JP2862547B2 - 核酸精製、分離及びハイブリダイゼーション用ポリカチオン性支持体 - Google Patents

核酸精製、分離及びハイブリダイゼーション用ポリカチオン性支持体

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Description

【発明の詳細な説明】 1.産業上の利用分野 本発明はポリカチオン性支持体、及び核酸を精製し、
ハイブリダイゼーション手順のために核酸を固定化し、
ハイブリダイズしていないより小さいポリヌクレオチド
又はオリゴヌクレオチドプローブを過度に除去すること
なく比較的大きいハイブリダイズしたポリヌクレオチド
を溶液から選択的に分離するための該支持体の使用に係
る。
2.従来技術の説明 近年、ポリヌクレオチドを精製し、ハイブリダイゼー
ション反応を利用してポリヌクレオチド中の特異的なヌ
クレオチド配列を検出したいという要求は非常に高まっ
ている。このために、ポリヌクレオチド及びそのハイブ
リッドを分離し、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオ
チドプローブを使用してポリヌクレオチド中の特異的な
標的ヌクレオチド配列を検出するべく多くの方法が開発
されている。
ポリヌクレオチド精製分野では、ハイブリダイゼーシ
ョンに先立ってポリヌクレオチドを精製するか、あるい
は種々の生化学的手順に抵触し得る生物汚染物を除去す
る方法が使用されている。歴史的には、フェノール抽
出、エタノール沈降、ゲル電気泳動、ゲル浸透のような
各種の方法が使用されている（Shin ＆ Martin,Biochem
istry，13:3411−3418［1974］;Enea ＆ Zinder,Scienc
e，190:584−586［1975］;Shin ＆ Khoury,Biochemistr
y 15:487−493,［1976］;Longacre ＆ Mach,J.Biol.Ch
em.253:7500−7507［1978］;Goldberg他，Methods in E
nzymol.,68:206−242［1979］;Kreig他，Analytical Bi
ochem.,134:288−294［1983］；及びGautreau他，Analy
tical Biochem.,134:320−324［1983］）。
より最近では、一重鎖及び二重鎖ポリヌクレオチドの
分離用精製に高速液体クロマトグラフィが使用されてい
る。この方法で使用されるアニオン交換カラムとして
は、RPC−５（Pearson他，Biochem.Biophys.Acta.,228.
770−774,［1974］）、Kel−Ｆを含む他の被覆支持体
（Shum及びCrosters,Nucl.Acids Res.,５,2297−2311,
［1978］）又はケイ酸ガラスビード（Narihara他，J.Ch
romatog.,236,513−518,［1982］）、及びNucleogen
（西ドイツDurenに所在のMacherey Nagelの登録商標）
のようなジエチルアミノエチル誘導シリカ（Colpan及び
Riesner,J.Chromatog.,296,339−353,［1984］;Hecker
他，J.Chromatog.,326,251−261,［1985］；並びにMull
er,Eur.J.Biochem.,155.203−212,［1986］）がある。
更に、別の最近の精製方法としては、特殊な支持体の
表面へのポリヌクレオチドの選択的吸着（Johnson他，B
iotechniques，４,64−70［1986］,Guenther他，Fed.Pr
oc.,44,1622（abs.7086）［1985］）、及び相補的核酸
配列によるポリヌクレオチドの固定化（Nanibhushan ＆
Crothers,Eur.Pat.App.No.130,523［1985」;Ruth他，F
ed.Proc．44,1622（abs.7088）,1985;Blakesley及びTho
mpson,Int.Pat.App.No.PCT/US84/00508［1985］）の両
方がある。
しかしながら、上記精製方法は特に臨床環境に適応さ
せる場合、以下に示すような１つ以上の制限がある。即
ち、これらの方法は時間と労力がかかり、所望のポリヌ
クレオチドを定量的に回収することができず、臨床サン
プルに適合せず、自動化システムとのインターフェース
が容易でないなどの欠点がある。
ポリヌクレオチドの精製以外には、ポリヌクレオチド
及びヌクレオチドフローブのハイブリッドをハイブリダ
イズしていないポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチ
ドプローブから分離するために固体支持体が使用されて
いる。適当に標識されたポリマーヌクレオチドプローブ
を使用するポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション
は、非反復又は誤って発現されたポリヌクレオチド標的
配列を検出するための確実で且つ高感度の方法であると
して長い間認められている。この能力により、細菌、ウ
イルス、寄生虫及び菌類のような感染性生物、鎌状赤血
球貧血のような遺伝的疾患、及び各種の癌を検出するこ
とができる。しかしながら、ハイブリダイズしたポリヌ
クレオチドをハイブリダイズしていないポリヌクレオチ
ドから迅速且つ簡便に分離することができないため、臨
床診断におけるハイブリダイゼーション手順の使用及び
調査環境は制限されている。
20年以上にわたり、ハイブリダイゼーションを使用し
て「標的」ポリヌクレオチドの存在を確認するための方
法を開発するべく研究者は努力を重ねている。これらの
方法の大部分は、ハイブリダイズしていないポリヌクレ
オチド又はオリゴヌクレオチドプローブ分子からのポリ
ヌクレオチドハイブリッドの分離に基づいている。1963
年及び1964年に、Nygaard ＆ Hall（Biochem Biophys R
es.Commun.,12,98［1963］；J.Mol.Biol.,９,125［196
4］）は、ニトロセルロースで過することによりDNA/R
NAハイブリッドを分離する方法を報告している。これら
の研究者は、一重鎖及び二重鎖RNAはニトロセルロース
に固着しないが、一重鎖DNA又はRNAと複合したDNAはニ
トロセルロースに固着することを発見した。こうして、
フィルタ上に捕えられた放射活性の量を測定することに
より、放射性物質で標識したRNAと標識しないDNAとの間
の反応を監視することができた。
この方法に続いてGillespie及びSpiegelman（J.Mol.B
iol.,12,829［1965］）は、一重鎖DNAをニトロセルロー
スフィルタに固定し、放射性物質で標識したRNAを含む
溶液とハイブリダイズされる方法を報告している。過剰
のRNAを除去後、フィルタに固定した放射性標識の量に
よりハイブリダイゼーションの程度を決定した。
翌年、Denhardt（Biochem.Biophys.Res.Commun.,23,6
41［1966］）は、一重鎖DNAをニトロセルロースに固定
し、フィルタに「キャップ」をして非特異的なバックグ
ラウンドを減少させ、固定化DNAを放射性物質で標識し
た適当なDNAプローブを含む溶液とハイブリダイズさせ
る同様のシステムの開発を報告している。このシステム
は、今日でもなお好適なハイブリダイゼーション手順の
ひとつである。しかしながら、この方法は労力及び時間
がかかり、一般に丸一日以上必要である。
ニトロセルロースの他には、ヒドロキシアパタイトが
一重鎖及び二重鎖ポリヌクレオチド種を分離するために
使用されている。例えば、Britten及びKohne（Carnegie
Inst.Washington Yearbook，65,78［1966］）はハイブ
リダイズした［32P］で標識した大腸菌DNAフラグメント
をハイブリダイズしていな大腸菌DNAフラグメントから
分離するためにヒドロキシアパタイトを使用している。
これらの方法はBrenner他（Anal.Biochem.,28,447［196
9］）により更に改良され、試験管内で分離を実施する
ように改良された。
ハイブリダイゼーション反応のためにDNA及びRNAの固
定化を更に改良するべく、別の方法も開発されている。
これらの方法には、塩化シアヌルで活性化した紙（Hang
er他，Biochem.Biophys．Acta，653,344［1981］）及び
アリールジアゾニウムセルロース紙（Seed,Nucl.Acids
Res.,10,1799［1982］）にDNA及びRNAを固定する方法が
ある。
ニトロセルロースに固定したDNA又はRNAにハイブリダ
イズした放射性物質以外で標識したビオチニル化プロー
ブを可視化する方法も記載されている（Leary他，Proc.
Natl.Acad.Sci.U.S.A.,80,4045［1983］）。しかしなが
ら、この方法は別途の「キャッピング」及び洗浄段階が
必要であるので、放射性標識を使用する従来のプロトコ
ールよりも更に労力がかかる。
ハイブリダイゼーションを使用する「標的」ポリヌク
レオチドの検出を改良するべく、二重（サンドイッチ）
ハイブリダイゼーションを使用する多数の方法が開発さ
れている。固定化ポリヌクレオチドを使用して標的ポリ
ヌクレオチドを検出した後、標識した第２のポリヌクレ
オチドとハイブリダイズさせる方法が一般的である（Du
nn ＆ Sambrook,Methods.Enzymol.,65,468−478［198
0］）;Palva,Journal Clin.Micro.,18,92−100［198
3］;Virtanen他，Lancet,381−383［1683］;Ranki他，G
ene，21,77−85［1983］;Ranki ＆ Soderland,U.S.P.N.
4,486,539［1984］;Polysky Cynkin他，Clin.Chem.,31,
1438−1443［1985］;Rank ＆ Soderlund U.S.P.N.4,56
3,419［1986］）。
サンドイッチアッセイ法の一例によると、溶液中で両
方のハイブリダイゼーション反応を行った後、固定化ス
トレプトビオジン上で分離し、ビオチンで標識したプロ
ーブを使用して完全なポリヌクレオチドサンドイッチを
分離する（Hansen ＆ Jones,E.P.O.0 139 489［198
5］）。
上記ハイブリダイゼーションシステムは、臨床環境で
広く有用なハイブリダイゼーションアッセイ手順を実施
するためにはまだ操作の容易さ及び処理速度が不足して
いる。これらのシステムは一般に時間及び労力がかか
り、感度が低い。更に、これらの方法の多くは成分サン
プル中に含まれる物質（agents）と不適合であり、迅速
に自動化できない。
3.用語の定義 本分中に使用される用語の定義を以下に述べる。
ヌクレオチド：リン酸基、五炭糖及び窒素含有基から構
成される核酸のサブユニット。RNAでは五炭糖はリボー
スである。DNAは２−デオキシリボースである。
ヌクレオチドマルチマー：ホスホジエステル結合により
結合したヌクレオチド鎖、又はかかるヌクレオチド鎖で
あって、望ましい特性、例えば検出性を付与する１又は
それ以上の非ヌクレオチド要素を有するヌクレオチド
鎖。
オリゴヌクレオチド：一般に約10〜約100個のヌクレオ
チド長を有し、場合によっては200個以上のヌクレオチ
ド長を有し得るヌクレオチドマルチマー。通常はヌクレ
オチドモノマーから合成されるかあるいは酵素的手段に
より得られる。
ポリヌクレオチド：一般に約100個以上のヌクレオチド
長を有するヌクレオチドマルチマー。
ヌクレオチドプローブ：通常は診断的意味を有するポリ
ヌクレオチドである第２のヌクレオチドマルチマーに含
まれる標的核酸配列と相補的なヌクレオチド配列を有す
るヌクレオチドマルチマー。通常、プローブは標的配列
と完全に相補的になるように選択される。しかしなが
ら、場合によってはプローブ中の１個以上のヌクレオチ
ドは標的配列中の対応する塩基に相補的でなくてもよ
く、あるいはそのほうが望ましい場合もある。ヌクレオ
チドプローブは同じく通常は標的配列を含むマルチマー
よりも小さいマルチマーである。典型的にはオリゴヌク
レオチドであるが、ポリヌクレオチドでもよく、通常、
例えば放射性分析、比色分析、蛍光分析、化学発光又は
他の適当な方法により検出し得る化学的置換基で標識さ
れている。
分離溶液：通常はポリヌクレオチド、又はそのハイブリ
ッドであるヌクレオチドマルチマーを、場合によっては
より小さいポリヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドを
含む汚染物と結合することなく本発明のカチオン性固体
支持体に固定化される組成を有する溶液。プローブとハ
イブリダイズしたポリヌクレオチドが固定化されている
とき、分離溶液は遊離したヌクレオチドプローブを支持
体に結合させないという付加的な特性を有する。
洗浄溶液：通常はポリヌクレオチド又は所望のポリヌク
レオチドハイブリッドである所望のヌクレオチドマルチ
マーを、本発明のカチオン性固体支持体から過度に除去
することなく過剰のヌクレオチドプローブ又は汚染物を
除去するような組成を有する溶液。洗浄溶液の組成は、
場合によっては分離溶液と同一でもよい。
溶離溶液：ポリヌクレオチド、ハイブリダイズしたポリ
ヌクレオチドのようなヌクレオチドマルチマー、又は標
識化ヌクレオチドプローブ、又は特異的標識をカチオン
性固体支持体から遊離させるように構成された溶液であ
って、特定の遊離は固体支持体から回収したい種類に依
存する。
ハイブリダイゼーション溶液：所望のハイブリダイゼー
ションを生じさせるように構成された溶液。所望のハイ
ブリダイゼーションは典型的にはポリヌクレオチドと標
的配列のプローブとの間に行われる。従って、先にカチ
オン性固体支持体に固定化したポリヌクレオチドとの間
にハイブリダイゼーションを生じる場合は、この溶液
は、支持体へのヌクレオチドプローブの非特異的結合を
最小にするという付加的な特性を有する。
4.発明の要約 本発明は、寸法に従ってヌクレオチドマルチマーを選
択的に吸着させるためにポリカチオン性固体支持体を使
用することができ、マルチマーが大きいほうが小さいマ
ルチマーよりも密接（強固）に支持体に結合するという
発見に基づく。結合相互作用は少なくとも部分的には、
正電荷を有する支持体とヌクレオチドマルチマーの負電
荷を有する糖リン酸塩主鎖との間のイオン引力に基づく
と考えられる。これらの特性はポリヌクレオチドを迅速
に精製し且つそのハイブリッドを複合溶液から分離する
ためにバッチ法で使用され得る。
本発明のひとつの方法は、所望のマルチマーをポリカ
チオン性支持体に吸着させることにより、低分子量のマ
ルチマーを含むマルチマーが得られる生物の各種の成分
を含む溶液中でヌクレオチドマルチマーを精製すること
が可能である。臨床サンプルの場合、ヌクレオチドマル
チマーはマルチマーを分離すべき体液及び組織の他の成
分からも除去される。固体支持体を溶液から分離後、マ
ルチマーは支持体から溶離され得る。
より短い標識化ヌクレオチドプローブで比較的長いポ
リヌクレオチドを検出するハイブリダイゼーション手順
