JPH0746999A - 水不溶性試薬および核酸プローブ、試験キットならびに診断および精製方法 - Google Patents
水不溶性試薬および核酸プローブ、試験キットならびに診断および精製方法Info
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- JPH0746999A JPH0746999A JP3007634A JP763491A JPH0746999A JP H0746999 A JPH0746999 A JP H0746999A JP 3007634 A JP3007634 A JP 3007634A JP 763491 A JP763491 A JP 763491A JP H0746999 A JPH0746999 A JP H0746999A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】粒子に共有結合した低ｐＩのタンパク質または
炭水化物から水不溶性試薬およびそれらから調製した核
酸プローブを提供する。 【構成】オリゴヌクレオチドをタンパク質または炭水化
物を介して粒子に連結し、水不溶性核酸プローブを形成
する。このタンパク質または炭水化物は約６以下のｐＩ
を示し、アシル化剤、アルキル化剤またはスルホニル化
剤で化学変性されたものである。前記粒子表面は他のタ
ンパク質または炭水化物が実質的に除去されている。こ
のプローブは標的核酸とオリゴヌクレオチドのハイブリ
ダイゼーションが行われる各種の診断方法および精製方
法に有用である。ある例では、プローブを使用してポリ
メラーゼ連結反応法によって増幅したＤＮＡ鎖を捕捉す
ることができる。
炭水化物から水不溶性試薬およびそれらから調製した核
酸プローブを提供する。 【構成】オリゴヌクレオチドをタンパク質または炭水化
物を介して粒子に連結し、水不溶性核酸プローブを形成
する。このタンパク質または炭水化物は約６以下のｐＩ
を示し、アシル化剤、アルキル化剤またはスルホニル化
剤で化学変性されたものである。前記粒子表面は他のタ
ンパク質または炭水化物が実質的に除去されている。こ
のプローブは標的核酸とオリゴヌクレオチドのハイブリ
ダイゼーションが行われる各種の診断方法および精製方
法に有用である。ある例では、プローブを使用してポリ
メラーゼ連結反応法によって増幅したＤＮＡ鎖を捕捉す
ることができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は、粒子に共有結合した
低ｐＩのタンパク質または炭水化物からなる水不溶性試
薬およびそれらから調製した核酸プローブに関する。ま
た、標的核酸を単離捕捉する方法および診断方法にも関
する。この発明は、遺伝研究、遺伝子工学、診断アッセ
イ、ＤＮＡの配列決定、核酸の合成および構造遺伝子の
合成に有用である。
低ｐＩのタンパク質または炭水化物からなる水不溶性試
薬およびそれらから調製した核酸プローブに関する。ま
た、標的核酸を単離捕捉する方法および診断方法にも関
する。この発明は、遺伝研究、遺伝子工学、診断アッセ
イ、ＤＮＡの配列決定、核酸の合成および構造遺伝子の
合成に有用である。
【０００２】
【従来の技術】すべての生物の遺伝物質を形成する核酸
の重要な性質の一つは、相補的核酸配列を有する核酸と
それらの配列特異的な水素結合の形成（すなわち、ハイ
ブリッド形成）性にある。核酸の相補的鎖とハイブリッ
ドを形成する核酸のこの性質は、ハイブリダイゼーショ
ンアッセイとして知られるものやＤＮＡ精製技法に利用
されてきた。
の重要な性質の一つは、相補的核酸配列を有する核酸と
それらの配列特異的な水素結合の形成（すなわち、ハイ
ブリッド形成）性にある。核酸の相補的鎖とハイブリッ
ドを形成する核酸のこの性質は、ハイブリダイゼーショ
ンアッセイとして知られるものやＤＮＡ精製技法に利用
されてきた。
【０００３】ハイブリダイゼーションアッセイでは、既
知の配列を有する核酸が被検試料中で相補的核酸配列を
有する「標的」核酸とのハイブリッドを形成するための
プローブとして使用されている。プローブを標識するこ
とは、対応する標的核酸のハイブリッドの検出を可能に
する。あるハイブリダイゼーションアッセイは、「サン
ドイッチアッセイ」として知られており、これらにおい
て１つは上記のように標識され、もう一つは一定の方法
で支持体（例えば、フィルター、シートまたは粒子）上
に固定される「捕捉」プローブからなる２種のプローブ
の使用を必要とする。
知の配列を有する核酸が被検試料中で相補的核酸配列を
有する「標的」核酸とのハイブリッドを形成するための
プローブとして使用されている。プローブを標識するこ
とは、対応する標的核酸のハイブリッドの検出を可能に
する。あるハイブリダイゼーションアッセイは、「サン
ドイッチアッセイ」として知られており、これらにおい
て１つは上記のように標識され、もう一つは一定の方法
で支持体（例えば、フィルター、シートまたは粒子）上
に固定される「捕捉」プローブからなる２種のプローブ
の使用を必要とする。
【０００４】特定生物のすべての種またはウイルス感染
細胞は核酸の形で遺伝成分を担っているので、ハイブリ
ダイゼーションアッセイは、ヒト、動物および植物の多
様な疾病状態の検出および診断のための有用な研究材料
であり、診断用材料でもある。さらに、特定のヌクレオ
チド配列に対するプローブとして利用できることは、ヒ
トの遺伝病の特定および診断に際して潜在的な価値があ
る。
細胞は核酸の形で遺伝成分を担っているので、ハイブリ
ダイゼーションアッセイは、ヒト、動物および植物の多
様な疾病状態の検出および診断のための有用な研究材料
であり、診断用材料でもある。さらに、特定のヌクレオ
チド配列に対するプローブとして利用できることは、ヒ
トの遺伝病の特定および診断に際して潜在的な価値があ
る。
【０００５】生物化学および分子生物学の技術分野で
は、核酸混合物からの核酸の精製または単離が遺伝物質
の研究および合成に重要になることがよくある。数多く
の方法が開発され、それによれば核酸は固体キャリアに
付着した相補的鎖を使用するアフィニティークロマトグ
ラフィーによって単離されている。
は、核酸混合物からの核酸の精製または単離が遺伝物質
の研究および合成に重要になることがよくある。数多く
の方法が開発され、それによれば核酸は固体キャリアに
付着した相補的鎖を使用するアフィニティークロマトグ
ラフィーによって単離されている。
【０００６】各種の支持体へのオリゴヌクレオチドの付
着は、多種多様な方法で行われてきた。これらの殆どの
方法は適当に共有結合するための支持体もしくはオリゴ
ヌクレオチドまたは両者の変性を必要とする。米国特許
第 4,713,326号明細書は、光化学反応性の内位添加化合
物を用い照射によって固体支持体に核酸をバインディン
グさせ、核酸を支持体に化学結合することを記載する。
光化学的または非光化学的な他の連結基も、粒子のよう
な固体支持体へオリゴヌクレオチドを連結するのに使用
されてきた。
着は、多種多様な方法で行われてきた。これらの殆どの
方法は適当に共有結合するための支持体もしくはオリゴ
ヌクレオチドまたは両者の変性を必要とする。米国特許
第 4,713,326号明細書は、光化学反応性の内位添加化合
物を用い照射によって固体支持体に核酸をバインディン
グさせ、核酸を支持体に化学結合することを記載する。
光化学的または非光化学的な他の連結基も、粒子のよう
な固体支持体へオリゴヌクレオチドを連結するのに使用
されてきた。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】ある例では、例えば粒
子が表面カルボン酸基を有する場合、粒子に核酸を直接
付着してプローブを調製することができる。しかしなが
ら、常に容易であるとはいえずまた都合がよいともいえ
ない。さらに、かかる反応性基を有する粒子の疎水性と
核酸の疎水性に起因し、粒子へ共有結合した後オリゴヌ
クレオチド分子が粒子に吸着する。このような吸着は、
相補的核酸とオリゴヌクレオチドの効率のよいハイブリ
ダイゼーションを阻害する。
子が表面カルボン酸基を有する場合、粒子に核酸を直接
付着してプローブを調製することができる。しかしなが
ら、常に容易であるとはいえずまた都合がよいともいえ
ない。さらに、かかる反応性基を有する粒子の疎水性と
核酸の疎水性に起因し、粒子へ共有結合した後オリゴヌ
クレオチド分子が粒子に吸着する。このような吸着は、
相補的核酸とオリゴヌクレオチドの効率のよいハイブリ
ダイゼーションを阻害する。
【０００８】水不溶性プローブを用いる核酸のハイブリ
ダイゼーションまたは精製について効率のよい手段を入
手することが望まれるであろう。
ダイゼーションまたは精製について効率のよい手段を入
手することが望まれるであろう。
【０００９】
【課題を解決するための手段】この発明は、 pI６以下
を示し、かつアシル化剤、アルキル化剤もしくはスルホ
ニル化剤で化学的に変性した非免疫反応性タンパク質ま
たは炭水化物を共有結合した水不溶性粒子であって、そ
の表面から他のタンパク質または炭水化物を実質的に除
去した粒子を含んでなる水不溶性試薬を提供する。
を示し、かつアシル化剤、アルキル化剤もしくはスルホ
ニル化剤で化学的に変性した非免疫反応性タンパク質ま
たは炭水化物を共有結合した水不溶性粒子であって、そ
の表面から他のタンパク質または炭水化物を実質的に除
去した粒子を含んでなる水不溶性試薬を提供する。
