gemisch wurde nochmals zentrifugiert, und der Überstand wurde entfernt. Die Beads wurden einmal mit Methylimidazolpuffer (1 ml) gewaschen, der Puffer wurde mittels Zentrifugieren entfernt und die Beads wurden in demselben Puffer (0,5 ml) resuspendiert.
Zu der Beadslösung wurde die 5'-Aminooligonukleotidsonde (25 ul der Vorratslösung oder etwa 5000 pmole) zugegeben, und die erhaltene Lösung wurde gut gemischt. Das 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid-Hydrochlorid-Reagenz (15 mg) wurde zu der Lösung zugegeben. Nach sorgfältigem Mischen mittels Verwirbeln wurde das Reaktionsgemisch mindestens 2 Stunden lang (üblicherweise 15 Stunden lang) bei 20 - 25 ºC stehen gelassen, wobei gelegentlich gemischt wurde.
Der Überstand wurde zunächst durch Zentrifugieren entfernt, und die Beads wurden anschließend mit den folgenden Pufferlösungen gewaschen, wobei der Überstand zwischen den Lösungen zentrifugiert und abpipettiert wurde:
a. einmal mit 1 ml glasdestilliertem Wasser,
b. einmal mit der SSPE-Pufferlösung,
c. einmal mit phosphatgepufferter Salzlösung, und
d. zweimal mit glasdestilliertem Wasser.
Nach der letzten Behandlung wurden die Beads in glasdestilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 92 ul resuspendiert, um eine 3 %-ige Beadsuspension herzustellen, und bei 4 ºC gehalten.

Beispiel 1: Verfahren zum Amplifizieren und Nachweisen von HLA-DNA

Dieses Beispiel veranschaulicht die Amplifikation und den Nachweis einer gereinigten Ziel-HLA-DNA.
Ungereinigtes bzw. Rohvollblutlysat wurde aus einer ungereinigten Vollblutprobe (100 ul) durch Kochen, Zentrifugieren und Abnehmen des Überstands hergestellt.
Portionen (jeweils 5 ul) des ungereinigten Lysats wurden jeweils 5 Minuten lang bei 95 ºC denaturiert und dann zu einer Probe (40 ul) von SSPE-Pufferlösung und nicht-ionischem Surfactant Triton X-100 (0,02 Gewichts-%) zugegeben, wobei man eine Testprobe erhielt.

Reinigungsverfahren:

Das zuvor beschriebene Reinigungsreagenz (2 ul bei 2 Gewichts-% in Wasser) wurde zu der zuvor beschriebenen Testprobe zugegeben, und das erhaltene Gemisch wurde bei 55 ºC 30 Minuten lang unter Rühren inkubiert. Das Gemisch wurde dann 1 Minute bei 14 000 UpM zentrifugiert, und der Überstand wurde verworfen. Das erhaltene Pellet wurde in einer Lösung (50 ul) aus SSPE-Pufferlösung und nicht-ionischem Surfactant Triton X-100 (0,02 Gewichts-%) resuspendiert, auf 55 ºC erhitzt und nochmals zentrifugiert. Dieses Verfahren wurde zweimal wiederholt, wobei man eine gereinigte Nukleinsäure erhielt, die mit dem Reinigungsreagenz hybridisiert ist.
Das erhaltene Pellet wurde dann in der folgenden Lösung (100 ul) suspendiert: Kaliumchlorid (50 mmolar), Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Puffer (10 mmolar, pH 8), Gelatine (0,1 mg/ml), Magnesiumchlorid (2,5 mmolar), HLA-Primer (- und +, jeweils 0,2 umolar) und dNTP's (jeweils 0,67 mmolar).
Die HLA-DNA-Primer wiesen die folgenden Sequenzen auf:
(+) 5'-X-GTGCTGCAGGTGTAAACTTGTACCAG-3'
(-) 5''-X-CGGATCCGGTAGCAGCGGTAGAGTTG-3'
wobei X für einen Biotintetraethylenglycol-Linker steht, der mittels des in der WO-A-80/02931 beschriebenen Verfahrens hergestellt und an die Primer gebunden wurde.
Die vorbestimmte Nukleinsäure wurde dann von dem Reinigungsreagenz durch 5-minütiges Erhitzen auf 95 ºC dehybridisiert, worauf rasch zentrifugiert und der Überstand gesammelt wurde.