で有用な本発明の別の方法によると、ポリヌクレオチド
及びプローブとそのハイブリッドをハイブリダイズして
いないプローブから分離するためにポリカチオン性支持
体が使用され得る。この方法の好適態様によると、ポリ
ヌクレオチドを含む溶液にプローブを加え、固定前にハ
イブリダイゼーションを生じさせる。プローブとのハイ
ブリダイゼーション後、溶液を支持体と接触させ、プロ
ーブとのハイブリッドを含むポリヌクレオチドを吸着さ
せる。あまり好適でない態様によると、ポリヌクレオチ
ドを含む溶液にポリカチオン性支持体を加え、プローブ
を加える前にポリヌクレオチドを支持体表面に吸着させ
る。この場合、ハイブリダイゼーションは支持体表面で
生じる。どちらの態様でも、支持体のカチオン性表面と
負電荷を有するポリヌクレオチド主鎖との間の相互作用
を介して、比較的長いポリヌクレオチドが支持体に結合
する。ポリヌクレオチドに結合しなかったプローブ分子
は支持体に結合せず、溶液中に止どまる。
支持体、及びポリヌクレオチドとのハイブリッドとし
て結合したヌクレオチドプローブは、傾瀉、遠心分離又
は過により溶液から分離され得る。粒子が磁性粒子の
場合は、磁場分離が使用され得る。精製手順において、
ヌクレオチドマルチマーは溶離法を使用することにより
固体支持体から回収され得る。プローブアッセイの場
合、固相又は溶液中の標識の存在が決定され得、診断的
意味を定性及び定量的に分析するために、サンプル中の
ポリヌクレオチドに含まれる標的核酸配列の存在及び量
に関連付けられる。
本発明の全態様において、非ヌクレオチド物質からヌ
クレオチドマルチマーを分離し、その相対長さに基づい
てヌクレオチドマルチマーの混合物を分離するための高
度に選択的な方法が提供される。従って、本発明による
と定性及び定量手順を含む多様な精製及びアッセイ手順
が実施され得る。
5.発明の詳細な説明 周知の核酸ハイブリダイゼーション法は、一重鎖ヌク
レオチドマルチマーが適当な条件下で相補的なストラン
ドに結合（ハイブリダイズ）する能力を利用している。
本発明は、ヌクレオチドプローブとのハイブリッドを形
成したポリヌクレオチドの存在を検出するための方法を
提供する。本発明はまた、ヌクレオチドマルチマー及び
そのハイブリッドの精製方法も提供する。
臨床サンプル中でヌクレオチドマルチマーを精製又は
ポリヌクレオチドをハイブリダイゼーションするための
方法は、分離を妨げると共にポリヌクレオチドの分解を
助長し得るような生物汚染物がもたらす障害を克服しな
ければならない。例えばリボソームRNA（rRNA）の場
合、rRNAが通常複合化するrRNAから各種のタンパク質を
除去することが精製に必要である。更に、rRNAの分解を
阻止するためには種々のヌクレアーゼ及び他の酵素を不
活性化しなければならない。
ハイブリダイゼーションは一般に長い標的ポリヌクレ
オチド分子、即ち約100個以上のヌクレオチド（塩基）
から構成される一重鎖DNA又はRNAを含む。標的DNA又はR
NAに特定の塩基配列（標的配列）が存在するか否かを決
定するためには、当業者に既知の各種の方法を使用して
ヌクレオチドプローブ分子を化学的に合成又は生物DNA
又はRNAから単離する。ヌクレオチドプローブは標的の
所望の塩基配列に相補的であり、一般に検出可能な化学
種で標識されている。しかしながら、他の手段によりハ
イブリッドを検出できる場合には、ヌクレオチドプロー
ブの標識は絶対的に必要ではない。典型的には、プロー
ブは15〜50個の塩基長のオリゴヌクレオチドであるが、
数百の塩基長でもよい。標的塩基配列が存在する場合、
ヌクレオチドプローブは塩基対合相互作用を通して標的
に結合する。ハイブリダイゼーションが一旦完了する
と、ハイブリッドは通常ハイブリダイズしていないヌク
レオチドプローブ分子を含む溶液から分離される。しか
しながら、用途によっては、例えば遠心分離又はポリヌ
クレオチドハイブリッドが吸着されている媒体から支持
体を除去することなく固定化ハイブリッドを濃縮するよ
うな他の方法により、単に可溶相と不溶相とを分離すれ
ば十分である。ハイブリッドをハイブリダイズしていな
いプローブから一旦分離したら、標準方法によりハイブ
リッドを検出する。直接標識法としては、放射性同位
体、酵素、蛍光及び化学発光分子がある。それ自体では
検出不可能な化学種を別の複合体に結合して検出する間
接標識も知られている。間接標識の例としては、ストリ
プトビオジン及び酵素の接合体を使用するビオチン標識
の検出が挙げられる。
標識化ヌクレオチドプローブを必要としない他の検出
手段では、ハイブリッドに固有のインターカレーター、
ハイブリッドに特異的な抗体、高感度重量測定手段、電
磁エネルギーの反射率の相違、又は電子検出を可能にす
る方法を使用することができる。当然のことながら、場
合によってはハイブリダイズしていないプローブを測定
することが望ましく、このような手順も本発明の範囲内
である。
本発明の方法に従ってカチオン性支持体及び適当な分
離溶液を使用すると、ポリヌクレオチド標的分子は支持
体に結合するが、結合しなかったヌクレオチドプローブ
は支持体にあまり結合しない。この現象の厳密な理論的
裏付けは完全には解明されておらず、発明者は特定の理
論に結び付ける意図はないが、恐らく支持体表面上の電
荷−電荷相互作用及びカチオン密度に関係があると考え
られる。予想可能なメカニズムとして、温和な緩衝条件
下では長いポリヌクレオチドの複合帯電領域は相互に協
働してカチオン性固体支持体の表面への結合を助ける。
一方、短いヌクレオチドプローブは同一多重度の電荷−
電荷結合領域をもたないので、支持体との結合強度が弱
い。なお、これらの支持体がオリゴヌクレオチド又はポ
リヌクレオチドを越えて長いポリヌクレオチドと選択的
に結合する能力は明白である。このことは以下の実施例
に明示され、本発明の方法が各種のポリヌクレオチド混
合物の精製及び分離に特に適当であることを示してい
る。従来技術とは異なり、本発明の方法は特にハイブリ
ダイゼーション手順で、長さ及び電荷に基づいてヌクレ
オチドマルチマーを迅速に分離することが可能である。
リン酸主鎖に低い負の電荷を有する従来のDNA又はRNA
のアナログをプローブとして使用することも本発明の範
囲内である。このようなアナログとしてMiller他，Bioc
hemistry，25,5092［1986］に記載のメチルホスホネー
トが挙げられる。
溶液中の相補的ヌクレオチドストランドを選択するた
めに磁性微小球（磁気マイクロスフェア）と共有結合し
たヌクレオチドプローブを使用することについては複数
の文献に教示されている。しかしながら従来技術では、
ヌクレオチドマルチマーが固体支持体に直接共有結合す
ると、ハイブリダイゼーションに必要な相補的ストラン
ド間の適正な相互作用に望ましくない立体状態が生じ得
ることが知られている。（Life Technologies,“Immobi
lization of Nucleic Acids"W085/04674［10/24/85］参
照）。この点に関する詳細な開示はないが、Whitehead
により記載されている方法は精製及びハイブリダイゼー
ションに不適当である。本発明は、分離を実施するため
にイオン相互作用に訴えることにより共有結合の必要を
なくす。即ち、本発明の特に好適な態様によると、ポリ
カチオン性表面を有する磁性微小球を使用して上記各種
の手順のいずれかで溶液からヌクレオチドマルチマー及
びそのハイブリッドを除去する。
本発明の方法は２つの主な要素を使用する。これらの
要素とは、カチオン性固体支持体と、ヌクレオチドマル
チマーを精製し、ヌクレオチドプローブとのハイブリッ
ドの形成に基づいてポリヌクレオチド中の標的配列をア
ッセイするための手順に関連する固定化、分離、洗浄、
及び溶離段階を助長するために使用される数種の接触溶
液の１種以上のことである。これらの溶液はポリヌクレ
オチドを固定化し、ポリヌクレオチドハイブリッドとヌ
クレオチドプローブとを分離し、固定化ポリヌクレオチ
ド（ポリヌクレオチドとヌクレオチドプローブとのハイ
ブリッドを含む）を洗浄し、固定化ポリヌクレオチド
（ポリヌクレオチドとヌクレオチドプローブとのハイブ
リッドを含む）を溶離し、又はポリヌクレオチドとヌク
レオチドプローブとの固定化ハイブリッドの存在に相関
する検出可能な成分を溶離するために使用される。
カチオン性固体支持体の組成と接触溶液の組成との間
には、接触溶液の組成が部分的にカチオン性固体支持体
の組成により決定されるかあるいはその逆であるような
相互作用が存在する。
更に、接触溶液の成分は方法の次段階で必要な組成を
形成するために持ち越され、試薬を添加することにより
修正され得るので、接触溶液の多くの間には緊密な関係
がある。
これらの組成の使用を解明するためには、一般に以下
の３つの使用範囲に分類することができる。
I.ポリヌクレオチド又はヌクレオチドマルチマーの精
製。
II.ポリヌクレオチドの固定化とそれに続くハイブリダ
イゼーションであり、典型的には該ポリヌクレオチドに
含まれる非反復ヌクレオチド配列を検出する。
III.溶液中に予め形成されたポリヌクレオチド及びヌク
レオチドプローブのハイブリッドの分離及び検出。
これらの手順のうちどれを実施したいかに応じて、異
なる接触溶液の組み合わせが必要である。一般に、これ
らの手順の各々に有用な段階及び溶液は次のものである
が、必ずしも１段階以上及び１種以上の溶液を使用する
必要はない。
I.ヌクレオチドマルチマーの精製 （１）分離溶液の存在下で通常はポリヌクレオチドであ
るヌクレオチドマルチマーをカチオン性固体支持体に固
定。
（２）洗浄溶液による汚染物の除去及びカチオン性固体
支持体に固定化したマルチマーと溶液相との分離。
（３）溶離溶液を使用してカチオン性固体支持体の表面
からマルチマーを回収。
II.ポリヌクレオチドの固定とそれに続くハイブリダイ
ゼーション （１）分離溶液の存在下でポリヌクレオチドをカチオン
性固体支持体に固定。
（２）洗浄溶液により汚染物を除去（任意段階）。
（３）ハイブリダイズしていないヌクレオチドプローブ
の固定化を最小にするように構成されたハイブリダイゼ
ーション溶液中で固定化ポリヌクレオチドをヌクレオチ
ドプローブと接触。
（４）ハイブリダイズしていないヌクレオチドプローブ
の固定化を最小にする洗浄溶液を使用してハイブリダイ
ズしていないプローブを除去し、溶液相中でカチオン性
支持体に固定化したハイブリッドを分離（任意段階）。
（５）溶離溶液によりハイブリッド又は固定化ハイブリ
ッドの存在に相関する検出可能な成分の回収（任意段
階）。
（６）ハイブリッド、又はハイブリッドの存在もしくは
ハイブリダイズしていないヌクレオチドプローブに相関
するハイブリッドに関連する検出可能な成分の検出。
III.溶液中に形成されたハイブリッドの分離及び検出 （１）ハイブリダイゼーション溶液の存在下でヌクレオ
チドプローブ及びヌクレオチドプローブに相補的な塩基
配列を含むポリヌクレオチドのハイブリダイゼーショ
ン。
（２）ハイブリダイズしていないヌクレオチドプローブ
を過度に固定化させることなく、形成されたハイブリッ
ドをカチオン性固体支持体に結合させるべく、ハイブリ
ダイゼーション混合物をカチオン性固体支持体及び分離
溶液に接触。
（３）ハイブリダイズしていないヌクレオチドプローブ
の固定化を最小にする洗浄溶液を使用して、ハイブリダ
イズしていないプローブを除去（任意段階）。
（４）溶離溶液を使用して、ハイブリッド、又は固定化
ハイブリッドの存在に相関する検出可能な成分の回収
（任意段階）。
（５）ハイブリッド、又はハイブリッドの存在もしくは
段階（３）のハイブリダイズしていないヌクレオチドプ
ローブに相関する検出可能な成分の検出。
当業者には自明のように、このポリカチオン性支持体
は、直接結合、競合及びプローブ置換アッセイを含む種
々のアッセイフォーマットで使用することができる。ま
た、標識は直接でも間接でもよい。プローブ置換アッセ
イフォーマットでは、ハイブリダイゼーションにより標
識が結合相でなく非結合相に現れる場合がある。以上の
例は、ヌクレオチドマルチマーを区別するためのカチオ
ン性支持体のひとつの特徴を説明するものに過ぎない。
本発明は特定のアッセイフォーマットに制限されるべき
でない。
解りやすくするために、カチオン性固体支持体の組成
及び各種の接触溶液の組成に関して以下に本発明をより
詳細に説明する。もっとも、本発明の実施に先立って精
製及びプローブされるヌクレオチドマルチマーを遊離さ
せるためにサンプル収集及びサンプル処理のような段階
を実施することは当業者に理解されよう。例えば、細胞
溶解を実施する必要性及びそのための手順は当業者に周
知であるので、このような手順について説明することは
本発明の詳細な説明には不要であると思われる。
カチオン性固体支持体 本発明のポリカチオン性支持体マトリクスは多様な無
機及び有機材料から選択でき、非限定的な例として、金
属酸化物、ガラス、ポリアミド、ポリエステル、ポリオ
レフィン、多糖類、ポリグリコール及びポリアミノ酸が
挙げられる。要は、マトリクス支持体が使用される条件
下で汚染物及びヌクレオチドプローブのいずれも不当に
吸着しないことである。
好適な支持体は必要な材料の量を最小にするために高
い表面積対体積比を有する支持体である。このような比
は、粒子、特にミクロン寸法の粒子、アガロースのよう
な多孔度の高い材料、あるいは単独もしくはフィルター
マットに配置された小直径の繊維を使用することにより
得られる。小さいミクロン寸法の粒子を使用すると好適
である。
以下の実施例において、マトリクスはWhitehead他，
（U.S.P.N.4,554,088;Nov.19,1985）により記載されて
いるような磁気反応性酸化鉄、ラテックス微小球、セフ
ァロースビード、又は適当に機能化された膜から構成さ
れ得るが、本発明はこれらの材料に限定されるものでは
ない。
支持体は適当な塩、洗浄剤及び温度の条件下で所望の
ポリヌクレオチドを吸着させるに十分な電荷密度を有す
るようにカチオンで修飾された表面を有しているべきで
ある。電荷密度は経験的に決定される必要があるが、一
般には支持体mg当たり0.01〜10マイクロ当量の範囲であ
る。
電荷は非限定的な例として第一アミン、第二アミン、
第三アミン、第四アミンを含むアルキル及びアリールア
ミン並びにグアニジン及びイミンのような範囲のカチオ
ンにより導入され得る。
このような部分の例を挙げると、３−アミノプロピル
基、２−アミノエチル−３−アミノプロピル基、トリス
（２−アミノエチル）アミン、スペルミン、スペルミジ
ン、ペンタメチル−２−アミノエチル−３−アミノプロ
ピル基、及びアミン官能基を有するポリマー（例えばポ
リリジン、ポリアルギニン、ポリエチレンイミン、及び
ポリアリルアミン）がある。
支持体の表面に通常存在している官能基は、カチオン
性官能基を含む試薬で容易に修飾され得る。ほぼあらゆ
るマトリクスの表面に官能基を導入するための多数の方
法が当業者に知られている。例えば、Porath及びAxen
（Methods in Enzymology，44,19−45.［1976］）、及
びGoldman他（“Biochemical Aspects of Reactions on