【００１０】既知のプローブに関する上記課題を、pI６
以下を示すタンパク質または炭水化物であって、オリゴ
ヌクレオチドとの共有結合反応用の基を提供するように
アシル化剤、アルキル化剤もしくはスルホニル化剤で化
学的に変性しており、そして他のタンパク質または炭水
化物を実質的に除去した水不溶性粒子に共有結合したタ
ンパク質または炭水化物である連結基を介して前記粒子
へ付着したヌクレオチドを含んでなる水不溶性核酸プロ
ーブによって解決する。
以下を示すタンパク質または炭水化物であって、オリゴ
ヌクレオチドとの共有結合反応用の基を提供するように
アシル化剤、アルキル化剤もしくはスルホニル化剤で化
学的に変性しており、そして他のタンパク質または炭水
化物を実質的に除去した水不溶性粒子に共有結合したタ
ンパク質または炭水化物である連結基を介して前記粒子
へ付着したヌクレオチドを含んでなる水不溶性核酸プロ
ーブによって解決する。
【００１１】さらに、この発明は、下記の工程を含んで
なる標的核酸を捕捉し単離するための方法を提供する。 Ａ．標的核酸を含有することが疑われる被検試料を、上
記水不溶性核酸プローブであって、前記標的核酸に対し
実質的に相補的であるオリゴヌクレオチドのプローブと
接触して水不溶性ハイブリダイゼーション生成物を形成
する工程、ならびに Ｂ．被検試料の残余から前記ハイブリダイゼーションし
た生成物を単離する工程。
なる標的核酸を捕捉し単離するための方法を提供する。 Ａ．標的核酸を含有することが疑われる被検試料を、上
記水不溶性核酸プローブであって、前記標的核酸に対し
実質的に相補的であるオリゴヌクレオチドのプローブと
接触して水不溶性ハイブリダイゼーション生成物を形成
する工程、ならびに Ｂ．被検試料の残余から前記ハイブリダイゼーションし
た生成物を単離する工程。
【００１２】さらにまた、この発明は下記の工程を含ん
でなる標的核酸の検出方法も提供する。 Ａ．標的核酸を含有することが疑われる被検試料を、上
記水不溶性核酸プローブであって、前記標的核酸に対し
実質的に相補的であるオリゴヌクレオチドのプローブと
接触して水不溶性ハイブリダイゼーション生成物を形成
する工程、ならびに Ｂ．前記ハイブリダイゼーション生成物を検出する工
程。 さらに、上記水不溶性核酸プローブを含んでなる診断試
験キットも提供する。
でなる標的核酸の検出方法も提供する。 Ａ．標的核酸を含有することが疑われる被検試料を、上
記水不溶性核酸プローブであって、前記標的核酸に対し
実質的に相補的であるオリゴヌクレオチドのプローブと
接触して水不溶性ハイブリダイゼーション生成物を形成
する工程、ならびに Ｂ．前記ハイブリダイゼーション生成物を検出する工
程。 さらに、上記水不溶性核酸プローブを含んでなる診断試
験キットも提供する。
【００１３】以下、この発明を具体的に説明する。この
発明は、被検試料における１種以上の標的核酸の精製、
増幅または検出について一定のプローブの使用に向けら
れる。このような試料としては、細胞物質、ウイルス性
の物質、毛髪、体液または遺伝子ＤＮＡもしくはＲＮＡ
を含有する他の物質を挙げることができる。精製の主目
的は診断法用の材料を調製することにあるが、精製した
核酸を使用してＤＮＡもしくはメッセンジャーＲＮＡの
クローニング効率の改良または化学合成から得られる核
酸混合物より所定の核酸を多量に得ることもできる。精
製した標的核酸の別の用途は当業者に自明であろう。
発明は、被検試料における１種以上の標的核酸の精製、
増幅または検出について一定のプローブの使用に向けら
れる。このような試料としては、細胞物質、ウイルス性
の物質、毛髪、体液または遺伝子ＤＮＡもしくはＲＮＡ
を含有する他の物質を挙げることができる。精製の主目
的は診断法用の材料を調製することにあるが、精製した
核酸を使用してＤＮＡもしくはメッセンジャーＲＮＡの
クローニング効率の改良または化学合成から得られる核
酸混合物より所定の核酸を多量に得ることもできる。精
製した標的核酸の別の用途は当業者に自明であろう。
【００１４】核酸は、プラスミド、またはいずれかの起
源（例えば、細菌、酵母、ウイルス、植物ならびに高等
動物およびヒト）由来の天然に見い出されるＤＮＡもし
くはＲＮＡを初めとする各種の起源から得ることができ
る。それらは、血液、組織物質または既知の方法に使用
する当該技術分野で知られた他の起源を初めとする各種
組織から抽出してもよい。この発明は、ゲノムＤＮＡ、
細菌ＤＮＡ、ウイルスＲＮＡまたは細菌もしくはウイル
ス感染細胞に見い出されるＤＮＡもしくはＲＮＡのよう
ないずれかの生体のウイルスまたは細胞に見い出される
核酸配列の検出に特に有用である。とりわけ、この発明
は HIV-Iまたは他のレトロウイルスが感染した細胞に由
来するＤＮＡの検出に有用である。
源（例えば、細菌、酵母、ウイルス、植物ならびに高等
動物およびヒト）由来の天然に見い出されるＤＮＡもし
くはＲＮＡを初めとする各種の起源から得ることができ
る。それらは、血液、組織物質または既知の方法に使用
する当該技術分野で知られた他の起源を初めとする各種
組織から抽出してもよい。この発明は、ゲノムＤＮＡ、
細菌ＤＮＡ、ウイルスＲＮＡまたは細菌もしくはウイル
ス感染細胞に見い出されるＤＮＡもしくはＲＮＡのよう
ないずれかの生体のウイルスまたは細胞に見い出される
核酸配列の検出に特に有用である。とりわけ、この発明
は HIV-Iまたは他のレトロウイルスが感染した細胞に由
来するＤＮＡの検出に有用である。
【００１５】好ましい態様では、この発明のプローブは
少なくとも特定の核酸を用いる反応段階に比例して指数
的な量を生成する連鎖反応によって増幅した後に使用さ
れる。この生成物は、使用した特定のプライマー末端に
対応する末端を有する個別の核酸の重複物であろう。核
酸のどのような起源も検出に用いる出発原料として利用
することができ、それは検出の標的とされる特定の核酸
を含むかまたは含有することが予測されるものである。
「核酸」はフラグメントまたは完全な核酸分子を意味す
る。さらに１種より多くの核酸を各標的核酸に対する水
不溶性プローブ類、プライマー類および標識プローブ類
（後述する）の特異的なセット（組）を用いて同時に精
製または検出できる。
少なくとも特定の核酸を用いる反応段階に比例して指数
的な量を生成する連鎖反応によって増幅した後に使用さ
れる。この生成物は、使用した特定のプライマー末端に
対応する末端を有する個別の核酸の重複物であろう。核
酸のどのような起源も検出に用いる出発原料として利用
することができ、それは検出の標的とされる特定の核酸
を含むかまたは含有することが予測されるものである。
「核酸」はフラグメントまたは完全な核酸分子を意味す
る。さらに１種より多くの核酸を各標的核酸に対する水
不溶性プローブ類、プライマー類および標識プローブ類
（後述する）の特異的なセット（組）を用いて同時に精
製または検出できる。
【００１６】本明細書で使用する「プローブ」の語は、
標的核酸に相補的であるオリゴヌクレオチドを含んでな
る捕捉プローブまたは検出プローブのいずれかを称す
る。「捕捉プローブ」は、水不溶性支持体に連結された
オリゴヌクレオチドを担持する水不溶性プローブであ
る。この発明の水不溶性プローブは「捕捉プローブ」と
もみなすことができる。検出プローブは、通常、水溶性
であるが、捕捉プローブを場合によって検出にも使用す
ることができる。しかしながら、水溶性検出プローブ
は、ある手段（例えば、放射性同位体、酵素、蛍光性マ
ーカー、発色性マーカーまたは他の有用な検出成分）で
検出可能に標識されているオリゴヌクレオチドを一般に
含む。
標的核酸に相補的であるオリゴヌクレオチドを含んでな
る捕捉プローブまたは検出プローブのいずれかを称す
る。「捕捉プローブ」は、水不溶性支持体に連結された
オリゴヌクレオチドを担持する水不溶性プローブであ
る。この発明の水不溶性プローブは「捕捉プローブ」と
もみなすことができる。検出プローブは、通常、水溶性
であるが、捕捉プローブを場合によって検出にも使用す
ることができる。しかしながら、水溶性検出プローブ
は、ある手段（例えば、放射性同位体、酵素、蛍光性マ
ーカー、発色性マーカーまたは他の有用な検出成分）で
検出可能に標識されているオリゴヌクレオチドを一般に
含む。
【００１７】この発明のプローブは当該技術分野でハイ
ブリダイゼーションアッセイと知られているアッセイに
使用することができる。一般的に、このようなアッセイ
はプローブと標的核酸のハイブリダイゼーション、次い
でハイブリダイゼーション生成物をある手段で検出する
ことが必要である。ある態様では、例えばプローブが水
不溶性であり、プローブと（オリゴヌクレオチドの一部
または水不溶性粒子の一部として）組み合わさった検出
可能なマーカーによって検出可能に標識される。このハ
イブリッドは、未ハイブリッド化物質から分離され、適
当な様式で検出される。一般的にサンドイッチハイブリ
ダイゼーションアッセイとして知られる別の態様では、
１つは標的核酸を捕捉するためのものであり、もう一つ
は検出するためのものである２種のプローブが使用され
る。前記ハイブリッド「サンドイッチ」は適当に検出さ
れる。このようなアッセイの詳細は上記「従来の技術」
の引例を初めとする従来技術で周知である。
ブリダイゼーションアッセイと知られているアッセイに
使用することができる。一般的に、このようなアッセイ
はプローブと標的核酸のハイブリダイゼーション、次い