Amplifikation der Zielnukleinsäure:

Der vorherige Überstand wurde mit DNA-Polymerase gemischt, die aus einem im Handel erhältlichen Thermus aquaticus (etwa 1 ul, enthaltend 4 I.U./ul) isoliert wurde, und die Amplifikation wurde für 30 aufeinanderfolgende Zyklen wie folgt durchgeführt:
70 ºC ansteigend auf 94 ºC 1 Minute
94 ºC 0,5 Minuten (Denaturieren)
94 ºC sinkend auf 50 ºC 1,25 Minuten
50 ºC 0,5 Minuten (Hybridisieren)
50 ºC ansteigend auf 70 ºC 0,75 Minuten
70 ºC 1 Minute (Verlängern)
Nach der Amplifikation wurden die dehybridisierten Produkte mittels Gelelektrophorese bestimmt, wobei 4 % Agarose verwendet wurde und anschließend mit Ethidiumbromid gefärbt wurde. Die Ergebnisse zeigten, daß die vorbestimmte Nukleinsäure spezifisch gereinigt und von dem rohen Lysat unter Verwendung des Reinigungsreagenzes entfernt wurde und daß die Amplifikation erfolgreich durchgeführt wurde.

Beispiel 2: Verfahren zum Nachweis von menschlichem β-Globin

Dieses Beispiel gleicht Beispiel 1, es veranschaulicht jedoch die Durchführung der vorliegenden Erfindung, um menschliche β-Globin-DNA zu reinigen und nachzuweisen.
Rohes Vollblutlysat wurde wie in Beispiel 1 beschrieben erhalten.
Es wurde ein Reinigungsreagenz hergestellt, wobei polymere Teilchen verwendet wurden, die Oberflächenaldehydgruppen aufweisen. Diese Teilchen wurden durch die folgenden Schritte hergestellt: Ein Gemisch aus 250 ml von 0,5 molarem Natriummethoxid in Methanol, 2-Nitropropan (12,5 ml) und eine wäßrige Suspension (3,5 % Feststoff) von Poly(styrol-co-vinylbenzylchlorid) (Molverhältnis 70 : 30) wurde zwei Stunden lang unter Rückfluß gekocht, dann abfiltriert. Die Teilchen auf dem Filter wurden mit Methanol gewaschen, getrocknet, in einem minimalen Volumen an Pyridin wieder quellen gelassen und in Wasser resuspendiert.
Es wurde ein Nukleinsäurefragment verwendet, das zu der menschlichen β-Globin-Ziel-DNA komplementär ist und die folgende Sequenz aufweist:
5'-X-CTCCTGAGGAGAAGTCTGC-3'
wobei X eine freie Aminogruppe ist, die durch einen Ethylenglycol-Spacerarm gebunden ist und wie zuvor beschrieben hergestellt wurde.
Die Aldehydgruppen auf den Teilchen und das Aminooligonukleotid wurden gekoppelt bzw. gebunden, wobei das in der US-A-4,587,046 beschriebene Verfahren verwendet wurde.
Es wurde hier das Reinigungsverfahren und das Amplifikationsverfahren von Beispiel 1 nachgearbeitet, mit der Ausnahme, daß zusätzlich zu der Verwendung von zwei Primern für menschliche β-Globin-DNA die beiden HLA-DNA-Primer von Beispiel 1 (0,2 umolar) als Kontrollen zugegeben wurden.
Die Primer der menschlichen β-Globin-DNA wiesen die folgenden Sequenzen auf:
(+) 5'-X-ACACAACTGTGTTCACTAGC-3'
(-) 5'-X-CAACTTCATCCACGTTGACC-3'
wobei X für einen Biotintetraethylenglycol-Spacerarm steht, der wie in der WO-A-89/02931 (zuvor angegeben) hergestellt und gebunden wurde.
Die Ergebnisse zeigten, daß das menschliche β-Globin-DNA- Target aus dem rohen Lysat erfolgreich entfernt wurde, amplifiziert und mittels Ethidiumbromid nachgewiesen wurde.
Die HLA-DNA wurde in diesem Beispiel nicht amplifiziert oder nachgewiesen.