Solid Supports",G.R.Strak,ed.,Academic Press［197
1］）を参照されたい。
一部において、カチオン性支持体の組成はその使用に
応じて経験的に決定される。固体支持体を調製するため
の典型的なプロトコールがこれに続くが、他の同様の手
順を使用してもよい。単にヌクレオチドマルチマーの精
製のためにカチオン性固体支持体を使用する場合には、
標的マルチマーが0.6M未満のpH＝6.8のリン酸ナトリウ
ムである緩衝液中で支持体に結合する能力、及び20mMを
越えるpH＝6.8のリン酸ナトリウムに溶離する能力を試
験する。ポリヌクレオチドが0.6M未満のpH＝6.8のリン
酸ナトリウムに結合しない場合、カチオン密度を増加
し、もしくは単一結合部位のカチオンの多重度を増加さ
せる（例えば３−アミノプロピル基がトリス（２−アミ
ノエチル）アミンに置換される）。他方、ポリヌクレオ
チドが20mMを越えるpH＝6.8のリン酸ナトリウム緩衝液
に溶離できない場合、カチオン密度を減少し、もしくは
単一結合部位のカチオンの多重度を減少させる。
ヌクレオチドプローブからポリヌクレオチドハイブリ
ッドを分離するために支持体を使用すべき場合は、ヌク
レオチドプローブがハイブリッドを保持する条件下で過
度に結合しないことが更に必要がある。これらの条件
は、pH＝6.8のリン酸ナトリウム濃度が20mM〜0.6Mの範
囲でポリヌクレオチド及びヌクレオチドプローブの結合
を監視し、ポリヌクレオチド対ヌクレオチドプローブの
最大結合比を与えるような緩衝液濃度を選択することに
より試験され得る。満足できる結合比が得られない場合
には、カチオンの表面密度及び多重度を更に修正する。
一般にポリヌクレオチド対ヌクレオチドプローブの長
さの比は、通常は良好な分離のために3:1、好ましくは
5:1より大きくすべきであることに留意されたい。もっ
とも、プローブ主鎖に低い負の電荷を有するDNA又はRNA
アナログを使用するとこの基準を緩和することができ
る。しかしながら、プローブ置換及び競合アッセイで
は、比を3:1にする必要がない場合もあり、実際にプロ
ーブ構成が標的よりも長い場合もある。
接触溶液 ポリカチオン性支持体の他に、分離溶液は特に重要で
あり、固定化を助長し且つヌクレオチドマルチマー及び
そのプローブハイブリッドの分解を阻止するように注意
深く調製すべきである。接触溶液には各種の緩衝液が含
まれ、その濃度は所望の操作に依存して変化し得る。溶
液の成分及びその濃度は、場合によって特に臨床サンプ
ル中でヌクレアーゼを不活性化する必要、所望のポリヌ
クレオチド分離、及び分離後に必要な他の段階などの多
数の因子に依存する。例えば後で酵素検出を予定してい
る場合には、内因性酵素活性からバックグラウンドをで
きるだけ少なくするために分離溶液の一部としてタンパ
ク質変性剤又は阻害剤が必要であり得る。
先の段階から維持されている成分も考慮しなければな
らない。例えば、ほとんどの場合、分離は生物材料又は
ハイブリダイゼーショ反応からポリヌクレオチドを除去
することにより実施される。生物サンプルからポリヌク
レオチドを遊離させるため又はハイブリダイゼーション
を助長する（即ち加速度ハイブリダイゼーション）ため
に使用される各種の成分及び試薬は後の分離溶液の成分
として維持される。
接触溶液は多くの共通成分を含み、場合によっては同
一の組成であり得る。例えば、ヌクレアーゼ活性の阻
害、ヌクレオチドプローブの結合の阻止、及びハイブリ
ダイゼーション加速に関連する物質の悪影響の無効化を
考慮すると、洗浄溶液と分離溶液の組成は同様であり得
る。
接触溶液調製の第１段階は、カチオン性固体支持体の
使用目的に依存する。次段階は接触溶液の調製である。
一般に、調製用試薬は次のカテゴリーから選択される。
酵素：酵素は部分的にヌクレアーゼを分解及び阻害し、
タンパク質／核酸相互作用を中断させ、場合によっては
固定化ハイブリッドに関連する標識を切断するために使
用される。これら酵素にはプロテアーゼ、ジエステラー
ゼ、ヌクレアーゼ及びペプチダーゼがある。
ヌクレアーゼ阻害剤：これらの剤はポリヌクレオチド分
子及びヌクレオチドプローブの両者の分解を阻止するた
めに使用され得る。その例としては、硫酸バナジル、バ
ナジルリボシド及びRNAGuard（米国NJ,Piscatawayに所
在のPharmacia Fine Chemicals製ヒト胎盤リボヌクレア
ーゼ阻害剤の商標）のようなリボヌクレアーゼ阻害剤、
デオキシリボヌクレアーゼ阻害剤、並びにドデシル硫酸
ナトリウム及びラウリル硫酸リチウムのような洗浄剤が
挙げられ、これらは一般的なタンパク質変性剤である。
キレート剤：これらの物質は非キレートー化時に各種の
酵素の活性に重要な各種の金属をキレート化するために
使用される。例えば、多くのデオキシリボヌクレアーゼ
は活性のためにCa2+を必要とする。Mn2+のような金属は
ハイブリダイゼーションを妨げ得るので、ハイブリダイ
ゼーション反応を最適化するためには金属イオンのキレ
ート化も重要である。キレート剤としては、エチレンジ
アミン四酢酸（EDTA）及びエチレングリコールビス（２
−アミノエチルエーテル）−N,N,N′,N′−四酢酸（EGT
A）がある。
洗浄剤：これらの物質は粒状材料を可溶化させ、ヌクレ
アーゼを阻害し、分離溶液及び洗浄溶液を使用してカチ
オン性固体支持体に固定化される汚染物及びヌクレオチ
ドプローブを減少させるために使用される。洗浄剤はハ
イブリダイゼーション反応を加速するためにも使用され
得る（加速系に関しては係属中の特許出願がある）。場
合によっては混合ミセルを形成することにより第２の洗
浄剤の悪影響を廃するために第１の洗浄剤を使用しても
よい。洗浄剤のカテゴリーに含まれる物質には、ドデシ
ル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、Ｎ−ラウ
ロイルサルコシン、ジイソブチルスルホ琥珀酸ナトリウ
ム、Triton（登録商標）Ｘ−100、Brij（登録商標）、T
ween（登録商標）−20及びTween（登録商標）−80があ
る（Triton、Brij及びTweenはICI Americasの登録商標
である）。
緩衝塩：これらの物質はヌクレオチドマルチマーの安定
性、ハイブリッドの安定性及び標識として使用される剤
の安定性に適合するpH範囲を維持するために使用され
る。これらの物質はカチオン性固体支持体上のハイブリ
ッドの固定化と、分離溶液を使用する溶液中のヌクレオ
チドプローブの保持との間に基本的なバランスを得るた
めにも使用される。更に、これらの物質はハイブリダイ
ゼーション溶液中にい緊縮を形成するためにも使用され
る。各種の塩の濃度は支持体の表面からハイブリッド又
はハイブリッドに関連するヌクレオチドプローブが溶離
するのを助長するためにも使用され得る。このような物
質としては、カリウム、ナトリウム、カルシウム、グア
ニジン、塩化物、フッ化物、硫酸塩、リン酸塩、酢酸
塩、コハク酸塩、フィチン酸及びトリポリリン酸塩の塩
がある。
有機溶媒：これらの溶液は各種の物質を乳化させ、ハイ
ブリダイゼーション温度及び条件を変更させ、汚染物質
を除去し、溶離溶液を使用してヌクレオチドプローブ及
びハイブリッドの除去を助けるために使用される。この
ような有機溶媒としては、メタノール、エタノール、イ
ソプロピルアルコール、ホルムアミド及びジメチルホル
ムアミドがある。
他の有機及び無機物質：所望の特性を与えるために各種
の接触溶液中に他の物質を使用してもよい。これらの物
質としては、酢酸、リン酸、フッ化水素、硫酸及び硝酸
がある。また、無機物質は溶離溶液を使用してヌクレオ
チドプローブから標識を除去するために使用され得る。
その例としては、過ヨウ素酸塩、酢酸鉛及び二酸化マン
ガンが挙げられる。
個々のケースで使用され得る個々の接触溶液は一般に
次のように調合される。
ハイブリダイゼーション溶液：一般に、塩緩衝液、洗浄
剤、ヌクレアーゼ阻害剤及びキレート剤から調合され
る。組成はポリヌクレオチドとヌクレアーゼプローブと
の間のハイブリダイゼーションを助長するように配合さ
れる。更に、ポリヌクレオチドがハイブリダイゼーショ
ンよりも前に固定化される場合は、ヌクレオチドプロー
ブがカチオン性支持体に過度に結合しないように組成を
選択する。
分離溶液：ヌクレオチドプローブを過度に固定化させる
ことなくハイブリッドを固定化させるべく、一般に塩緩
衝液、洗浄剤及びヌクレオチド阻害剤から構成される。
洗浄溶液：汚染物及びハイブリダイズしていないヌクレ
アーゼプローブを除去しながら固定化ハイブリッドを維
持するように、一般に塩緩衝液及び洗浄剤から調合され
る。
溶離溶液：ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドハイブ
リッド、ヌクレアーゼプローブ又はハイブリッドに関連
する標識を支持体の表面から遊離させるように、一般に
塩緩衝液、有機溶媒、洗浄剤及び他の試薬から構成され
る。
検出溶液：ハイブリッド又は特異的標識を検出するよう
に個々に調合される。その組成は検出手段に依存し、従
来技術の方法に従って調合される。例えば、標識が酵素
の場合、検出溶液は選択された酵素基質及び他の試薬を
含む。
以上の一般的な説明を一読した当業者は、以下の実施
例を参考にすることにより、当業者の知識の範囲内で十
分に特定の接触溶液の成分を多様な手順及び条件に適合
させることが可能であろう。以下の実施例で使用される
材料の出所を列挙すると、磁性アミン微小球はAdvanced
Magnetics,Inc.（米国MA,Cambridge;Biomg M4100,50mg
/ml水溶液）から入手し、リゾチームは米国MO,St.Louis
に所在のSigma社のGrade Iであり、尿素は米国MD,Bethe
sdaに所在のBethdsda Research Labsの酵素グレートで
あり、RNAGuard（登録商標）（ヒト胎盤リボヌクレアー
ゼ阻害剤）は米国NJ,Piscatawayに所在のPharmacia社か
ら入手し、Cystoscint（登録商標）（液体シンチレーシ
ョンカクテル）は米国CA,San Diegoに所在のWestChem社
から入手し、ポリエチレングリコール8000は米国NY,Roc
hesterに所在のEastman Kodak社から入手し、実施例７
及び12で使用したスルホ琥珀酸ジイソブチル（DIBSS）
は米国IN,Monaに所在のGen Probe,Inc.の加速系（系属
特許出願）であり、ヒドロキシアパタイト（HAP）及びZ
wittergent3−14は米国CA,La Jollaに所在のBehring−D
iagnostics,Calbiochem Divisionから入手し、ドデシル
硫酸ナトリウム（SDS）は米国MO,St.Louisに所在のSigm
a社から入手したTrizma−base（tris）であり、Triton
X−100は米国NY,Orangeburgに所在のFisher Diagnostic
sから入手し、ストックは［3H］−rRNA（大腸菌リボソ
ームの16S及び23Sサブユニット）とした。16Sサブユニ
ットのrRNAは約1500個の塩基長であり、23Sサブユニッ
トは約3000塩基長である。他の全試薬は試薬グレードと
した。全リン酸緩衝液（PB）は、特に明記しない限りpH
6.8のナトリウム塩とした。全操作は、特に明記しない
限り容量1.5mlのねじ蓋式ポリプロピレン微細遠心分離
管内で室温で実施した。
実施例１ 磁気アミンマイクロスフェアへのrRNAの結合 rRNAの結合に対する種々のバッファ濃度の影響を測定
するために、５μの磁気アミンマイクロスフェア,1μ
（１μｇ）の［3H］−rRNA及び100又は150μの下記
第１表に示した試薬を合せることにより分離用混合物を
調製した。試薬には、完全アッセイのプロトコールに使
用するかもしれず、rRNA結合に対するそれらの影響を研
究されたものも含んでいる。混合物を２秒間軽く渦動さ
せ、５〜10分間放置した。BioMag Separator（Advanced
Magnetics社，カタログ＃M4101）を使って管の底に磁
気マイクロスフェアをペレット化させ、上清（非結合）
を除去した。次いで、結合が行われたバッファ100又は1
50μ中で磁気アミンマイクロスフェアを１〜２秒渦動
させることにより（１〜２回）洗浄し、磁気により磁気
アミンマイクロスフェアをペレット状にし、上清を除去
した。次に、磁気アミンマイクロスフェアを100又は150
μの洗浄用バッファに再び懸濁させ、非結合及び洗液
画分と同様に20mlのポリプロピレン管内の15mlのCytosc
intに加えた。次に、Nuclear Cicagoシンチレーション
カウンターを使って、各サンプル中のトリチウム量を測
定した。
下記第１表に示すように、磁気アミンマイクロスフェ
アへの吸着によるrRNAの除去はバッファ濃度の変化に感
受性であるが、完全アッセイのプロントコール中に存在
するかも知れない他の試薬には余り影響されない。より
重要なことには、試薬の濃度を変化させることにより、
或いは溶液中に他の試薬を添加することにより、結合を
減少させる試薬の作用を操作することができる。
実施例２ 磁気アミンマイクロスフェアへのDNAの結合 本研究は、磁気アミンマイクロスフェアへのDNAの結
合に対する種々のバッファ濃度及び他のアッセイ用試薬
の影響を測定するために計画されたものであった。保存
rRNAの代りに、Mycoplasma pneumonia由来のrRNAに対す
る［3H］−cDNAを使用する以外は実施例１の方法を用い
た。cDNAは約400〜1600塩化の大きさのcDNAの混合物で
あった。
第２表に示すように、cDNAはrRNAとほぼ同様に磁気ア
ミンマイクロスフェアに結合し、結合の程度は他の試薬
を添加すること並びにバッファ濃度を変化させることに
より操作できる。
実施例３ 磁気アミンマイクロスフェアからのrRNAの溶離及びハイ
プリット形 この実施例では、［3H］−rRNAを磁気アミンマイクロ
スフェアから溶離し、ハイブリッド形成させた。実施例
１に記載と材料の他に、［γ32P］−ATPはAmersham社,A
rlington Hts.,IL,USAから、T4ポリヌクレオチドキナー
ゼはBethesda Research Labs.社,Gaithersburg、MD,USA
から入手した。
Applied Biosystems社のモデル380 A DNA合成装置を
使用してプローブを合成した。標準のホスホロアミダイ
ト化学を用い、配列「５′−AGGACCGTTATAGTTAGGGCCGCC
GT−３′」でデオキシオリゴヌクレオチドを製造した
（この配列は大腸菌（E.coli）リポゾームの23Sサブユ
ニットの塩基1901〜1926に相補である）（プローブ配列
に関し特許出願中）。次Maxam及びGilbertの方法（Pro
c.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,74,560（1977）に従い、［γ
32P］−ATP及びT4ポリヌクレオチドキナーゼを使ってオ
リゴマーの５′末端を標識した。
［3H］−rRNAの不動態化，溶離及びハイブリッド形
成：磁気アミンマイクロスフェア（50mg/ml）10μ,0.