でハイブリダイゼーション生成物をある手段で検出する
ことが必要である。ある態様では、例えばプローブが水
不溶性であり、プローブと（オリゴヌクレオチドの一部
または水不溶性粒子の一部として）組み合わさった検出
可能なマーカーによって検出可能に標識される。このハ
イブリッドは、未ハイブリッド化物質から分離され、適
当な様式で検出される。一般的にサンドイッチハイブリ
ダイゼーションアッセイとして知られる別の態様では、
１つは標的核酸を捕捉するためのものであり、もう一つ
は検出するためのものである２種のプローブが使用され
る。前記ハイブリッド「サンドイッチ」は適当に検出さ
れる。このようなアッセイの詳細は上記「従来の技術」
の引例を初めとする従来技術で周知である。
【００１８】この発明のプローブを用いる方法のすべて
において、プローブオリゴヌクレオチドと標的核酸のハ
イブリダイゼーションが必須である。一般的に、ハイブ
リダイゼーションは当該技術分野で周知の条件、例えば
最低１分間の接触、ゆるやかな攪拌、pH範囲５〜９、お
よびプローブのＴm に応じた０〜75℃の温度下で生じ
る。当該技術分野で知られているように、Ｔm はプロー
ブ分子の半分がハイブリダイゼーションしそして半分が
ハイブリダイゼーションしない温度を称する。
において、プローブオリゴヌクレオチドと標的核酸のハ
イブリダイゼーションが必須である。一般的に、ハイブ
リダイゼーションは当該技術分野で周知の条件、例えば
最低１分間の接触、ゆるやかな攪拌、pH範囲５〜９、お
よびプローブのＴm に応じた０〜75℃の温度下で生じ
る。当該技術分野で知られているように、Ｔm はプロー
ブ分子の半分がハイブリダイゼーションしそして半分が
ハイブリダイゼーションしない温度を称する。
【００１９】好ましい態様では、この発明のプローブ
は、今日ポリメラーゼ連鎖反応として広く知られている
増幅法を用いる標的核酸の検出に使用される。このよう
な方法の詳細は、米国特許第 4,683,195号、同 4,683,2
02号及びヨーロッパ特許公開第258,017号公報に示され
ている。
は、今日ポリメラーゼ連鎖反応として広く知られている
増幅法を用いる標的核酸の検出に使用される。このよう
な方法の詳細は、米国特許第 4,683,195号、同 4,683,2
02号及びヨーロッパ特許公開第258,017号公報に示され
ている。
【００２０】この発明は、２本の相補鎖を有する標的精
製核酸の増幅または検出に有用である。目的の核酸配列
の殆どは、既に２本鎖であり、例えばＤＮＡに見られる
ものである。しかしながら、一本鎖核酸配列（例えば、
mRNA）も同様に増幅そして検出できる。
製核酸の増幅または検出に有用である。目的の核酸配列
の殆どは、既に２本鎖であり、例えばＤＮＡに見られる
ものである。しかしながら、一本鎖核酸配列（例えば、
mRNA）も同様に増幅そして検出できる。
【００２１】１種より多くの標的精製核酸を提供する必
要がある場合には、プライマーの適当数のセットが上記
一般的な操作で使用される。少なくとも１つのプライマ
ーエクステンション生成物の生成後、この発明の方法の
いずれかの時点でその生成物を検出プローブ（後述す
る）とハイブリダイゼーションすることができる。
要がある場合には、プライマーの適当数のセットが上記
一般的な操作で使用される。少なくとも１つのプライマ
ーエクステンション生成物の生成後、この発明の方法の
いずれかの時点でその生成物を検出プローブ（後述す
る）とハイブリダイゼーションすることができる。
【００２２】一般的に、目的の核酸配列の所定量が生成
されると、最後にそのプライマーエクステンション生成
物が分離され、この最初のプライマーエクステンション
生成物が検出のために標識されそしてそれらに相補的で
ある水溶性検出プローブと接触して一定の生成物が形成
される。このプローブは、標的核酸配列と相補的なオリ
ゴヌクレオチドである。このオリゴヌクレオチドは、い
ずれか適当な鎖長の核酸でありうるが、好ましくは15〜
40個の核酸である。それは、いずれか適当な検出可能物
質で（通常５′末端にて）標識される。標識の付着およ
びプローブの調製方法は、例えば、アグラワール(Agraw
al) ら、Nucleic Acid Res. , 14, 6227〜45ページ(198
6)に記載されるように当該技術分野で周知である。有用
な標識としては、放射性同位体、電子の濃密な試薬、発
色体、蛍光体、リン光成分、フェリチンおよび他の磁性
粒子、ビオチン、アビジン、化学発光成分および酵素
（これが好ましい）が挙げられる。有用な酵素として
は、グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ウリ
カーゼ、アルカリホスファターゼおよび当該技術分野で
既知の他の酵素が挙げられる。このような酵素に対する
基質および色素生成組成物は周知である。
されると、最後にそのプライマーエクステンション生成
物が分離され、この最初のプライマーエクステンション
生成物が検出のために標識されそしてそれらに相補的で
ある水溶性検出プローブと接触して一定の生成物が形成
される。このプローブは、標的核酸配列と相補的なオリ
ゴヌクレオチドである。このオリゴヌクレオチドは、い
ずれか適当な鎖長の核酸でありうるが、好ましくは15〜
40個の核酸である。それは、いずれか適当な検出可能物
質で（通常５′末端にて）標識される。標識の付着およ
びプローブの調製方法は、例えば、アグラワール(Agraw
al) ら、Nucleic Acid Res. , 14, 6227〜45ページ(198
6)に記載されるように当該技術分野で周知である。有用
な標識としては、放射性同位体、電子の濃密な試薬、発
色体、蛍光体、リン光成分、フェリチンおよび他の磁性
粒子、ビオチン、アビジン、化学発光成分および酵素
（これが好ましい）が挙げられる。有用な酵素として
は、グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ウリ
カーゼ、アルカリホスファターゼおよび当該技術分野で
既知の他の酵素が挙げられる。このような酵素に対する
基質および色素生成組成物は周知である。
【００２３】特に好ましい態様では、標識がペルオキシ
ダーゼであり、アッセイのいずれかの時点で過酸化水素
および適当な色素生成組成物を加えて検出可能な色素を
提供する。例えば、有用な色素生成試薬はテトラメチル
ベンジジンおよびその誘導体類、ならびにロイコ染料、
例えばトリアリールイミダゾールロイコ染料（米国特許
第 4,089,747号明細書に記載されるようなもの）または
ペルオキシダーゼと過酸化水素の存在下で反応して色素
を提供する他の化合物を含む。特に有用な色素生成組成
物は、後述の例で具体的に説明する。
ダーゼであり、アッセイのいずれかの時点で過酸化水素
および適当な色素生成組成物を加えて検出可能な色素を
提供する。例えば、有用な色素生成試薬はテトラメチル
ベンジジンおよびその誘導体類、ならびにロイコ染料、
例えばトリアリールイミダゾールロイコ染料（米国特許
第 4,089,747号明細書に記載されるようなもの）または
ペルオキシダーゼと過酸化水素の存在下で反応して色素
を提供する他の化合物を含む。特に有用な色素生成組成
物は、後述の例で具体的に説明する。
【００２４】別の態様では、増幅した標的核酸を特異的
なバインディングリガント、例えばビオチンまたはアビ
ジンを結合したプライマーを使用して検出する。このリ
ガンドは、上記のように適当に標識されたその受容体分
子（すなわち、対応する反応性物質）と反応できる。例
えば、ビオチニル化プライマーは酵素標識ストレプトア
ビジン分子を用いて検出できる。他の特異的バインディ
ング対、例えば抗体−抗原、抗体−ハプテン、糖−レク
チンが同様に使用できる。
なバインディングリガント、例えばビオチンまたはアビ
ジンを結合したプライマーを使用して検出する。このリ
ガンドは、上記のように適当に標識されたその受容体分
子（すなわち、対応する反応性物質）と反応できる。例
えば、ビオチニル化プライマーは酵素標識ストレプトア
ビジン分子を用いて検出できる。他の特異的バインディ
ング対、例えば抗体−抗原、抗体−ハプテン、糖−レク
チンが同様に使用できる。
【００２５】増幅した標的核酸生成物を検出するには、
それを捕捉プローブ（上記のような）とハイブリダイゼ
ーションさせる。得られた不溶化複合体生成物を、濾
過、遠心、洗浄または他の適当な分離技法によって未複
合体化物質から分離できる。特に有用な分離手段は、Pa
ll Corp.から市販されているポリアミド膜（例えば、Lo
Prodyne(商標) またはBiodyne(商標) 膜）のような微孔
質濾過膜である。それらを未処理のまま使用するか、あ
るいは分析操作を促進する界面活性剤または他の材料で
予め塗布してもよい。
それを捕捉プローブ（上記のような）とハイブリダイゼ
ーションさせる。得られた不溶化複合体生成物を、濾
過、遠心、洗浄または他の適当な分離技法によって未複
合体化物質から分離できる。特に有用な分離手段は、Pa
ll Corp.から市販されているポリアミド膜（例えば、Lo
Prodyne(商標) またはBiodyne(商標) 膜）のような微孔
質濾過膜である。それらを未処理のまま使用するか、あ
るいは分析操作を促進する界面活性剤または他の材料で
予め塗布してもよい。
【００２６】膜は、分析の他の工程を実施するのに適す