Claims

1. Verfahren zum Amplifizieren von mindestens einer einzelsträngigen Ziel-Nukleinsäure in einer biologischen Probe, von der angenomiuen wird, daß sie eine Mischung von Nukleinsäuren enthält, unter Anwendung einer Polymerasenkettenreaktion, bei dem man:

A. die Probe mit einem Reinigungsreagenz in Kontakt bringt, das ein nicht poröses, nicht magnetisches Teilchen umfaßt, an das ein Nukleinsäurefragment direkt gebunden ist, das zu einer Nukleinsäuresequenz der Ziel-Nukleinsäure komplementär ist, unter Bedingungen, die zur Bildung eines unlöslichen Hybrides geeignet sind,

B. das Hybrid von dem Rest der Probe abtrennt, und

C. die Nukleinsäuresequenz von Interesse amplifiziert, wobei eine Polymerasenkettenreaktion mit oder ohne Denaturierung von dem unlöslichen Hybrid angewendet wird.

2. Verfahren zum Nachweisen von mindestens einer Ziel- Nukleinsäure mit zwei komplementären Strängen, die in einer biologischen Probe vorliegen, von der angenommen wird, daß sie eine Mischung von Nukleinsäuren enthält, bei dem man:

A. die komplementären Stränge in der Probe denaturiert,

B. die Probe mit einem Reinigungsreagenz in Kontakt bringt, das ein nicht poröses, nicht magnetisches Teilchen mit einem direkt hieran gebundenen Nukleinsäurefragment umfaßt das komplementär zu einer Nukleinsäuresequenz der Ziel-Nukleinsäure ist, unter Bedingungen, die zur Bildung eines unlöslichen Hybrides geeignet sind,

C. das Hybrid von dem Rest der Probe trennt, wobei gereinigte Ziel-Nukleinsäure gewonnen wird,

D. das Hybrid denaturiert und das unlösliche komplementäre Fragment von der Ziel-Nukleinsäure abtrennt,

E. eine Probe der denaturierten Ziel-Nukleinsäure mit ersten und zweiten Primern in Kontakt bringt, von denen einer zu der Nukleinsäuresequenz von Interesse komplementär ist und der andere zu dem anderen Strang der Ziel-Nukleinsäure komplementär ist, unter Bildung von hybridisierten Produkten von dem ersten und dem zweiten Primer und den komplementären Nukleinsäuresträngen,

F. erste und zweite Extensionsprodukte der Primer in dem hybridisierten Produkt bildet, wobei die Extensionsprodukte, wenn sie von ihren Komplementen getrennt werden, als Matrizenstränge für die Synthese der Extensionsprodukte der Primer dienen können,

G. die Primerextensionsprodukte von den Matrizensträngen, auf denen sie synthetisiert wurden, trennt,

H. die abgetrennten Extensionsprodukte und die Ziel-Nukleinsäure mit zusätzlichen ersten und zweiten Primern in Kontakt bringt, wobei die spezifische Nukleinsäuresequenz amplifiziert wird und wobei komplementäre Produkte gebildet werden,

I. die Primerextensionsprodukte von den in der Stufe H gebildeten komplementären Produkten trennt,

J. mindestens ein Primerextensionsprodukt, das in der Stufe H abgetrennt worden ist, mit einer Oligonukleotidsonde kontaktiert, die für den Nachweis markiert ist und dazu komplementär ist, um ein komplementäres Produkt der Sonde und des Primerextensionsproduktes zu bilden, und

K. das in der Stufe J gebildete komplementäre Produkt als eine lndikation für das Vorliegen der Ziel- Nukleinsäure in der Probe nachweist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, bei dem die Probe Vollblut oder Samen ist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem die Ziel-Nukleinsäure HIV-I-DNA ist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem die Ziel-Nukleinsäure menschliche Leukozyten-Antigen-DNA ist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem die Ziel-Nukleinsäure menschliche β-Globin-DNA ist.