14M PB100μ，及び［3H］−rRNA［1mg/ml］３μを
合わせることにより［3H］−rRNAを不動態化した。混合
物を１〜２秒軽く渦動させ、５〜10分放置した。磁気ア
ミンマイクロスフェアを磁気的にペレット化し、（非結
合）上清を除去した。次に、磁気アミンマイクロスフェ
アを0.14M PB 100μで１回洗浄し、上清を除去した。
［3H］−rRNAを溶離するために、磁気アミンマイクロ
スフェアに50μの0.6M PBを加え、混合物を１〜２秒
渦動させた。５μを取り出し、放射活性を測定した
（実施例１参照）。溶液の残りを15〜30分間室温に放置
した。次に、磁気アミンマイクロスフェアを磁気的にペ
レット化し、上清の５μのアリコートの放射活性を測
定した。上清のもう１つのアリコートを取り、下記のハ
イブリッド形成用混合物中に入れた;0.6M PB中の溶離し
た［3H］−rRNA25μ（1.1pmol），［32P］−DNAプロ
ーブ0.5μ（.23pmol）,1％SDS1.5μ及びH2O4μ、
全体で31μの溶液となる。
（放射活性に基き）同量の保存［3H］−rRNAを使用し
て対照のハイブリッド形成も実施した：保存［3H］−rR
NA1.8μ（1.1pmol），［32P］−DNAプローブ0.5μ
（.23pmol）1.0M PB4.8μ,1％SDS 1.5μ，及びH2O1
2.4μ、全体で31μの溶液となる。
次に、ハイブリッド形成用混合物を50℃で３時間イン
キュベートした。7mlのポリプロピレンのシンチレーシ
ョンバイアル中の２％のヒドロキシアパタイト（HAP）
を含有する0.14MのPB5mlに各混合物を加えた。15秒間渦
動させた後、サンプルを50℃で５分間インキュベートし
た。次に、IECテーブルトップ臨床用遠心器（Needham H
ts.,MA,USA）で2000×Ｇ、２分間遠心分離することによ
り、HAPをペレット化した。上清を除去し、0.14M PB5ml
を加え、混合物を15秒間渦動させた後、上述のように遠
心分離した。上清を除去し、HAP,非結合物及び洗浄液の
Cerenkov［32P］活性を測定して、ハイブリッド形成
率、すなわち、HAPに結合した［32P］値を有するプロー
ブの割合を測定した。
支持体に結合した［3H］−rRNAの内80％が溶離され
た。溶離されたrRNA又は保存rRNAのいずれも、DNAプロ
ーブと反応させると31％でハイブリッド形成した。結果
は、本発明方法によるポリヌクレオチドの精製が、更に
ハイブリッド形成を行ったり、他の研究を行うためには
ポリヌクレオチドを破損しないことを示している。
実施例４ 磁気アミンマイクロスフェアへの尿中rRNAの結合 この実験は、磁気アミンマイクロスフェアへのrRNAの
結合に対する尿の影響を測定するために実施した。実施
例３に記載の材料の他に、新鮮尿のサンプルを志願者か
ら得た。
100μの新鮮尿に、500μの50mM PB、8Mの尿素又
はpH4のHOAc（HOAc 1ml当り10N NaOHを0.28mlを加えて
氷酢酸をpH4に調整した）並びに保存［3H］−rRNA1μ
（１μｇ）及び磁気アミンマイクロスフェア５μを加
えた。実施例１に記載したように混合物を処理したが、
各々は50mM PB200μで洗浄した。
結果から、核酸を遊離させ、蛋白質やヌクレアーゼを
変性させるために生物学的サンプルと共に使用する尿素
は、尿の存在下で［3H］−rRNAの結合を0.8％まで減少
させることが示された。尿とリン酸バッファのみの中で
は、［3H］−rRNAの13％のみが支持体に結合した。pH4
のHOAcとの組合せ中でのみ、100％のrRNAが磁気アミン
マイクロスフェアに結合した。
実施例５ 磁気アミンマイクロスフェアへの、たん（sputum）の中
に懸濁させたrRNAの結合 より複雑な生物学的サンプル中で［3H］−rRNAを結合
させるのに必要な試薬及びバッファの適切な組合せ及び
濃度を決定するためにこの研究を行った。実施例４に記
載の材料に加え、貯蔵した凍結したたん（各保存物は数
例の患者からのたんを含んでいる）を種々の病院から入
手した。
先ず、1/10容の0.5Mジチオスウィトール（DTT）を加
えた後に渦動させ、22℃で10〜15分間インキュベートす
ることにより、（使用の直前に）たんのサンプルを液体
とした。次に、液体化したたんのアリコート100μ
に、１μの保存［3H］−rRNA（１μｇ）及び５μの
磁気アミンマイクロスフェアと共に種々の試薬を加え
た。22℃で５分間インキュベーションした後、次に、サ
ンプルを実施例１のように（但し、各々を50mM PB 200
μで洗うことを除いて）処理して［3H］−rRNA結合の
程度を測定した。結果を第３表にまとめる。
実施例６ たんから精製したrRNAのハイブリッド形成 この実施例では、たんから取り出し、支持体に結合し
た［3H］−rRNAを溶離して、本発明に使用する分離法が
ハイブリッド形成能を非常に減少させるかどうかを決め
るための研究を行った。
配列「５′−GGCCGTTACCCCACCTACTAGCTAAT−３′」
（大腸菌（E.coli）の16Sリボゾームの塩基235〜260に
相補）10/を有するデオキシヌクレオチドプローブを合
成し、実施例２に記載のように［32P］で標識した。
磁気アミンマイクロスフェアにたん中の［3H］−rRNA
を結合させ、非結合画分を除去（実施例５参照）した後
に、1M NaCl,50mM PBで磁気アミンマイクロスフェアを
１回洗浄した。上清を除去した後、0.6M PB50μを加
え、時時混合しながら混合物を22℃で30分間又は72℃で
15分間インキュベートした。次に、磁気アミンマイクロ
スフェアを磁気的にペレット化し、上清のアリコートの
放射活性と、インキュベーション（前記参照）前の磁気
アミンマイクロスフェアのアリコートの放射活性を比較
して、溶離された［3H］−rRNAのパーセンテージを測定
した。
標識過剰な場合とプローブ過剰な場合の両者で保存rR
NAと溶離rRNAとのハイブリッド形成能を比較することに
よって、相補DNA−プローブ（材料参照）とハイブリッ
ド形成する溶離［2H］−rRNAの能力を測定した。次のハ
イブリッド形成溶混合物を調製した： （１）0.6M PB中の溶離rRNA30μ（.44pmol）,DNA−プ
ローブ１μ（.07pmol）,1％SDS4μ,H2O 2.5μ，
全体で37.5μ。
（２）保存rRNA 0.7μ（.44pmol）,0.6M PB29.3μ,
DNA−プローブ１μ（.0.7pmol）,1％SDS4μ及びH2O
1.6μ，全体で36.6μ。
（３）0.6M PB中の溶離rRNA9.35μ（.14pmol）,DNA−
プローブ１μ（.7pmol），及び１％SDS1.34μ，全
体として11.96μ。
（４）保存rRNA0.22μ（.14pmol）,0.6M PB9.13μ,
DNA−プローブ１μ（.7pmol），及び１％SDS1.06μ
，全体として11.41μ。
次に、ハイブリッド形成用混合物を50℃として２時間
インキュベートした後、実施例２に記載のようにHAP上
のハイブリッドを単離した。標的が過剰な場合、rRNAと
比べて溶離rRNAは67％のハイブリッド形成能を示した。
プローブが過剰な場合には、保存rRNAと比べて溶離rRNA
は65％のハイブリッド形成能を示した。
実施例７ 磁気アミンマイクロスフェアを使用した、バッファ溶液
からのRNA/DNAハイブリッドの回収 この実験は、溶液中で形成されたRNA/DNAハイブリッ
ド用分離支持体としての磁気アミンマイクロスフェアを
研究するために計画した。材料は実施例３に記載したも
のと同じである。更に、Legionella特異性のDNAプロー
ブ（平均100塩基の長さ）を使用した。
２つの異なる系で、RNA/DNAハイブリッドを分離する
磁気アミンマイクロスフェアの能力を検討した。
系1:保存［3H］−rRNA8μ（5pmol），デオキシオリゴ
ヌクレオチドプローブ１μ（.5pmol）,0.28M PB10μ
及び１％SDS1μを合わせ、この混合物を50℃で1.5
時間インキュベートすることによりRNA/DNAハイブリッ
ドを形成した。更に、８μの標的RNAを８μの水に
置き換えた以外は、ハイブリッド混合物と同様に対照の
混合物を作った。この対照混合物も50℃で1.5時間イン
キュベートした。各混合物の半量（10μ）を0.14M PB
中の２％HAP5mlに加え、実施例２に記載のように仕上げ
た。各混合物の他の半量を200μの0.14M PB＋10μ
の磁気アミンマイクロスフェアに加え、（洗浄用に0.14
M PBを使用して）実施例１に記載のように仕上げた。
系2:Legionella rRNA 4μ（2.5fmol）,Legionellaプ
ローブ２μ（1.3fmol）及び44％DIBSS,30mM PB及び３
％SDSを含むもの196μとを合わせてRNA/DNAハイブリ
ッド混合物を製造した。４μの標的RNAを４μの水
に置き換える以外はハイブリッド混合物と同じに対照混
合物を作った両方の混合物を72℃で２時間インキュベー
トした。各混合物のアリコート50μを0.14M PB中の２
％HAP5mlに加え、72℃にし、２回洗浄を行うこと以外は
実施例２に記載した通りに仕上げた。最終条件が、18％
DIBSS,5％Triton X−100,0.1M PB及び10μの磁気アミ
ンマイクロスフェアを含有する全量150μとなるよう
に、分離用混合物に各混合物のもう一方の50μを加え
た。次に、72℃で、２回洗浄する（１回目の洗浄は18％
DIBSS,5％Triton及び0.1M PB;2回目の洗浄は５％Trito
n,0.1M PB）以外は実施例１に記載した通りに磁気アミ
ンマイクロスフェアを仕上げた。結果を第４表に示す。
この結果は、磁気アミンマイクロスフェアは、ハイブ
リッド形成しなかったプローブを溶液中に残し、バッフ
ァ溶液からRNA/DNAハイブリッドを回収したことを示し
ている。
実施例８ 磁気アミンマイクロスフェアを用いた溶液からのDNA/DN
Aハイブリッドの回収 この実験は、溶液中で形成されたDNA/DNAハイブリッ
ド用の分離支持体としての磁気マイクロスフェアを研究
するために実施した。実施例２に記載した材料の他に、
実施例２に記載のcDNAの36−塩基領域に相補する合成の
36−塩基デオキシオリゴヌクレオチドプローブを使用し
た。
実施例３に記載したように、オリゴヌクレオチドを［
32P］で標識した。cDNA標識20μ（約20fmol），プロ
ーブ１μ（約60fmol）並びに44％DIBSS,30mM PB及び
３％SDSを含むもの200μ合わせてDNA/DNAハイブリッ
ド混合物を製造した。標的20μに置き換えること以外
はハイブリッド混合物と同様にして対照混合物を製造し
た。両方の混合物を60℃で２時間インキュベートした。
0.08M PB中の２％HAP 450μ又は５％Triton,45mM PB4
50μのいずれかに磁気アミンマイクロスフェア10μ
を加えたものに、各混合物のアリコート50μを加え
た。各分離用混合物を室温で５分間インキュベートし、
前述の実施例に記載したようにHAP又はマイクロスフェ
アをペレット化し、上清を除去した。前述の実施例に記
載したように、0.08M PB（HAP）又は５％Triton,45mM P
B（マイクロスフェア）でペレットを室温で１回洗浄し
た。次に、全ての画分を15mlのCytoscinrtに溶解し、前
述のように放射活性を測定した。第５表の結果と実施例
７の系２の結果とを好適に比較すると、ハイブリッドの
結合は電荷依存性であり、標的がRNAであるかDNAである
かということには作用されないことを示している。
実施例９ 磁気アミンマイクロスフェアに結合した核酸ハイブリッ
ドに関連した標識ヌクレオチドプローブを除去するため
の溶離バッファの研究 磁気アミンマイクロスフェアに結合したDNA/RNAハイ
ブリッドに関連した標識ヌクレオチドプローブを除去す
るための種々の溶離バッファの力を次の方法で示した。
方法1:pH5の0.5M PB中で［125I］−標識デオキシオリ
ゴヌクレオチドプローブ（標準法で調製）を標的RNAに
ハイブリッド形成させた（60℃で30分間、全容量30μ
）。次に、1mlの0.25M PB,pH5,0.05％Triton X−100
及び2.5mgの磁気アミンマイクロスフェアを加え、渦動
させ、そして60℃で５分間インキュベートした。球を0.