るコンテナと共に分離基材として使用することができ
る。しかしながら、それらは試験デバイスに固定するこ
とが好ましい。各種の試験デバイスが、米国特許第 3,8
25,410号、同 3,888,629号、同3,970,429号および同 4,
446,232号明細書に記載されるものを初めとして知られ
ている。
るコンテナと共に分離基材として使用することができ
る。しかしながら、それらは試験デバイスに固定するこ
とが好ましい。各種の試験デバイスが、米国特許第 3,8
25,410号、同 3,888,629号、同3,970,429号および同 4,
446,232号明細書に記載されるものを初めとして知られ
ている。
【００２７】従って、標的核酸の検出方法は次の工程を
含んでなる。 Ａ．相補的プライマー、デオキシリボヌクレオシドトリ
ホスフェートおよび重合剤の存在下で被検体中の標的核
酸を増幅する工程、 Ｂ．前記の増幅標的核酸を、pI６以下を示すタンパク質
または炭水化物であって、オリゴヌクレオチドとの共有
結合反応用の基を提供するようにアシル化剤、アルキル
化剤もしくはスルホニル化剤で化学的に変性しており、
そして他のタンパク質または炭水化物を実質的に除去し
た水不溶性粒子表面に共有結合したタンパク質または炭
水化物である連結基を介してその粒子に付着した前記オ
リゴヌクレオチドを含んでなる水不溶性核酸プローブと
接触して標的核酸と前記水不溶性プローブの固定化ハイ
ブリダイゼーション生成物を形成する工程、 Ｃ．前記固定化生成物を未固定化物質から分離する工
程、 Ｄ．被検体中の標的核酸量を示すものとして前記固定化
生成物を検出する工程。
含んでなる。 Ａ．相補的プライマー、デオキシリボヌクレオシドトリ
ホスフェートおよび重合剤の存在下で被検体中の標的核
酸を増幅する工程、 Ｂ．前記の増幅標的核酸を、pI６以下を示すタンパク質
または炭水化物であって、オリゴヌクレオチドとの共有
結合反応用の基を提供するようにアシル化剤、アルキル
化剤もしくはスルホニル化剤で化学的に変性しており、
そして他のタンパク質または炭水化物を実質的に除去し
た水不溶性粒子表面に共有結合したタンパク質または炭
水化物である連結基を介してその粒子に付着した前記オ
リゴヌクレオチドを含んでなる水不溶性核酸プローブと
接触して標的核酸と前記水不溶性プローブの固定化ハイ
ブリダイゼーション生成物を形成する工程、 Ｃ．前記固定化生成物を未固定化物質から分離する工
程、 Ｄ．被検体中の標的核酸量を示すものとして前記固定化
生成物を検出する工程。
【００２８】この発明の水不溶性試薬は、それを使用し
て水不溶性粒子に共有結合したｐＩが６以下を示すタン
パク質または炭水化物を含んでなるこの発明のプローブ
を調製することができる。有用な粒子は、水に溶解しな
いかまたは殆ど膨潤しないいずれかの適当な合成もしく
は天然材料から調製できる。限定されるものでないが、
適当な粒状材質としては、セルロース系材料、ガラス、
セラミック、金属および各種のポリマー類が挙げられ
る。それらは、球形、卵形、立方形、不規則または平板
状であり0.１〜10μｍの平均寸法（例えば、直径）を有
するいずれかの形状およびサイズであることができる
が、一定の例ではより大きいかもしくはより小さいサイ
ズのものであってもよい。
て水不溶性粒子に共有結合したｐＩが６以下を示すタン
パク質または炭水化物を含んでなるこの発明のプローブ
を調製することができる。有用な粒子は、水に溶解しな
いかまたは殆ど膨潤しないいずれかの適当な合成もしく
は天然材料から調製できる。限定されるものでないが、
適当な粒状材質としては、セルロース系材料、ガラス、
セラミック、金属および各種のポリマー類が挙げられ
る。それらは、球形、卵形、立方形、不規則または平板
状であり0.１〜10μｍの平均寸法（例えば、直径）を有
するいずれかの形状およびサイズであることができる
が、一定の例ではより大きいかもしくはより小さいサイ
ズのものであってもよい。
【００２９】好ましくは、粒子は球形で平均径が0.１〜
10μｍであり、タンパク質または炭水化物と反応しうる
表面上の基を有する合成ポリマー類から構成される。限
定されるものでないが、有用な反応性基としては、カル
ボキシ、アミノ、スルフヒドリル、アルデヒド、活性２
−置換エチルスルホニル、ビニルスルホニル、活性ハロ
ゲン原子、ビニルスルホニルアルキレン、ニトロアリー
ル、エステルおよび当業者に自明な他の基が挙げられ
る。特に有用な反応性基としては、カルボキシ、活性ハ
ロゲン原子、ビニルスルホニル、ビニルスルホニルアル
キレンおよび活性２−置換エチルスルホニルが挙げられ
る。活性２−置換エチルスルホニル基を有するモノマー
類が最も好ましい。これらの材料の幾つかは、ヨーロッ
パ特許公開第 302,715号公報に詳細に記載されている。
10μｍであり、タンパク質または炭水化物と反応しうる
表面上の基を有する合成ポリマー類から構成される。限
定されるものでないが、有用な反応性基としては、カル
ボキシ、アミノ、スルフヒドリル、アルデヒド、活性２
−置換エチルスルホニル、ビニルスルホニル、活性ハロ
ゲン原子、ビニルスルホニルアルキレン、ニトロアリー
ル、エステルおよび当業者に自明な他の基が挙げられ
る。特に有用な反応性基としては、カルボキシ、活性ハ
ロゲン原子、ビニルスルホニル、ビニルスルホニルアル
キレンおよび活性２−置換エチルスルホニルが挙げられ
る。活性２−置換エチルスルホニル基を有するモノマー
類が最も好ましい。これらの材料の幾つかは、ヨーロッ
パ特許公開第 302,715号公報に詳細に記載されている。
【００３０】低ｐＩタンパク質または炭水化物は上記の
粒子に共有結合される。一般的に、単一のタンパク質ま
たは炭水化物が使用されるが、場合により混合物が適す
る。これらの材料は、６以下のｐＩを示し、水溶性であ
る。ｐＩ（または等電点）の語は、分子の電荷が中性で
あるように分子中に等しい数の正電荷および負電荷が存
在するpHとして知られている。タンパク質または炭水化
物のｐＩは標準的な物質および操作によって測定するこ
とができる。例えば、ＬＫＢアンホリン(Ampholine) Ｐ
ＡＧプレート (LKB-Produkter AB, Bromma, Sweden、よ
り入手可能)(pH3.５〜9.５）と標準的な測定器を用いる
等電点電気泳動によってｐＩ値を測定できる。
粒子に共有結合される。一般的に、単一のタンパク質ま
たは炭水化物が使用されるが、場合により混合物が適す
る。これらの材料は、６以下のｐＩを示し、水溶性であ
る。ｐＩ（または等電点）の語は、分子の電荷が中性で
あるように分子中に等しい数の正電荷および負電荷が存
在するpHとして知られている。タンパク質または炭水化
物のｐＩは標準的な物質および操作によって測定するこ
とができる。例えば、ＬＫＢアンホリン(Ampholine) Ｐ
ＡＧプレート (LKB-Produkter AB, Bromma, Sweden、よ
り入手可能)(pH3.５〜9.５）と標準的な測定器を用いる
等電点電気泳動によってｐＩ値を測定できる。
【００３１】この発明で有用なタンパク質および炭水化
物は免疫反応性物質、すなわち適当な宿主哺乳類におい
て免疫応答性物質を産生し、抗体−抗原反応に関与しう
る抗体または抗原物質であることができる。しかしなが
ら、タンパク質および炭水化物は非免疫反応性（それら
が認識できる程度までは免疫反応に関与しないことを意
味する）であることが好ましい。
物は免疫反応性物質、すなわち適当な宿主哺乳類におい
て免疫応答性物質を産生し、抗体−抗原反応に関与しう
る抗体または抗原物質であることができる。しかしなが
ら、タンパク質および炭水化物は非免疫反応性（それら
が認識できる程度までは免疫反応に関与しないことを意
味する）であることが好ましい。
【００３２】有用な水溶性非免疫反応性タンパク質とし
ては、カゼイン誘導体および負に帯電した他のタンパク
質誘導体類、例えばスクシニル化カゼイン、グルタリル
化カゼイン、スクシニル化ウシ血清アルブミン、スクシ
ニル化コラーゲンおよび当業者に自明の他のタンパク質
が挙げられる。これらの誘導体類は、一般的に、適当な
アミン基を有するカゼイン、ウシ血清アルブミン、コラ
ーゲンおよび他のタンパク質のアシル化、アルキル化ま
たはスルホニル化によってタンパク質または炭水化物上
に反応性カルボキシ基を提供することで得られる。この
ような変性したタンパク質および炭水化物は、一般的に
市販されている。
ては、カゼイン誘導体および負に帯電した他のタンパク
質誘導体類、例えばスクシニル化カゼイン、グルタリル
化カゼイン、スクシニル化ウシ血清アルブミン、スクシ
ニル化コラーゲンおよび当業者に自明の他のタンパク質
が挙げられる。これらの誘導体類は、一般的に、適当な
アミン基を有するカゼイン、ウシ血清アルブミン、コラ
ーゲンおよび他のタンパク質のアシル化、アルキル化ま
たはスルホニル化によってタンパク質または炭水化物上
に反応性カルボキシ基を提供することで得られる。この
ような変性したタンパク質および炭水化物は、一般的に
市販されている。
【００３３】アシル化剤および条件は、例えば米国特許
第 4,591,571号明細書に記載されており、ジカルボン酸
およびポリカルボン酸由来の酸無水物、アシルハロゲン
化物およびエステル誘導体が挙げられる。コハク酸無水
物が好ましいアシル化剤である。カゼインのスクシニル
化は後述の例１に記載されている。限定されるものでは
ないが、有用なアルキル化剤およびスルホニル化剤とし