25M PB,pH5,0.05％Triton X−100で２回洗浄した。磁気
アミンマイクロスフェアのアリコート（５％）100μ
に加え、60℃で５分間インキュベートし、球から上清を
分離し、γ−カウンター（Iso−Data,Palatine,IL,USA,
モデル20/20 DM）を使って各画分中に存在する［125I］
の量を測定することにより強力な溶離剤を試験した。結
果を第６表に全める。
第 ６ 表 溶 離 剤 溶離率 0.25M PB,pH5,0.01％ SDS,50％ホルムアミド 95 3M NaOAc,pH5 95 0.25M PB,pH5,0.01％ SDS,50％ DMSO 85 0.1M NaOAc,pH5,1％ SDS,1Mグアニジニウム −HCl 70 0.1M NaOAc,pH5,1％ SDS,1Mプロピオン酸 ナトリウム 68 0.1M NaOAc,pH5,0.01％ SDS,0.1M プロピオン酸ナトリウム 65 1Mクエン酸ナトリウム,pH5 60 0.25M PB,pH5,5％ SDS 56 0.1M NaOAc,pH5,1％ SDS 0.1M MgCl2 40 これらの結果は、広範囲の試薬がマイクロスフェアに
結合したRNA/DNAハイブリッドから標識ヌクレオチドプ
ローブを除去しうることを示した。
方法2:他の溶離剤がアミン磁気マイクロスフェアに結合
したDNA/RNAハイブリッドに関連した標識ヌクレオチド
プローブを除去しうることを示すために、次のプロトコ
ールを使用してこれらの強力な溶離試薬を試験した。
0.48M PB（pH5）/0.1％SDS（全容量150μ）中、60
℃で30分間、標的rRNAに［32P］−標識デオキシオリゴ
ヌクレオチドプローブ（上述のように調製した）をハイ
ブリッド形成させた。次に、0.15M PB（pH6.8）/5.0％T
riton X−1001ml及びアミン磁気マイクロスフェア2.5mg
を加え、渦動させ、60℃で５分間インキュベートした。
0.3M PB（pH6.8）で３回マイクロスフェアを洗浄した。
次に、アミ磁気マイクロスフェアに溶離溶液300μを
加え、60℃で５分間インキュベートし、球から上清を分
離し、シンチレーションカウンター（Delta 300 Scinti
llation System,Searle Analytical社、Des Plaines,I
L,USA）を使って各画分中に存在する［32P］量を測定す
ることにより、溶離試薬を試験した。結果を第７表に全
める。
第 ７ 表 溶離剤 溶離率 0.05Mフィチン酸,pH8.0 91％ 0.05Mトリポリホスフェート,pH8.0 87％ 0.3 M PB（pH6.8）/50％ホルムアミド 86％ これらの結果は、ポリホスフェートは磁気アミンマイ
クロスフェアから核酸を効率的に溶離しうることを示し
ている。
実施例10 固相ハイブリッド形成支持体としての磁気アミンマイク
ロスフェアの使用 この実験では、標的rRNAを磁気アミンマイクロスフェ
アに結合させ、その後ハイブリッド形成させた。磁気ア
ミンマイクロスフェア５μに、0.14PB 100μ及び保
存［3H］−rRNA2μ（２μg,1.26pmol）を加えた。材
料は実施例３に記載したものと同じであった。混合物を
22℃で10分間インキュベートし、磁気アミンマイクロス
フェアを磁気的にペレット化し、上清を除去した。磁気
アミンマイクロスフェアに、0.14M PB20μ及びプロー
ブ0.5μ（.23pmol）を加えた。対照として、保存
［3H］−rRNA2μ，プローブ0.5μ0.28M PB5μ,1
％SDS 0.5μ及びH O2μの溶液中でハイブリッドを
形成した。次に、両方のハイブリッド形成混合物を40℃
で３時間インキュベートした。実施例１に記載のよう
に、0.14M PB 100μで磁気アミンマイクロスフェアを
３回洗浄した。結果から、溶液中でのハイブリッド形成
（対照）が20％であるのに比較して、不動態化したrRNA
の場合にはプローブのハイブリッド形成率は５％であっ
たことが示されている。
実施例11 細胞溶解物から核酸を精製するための磁気アミンマイク
ロスフェアの使用 この実験は、ハイブリッド形成能を顕著に減少させる
ことなく粗サンプルからRNAを精製するために上述の磁
気アミンマイクロスフェアを使用しうることを示すため
に実施した。
Legionella pneumophila由来のrRNAを使ってrRNAの
精製法を研究した。材料は実施例に記載したものと同じ
であった。更に、Legionella特異性プローブ及びLegion
ella pneumophila生物を用いた。
水30μ,Legionella pneumophila懸濁物（５×10生
物）５μ及び24％SDS,.08M Tris−塩基,.08M EGTA及
び.08M EDTA5μを合わせた後、72℃で30分間インキュ
ベートすることにより、細胞を溶解し、rRNAを放出させ
た。次に、下記のアッセイ用混合物を使用してサンプル
の４分の１を直接rRNAについてアッセイしたサンプル10
μ＋5.94M PB,114μ＋DNA−プローブ11/１μ＋水
75μ。混合物を72℃で30分間インキュベートし、HAP
結合ステップを50℃で実施する代りに72℃で実施するこ
と以外は実施例２に記載したようにHAPを使用してハイ
ブリッド形成について分析した。サンプルのもう一方の
10μに、HOAc/尿素（実施例５参照）30μを加え、
混合物を５秒間渦動させ、磁気アミンマイクロスフェア
５μを加え、混合物を（約３秒間）軽く渦動させた。
22℃で５分間インキュベートした後、23℃で1M NaCl,50
mM PB 150μで続けて洗浄し、結合したrRNAを0.6M PB
50μで溶離した（詳細は実施例２に記載）。次に、サ
ンプル50μ,5.94MPBA109μ,DNA−プローブ１μ及
び水40μを合せ、混合物を72℃で30分間インキュベー
トし、HAPを使用してハイブリッド形成を分析（実施例
２参照）することにより溶離液をrRNAについてアッセイ
した。結果は第８表に全める。
第 ８ 表 ハイブリッド形成率 直接アッセイ 30 マイクロスフェア精製，溶離，アッセイ 21 11/促進速度系について特許出願中 実施例12 磁気アミンマイクロスフェアによるたんからの核酸の精
製 この実験では、たんからLegionella pneumophila rR
NAを精製し、前記rRNAを続いてハイブリッド形成させる
ための磁気アミンマイクロスフェアの使用を示した。材
料は実施例７のものと同じあった。実施例５に記載のよ
うに、貯蔵したたんのサンプルを液体化した。このたん
のサンプルのアリコート30μ又は水のアリコート30μ
にLegionella pneumophila懸濁液（５μ当り２×10
6,2×105又は２×104細胞）５μを加えた。実施例11
に記載したと同じ方法を使用して、細胞を溶解させ、各
サンプルの半量を直接ハイブリッド形成させ（ここでは
サンプル20μと水65μを使用した）、半量は磁気ア
ミンマイクロスフェアを使用してrRNAを精製した後にハ
イブリッド形成させた（ここでは、サンプル20μとHO
Ac/尿素60μを使用した）。HAPを使用してハイブリッ
ド形成を分析した（実施例２参照）。結果を第９表に示
す。 第 ９ 表 ハイブリッド形成率 水 106生物 42 105生物 33 104生物 5.9 たん 106生物 67 105生物 13 104生物 2.6 バックグラウンド（生物なし） 1.2 実施例13 磁気アミンマイクロスフェア上でのハイブリッドの分離
によるLegionella pneumophillia由来のrRNAの溶液中で
のハイブリッド形成の促進12/ この実験では、溶液中でのハイブリッド形成の促進と
共にたんの中のLegionella pneumophilia rRNAの検出
への磁気アミンマイクロスフェアの使用を示した。貯蔵
したたんの代りに各々のたんを使用すること以外は実施
例11に記載したものと同じ材料を使用した。更に、5ml
のぬいぶた式の管をVanguard（スウェーデン）から；ガ
ラスビーズ（0.2〜0.3ml）をGlen Millo社,Maywood,NJ,
USAから；超音波清浄器をBranson Equipement社,Shelto
n,CT,USA（モデル1200）から；そしてCorning磁気セパ
レータラックをAdvanced Magnetics社（カタログ＃M470
0）から購入した。
貯蔵したたんについて実施例５で記載したように、各
々のたんを液体化した。次に、0.1ml中に104の生物を含
むように、液体化したたんにLegionella pneumophilia
を接種した（実施例10参照）。5mlの管にガラスビーズ
（酸で洗ったもの）100μ溶解バッファ（20％SDS,10m
M EDTA,10mM EGTA,50mM Tris,pH8.0）100μ及び接種
したたん0.1ml又は陰性の対照（0.1％SDS中1mg/mlの子
牛胸線DNA）0.1mlを加え、全て３つずつ作った。次に、
サンプルを72℃で15分間超音波処理し、プローブ溶液
（44％DIBSS,50mM PB,pH6.8,2ml当りに10,000cpmのLegi
onella特異性DNAプローブ）を加え、混合物を渦動さ
せ、次いで72℃で１時間インキュベートした。次に、以
下の方法の１つによりハイブリッドを単離した（全て３
つずつ）:1,HAP,遠心分離−各管に分離溶液（0.26M PB,
pH6.8中５％のHAP,.02％SDS）2mlを加え、管を５回逆転
させ、72℃で５分間インキュベートし、20回逆転させて
から2000×ｇで２分間遠心分離した。上清を静かに除去
して捨て、4.5mlの洗浄液（0.14M PB,pH6.8,.02％SD
S,）を加え、各管を20秒間渦動させ、HAPをペレットし
て、上記のようにして上清を静かに捨てた。次に、Bert
holdガンマカウンターで各管の放射活性を測定した。2.
磁気アミンマイクロスフェア，遠心分離−各管に磁気分
離溶液（9.5％ Triton,0.15M PB,pH6.8,溶液2.75ml当り
150の磁気アミンマイクロスフェア）を加え、以下の
ことを除いては方法１に記載の通りに各管を処理した：
洗浄液は18％DIBSS,5％ Triton,0.1M PBであり；洗浄液
添加後に、管を逆さにして磁気アミンマイクロスフェア
を再び混合した。3.磁気アミンマイクロスフェア，磁気
分離−この方法は、遠心分離をCorning磁気セパレータ
ラックを使用した磁気分離に代えたこと以外は、方法２
と全く同じである。結果を第10表に示す。
方法１＝HAP,遠心分離、方法２＝磁気アミンマイクロス
フェア，遠心分離、方法３＝磁気アミンマイクロスフェ
ア，磁気分離。対照の値は、各々３回行った４つの別々
の測定の平均を表わしている。ハイブリッドの値は、各
々３回行った30の別々の測定（30の個々のたん）の平均
を表わしている。
実施例14 rRNAを分離するための磁気プロピルアミンマイクロスフ
ェアの使用 本発明方法は、支持体表面として、１つの型の磁気カ
チオン性マイクロスフェアの特性に限定されるものでは
なく、他のカチオンも包含することを示すために、磁気
プロピルアミンマイクロスフェアを用いて規定のバッフ
ァから［3H］−rRNAを除去した。マイクロスフェアがＮ
−３−アミノプロピルシラン磁気マイクロスフェア（Ad
vanced Magnetics社，特注品）であること以外は、実施
例１に記載したものと同じ材料であった。
［3H］−rRNAを除去するためにここで使用した方法
は、磁気アミンマイクロスフェアの代わりに磁気プロピ
ルアミンマイクロスフェアを使用すること以外は、実施
例１で使用したものと全く同じであった。140mM PB中で
は、93％のrRNAがマイクロスフェアに結合した。100mM
PB＋1M NaClの溶液中では、83％が結合した。
実施例15 rRNAを分離するための磁気４級アンモニウムマイクロス
フェアの使用 他のポリカチオン性支持体を使用する本発明方法を更
に研究するために磁気四級アンモニウムマイクロスフェ
アを合成した。磁気アミンマイクロスフェア（BioMag M
4100）はAldrich Chemical社から購入した。インドメタ
ンはAldrich Chemical社，ミルウォキー,WT,USAから2,6
−ルチジンはSigma chemical社，セントルイス,MO,USA
から購入した。他の材料は試薬級であった。
磁気アミンマイクロスフェア（250mg,5.0ml）を10ml
の水に希釈した。マイクロスフェアを磁気的に分離し、
50％（v/v）エタノール／水20mlに懸濁した後、磁気的
に分離して洗浄した。この洗浄プロセスは20mlの無水エ
タノールを使って２回繰り返した。次に、洗浄したマイ
クロスフェアを20mlの無水エタノールに再懸濁した。撹
拌しながら、インドメタン（250μ,4m mol）及び2,6
−ルチジン（24.5μ,210μmol）を加えた；撹拌は室
温で一晩続けた。次に、マイクロスフェアを磁気的に除
去し、上述のように20mlの水で４回洗浄し、5mlの水に
再度懸濁させて４℃で保存した。
次に、溶液中のDNAオリゴヌクレオチドからRNAポリヌ
クレオチドを識別する支持体の能力を研究するために、
規定のバッファから［3H］−rRNA及び［32P］デオキシ
オリゴヌクレオチドを除去するために磁気四級アミンマ
イクロスフェアを使用した。デオキシオリゴヌクレオチ
ドは実施例８に記載の36merであった。他の全材料は実
施例１に記載のものと同じだった。
実施例１に記載の方法を使って結合を測定し、その結
果を第11表に示す。
実施例16 rRNAを分離するための磁気ポリ−Ｄ−リジン官能基を有
するマイクロスフェアの使用 実施例14及び15に上記したカチオン性誘導体の他に、
ポリ−Ｄ−リジンを使って磁気マイクロスフェア誘導体
化した。
材料：カルボキシル末端を有する磁気マイクロスフェ
アはAdvanced Magnetics社（Biomag M4125、1g当り約25
0u当量のカルボキシル基を含む）から購入した。68モノ
マー単位の平均重合化率を有するポリ−Ｄ−リジンはSi
gmaChemicala社，セントルイス、MO,USAから入手した。
N,N′ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）はPierce
Chemical社、ロックフォード,IL,USAからであり、Ｎ−
ヒドロキシサクシンイミド（NHS）はEastman−Kodak
社，ロチェスター,NY,USAからであった。
テフロン加工したねじぶた式のガラスの試験管に、カ
ルボキシル末端を有する磁気マイクロスフェアの20mg/m
lの懸濁液10mlを移した。マイクロスフェアを磁気的に
分離し、0.1N NaOH（10ml）、0.1M EDTA（10ml,pH7）、
水（２×10ml）、５％ジオキサン／水（10ml）及び乾燥
ジオキサン（３×10ml）で順次洗浄した。次に、NHS（2
50mg）を含有する乾燥ジオキサン（10ml）中にマイクロ
スフェアを再懸濁した。次に、DCC（400mg）を加え、遮
光するためにホイルで試験管を覆った。15時間、上下に
（end−over−end）回転させて懸濁液を混合した。磁気
的分離後に、ジオキサン（３×10ml）、メタノール（３
×10ml）及び乾燥ジオキサン（３×10ml）で順次NHS−
修飾マイクロスフェアを洗浄し、乾燥ジオキサン（10m
l）に再懸濁した。得られたNHS−修飾マイクロスフェア
懸濁液1mlを磁気的に分離し、希塩酸水溶液（pH4.3）で
洗浄し、ポリ−Ｄ−リジン（7mg）を含有する0.2M NaHC
O3/0.4M NaCl/0.05％NaN3の溶液0.5mlに再懸濁させた。
２時間後、1MエタノールアミンHCl（pH8.4,100μ）の
溶液のアリコートを加え、非反応NHSエステル基におお
いをした。マイクロスフェアを磁気的に分離し、水（２
×1ml）で洗い、水（0.5ml）に再懸濁させた。
ポリ−Ｄ−リジン官能基を有する磁気マイクロスフェ
アは、次のように、rRNAと合成オリゴヌクレオチド（26
mer）との間の結合識別を行うことが示された： 〔3H〕−標識した大腸菌（E.coli）由来のrRNA及び
〔32P〕−末端標識したオリゴヌクレオチドを得た。
ねじぶた式の1.5mlのポリプロピレン管に、ポリ−Ｄ
−リジン官能基を有するマイクロスフェア（５μ）、
バッファ（0.1Mリン酸ナトリウム、pH6.8/0.75M NaCl、
0.5ml）、及び〔3H〕−rRNA溶液又は〔32P〕オリゴヌク
レオチド溶液のいずれかのアリコートを加えた。得られ
た懸濁液を10分間に亘り繰り返し渦動させることにより
混合した。上清を磁気分離で除去し、シンチレーション
液（5ml,BetagelTMカクテル）を含むバイアルに移し
た。次に、シンチレーション測定で放射活性を定量し
た： マイクロスフェアに結合した 〔32P〕オリゴヌクレオチド： ０〜３％ マイクロスフェアに結合した〔3H〕rRNA: 78〜82％ 実施例17 化学ルミネセントな非アイソトープアッセイにおける磁
気アミンマイクロスフェアの使用 非アイソトープアッセイ系用分離支持体として使用さ
れる磁気アミンマイクロスフェアの能力を示すために、
化学レミネセントなアクリジニウムエステルで標識した
合成デオキシオリゴヌクレオチドプローブを使って形成
したハイブリッドの分離を検討した。実施例１に挙げた
材料の他に、Chelamydia trachomatisのrRNAに特異的な
デオキシオリゴヌクレオチドプローブ（33−mer）を合
成し、1987年10月２日にArnoldらが出願した米国特許出
願第105,080号「ヌクレオチドプローブのアクリジニウ
ムエステル標識及び精製」に記載されている通りに化学
ルミセントなアクリジニウムエステル（AE）で標識し
た。Chlamydia trachomatis rRNAを使用し、アッセイ管
は12×75mmのポリスチレン管であった。他の全成分は試
薬級であった。
次の方法に従って、標的RNA（この場合、Chlamydia t
rachomatis）にAE−標識プローブをハイブリッド形成さ
せた： ハイブリッド形成用混合物 200μのハイブリッド形成用バッファ（0.1Mコハク
酸リチウム、pH5.2、10％ドデシル硫酸ナトリウム、2mM
EDTA、及び2mMEGTA）、 １μのRNA（10-3μｇ）、 １μのAE−プローブ（0.125pmol） 対照混合物は、RNAの代りに水を含有すること以外は
ハイブリッド形成用混合物と同じであった。混合物を60
℃で30分間インキュベートし、0.4M PB,pH6.0,5％（v/
v）Triton −X100,8％（wt/v）DIBSS及び2.5mgの磁気ア
ミンマイクロスフェアを含有する分離溶液2mlを加え、
混合物を渦動させ、60℃で更に５分間インキュベートし
た。次に磁気アミンマイクロスフェアを磁気的に管の端
に引き寄せ、上清を静かに捨て、60℃に予め温めたpH6.