ては、ブロモ酢酸、クロロ酢酸、フルオロニトロベンゼ
ン、ｍ−（クロロスルホニル）安息香酸、ブロモマロン
酸、ブロモプロピオン酸およびｐ−（クロロスルホニ
ル）安息香酸が挙げられる。
第 4,591,571号明細書に記載されており、ジカルボン酸
およびポリカルボン酸由来の酸無水物、アシルハロゲン
化物およびエステル誘導体が挙げられる。コハク酸無水
物が好ましいアシル化剤である。カゼインのスクシニル
化は後述の例１に記載されている。限定されるものでは
ないが、有用なアルキル化剤およびスルホニル化剤とし
ては、ブロモ酢酸、クロロ酢酸、フルオロニトロベンゼ
ン、ｍ−（クロロスルホニル）安息香酸、ブロモマロン
酸、ブロモプロピオン酸およびｐ−（クロロスルホニ
ル）安息香酸が挙げられる。
【００３４】タンパク質をアシル化、アルキル化または
スルホニル化するための条件は、一般的にタンパク質の
重量に対して３倍の変性剤を用い室温でホウ酸緩衝液
（0.05モル濃度、pH8.５）の使用を含む。タンパク質
は、それを前記粒子に共有結合した後にこの発明で使用
するために変性される。
スルホニル化するための条件は、一般的にタンパク質の
重量に対して３倍の変性剤を用い室温でホウ酸緩衝液
（0.05モル濃度、pH8.５）の使用を含む。タンパク質
は、それを前記粒子に共有結合した後にこの発明で使用
するために変性される。
【００３５】限定されるものでないが、低ｐＩを示す水
溶性炭水化物としては、カルボキシメチルセルロース、
カルボキシエチルセルロースおよび当業者に自明の他の
炭水化物が挙げられる。このような材料は一般的に市販
されている。
溶性炭水化物としては、カルボキシメチルセルロース、
カルボキシエチルセルロースおよび当業者に自明の他の
炭水化物が挙げられる。このような材料は一般的に市販
されている。
【００３６】好ましい低ｐＩタンパク質および炭水化物
の群には、スクシニル化カゼイン、スクシニル化コラー
ゲン、グルタリル化カゼイン、スクシニル化ウシ血清ア
ルブミン、カルボキシメチルセルロースおよびカルボキ
シエチルセルロースが含まれる。スクシニル化カゼイン
が特に好ましい。
の群には、スクシニル化カゼイン、スクシニル化コラー
ゲン、グルタリル化カゼイン、スクシニル化ウシ血清ア
ルブミン、カルボキシメチルセルロースおよびカルボキ
シエチルセルロースが含まれる。スクシニル化カゼイン
が特に好ましい。
【００３７】この発明の水不溶性試薬は、一般的に、タ
ンパク質または炭水化物がそれらを付着するような粒子
の表面反応性基と最初に反応することによって調製され
る。タンパク質は、粒子上に存在する表面基と直接また
は連結部分を介して反応することができる。一般的に、
タンパク質または炭水化物を結合する条件は、反応を促
進するpHおよび温度条件下で一定時間（通常、最低６時
間）前記粒子とタンパク質（または炭水化物）を接触さ
せることによって実施される。有用なpHは通常、５〜９
であり、温度は通常、20〜40℃である。代表的な方法は
後述の例１に記載される。
ンパク質または炭水化物がそれらを付着するような粒子
の表面反応性基と最初に反応することによって調製され
る。タンパク質は、粒子上に存在する表面基と直接また
は連結部分を介して反応することができる。一般的に、
タンパク質または炭水化物を結合する条件は、反応を促
進するpHおよび温度条件下で一定時間（通常、最低６時
間）前記粒子とタンパク質（または炭水化物）を接触さ
せることによって実施される。有用なpHは通常、５〜９
であり、温度は通常、20〜40℃である。代表的な方法は
後述の例１に記載される。
【００３８】タンパク質または炭水化物を変性して反応
性カルボキシ基を付与した後、それにオリゴヌクレオチ
ドを結合する。プローブの調製に使用されるオリゴヌク
レオチド類は上記にほぼ記載した。それらは、一般的に
鎖長15〜50個のヌクレオチドであり、標的核酸の核酸配
列に相補的である。それらは、２−（Ｎ−モルホリノ）
エタンスルホン酸緩衝液（pH６）中で一般的にカルボニ
ル基のカルボジイミド活性化によって変性タンパク質ま
たは炭水化物に結合される。プローブを調製するための
代表的な方法は後述の例２に示される。
性カルボキシ基を付与した後、それにオリゴヌクレオチ
ドを結合する。プローブの調製に使用されるオリゴヌク
レオチド類は上記にほぼ記載した。それらは、一般的に
鎖長15〜50個のヌクレオチドであり、標的核酸の核酸配
列に相補的である。それらは、２−（Ｎ−モルホリノ）
エタンスルホン酸緩衝液（pH６）中で一般的にカルボニ
ル基のカルボジイミド活性化によって変性タンパク質ま
たは炭水化物に結合される。プローブを調製するための
代表的な方法は後述の例２に示される。
【００３９】上記のように、このプローブは組み合わさ
れた検出可能な標識を有することができる（検出可能な
標識がある様式でプローブの一部となりうることを意味
する）。例えば、タンパク質もしくは炭水化物連結基ま
たはオリゴヌクレオチドを、例えば既知の化学的方法を
用いて酵素または放射性同位体によって標識する。ま
た、吸収性色素を含有する粒子を担持する態様における
ごとく、マーカーは粒子内またはその表面に存在しても
よい。
れた検出可能な標識を有することができる（検出可能な
標識がある様式でプローブの一部となりうることを意味
する）。例えば、タンパク質もしくは炭水化物連結基ま
たはオリゴヌクレオチドを、例えば既知の化学的方法を
用いて酵素または放射性同位体によって標識する。ま
た、吸収性色素を含有する粒子を担持する態様における
ごとく、マーカーは粒子内またはその表面に存在しても
よい。
【００４０】プローブの粒子は、本明細書で開示する低
ｐＩ材料以外のどのようなタンパク質または炭水化物を
どのような状態でも担持しない。「実質的に除去した」
とは、他のタンパク質または炭水化物によって粒子表面
積の５％未満が被覆されるにすぎないことを意味する。
ｐＩ材料以外のどのようなタンパク質または炭水化物を
どのような状態でも担持しない。「実質的に除去した」
とは、他のタンパク質または炭水化物によって粒子表面
積の５％未満が被覆されるにすぎないことを意味する。
【００４１】この発明のプローブは、適当な試薬、試験
装置および診断試験を行うのに必要な説明書と共に診断
試験キットの成分として提供することができる。限定さ
れるものでないが、この発明の試験キットに含めること
ができる有用な試薬類としては、標的核酸に相補的でも
ある水溶性プローブまたはプライマー類、洗液、色素生
成組成物、酵素の基質およびポリメラーゼ連鎖反応試薬
が挙げられる。
装置および診断試験を行うのに必要な説明書と共に診断
試験キットの成分として提供することができる。限定さ
れるものでないが、この発明の試験キットに含めること
ができる有用な試薬類としては、標的核酸に相補的でも
ある水溶性プローブまたはプライマー類、洗液、色素生
成組成物、酵素の基質およびポリメラーゼ連鎖反応試薬
が挙げられる。
【００４２】
【実施例】以下の例は、この発明の実施を具体的に説明
する目的で提供する。それによってこの発明を限定する
意図は存在しない。すべてのパーセンテージは、別に指
摘しない限り重量による。
する目的で提供する。それによってこの発明を限定する
意図は存在しない。すべてのパーセンテージは、別に指
摘しない限り重量による。
【００４３】例１：水不溶性試薬の調製 この発明の実施に有用な試薬を以下の手順で調製した。
ポリ〔スチレン−コ−ｍ＆ｐ−（２−クロロエチルスル
ホニルメチル）−スチレン〕（モル比、95.5：4.５、平
均サイズ2.２μｍ）を含んでなるポリマー粒子を、特開
昭64-54259号公報に記載されている方法によって調製し
た。
ポリ〔スチレン−コ−ｍ＆ｐ−（２−クロロエチルスル
ホニルメチル）−スチレン〕（モル比、95.5：4.５、平
均サイズ2.２μｍ）を含んでなるポリマー粒子を、特開
昭64-54259号公報に記載されている方法によって調製し
た。
【００４４】次の方法でこれらの粒子にカゼインを付着
した。カゼイン〔Sigma Chemical、0.05モル濃度のホウ
酸緩衝液（pH8.５）１ml当たり2.57ml溶液4.94ml〕、チ
メロサール（0.01％）および上記ポリマー粒子懸濁液
（ホウ酸緩衝液１ml当たり0.0637ｇ、17.7ml）を室温で
16時間回転した。次に、この混合物を遠心し、緩衝液を
廃棄した。得られたペレットをグリシン緩衝液（0.１モ
ル濃度、50ml、pH8.５）およびチメロサール（0.01％）
中に再懸濁した。この混合物を遠心し、得られたペレッ
トをグリシン緩衝液(250ml) で再懸濁して0.45％固体と
した。
した。カゼイン〔Sigma Chemical、0.05モル濃度のホウ
酸緩衝液（pH8.５）１ml当たり2.57ml溶液4.94ml〕、チ
メロサール（0.01％）および上記ポリマー粒子懸濁液
（ホウ酸緩衝液１ml当たり0.0637ｇ、17.7ml）を室温で
16時間回転した。次に、この混合物を遠心し、緩衝液を
廃棄した。得られたペレットをグリシン緩衝液（0.１モ
ル濃度、50ml、pH8.５）およびチメロサール（0.01％）
中に再懸濁した。この混合物を遠心し、得られたペレッ
トをグリシン緩衝液(250ml) で再懸濁して0.45％固体と
した。
【００４５】粒子2.54ｇを含有する粒子懸濁液（50ml）
の試料を、ホウ酸塩緩衝液（10ml、0.05モル濃度、pH8.