0の0.4M PB 2mlで磁気アミンマイクロスフェアを３回洗
浄した（洗浄用バッファを加え、渦動させ、磁気的に分
離し、静かに捨てる）。次に0.2M PB,pH6.0,50％ホルム
アミドを含有する溶離バッファ300μを加え、渦動さ
せ、60℃で２分間インキュベートすることにより、磁気
アミンマイクロスフェアから結合プローブを溶離した。
磁気アミンマイクロスフェアを磁気的に管の端に引き寄
せ、溶液を新しいアッセイ管に移した。次に0.25NHNO3,
0.1％H2O2200μを自動注入し、１秒後に1N NaOH200μ
を注入して、５秒間化学ルミネセンスを読む（結果は
「相対光単位、又はrlu」で示される）ことにより、Ber
thold ClinilumatモデルLB9502（Wildbad,西独）で、各
サンプルの化学ルミネセンスを測定した。
結果： 対 照− 160rlu 10-3μg rRNA−3929rlu これらの結果から、非アイソトープ標識を使用するア
ッセイ系において、磁気アミンマイクロスフェアはハイ
ブリッド形成していないプローブからハイブリッド形成
したものをはっきりと分離できることが示された。ここ
で、標的RNAが非常に低濃度（10-3μｇ）であっても、
バックグラウンドは非常に低く（注入rluの0.01％未
満）、信号が非常にはっきりしていることが判る。
実施例18 臨床検体を用いる化学ルミネセントな非アイソトープア
ッセイにおける磁気アミンマイクロスフェアの使用 臨床検体の存在下での非アイソトープアッセイ系用分
離支持体として使用される磁気アミンマイクロスフェア
の能力を示すために、実施例17に記載のAE−プローブを
使用して臨床検体中の標的rRNAの希釈系を検出した。実
施例17に挙げた材料の他に、喉のスワブ物質を志願者か
ら得、３％ドデシル硫酸リチウム、30mM PB（pH6.8）,1
mM EDTA及びEGTA中に入えた（以下、これを単に「喉の
スワブ」と呼ぶ）。次の方法に従って、AE−プローブを
喉のスワブ物質中で少量のその標的rRNA（この場合、Ch
lamydia trachomatis）とハイブリッド形成させた。
50μの喉のスワブ 6μの4.8M PB（pH4.7） 2μのAE−プローブ（lpmole） 2μのRNA（３×10-3,3×10-2,3×10-1μｇ） 対照の混合物はRNAの代りに水を含有していること以
外はハイブリッド形成用混合物と同じであった。この混
合物を60℃で60分間インキュベートし、次に実施例17に
記載したように、各々の３分の１を分離し、洗浄し、溶
離させた。
結果： 対 照 − 4,049rlu 10-3μg rRNA − 9,500rlu 10-2μg rRNA − 61,000rlu 10-1μg rRNA − 657,000rlu これらの結果は、非アイソトープ標識を使用するアッ
セイ系で、臨床検体の存在下で、磁気アミンマイクロス
フェアはハイブリッド形成していないプローブからハイ
ブリッド形成したものをはっきりと分離できることを示
している。このサンプルではより大量のプローブを使用
しているので、ここでは、対照が少なくとも部分的に実
施例17のものよりも高い値を示している。
実施例19 他のポリカチオン性支持体の合成 ハイブリッド分離におけるカチオン性支持体の使用を
更に示すために次の支持体を合成した。
ａ）スペルミンラテックスマイクロスフェア スペルミンではそのカチオンがポリヌクレオチドのア
ニオンに対応するように配置されているポリアミンであ
るために、本実施例ではスペルミンを選択した。ラテッ
クスアミンマイクロスフェア（固体2.5％，平均直径１
μ,0.125m当量/g）はPolysciences社，ワーリントン,P
A,USAから購入した。1,4−ブタンジオール、ジグリシジ
ルエーテル及びスペルミンはAdrich Chemical社，ミル
ウォーキー,WI,USAからのものであった。Millititer 96
濾過ユニット及び0.22μのDurapore RフィルターはMill
ipore Filter社，ベッドフォード、MA,USAから贈呈され
た。他の全材料は試薬級であった。
先ず、1,4−ブタンジオールグリシジルエーテルでマ
イクロスフェアを活性化した。25mg（1ml）のラテック
スアミンマイクロスフェアを0.22μのDurapore Rフィル
タ上で濾過した。次に、NaBH4 2mg/mlを含有する0.6N N
aOH 150μにマイクロスフェアを再懸濁させ、スラリ
ーをガラスの試験管に移し、ここに1,4−ブタンジオー
ルグリシジルエーテル（150μ）を渦巻かせながらゆ
っくりと加えた。混合物を１時間に亘り10分毎に軽く渦
動させた後、水1mlを加えた。次に、上述のようにマイ
クロスフェアを濾過し、水（2ml）で洗浄した。
次に、活性化したマイクロスフェアをスペルミンと反
応させた。上記反応からのエポキシド修飾マイクロスフ
ェアを0.1M Na2CO3,pH:11.61mlに懸濁させ、混合しなが
ら（50℃に温めた）スペルミン75μを加えた。室温で
12時間反応させた後、マイクロスフェアを濾過し、水
（2ml）で洗浄し、水（800μ）に再懸濁させた。
（ｂ） トリス（２−アミノエチル）アミンラテックス
マイクロスフェアフェア（「トリス−ラテックス」）の
合成 トリス（２−アミノエチル）アミンはAldrich Chemic
al社，ミルウォーキー,WI,USAから購入した。この化合
物ではそのカチオンがポリヌクレオチドアニオンとほぼ
同じだけ離れて配置されているので、この化合物を選択
した。
本実施例の（ａ）に上述した方法に従って、トリス
（２−アミノエチル）アミン（50μ）を活性化したマ
イクロスフェアに加えた。
（ｃ） トリス（２−アミノエチル）アミンセファロー
ス4B（「トリス−セファロース）の合成 トレシルで活性化したセァロース4BはPharmacia Fine
Chemicals AB,Uppsala,スウェーデンから購入した。凍
結乾燥したトレシル−活性化セァロース4B（1g）を、45
分間に亘り、1mM HCl（200ml）を使って、0.22μ Durap
ore R（Millipore社，ベッドフォード,MA、USA）フィル
タ上で洗浄した。次に0.1M NaHCO3（pH8）/0.5MNaCl 5m
lとトリス（２−アミノエチル）アミン200μとを含む
15mlのポリプロピレンのねじぶた式の管にゲルを移し
た。室温で２時間ゆっくりと上下に回転させることによ
り反応液を混合させた。濾過によりゲルを回収し、0.1M
NaHCO3（pH8）/0.5M NaCl10ml、次いで0.1Mトリス（pH
8）50mlで洗浄した。次に、誘導体化したゲルを15mlの
ねじぶた式の管に移し、４時間上下に回転させることに
より0.1Mトリス（pH8）中で更に洗浄した。ゲルを濾過
し、10mlの0.1M酢酸ナトリウム（pH4）/0.5M NaCl、次
いで10mlの0.1M Tris（pH8）/0.5M NaClで洗浄した。こ
の洗浄サイクルを２回繰り返した。次に、保存用にゲル
を0.1Mトリス（pH8）/0.5M NaCl/0.02％アジドナトリウ
ムに懸濁させた。
（ｄ） トリス−（２−アミノエチル）アミンアクリル
マイクロスフェア（「トリス−アクリルマイクロスフェ
ア」）の合成： 材料：トシル−活性化アクリルマイクロスフェアはKi
rkgaard ＆ Perry Labs社,Gaithersburg,MD,USAから購
入した（平均粒径３μ）。
ねじぶた式の1.5mlポリプロピレン管に、活性化マイ
クロスフェア（10％懸濁液）1mlを移した。Tomy−Seiko
の微細遠心分離器（モデルMR−15A,東京，日本）で５分
間、10,000rpmで遠心分離してマイクロスフェアを分離
し、上清を除去した。次に、0.1M NaHCO3（0.9ml）とト
リス（２−アミノエチル）アミン（0.1ml）を加え、渦
動させることによりマイクロスフェアを再懸濁させた。
管の内容物を16時間上下に回転させて混合した。アミン
−修飾マイクロスフェアを遠心分離により除去し、水
（５×1ml）で洗い、0.02％NaN3を含有する20mMリン酸
ナトリウム緩衝食塩水（1ml）中に再懸濁した。
（ｅ） Tris−（２−アミノエチル）アミン及びポリ−
Ｄ−リジンによる親水性のポリウレタンからなる膜の官
能化（「トリス−ポリウレタン膜」及び「ポリ−Ｄ−リ
ジンポリウレタン膜」） HPI親和性膜（親水性ポリウレタンベース）はAmicon
社，デンバー,MA,USAから入手した。この膜の大体の孔
の大きさ及び厚さは各々1.2ミクロン及び12,000分の１
インチであった。２−フルオロ−１−メチルピリジニウ
ムホスフェート（FMP）はAldrich Chemical社，ミルウ
ォーキー,WI,USAから；ポリ−Ｄ−リジン（１分子当り
平均68モノマー）はSigma Chemical社，セントルイス,M
O,USAから購入した。
T.T.Ngo,Biotechnology，４,134（1986）に報告され
た方法の変法により、膜上の利用しうるヒドロキシル基
をFMPで活性化した。１×1cmの正方形の膜を15mlの平底
のねじぶた式バイアルに移し、乾燥アセトニトリルで２
回洗浄した。次に、再蒸留したトリエチルアミン（80μ
）を含有する乾燥アセトニトリル（4ml）にこの正方
形を懸濁した。渦巻きさせながら、トリエチルアミン
（100μ）を含有する乾燥アセトニトリル（10ml）中
のFMP（200mg）溶液を滴加した。次に、バイアルの内容
物を１時間回転台の上で渦巻きさせた後、溶液を除去
し、アセトニトリル（２×5ml）、アセトン（5ml）、5
0:50アセトン/5mMHCl水溶液（5ml）及び5mM HCl水溶液
（5ml）で順次、膜片を洗浄した。次に、FMP活性化した
膜の正方形を２つのガラスのバイアルに分け、トリス−
（２−アミノエチル）アミン（100μ）又はポリ−Ｄ
−リジン（50μｇ）のいずれかを含有する0.5M NaHCO3
5mlで処理した。各バイアルの内容物を回転台で15時間
混合した。最後に、1M NaCl（３×5ml）,0.1Mリン酸ナ
トリウムバッファpH7（３×5ml）及び水（３×5ml）で
順次、アミン−誘導体化した膜の片を洗浄し、次に、3M
M紙（Whatman社，メイドストン，英国）上で吸い取り乾
燥させ、室温で乾燥した所に保存した。
実施例20 スペルミンラテックスマイクロスフェアによる核酸の分
離 実施例19に記載したように、スペルミンラテックスマ
イクロスフェアを調製した。上述のように、保存〔3H〕
rRNAは大腸菌（E.coli）由来のものであった。〔γ−
32P〕ATPはNewEngland Nuclear Research Products社，
ボストン,MA,USA,から;T4ポリヌクレオチドキナーゼはB
ethesda Research Labs社,Gaithersburg,MD,USAから;Be
tagelTM（液体シンチレーション用カクテル）はWostche
m,サンディエゴ,CAからであった。
プローブ合成及び標識：標準のホスホルアミダイト化
学14/を使用し、Applied Biosystem社のモデル380A DNA
合成器（Foster市,CA,USA）を使って、「５′−GGCCGTT
ACCCCACCTACTAGCTAAT−３′」の配列を持つデオキシヌ
クレオチドを製造した（この配列は大腸菌（E.coli）リ
ポソームの23cサブユニットの塩基235〜2601:相補す
る）。Maxam及びGillbertの方法（Proc.Natl.Acad.Sci.
U.S.A.,74,560（1977））に従い、〔γ−32P〕ATP及びT
4−ポリヌクレオチドキナーゼを使用してこのオリゴマ
ーの５′−未満を標識した。
〔3H〕−rRNA及び〔32P〕−DNAの不動態化：試験バッ
ファ0.5ml、スペルミンラテックスマイクロスフェア20
μ及び〔3H〕−rRNA（14,000 CPM）又は〔32P〕DNAオ
リゴマー（15,000 CPM）のいずれか0.5μを混合さ
せ、50℃で５分間インキュベートした。次に、Tomy Sei
koモデルMR−15A微細遠心器（東京、日本）で２分間、1
3,000RPMで遠心分離してマイクロスフェアをペレット化
した。上清を除去し、20mlのポリプロピレン管内のBeta
gelTM15mlに加えた。Nuclear Chicagoシンチレーション
カウンターを使って、各サンプル中の〔3H〕又は
〔32P〕の量を測定した。
結果は第12表に示す。200mM〜400mM PBの濃度では、
スペルミンラテックスマイクロスフェアは最大限に標的
ポリヌクレオチドを除去し、最小限にプローブオリゴヌ
クレオチドと結合した。より高いバッファ濃度の方がよ
り優先的に選択された。
実施例21 トリス−ラテックスマイクロスフェアによる核酸の分離 実施例19に上述したように、トリス−ラテックスマイ
クロスフェアを調製した。他の材料は実施例20に記載し
てある。
スペルミンラテックスマイクロスフェアの代りにトリ
ス−ラテックスマイクロスフェアを使用して、上述のよ
うに操作を行った。結果は第13表に示す。スペルミンラ
テックスによると同様に、トリス−ラテックスマイクロ
スフェアは、200〜400mM PBで最適にオリゴヌクレオチ
ドからポリヌクレオチド標的に選択することを示した。
実施例22 トリス−セファロースによる核酸の分離 実施例19に記載のようにしてトリス−セファロースを
調製した。他の材料は実施例20に記載してある。0.3M P
B 0.5ml及び〔3H〕−rRNA又は〔32P〕DNAオリゴマーの
いずれか0.5μにトリス−セファロース（100μ）を
加えた。内容物をしばしば渦巻させながら15分間60℃で
インキュベートしてゲルを懸濁させた。13,000RPMで30
秒遠心分離にかけてゲルをペレット化し、上清を除去し
て、BetagelTM15mlを含有する20mlのポリプロピレンバ
イアルに移した。ゲルを0.3M PB0.5mlで２回洗った。洗
液を遠心分離して分け、上述のBetagelTM含有ポリプロ
ピレンバイアルに移した。最後に、ゲルを0.3M PB0.5ml
中に懸濁させ、同様に、BetagelTM15ml含有のポリプロ
ピレンバイアルに移した。上述のようにして、シンチレ
ーション測定により各サンプル中の〔3H〕又は〔32P〕
量を測定した。第14表の結果は、DNAオリゴヌクレオチ
ドよりもRNAポリヌクレオチドにより結合することを示
してる。
第14表 サンプル ゲルに結合するパーセント 〔3H〕−rRNA 75.1 ％ 〔3H〕−rRNA 80.6 ％ 〔32P〕−DNA（26−mer） 0.54％ 〔32P〕−DNA（26−mer） 0.71％ 実施例23 トリス−アクリルマイクロスフェアによる核酸の分離 rRNAと合成オリゴヌクレオチドに対するトリス−（２
−アミノエチル）アミン誘導体化したアクリルマイクロ
スフェア（実施例19に上述）の結合識別を示した。大腸
菌（E.coli）由来の〔3H〕−rRNA及び〔32P〕末端標識
オリゴヌクレオチド（26mer）は実施例20に記載してあ
る。1.5mlのねじぶた式のポリプロピレン管に：トリス
−（２−アミノエチル）アミン修飾マイクロスフェア懸
濁液（７μ）、リン酸ナトリウムバッファ（pH6.8,20
0μ、0.1〜0.4Mの範囲）、及び〔3H〕rRNA溶液又は〔
32P〕−標識オリゴヌクレオチド溶液のいずれか（１μ
）を加えた。懸濁液を50℃で10分間加熱し、次にマイ
クロタイター濾過マニホルド（0.22μの孔径,Millipore
社，ベットフォード,MA,USA）のウェルに移した。真空
にして、同じバッファ（200μ）でフィルタ上でマイ
クロスフェアを洗浄した。真空を解除してからマイクロ
スフェアを20mMのリン酸ナトリウム緩衝食塩水（200μ
）に再懸濁させ、シンチレーションカクテル（10ml、
BetagelTM）を含有するバイアルに移した。マイクロス
フェアに結合した残存放射活性をシンチレーション測定
で定量した。データを第15表に含める。
実施例24 ポリ−Ｄ−リジンポリウレタン膜及びトリス−ポリウレ
タン膜による核酸の分離 上記に既述の通り、実施例19上に上記したポリ−Ｄ−
リジン修飾膜片はrRNAと合成オリゴヌクレオチド（19me
r）に対し同様な結合識別を表すことが示された。
大腸菌（E.coli）由来の〔3H〕−rRNA及び〔32P〕末
端標識オリゴヌクレオチド（19mer）を使用した。小穴
を開けた吸い取り装置（J.M.Specialty Parts,サンディ
エゴ,CA,USA）中の３枚の3MM紙（Watman社，メイドスト
ン，英国）の一番上に、アミン修飾した膜片を置いた。
〔3H〕−rRNA又は〔32P〕−標識オリゴヌクレオチドの
１μアリコートを、バッファＡ（0.1Mリン酸ナトリウ
ム（pH6.8）/0.15M NaCl/0.02％SDS/0.1％Triton X−10
0）又はバッファＢ（0.1Mリン酸ナトリウム（pH6.8）/
0.45M NaCl/0.02％SDS/0.1％Triton X−100）いずれか
の200μ中で希釈した。次に、小穴付き吸い取り器の
適当なウェルに得られた溶液を入れ、毛管現象によりア
ミン修飾膜片を通過させた。次に小穴付き吸い取り器か
ら膜を除去し、同じバッファ（バッファＡ又はバッファ
B,2×2ml）で洗い、シンチレーションカクテル（Betage
lTM）5mlを含有するバイアルに移した。膜片に結合した
放射活性をシンチレーション測定で定量した。
結果を第16表に示す。
実施例25 比色アッセイにおけるビオチニル化DNA−プローブと一
緒のトリス−ラテックスマイクロスフェアの使用 比色ハイブリッド形成アッセイへの本発明方法の可能
性を決定するために、Mycoplasma PneumoniaeのrRNAに
対するビオチン標識したDNAプローブと共にトリスラテ
ックスマイクロスフェアを使用した。
（ａ） Mycoplasma pneumoniaeのrRNAの領域に相補す
るビオチン標識DNAオリゴマーの合成 材料：ビオチニル−Ｅ−アミンカプロン酸Ｎ−ヒドロ
キシサクシンイミドエステル（Biotin−Ｘ−NHS）はCal
biochem−Behring社，サンディエゴ,CA,USAから購入し
た。５−アリールアミンUTP、末端デオキシヌクレオチ
ドトランスフェラーゼ、及び５×テイリング（tailin
g）バッファはBethesda Reseavch Laboratories,Gaithe
rburg,MD,USAの製品であった。Bio−GelP−60（100−10
0メッシュ）はBio−Rad Laboratories,リッチモンド,C
A,USAから;Sephadex G−25（中）はPharmacia Fine Che
micals,ピスタカウェイ,NJからのものであった。使用し
た他の材料は実施例19及び20に上述してある。Mycoplas
ma pneumoniae由来のrRNAの16Sサブユニット中に存在
する配列に相補の36ヌクレオチド長のデオキシリボヌク
レオチドプローブを使用した。実施例20に記載したよう
に、このオリゴマー５′−末端を標識した。
アリルアミンUTPによるテイリング反応:50μの１×
テイリングバッファ中、0.1mMアリルアミンUTP及び40単
位の末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼと9p
molの〔32P〕−オリゴマーを37℃で１時間反応させた。
0.1M PB/2mM EDTAで溶出するBio−Gel P−60カラム（７
×10cm）で、尾を付けたオリゴマーを精製した。次に、
オリゴマーをSephadex G−25カラムに通し、0.2M重炭酸
トリエチルアンモニウム（TEAB,pH8）で溶出して脱塩さ
せた。
ビオチン−Ｘ−NHSとの反応:60分間隔で４回、0.1M N
aHCO3（pH8.8）/0.02％SDS 150μ中に溶解したアリル
アミンUTPの尾を持つオリゴマーを10μのビオチン−
Ｘ−NHS（DMSO中の30mM保存液）で処理した。0.1M PB/2
mM EDTA/0.2％SDSで溶出するSephadex G−25（0.7×10c
m）カラムで、ビオチニル化したオリゴマーを精製し
た。
（ｂ） ビオチニル化DNAプローブrRNAハイブリッドの
「トリス−ラテックス」上への不動態化 Mycoplasma pneumoniae由来rRNAの保存溶液（１μg/
μ）を使用した。実施例19に記載のようにトリス−ラ
テックス懸濁液を調製した。他の材料は試薬級であっ
た。
ハイブリッド形成用反応混合物は次のようであった： ハイブリッド:rRNA1μ（１μｇ）、ビオチニル化DN
Aプローブ10μ（0.1pmol）、１％SDS0.4μ、1M PB
2.4μ、及びH2O6.2μ、全体として20μ。
プローブの対照：ビオチニル化DNAプローブ10μ
（0.1pmol）、１％SDS 0.4μ、1M PB2.4μ、及びH2
O7.2μ、全体として20μ。
ハイブリッド形成用混合物を60℃で１時間インキュベ
ートした後、トリス−ラテックス（水性懸濁液）10μ
及び0.4M PB/0.02％SDS/1.0％Triton X−100を加えた。
内容物を混合し、60℃で５分間インキュベートした。1
3,000RPMで２分間遠心分離させて、トリス−ラテックス
マイクロスフェアをペレット化した。Cerenkov放射性を
使ったシンチレーション測定により、マイクロスフェア
に結合したままの〔32P〕量を測定した。
ハイブリッドの実験では、トリスラテックスには全放
射活性の61％が結合している一方、プローブの対照では
５％しか結合していなかった。このことは、前の実験で
の56％のハイブリッド形成を反映している。
（ｃ） ビオチニル化したDNAプローブ−rRNAハイブリ
ッドはトリス−ラテックス上で非アイソトープ的に検出
された アジピン−アルカリ性ホスファターゼ複合体製造用試
薬はVector Laboratories,Burlingame,CA,USAから購入
した。牛血清アルブミン（BSA）、ニトロブル−テトラ
ゾリン塩（NBT）、５−ブロモ−４−クロロ−３−イン
ドリルホスフェート（BCIP）及びTween−20はSigma Che
mical社、セントルイス,MO,USAの製品であった。他の材
料は実施例19及び20に記載した。
（本実施例中で上記したように、）ビオチニル化DNA
プローブ/rRNAハイブリッド又はビオチニル化DNAプロー
ブのみのいずれかと共にインキュベートしたトリス−ラ
テックスの２つのサンプルを、Durapore R（Millipore
社,Bedford,MA,USA）フィルターを使用するMillititer
96濾過装置で濾過した。0.1Mトリス（pH7.5）/0.1M NaC
l/3mM MgCl2/0.05％Tween−20中の３％BSA 200μ中に
濾過固体の各サンプルを懸濁させ、1.5mlのねじぶた式
のポリエチレン管に移し、44℃で１時間インキュベート
した。次にサンプルを上述のように濾過し、（製造者の
指示に従って、リン酸塩緩衝食塩水中で調製した）スト
レプトアジピン−アルカリ性ホスファターゼ複合体200
μ中に、濾過した固体を再懸濁させた。10分後に、サ
ンプルを濾過し、0.1Mトリス（pH7.5）/0.1M NaCl/3mM
MgCl2/0.05％Tween−20 200μで２回、次に0.1Mトリ
ス（pH9.5）/0.1M NaCl/50mM MgCl2200μで１回洗浄
した。次いで、0.33mg/ml（NBT）及び0.17mg/ml（BCI
P）を含有する0.1M Tris（pH9.5）/0.1M NaCl/50mM MgC
l2200μ中に濾別した固体を再懸濁させた。暗所で10
分間発色させた。次に、濾過によりラテックス粒子を除
去し、0.1M NaCl/3mM MgCl2/0.05％Tween−20で２回洗
浄した。
約２分以内に、ハイブリッドサンプルについては、ト
リス−ラテックスマイクロスフェアの表面上に沈積した
水色の沈澱が認められた。これは、ビオチニル化プロー
ブのみのサンプルについて観察された非常に薄い発色と
はっきりと区別できた。
実施例26 非アイソトープ比色アッセイにおけるビオチニル化プロ
ーブと一緒のトリス−セファロースの使用 トリス−ラテックスマイクロスフェアの代りにトリス
−セファロースゲルと共に実施例25のハイブリッド形成
系を使用した。
（ａ） ハイブリッド形成させたビオチニル化プローブ
をTris−Sepharose上に不動態化した 1ccのツベルクリンシリンジを使って、（実施例19に
記載したように調製した）トリス−セファロースを0.1m
l含有する小さいカラムを製造した。（実施例19に記載
のように調製した）ハイブリッド形成用混合物を0.25M
PB/0.02％SDS/1.0％Triton X−100 0.5ml中に溶解さ
せ、５分間に亘ってトリス−セファロースカラムを通し
て一滴毎に通過させた。次に、0.5mlの同じバッファで
カラムを洗った。実施例25（ｂ）に記載のように、シン
チレーション測定により、カラムに結合した残存
〔32P〕量を測定した。トリス−セファロースはプロー
ブよりも特に正確にハイブリッドを選択することを示し
た。ハイブリッドの内、81％はトリス−セファロースに
結合したが、プローブの対照は0.0％しか結合しなかっ
た。（プローブ対照に結合したままの〔32P〕の量はバ
ックグラウンド以上には測定できなかった。）。
（ｂ） ビオチニル化プローブを非アイソトープ的に検
出した 材料は実施例21（ｃ）に記載した通りであった。本実
施例中に上述したように、トリス−セファロースの小さ
なカラムを調製し、ハイブリッド形成用反応混合物で処
理した。次に、アビジン−アルカリ性ホスファターゼ複
合体（0.5ml、実施例25（ｃ）に記載したように調製す
る）をカラムに一滴ずつ通した。10分後に、軽く加圧し
て、残ったアビジン−アルカリ性ホスァターゼ溶液を押
出した。0.5mlの0.1Mトリス（pH7.5）/0.1M NaCl/3mM M
gCl2で２回、0.1Mトリス（pH9.5）/0.1M NaCl/50mM MgC
l2で１回ゲルを洗った。次に、NBT/BCIP染色試薬（0.5m
l、実施例25参照）をゆっくりとゲルに通した。10分後
に、残った試薬を押出し、0.5mlの0.1Mトリス（pH7.5）
/0.1M NaCl/3mM MgCl2で２回ゲルを洗った。
約２分以内に、ハイブリッドサンプルについては水色
の発色が認められた。これはプローブのみのサンプルと
は容易に区別された。プローブのみのものでは、10分間
発色させた後に、薄く青色になるだけであった。注：こ
の支持体では、前の支持体（実施例25（ｃ））で必要と
された３％BSAによる「キャッピング」ステップは必要
なかった。
実施例27 比色アッセイにおけるアルカリ性ホスファターゼ標識DN
Aプローブと一緒のトリス−セファロースの使用 実施例19に記載したカチオン性支持体は、アルカリ性
ホスファターゼ／デオキシオリゴヌクレオチドプローブ
抱合体を使用する比色ハイブリッド形成アッセイにも使
用できることを示した。
材料:E.JablonskiらがNucl.Acids Res.,Vol.14,p.611
5（1986）に載した方法の変方により、大腸菌（E.col
i）由来rRNA（以下に「標的rRNA」と呼ぶ）に相補の、
アルカリ性ホスファターゼ標識合成オリゴヌクレオチド
（26mer）を製造した。Candida albicans由来rRNA（以
下、「非標的rRNA」と呼ぶ）との交差ハイブリッド形成
が最少となるようにオリゴヌクレオチド配列を選択し
た。標的及び非標的rRNAを単離精製した。NBT及びBCIP
染料は実施例25に上記した。他の材料は試薬級であっ
た。
オリゴヌクレオチド−アルカリ性ホスファターゼ抱合
体（10μ,1mol）、標的又は非標的rRNAのいずれかの
希釈物（１μ,1〜0.0001μｇ）、4.8Mリン酸ナトリウ
ムバッファ（２μ,pH6.8）、ドデシル硫酸ナトリウム
（0.4μ,1％溶液v/v）及び滅菌水（13.6μ）、全容
量20μを加えて、1.5mlのポリプロピレンの微細遠心
分離管中でハイブリッド形成要カクテルを調製した。こ
れらのカクテルを50℃で30分間ハイブリッド形成させ
た。次に、0.3Mリン酸ナトリウム（0.5ml,pH6.8）及び
トリス−セァロース（約30μの床容量）を加え、50℃
の水浴中で10分間振とうすることにより内容物を混合さ
せた。次に、管を微細遠心器で軽く回転させ、パストゥ
ールピペットで上清を排出させた。次に、0.3Mリン酸ナ
トリウムバッファ（３×0.5ml）、次に50mMトリスHCl
（pH8）/0.1M NaCl/1mM MgCl2/0.1mM ZnCl2（２×0.5m
l）で順次、トリス−セファロースペレットを洗浄し
た。次に、NBT（0.33mg/ml）及びBCIP（0.25mg/ml）を
含有する0.1MトリスHCl（pH9.5）/0.1M NaCl/50mM MgCl
2の溶液300μ中にペレットを再懸濁させ、42℃で４時
間インキュベートした。0.001μｇまで少ない標的rRNA
によるハイブリッド形成反応からのトリス−セファロー
スペレット上には青紫色の発色が認められた。最大限1.