５）で３度洗浄し、ジメチルスルホキシド溶液（10mg／
ml）中でコハク酸無水物 (Sigma Chemical、0.762ml)と
混合し、室温で４時間反応し、カゼイン分子を変性して
カルボキシを付与した。混合物を遠心し、溶液を廃棄し
た。得られたペレットをグリシン緩衝液（50ml、0.01モ
ル濃度、pH8.５）で３度洗浄し、0.45％固体になるまで
グリシン緩衝液で再懸濁して目的の試薬を得た。
の試料を、ホウ酸塩緩衝液（10ml、0.05モル濃度、pH8.
５）で３度洗浄し、ジメチルスルホキシド溶液（10mg／
ml）中でコハク酸無水物 (Sigma Chemical、0.762ml)と
混合し、室温で４時間反応し、カゼイン分子を変性して
カルボキシを付与した。混合物を遠心し、溶液を廃棄し
た。得られたペレットをグリシン緩衝液（50ml、0.01モ
ル濃度、pH8.５）で３度洗浄し、0.45％固体になるまで
グリシン緩衝液で再懸濁して目的の試薬を得た。
【００４６】例２：水不溶性核酸プローブの調製 グリシン緩衝液中例１の試薬の懸濁液（15ml、0.0045ｇ
／ml）を遠心し、ペレットを２−（Ｎ−モルホリノ）エ
タンスルホン酸緩衝液（0.１モル濃度、pH６）で再懸濁
した。この操作を２度繰り返し、得られたペレットを、
１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカル
ボジイミド塩酸塩（同一の緩衝液１ml当たり 100mg溶液
0.338ml)および下記の配列を有するオリゴヌクレオチド
（緩衝液１ml当たり5.73ODの溶液 0.654μｌ）と混合し
た。この懸濁液を室温で６時間回転攪拌し、次いで遠心
し、ペレットをナノ純度の水（15ml）で再懸濁した。こ
の遠心操作を３度繰り返し、得られたペレットを水に懸
濁して水不溶性プローブの0.45％固体懸濁液を得た。
／ml）を遠心し、ペレットを２−（Ｎ−モルホリノ）エ
タンスルホン酸緩衝液（0.１モル濃度、pH６）で再懸濁
した。この操作を２度繰り返し、得られたペレットを、
１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカル
ボジイミド塩酸塩（同一の緩衝液１ml当たり 100mg溶液
0.338ml)および下記の配列を有するオリゴヌクレオチド
（緩衝液１ml当たり5.73ODの溶液 0.654μｌ）と混合し
た。この懸濁液を室温で６時間回転攪拌し、次いで遠心
し、ペレットをナノ純度の水（15ml）で再懸濁した。こ
の遠心操作を３度繰り返し、得られたペレットを水に懸
濁して水不溶性プローブの0.45％固体懸濁液を得た。
【００４７】このプローブのオリゴヌクレオチドは次の
核酸配列（標準的な塩基の同定を用いる）を有してい
た。 5′-ATCCTGGGATTAAATAAAATAGTAAGAATGT-3′
核酸配列（標準的な塩基の同定を用いる）を有してい
た。 5′-ATCCTGGGATTAAATAAAATAGTAAGAATGT-3′
【００４８】例３：プローブを用いる診断アッセイ 例２で調製したプローブを用いて下記の方法で標的核酸
を検出した。この例は、「フロースロー(flow throug
h)」法と称する方法で水不溶性プローブを、使い捨て試
験デバイス中の濾過膜に固定したものを用いる HIV-I D
NAの検出を例示する。標的の HIV-I DNAとのハイブリダ
イゼーションを起こして水不溶性生成物を形成し、次い
で水溶性物質を濾過膜を通して洗浄した。水不溶性生成
物が膜表面上で検出される。
を検出した。この例は、「フロースロー(flow throug
h)」法と称する方法で水不溶性プローブを、使い捨て試
験デバイス中の濾過膜に固定したものを用いる HIV-I D
NAの検出を例示する。標的の HIV-I DNAとのハイブリダ
イゼーションを起こして水不溶性生成物を形成し、次い
で水溶性物質を濾過膜を通して洗浄した。水不溶性生成
物が膜表面上で検出される。
【００４９】材 料 ロイコ染料溶液は、次のように２−（４−ヒドロキシ−
３，５−ジメトキシフェニル）−４，５−ビス（４−メ
トキシフェニル）イミダゾールを含むように調製した。
固体ロイコ染料（0.１％溶液を調製する量）を、リン酸
ナトリウム緩衝液（５ミリモル濃度）中20％ポリ（ビニ
ルピロリドン）溶液で溶解した。次に、この溶液を、リ
ン酸ナトリウム緩衝液中過酸化水素（10ミリモル濃
度）、４′−ヒドロキシアセタニリド電子移動剤（５ミ
リモル濃度）およびジエチレントリアミン五酢酸キレー
ト剤（10マイクロモル濃度）含有溶液に添加し、最終濃
度１％ポリ（ビニルピロリドン）および 0.005％ロイコ
染料とした。
３，５−ジメトキシフェニル）−４，５−ビス（４−メ
トキシフェニル）イミダゾールを含むように調製した。
固体ロイコ染料（0.１％溶液を調製する量）を、リン酸
ナトリウム緩衝液（５ミリモル濃度）中20％ポリ（ビニ
ルピロリドン）溶液で溶解した。次に、この溶液を、リ
ン酸ナトリウム緩衝液中過酸化水素（10ミリモル濃
度）、４′−ヒドロキシアセタニリド電子移動剤（５ミ
リモル濃度）およびジエチレントリアミン五酢酸キレー
ト剤（10マイクロモル濃度）含有溶液に添加し、最終濃
度１％ポリ（ビニルピロリドン）および 0.005％ロイコ
染料とした。
【００５０】スクシニル化カゼインは、カゼインを同重
量のコハク酸無水物と25℃で４時間反応させ、次いで透
析によって精製して調製した。この例で検出する標的Ｄ
ＮＡフラグメントは、標準的な方法を用いて HIV-Iゲノ
ムのｇａｇ領域（コア−タンパク質）の 180ヌクレオチ
ドセグメントをＭ13ベクターの誘導体にクローン化して
調製した。
量のコハク酸無水物と25℃で４時間反応させ、次いで透
析によって精製して調製した。この例で検出する標的Ｄ
ＮＡフラグメントは、標準的な方法を用いて HIV-Iゲノ
ムのｇａｇ領域（コア−タンパク質）の 180ヌクレオチ
ドセグメントをＭ13ベクターの誘導体にクローン化して
調製した。
【００５１】予め測定されたＤＮＡ鎖の増幅に使用した
プライマー類は次のヌクレオチド配列を有していた。 5′-X- TTTGGTCCTTGTCTTATGTCCAGAATGC-3′および 5′-ATAATCCACCTATCCCAGTAGGAGAAAT-3 ′ 上記配列中、Ｘはビオチンテトラエチレングリコールス
ペーサーを表わし、国際公開第89／02931 号公報に記載
される方法で調製し結合した。
プライマー類は次のヌクレオチド配列を有していた。 5′-X- TTTGGTCCTTGTCTTATGTCCAGAATGC-3′および 5′-ATAATCCACCTATCCCAGTAGGAGAAAT-3 ′ 上記配列中、Ｘはビオチンテトラエチレングリコールス
ペーサーを表わし、国際公開第89／02931 号公報に記載
される方法で調製し結合した。
【００５２】ＤＮＡポリメラーゼは、ヨーロッパ特許公
開第 258,017号公報に記載される方法に準じてサーマス
・アクアティカス（Thermus aquaticus ）より単離し
た（１単位は、37℃中30分でプライマーエクステンショ
ン生成物中に dNTP 10ミリモルが取り込まれる活性に相
当する）。
開第 258,017号公報に記載される方法に準じてサーマス
・アクアティカス（Thermus aquaticus ）より単離し
た（１単位は、37℃中30分でプライマーエクステンショ
ン生成物中に dNTP 10ミリモルが取り込まれる活性に相
当する）。
【００５３】ストレプトアビジン−ワサビペルオキシダ
ーゼ結合物を、Zymed Labs(San Francisco) から入手
し、カゼイン（0.５％）、３−（Ｎ−モルホリノ）−プ
ロパンスルホン酸緩衝剤(100ミリモル濃度、pH7.５）お
よび防腐剤（0.01％）を含有するリン酸緩衝溶液で１：
8000に希釈した。結合体の最終濃度は 156ng／mlであっ
た。リン酸緩衝溶液は、リン酸ナトリウム（25ミリモル
濃度、pH7.３）と塩化ナトリウム（75ミリモル濃度）を
含めた。
ーゼ結合物を、Zymed Labs(San Francisco) から入手
し、カゼイン（0.５％）、３−（Ｎ−モルホリノ）−プ
ロパンスルホン酸緩衝剤(100ミリモル濃度、pH7.５）お
よび防腐剤（0.01％）を含有するリン酸緩衝溶液で１：
8000に希釈した。結合体の最終濃度は 156ng／mlであっ
た。リン酸緩衝溶液は、リン酸ナトリウム（25ミリモル
濃度、pH7.３）と塩化ナトリウム（75ミリモル濃度）を
含めた。
【００５４】例２の水不溶性プローブ（0.45％懸濁液１
μｌ）を、Surecell（商標）使い捨て試験デバイス(Eas
tman Koduk Co.) の試験ウェル中に設置した数個の微孔
質膜〔スクシニル化カゼインを１ｍ2 当たり１ｇ塗布し
たBiodyne(商標) Ａナイロン膜〕それぞれの特定の区画
（約２mm2 未満）に堆積した。このプローブを室温で約
30分間乾燥した。次に、得られた試験製品を次のアッセ
イで使用した。
μｌ）を、Surecell（商標）使い捨て試験デバイス(Eas
tman Koduk Co.) の試験ウェル中に設置した数個の微孔
質膜〔スクシニル化カゼインを１ｍ2 当たり１ｇ塗布し
たBiodyne(商標) Ａナイロン膜〕それぞれの特定の区画
（約２mm2 未満）に堆積した。このプローブを室温で約
30分間乾燥した。次に、得られた試験製品を次のアッセ
イで使用した。
【００５５】アッセイ手順 トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝剤（10ミ
リモル濃度、pH８）、塩化カリウム（50ミリモル濃
度）、塩化マグネシウム（10ミリモル濃度）およびゼラ
チン（10μｇ）を含む緩衝液に、上記プライマー類（各
100ピコモル）、dNTP（各1.５ミリモル濃度）、上記ポ
リメラーゼ（7.５単位）およびヒト胎盤ＤＮＡ(Sigma、
１μｇ）を加えた。さらに、上記ＤＮＡ標的（10-16 モ
ル濃度）を加え、総容量を 100μｌにした。
リモル濃度、pH８）、塩化カリウム（50ミリモル濃
度）、塩化マグネシウム（10ミリモル濃度）およびゼラ
チン（10μｇ）を含む緩衝液に、上記プライマー類（各
100ピコモル）、dNTP（各1.５ミリモル濃度）、上記ポ
リメラーゼ（7.５単位）およびヒト胎盤ＤＮＡ(Sigma、
１μｇ）を加えた。さらに、上記ＤＮＡ標的（10-16 モ
ル濃度）を加え、総容量を 100μｌにした。
【００５６】対照(100μｌ) は、標的としてβ−グロビ
ン遺伝子を含むヒト胎盤ＤＮＡ（10μｇ／ml）、および
当該技術分野で既知のβ−グロビンＤＮＡに対して特異
的でプライマーの１つはビオチニル化されている適当な
プライマー類を含めためのを調製した。
ン遺伝子を含むヒト胎盤ＤＮＡ（10μｇ／ml）、および
当該技術分野で既知のβ−グロビンＤＮＡに対して特異
的でプライマーの１つはビオチニル化されている適当な
プライマー類を含めためのを調製した。
【００５７】上記各溶液をポリプロピレン微量遠心管中
に入れ、プライマーエクステンション生成物を形成し、
その後次のような連続加熱サイクルを30回使用して増幅
を行った。 70℃から95℃への昇温 1 分 95℃ 0.５分（変性） 95℃から55℃への降温 1.25分 55℃ 0.５分（ハイブリダイゼー
ション） 55℃から70℃への昇温 0.75分 70℃ 1 分（エクステンション）
に入れ、プライマーエクステンション生成物を形成し、
その後次のような連続加熱サイクルを30回使用して増幅
を行った。 70℃から95℃への昇温 1 分 95℃ 0.５分（変性） 95℃から55℃への降温 1.25分 55℃ 0.５分（ハイブリダイゼー
ション） 55℃から70℃への昇温 0.75分 70℃ 1 分（エクステンション）
【００５８】加熱サイクル30回を通じて増幅した後、各
混合物の５μｌアリコートを、トリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタン緩衝剤（10ミリモル濃度、pH８）、塩
化カリウム（50ミリモル濃度）、塩化マグネシウム（10
ミリモル濃度）およびゼラチン（溶液10ml当たり１μ
ｇ）を含む溶液(95 μｌ）に加え、熱変性（95℃で５
分）し、次いで上記Surecell（商標）試験デバイスの試
験ウェル（各ウェル中のそれぞれの溶液約95μｌ）に加
えた。
混合物の５μｌアリコートを、トリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタン緩衝剤（10ミリモル濃度、pH８）、塩
化カリウム（50ミリモル濃度）、塩化マグネシウム（10
ミリモル濃度）およびゼラチン（溶液10ml当たり１μ
ｇ）を含む溶液(95 μｌ）に加え、熱変性（95℃で５
分）し、次いで上記Surecell（商標）試験デバイスの試
験ウェル（各ウェル中のそれぞれの溶液約95μｌ）に加
えた。
【００５９】各試験ウェル上にテープを設置しそれらを
密封し、それらのデバイスを５分間42℃でインキュベー
ションして試験ウェル中に固定された水不溶性プローブ
に増幅した HIV-I DNAフラグメントをハイブリダイゼー
ションした。次に、テープを各試験ウェルから除去し、
次いでリン酸塩緩衝剤（10ミリモル濃度、pH7.４）、塩
化ナトリウム(150ミリモル濃度) 、エチレンジアミン四
酢酸（１ミリモル濃度）およびデシル硫酸ナトリウム
（１％）を含む緩衝液(250μｌ）で55℃にて洗浄した。
密封し、それらのデバイスを５分間42℃でインキュベー
ションして試験ウェル中に固定された水不溶性プローブ
に増幅した HIV-I DNAフラグメントをハイブリダイゼー
ションした。次に、テープを各試験ウェルから除去し、
次いでリン酸塩緩衝剤（10ミリモル濃度、pH7.４）、塩
化ナトリウム(150ミリモル濃度) 、エチレンジアミン四
酢酸（１ミリモル濃度）およびデシル硫酸ナトリウム
（１％）を含む緩衝液(250μｌ）で55℃にて洗浄した。
【００６０】上記ペルオキシダーゼ結合物（50μｌ、7.
８ng）を、各試験ウェルに加え、これらのデバイスを２
分間室温でインキュベーションした。２度目の洗浄(250
μｌ）を上記緩衝液を用いて行った。ロイコ染料溶液(1
00μｌ）を各試験ウェルに加え、次いでさらにインキュ
ベーションを２分間室温で行った。生じた色素形成反応
をアジ化ナトリウム（0.１％の 100μｌ）の添加によっ
て停止し、得られた色素を膜上で観察した。
８ng）を、各試験ウェルに加え、これらのデバイスを２
分間室温でインキュベーションした。２度目の洗浄(250
μｌ）を上記緩衝液を用いて行った。ロイコ染料溶液(1
00μｌ）を各試験ウェルに加え、次いでさらにインキュ
ベーションを２分間室温で行った。生じた色素形成反応
をアジ化ナトリウム（0.１％の 100μｌ）の添加によっ
て停止し、得られた色素を膜上で観察した。
【００６１】アッセイによって膜上に形成された色素量
を、０〜５（０は濃度がなくそして５は最高の濃度を示
す）の段階標準によって視覚的に評価した。バックグラ
ンド値は、水不溶性プローブが存在しない場所の膜領域
上を読み取った濃度から得た。この発明のアッセイにつ
いて読み取った色素濃度は約4.８であることが測定され
たが、一方バックグランド濃度は約0.５であった。
を、０〜５（０は濃度がなくそして５は最高の濃度を示
す）の段階標準によって視覚的に評価した。バックグラ
ンド値は、水不溶性プローブが存在しない場所の膜領域
上を読み取った濃度から得た。この発明のアッセイにつ
いて読み取った色素濃度は約4.８であることが測定され
たが、一方バックグランド濃度は約0.５であった。
【００６２】
【発明の効果】この発明は、核酸の精製、ポリメラーゼ
連鎖反応増幅およびハイブリダイゼーションアッセイを
初めとする各種の研究および診断法で使用できる粒子か
ら形成される有用な水不溶性核酸プローブを提供する。
これらのプローブは、粒子表面へのオリゴヌクレオチド
の最少限の吸着が存在するにすぎないので非常に効率が
よい。さらに、オリゴヌクレオチドが粒子に効率よく連
結されている。
連鎖反応増幅およびハイブリダイゼーションアッセイを
初めとする各種の研究および診断法で使用できる粒子か
ら形成される有用な水不溶性核酸プローブを提供する。
これらのプローブは、粒子表面へのオリゴヌクレオチド
の最少限の吸着が存在するにすぎないので非常に効率が
よい。さらに、オリゴヌクレオチドが粒子に効率よく連
結されている。
【００６３】これらの利点は、pI６未満を示すタンパク
質または炭水化物を介して粒子にオリゴヌクレオチドを
連結することによって達成される。この連結部分は、タ
ンパク質または炭水化物を粒子に共有結合することによ
って得られ、次いでタンパク質または炭水化物の変性に
よってそのペンダントアミノ基をカルボン酸基に転化
し、これによってそのｐＩを６以下に低下する。次に、
この変性タンパク質または炭水化物にオリゴヌクレオチ
ドが付着される。
質または炭水化物を介して粒子にオリゴヌクレオチドを
連結することによって達成される。この連結部分は、タ
ンパク質または炭水化物を粒子に共有結合することによ
って得られ、次いでタンパク質または炭水化物の変性に
よってそのペンダントアミノ基をカルボン酸基に転化
し、これによってそのｐＩを６以下に低下する。次に、
この変性タンパク質または炭水化物にオリゴヌクレオチ
ドが付着される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ジョン ブルース フィンドレイ アメリカ合衆国，ニューヨーク 14612, ロチェスター，クロスローズ レーン 148 (72)発明者 マリーン マリー キング アメリカ合衆国，ニューヨーク 14526, ペンフィールド，ゲブハルト ロード 28
Claims (6)
- 【請求項１】 pI６以下を示し、かつアシル化剤、アル
キル化剤もしくはスルホニル化剤で化学的に変性した非
免疫反応性タンパク質または炭水化物を共有結合した水
不溶性粒子であって、その表面から他のタンパク質また
は炭水化物を実質的に除去した粒子を含んでなる水不溶
性試薬。 - 【請求項２】 pI６以下を示すタンパク質または炭水化
物であって、オリゴヌクレオチドとの共有結合反応用の
基を提供するようにアシル化剤、アルキル化剤もしくは
スルホニル化剤で化学的に変性しており、そして他のタ
ンパク質または炭水化物を実質的に除去した水不溶性粒
子に共有結合したタンパク質または炭水化物である連結
基を介して前記粒子へ付着したヌクレオチドを含んでな
る水不溶性核酸プローブ。 - 【請求項３】 Ａ．標的核酸を含有することが疑われる
被検試料を、pI６以下を示すタンパク質または炭水化物
であって、オリゴヌクレオチドとの共有結合反応用の基
を提供するようにアシル化剤、アルキル化剤もしくはス
ルホニル化剤で化学的に変性しており、そして他のタン
パク質または炭水化物を実質的に除去した水不溶性粒子
に共有結合したタンパク質または炭水化物である連結基
を介して前記粒子へ付着したヌクレオチドであって、前
記標的核酸に実質的に相補的であるオリゴヌクレオチド
を含んでなる水不溶性核酸プローブと接触して水不溶性
ハイブリダイゼーション生成物を形成する工程、ならび
に Ｂ．被検試料の残余から前記ハイブリダイゼーションし
た生成物を単離する工程、を含んでなる標的核酸の捕捉
および単離方法。 - 【請求項４】 Ａ．標的核酸を含有することが疑われる
被検試料を、pI６以下を示すタンパク質または炭水化物
であって、オリゴヌクレオチドとの共有結合反応用の基
を提供するようにアシル化剤、アルキル化剤もしくはス
ルホニル化剤で化学的に変性しており、そして他のタン
パク質または炭水化物を実質的に除去した水不溶性粒子
に共有結合したタンパク質または炭水化物である連結基
を介して前記粒子へ付着したヌクレオチドであって、前
記標的核酸に実質的に相補的であるオリゴヌクレオチド
を含んでなる水不溶性核酸プローブと接触して水不溶性
ハイブリダイゼーション生成物を形成する工程、ならび
に Ｂ．前記ハイブリダイゼーションした生成物を検出する
工程、を含んでなる標的核酸の検出方法。 - 【請求項５】 Ａ．被検試料中の標的核酸を増幅する工
程、 Ｂ．前記増幅した標的核酸を、pI６以下を示すタンパク
質または炭水化物であって、オリゴヌクレオチドとの共
有結合反応用の基を提供するようにアシル化剤、アルキ
ル化剤もしくはスルホニル化剤で化学的に変性してお
り、そして他のタンパク質または炭水化物を実質的に除
去した水不溶性粒子に共有結合したタンパク質または炭
水化物である連結基を介して前記粒子へ付着したヌクレ
オチドを含んでなる水不溶性核酸プローブと接触して標
的核酸とその水不溶性プローブの固定化ハイブリダイゼ
ーション生成物を形成する工程、 Ｃ．未固定化物質から前記固定化生成物を分離する工
程、ならびに Ｄ．前記固定化生成物を検出する工程、 を含んでなる標的核酸の検出方法。 - 【請求項６】 請求項１記載の水不溶性核酸プローブを
含んでなる診断試験キット。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US47116890A | 1990-01-26 | 1990-01-26 | |
| US471168 | 1990-01-26 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0746999A true JPH0746999A (ja) | 1995-02-21 |
Family
ID=23870526
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3007634A Pending JPH0746999A (ja) | 1990-01-26 | 1991-01-25 | 水不溶性試薬および核酸プローブ、試験キットならびに診断および精製方法 |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5328825A (ja) |
| EP (1) | EP0439222B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0746999A (ja) |
| KR (1) | KR910014701A (ja) |
| AT (1) | ATE129526T1 (ja) |
| CA (1) | CA2031659A1 (ja) |
| DE (1) | DE69114023T2 (ja) |
| FI (1) | FI910396A (ja) |
| HK (1) | HK38196A (ja) |
| IE (1) | IE910264A1 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5232829A (en) * | 1989-09-29 | 1993-08-03 | Hoffmann-La Roche Inc. | Detection of chlamydia trachomatis by polymerase chain reaction using biotin labelled lina primers and capture probes |
| US5663318A (en) * | 1991-03-01 | 1997-09-02 | Pegg; Randall Kevin | Assay preparation containing capture and detection polynucleotides covalently bound to substrates with a heterobifunctional crosslinking agent |
| FR2677039B1 (fr) * | 1991-05-31 | 1994-09-09 | Cis Bio Int | Oligonucleotides, utilisables comme reactifs pour la detection in vitro des infections a retrovirus de type hiv et procede de detection de retrovirus de type hiv. |
| FR2680005B1 (fr) * | 1991-08-01 | 1994-09-02 | Coletica | Utilisation de collagene comme support solide de fixation d'un capteur capable de reagir specifiquement avec un element a detecter dans un milieu biologique, reactif et procede de mise en óoeuvre. |
| US5648208A (en) * | 1991-08-01 | 1997-07-15 | Coletica | Use of a collagen as solid binding substrate for a ligand capable of reacting specifically with an element to be detected in a biological medium, reactant and implementation |
| US5747244A (en) * | 1991-12-23 | 1998-05-05 | Chiron Corporation | Nucleic acid probes immobilized on polystyrene surfaces |
| US5679510A (en) * | 1993-04-27 | 1997-10-21 | Hybridon, Inc. | Quantitative detection of specific nucleic acid sequences using lambdoid bacteriophages linked by oligonucleotides to solid support |
| US5591580A (en) * | 1994-03-31 | 1997-01-07 | Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. | Method, test element and test kit for semi-quantitative detection of target nucleic acid |
| US5622822A (en) | 1994-09-13 | 1997-04-22 | Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. | Methods for capture and selective release of nucleic acids using polyethyleneimine and an anionic phosphate ester surfactant and amplification of same |
| US5582988A (en) | 1994-09-15 | 1996-12-10 | Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. | Methods for capture and selective release of nucleic acids using weakly basic polymer and amplification of same |
| US5705366A (en) | 1994-09-15 | 1998-01-06 | Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. | Coamplification of target nucleic acids using volume exclusion agent in reaction composition, test kit and test device useful therefor |
| CA2226717A1 (en) * | 1995-07-13 | 1997-01-30 | Immunological Associates Of Denver | Self-contained device integrating nucleic acid extraction, amplification and detection |
| US5989813A (en) * | 1995-07-13 | 1999-11-23 | Molecular Innovations, Inc. | Detection of amplified nucleic acid sequences using bifunctional haptenization and dyed microparticles |
| ZA9610721B (en) | 1995-12-21 | 1998-06-19 | Cornell Res Foundation Inc | Grapevine leafroll virus proteins and their uses. |
| US6093544A (en) | 1997-05-20 | 2000-07-25 | Cornell Research Foundation, Inc. | Rupestris stem pitting associated virus nucleic acids, proteins, and their uses |
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