0μｇまでの非標的rRNAを有する対照からのトリス−セ
ファロースペレットでは発色は全く認められなかった。
実施例28 比色アッセイにおけるアルカリ性ホスファターゼ標識DN
Aプローブと一緒のポリ−Ｄ−リジンポリウレタン膜の
使用 この実験では、比色アッセイにおける分離支持体とし
てのカチオン膜の使用を示した。
実施例27に記載のようにハイブリッド形成反応を行っ
た。この反応液に、300μの希釈バッファ（0.1Mリン
酸ナトリウム（pH6.8）/0.45M NaCl/0.02％SDS/0.1％Tr
iton X−100）を加えた。実施例24に記載の小穴の開い
た吸い取り装置を使用し、毛細管作用により、得られた
溶液をポリ−Ｄ−リジン膜片の間に通した。次に、膜片
を小穴付き吸い取り器からとり除き、希釈バッファ（２
×2ml）及びアッセイ用バッファ（２−アミノ−２−メ
チルプロパンジオールHCl（pH10.2）/0.1M NaCl、２×4
ml）で、洗浄した。次に、NBT（0.33mg/ml）及びBCIP
（0.25mg/ml）を含有するアッセイ用バッファ（10ml）
に膜片を浸した。10分後に、１μｇの標的rRNAを含有す
るハイブリッド形成用反応液で処理した小穴は濃い青紫
色に呈色したが、１μｇの非標的rRNAを含有する対照で
は呈色は認められなかった。
この比色アッセイは、スロット−プロットアッセイに
典型的に必要とされるハイブリッドの予形成、固定及び
ブロックステップは必要としなかったので、現存の技術
よりも顕著に改善されている。
実施例29 化学ルミネセント非アイソトープアッセイにおけるポリ
−Ｄ−リジンポリウレタン膜の使用 アクリジニウムエステル（AE）標識DNAプローブを使
用する化学ルミネセンスによる非アイソトープハイブリ
ッド形成アッセイにおける、実施例19に記載のカチオン
膜分離支持体の使用を示した。
本明細書に参考として含まれる、1987年10月２日に出
願された「ヌクレオチドプローブのアクリジニウムエス
テル標識及び精製」という名称の米国特許出願第105,08
0号に記載の通りに、化学ルミネセントなアクリジニウ
ムエステル標識オリゴヌクレオチドプローブの生成及び
検出方法を実施した。大腸菌（E.coli）由来のrRNA中の
配列に相補のアクリジニウムエステル（AE）標識オリゴ
ヌクレオチド（26mer）はプローブ分子当り１つのアク
リジニウムエステルを導入して製造した。他の材料及び
試薬は実施例19及び27に上記した。
1.5mlポリプロピレン微細遠心分離管でハイブリッド
形成用カクテルを調製した:AE−標識プローブ（２μ,
1.5×106相対光単位、「RLU′Ｓ」）、１％SDS（v/v,1
μ）、1Mリン酸ナトリウムバッファ（pH4.9,5μ
）、及び標的又は非標的rRNAのいずれか（１μg/μ
,1μ）、全反応液容量９μ。各管の内容物を60℃
で30分間インキュベートした。分離バッファ（0.6ml,0.
1Mリン酸ナトリウムpH6.8/0.15M NaCl/0.02％SDS/0.1％
Triton X−100）を加え、上述のように、小穴付き吸い
取り装置を使って、毛管作用により、得られた溶液をポ
リ−Ｄ−リジン修飾膜片に移した。各小穴の下の膜片を
別々に分離バッファ（３×2ml）で洗い、次いで、0.25c
m2の片に切断し、200μの水を含有する12×75mmのポ
リプロピレン管（Sarsted,西独）に移した。上記のよう
に、各管の内容物の相対化学ルミネセンスを定量した。
特別に、２つの注入サイクルを用いるCliniLumatモデル
LB9502Luminometer（Berthold,ワイルドバッド，西独）
を使用した：注入＃１−0.25M HNO3/0.1％H2O2（200μ
）、注入＃２−2Mリン酸カリウムバッファ（pH13.2,2
00μ）。結果は第17表に示す。
第17表 膜に適用したサンプル 相対化学ルミネセンス 分離バッファのみ 27,291 ハイブリッド形成用反応液 21,807 非標的rRNA 51,292 18,961 ハイブリッド形成用反応液 192,058 標的rRNA 286,842 242,625 実施例30 化学ルミネセント非アイソトープハイブリッド形成アッ
セイにおけるトリス−セファロースの使用 実施例29に記載のように、アクリジニウムエステル標
的オリゴヌクレオチドプローブ/rRNAのハイブリッド形
成反応を実施した。これらの反応液のアリコートをきれ
いな1.5mlのポリプロピレンの微細遠沈管に移し、0.3M
リン酸バッファ（pH6.8,0.5ml）で希釈した。次に、ト
リス−セファロース（30μの床容量、実施例19に記載
のようにして調製）を加え、室温で10分間、静かに渦動
させることにより内容物を混合した。微細遠心分離器で
軽く回転させた後上清を除去し、得られたトリス−セフ
ァロースペレットを0.3Mリン酸ナトリウム（pH6.8,2×
0.5ml）で洗浄し、次いで、0.3Mリン酸ナトリウム（pH
6.8,0.5ml）に懸濁させた。得られた懸濁液のアリコー
ト（0.4ml）を12×75mmのポリプロピレン管に移し、30
％の過酸化水素（0.5μ）を加えた。化学ルミネセン
ト反応を開始するために2N NaOH（200μ）を１回注入
すること以外は実施例29に記載のように化学ルミネセン
スを測定した。結果を第18表に示す。
第18表 トリス−セファロースに結合させたサンプル 相対化学ルミネセンス 対 照（標的を含まず） 637 標 的（大腸菌（E.coli）rRNA） 97.071 非標的（C.albicans rRNA） 702 核酸の精製、及び細胞、ウィルス及び真菌のような感
染源；癌細胞；及び鎌状赤血球貧血のような遺伝性疾患
に関する情報を与えうる細胞を含む広範囲の源由来のDN
A及びRNA中の標的ヌクレオチド配列の検出に上記方法及
び組成物を使用しうることは当業者に理解されよう。従
って、本発明の範囲は添付の請求の範囲を参照してのみ
限定されよう。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 レノルズ，マーク・アラン アメリカ合衆国、カリフオルニア・ 92037、ラ・ホーラ、イーブニング・ウ エイ・3115―ジイー (72)発明者 ウオールドロツプ，アリグザンダー・エ イ．ザ・サード アメリカ合衆国、カリフオルニア・ 92123、サン・デイエゴ、ビリツジ・グ レン・ドライブ・9249 (56)参考文献 特表 昭61−502376（ＪＰ，Ａ)

Claims (74)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】不純な生物学的試料中の100ヌクレオチド
    より長いポリヌクレオチドを10から100ヌクレオチドの
    長さのオリゴヌクレオチドから分離する方法であって、 上記ポリヌクレオチドは、長さ及び／又は電荷において
    上記オリゴヌクレオチドと充分に異なるものであり、 （ａ）上記生物学的試料を、アンモニウムイオン、イン
    モニウムイオン及びグアニジニウムイオンからなる群か
    ら選択されたカチオンを複数有する固体支持体に、上記
    ポリヌクレオチドは該固体支持体に結合するがオリゴヌ
    クレオチドは該固体支持体に結合しないような環境的条
    件下で接触させる段階と、 （ｂ）上記ポリヌクレオチドが固体支持体に結合した状
    態で、オリゴヌクレオチドを固体支持体から分離する段
    階と を含むことを特徴とする上記の方法。
  2. 【請求項２】上記ポリヌクレオチドと上記オリゴヌクレ
    オチドの長さの比が3:1より大である請求項１に記載の
    方法。
  3. 【請求項３】上記の段階をバッチ式で行う請求項１又は
    ２に記載の方法。
  4. 【請求項４】固体支持体が、下記のものからなる群： 磁性アミン固体支持体 磁性プロピルアミン固体支持体 磁性四級アンモニウム固体支持体 磁性ポリ−Ｄ−リシン官能化固体支持体 ポリ−Ｄ−リシン官能化ポリウレタン固体支持体 スペルミンラテックス固体支持体 トリス（２−アミノエチル）アミンラテックス固体支持
    体 トリス（２−アミノエチル）アミンビーズ化アガロース
    固体支持体 トリス（２−アミノエチル）アクリル固体支持体、及び トリス（２−アミノエチル）ポリウレタンアミン固体支
    持体 から選択されたものである請求項１ないし３のいずれか
    に記載の方法。
  5. 【請求項５】上記環境的条件が、上記ポリヌクレオチド
    が上記固体支持体と結合するのを妨げないイオン性洗浄
    剤を存在させることを含む請求項１ないし４のいずれか
    に記載の方法。
  6. 【請求項６】段階（ｂ）の後、固体支持体を洗浄する請
    求項１ないし５のいずれかに記載の方法。
  7. 【請求項７】段階（ｂ）の後、固体支持体を処理してポ
    リヌクレオチドを回収する請求項１ないし６のいずれか
    に記載の方法。
  8. 【請求項８】上記固体支持体を溶離溶液で処理してポリ
    ヌクレオチドを脱着し、この溶離溶液を固体支持体から
    分離することを更に含む請求項１ないし７のいずれかに
    記載の方法。
  9. 【請求項９】上記溶離溶液が、下記のものからなる群： ホスフェート溶液 ピロホスフェート溶液 トリポリホスフェート溶液 フィチン酸溶液、及び 50％フォルムアミド溶液 から選択されたものである請求項８に記載の方法。
  10. 【請求項１０】上記ポリヌクレオチドを上記溶離溶液か
    ら回収する請求項８又は９に記載の方法。
  11. 【請求項１１】生物学的試料が臨床検体である請求項１
    ないし10のいずれかに記載の方法。
  12. 【請求項１２】上記臨床検体が体液及び組織からなる群
    から選択されたものである請求項11に記載の方法。
  13. 【請求項１３】上記臨床検体が尿検体、喀痰検体及びス
    ワブ検体からなる群から選択されたものである請求項11
    又は12に記載の方法。
  14. 【請求項１４】固体支持体が粒子からなることを特徴と
    する請求項１ないし13のいずれかに記載の方法。
  15. 【請求項１５】上記粒子が約１μｍのサイズを有するも
    のである請求項14に記載の方法。
  16. 【請求項１６】上記粒子が磁界中を移動し、これによっ
    て磁石を用いた該粒子の溶液からの分離が可能になるの
    に十分な程度に、上記粒子が磁気で引き付けられるもの
    である請求項14又は15に記載の方法。
  17. 【請求項１７】固体支持体が繊維からなるものである請
    求項１ないし13のいずれかに記載の方法。
  18. 【請求項１８】固体支持体が膜からなるものである請求
    項１ないし13のいずれかに記載の方法。
  19. 【請求項１９】固体支持体が、金属酸化物、ガラス、ラ
    テックス、ポリアミド、ポリエステル、ポリオレフィ
    ン、多糖、ポリグリコール及びポリアミノ酸からなる群
    から選ばれた材料から形成されたものである請求項１な
    いし18のいずれかに記載の方法。
  20. 【請求項２０】不純な生物学的試料中のポリヌクレオチ
    ド上に存在する標的配列を検出するためのアッセイであ
    って、 （ａ）上記生物学的試料を上記標的配列とハイブリダイ
    ズし得る標識化オリゴヌクレオチドプローブと接触させ
    てハイブリッドを形成する段階と、 （ｂ）上記ハイブリッドを、アンモニウムイオン、イン
    モニウムイオン及びグアニジニウムイオンからなる群か
    ら選択されたカチオンを複数有する固体支持体に、上記
    ハイブリッドは固体支持体に結合し結合相を形成するが
    ハイブリダイズしていないオリゴヌクレオチドは固体支
    持体に結合せず遊離相を形成するような環境的条件下で
    接触させる段階と、 （ｃ）上記結合相又は上記遊離相中の標識を定量的或い
    は定性的に測定することによって、上記標的配列を検出
    する段階と からなるアッセイ。
  21. 【請求項２１】上記ポリヌクレオチドと上記オリゴヌク
    レオチドプローブの長さの比が3:1より大である請求項2
    0に記載のアッセイ。
  22. 【請求項２２】上記ポリヌクレオチドは、長さ及び／又
    は電荷において上記オリゴヌクレオチドプローブと充分
    に異なるものである請求項20に記載のアッセイ。
  23. 【請求項２３】固体支持体が、 磁性アミン固体支持体 磁性プロピルアミン固体支持体 磁性四級アンモニウム固体支持体 磁性ポリ−Ｄ−リシン官能化固体支持体 ポリ−Ｄ−リシン官能化ポリウレタン固体支持体 スペルミンラテックス固体支持体 トリス（２−アミノエチル）アミンラテックス固体支持
    体 トリス（２−アミノエチル）アミンビーズ化アガロース
    固体支持体 トリス（２−アミノエチル）アクリル固体支持体 トリス（２−アミノエチル）ポリウレタンアミン固体支
    持体 からなる群から選ばれたものである請求項20ないし22の
    いずれかに記載のアッセイ。
  24. 【請求項２４】上記結合相を遊離相から分離し、結合相
    を洗浄する段階を更に含む請求項20ないし23のいずれか
    に記載のアッセイ。
  25. 【請求項２５】上記環境的条件が、上記ポリヌクレオチ
    ドが上記固体支持体に結合することを妨げないイオン性
    洗浄剤が存在することを含んでいる請求項20ないし24の
    いずれかに記載のアッセイ。
  26. 【請求項２６】上記生物学的試料が臨床検体である請求
    項20ないし25のいずれかに記載のアッセイ。
  27. 【請求項２７】上記臨床検体が体液及び組織からなる群
    から選択されたものである請求項26に記載のアッセイ。
  28. 【請求項２８】上記臨床検体が尿検体、喀痰検体及びス
    ワブ検体から選択されたものである請求項26又は27に記
    載のアッセイ。
  29. 【請求項２９】上記固体支持体が粒子からなる請求項20
    ないし28のいずれかに記載のアッセイ。
  30. 【請求項３０】上記粒子が磁界中を移動し、これにより
    磁石を用いて粒子を溶液から分離することが可能となる
    のに充分な程度に、粒子が磁気で吸引されるものであ
    る、請求項29に記載のアッセイ。
  31. 【請求項３１】上記固体支持体が、金属酸化物、ガラ
    ス、ラテックス、ポリアミド、ポリエステル、ポリオレ
    フィン、多糖、ポリグリコール及びポリアミノ酸からな
    る群から選択された材料で形成されたものである請求項
    20ないし30のいずれかに記載のアッセイ。
  32. 【請求項３２】上記オリゴヌクレオチドプローブがDNA
    又はRNAのアナログであって、該アナログがアルキルホ
    スホネート及びアリールホスホネートからなる群から選
    ばれたものである請求項20ないし31のいずれかに記載の
    アッセイ。
  33. 【請求項３３】上記アナログがメチルホスホネートであ
    る請求項32に記載のアッセイ。
  34. 【請求項３４】不純な生物学的試料中のポリヌクレオチ
    ド上に存在する標的配列を検出するためのアッセイであ
    って、 （ａ）上記生物学的試料を、オリゴヌクレオチドプロー
    ブであって上記標的配列とハイブリダイズし得るものと
    接触させてハイブリッドを形成する段階、 （ｂ）上記ハイブリッドを、アンモニウムイオン、イン
    モニウムイオン、及びグアニジニウムイオンからなる群
    から選ばれたカチオンを複数有する固体支持体と、上記
    ハイブリッドは固体支持体に結合しハイブリダイズしな
    かったオリゴヌクレオチドプローブは固体支持体に結合
    しない様な環境的条件下で、接触させる段階、 （ｃ）上記固体支持体をハイブリダイズしなかったオリ
    ゴヌクレオチドプローブから分離する段階、 （ｄ）ハイブリッドとして上記固体支持体に結合した上
    記オリゴヌクレオチドプローブ、又はハイブリダイズし
    なかったオリゴヌクレオチドプローブを定量的又は定性
    的に測定することにより、上記標的配列の存在を検出す
    る段階 からなるアッセイ。
  35. 【請求項３５】上記ポリヌクレオチドと上記オリゴヌク
    レオチドプローブの長さの比が3:1より大である請求項3
    4に記載のアッセイ。
  36. 【請求項３６】上記ポリヌクレオチドは、長さ及び／又
    は電荷において上記オリゴヌクレオチドプローブと充分
    に異なるものである請求項34に記載のアッセイ。
  37. 【請求項３７】上記ハイブリッド、標識化された上記オ
    リゴヌクレオチドプローブ、又は標識化された上記オリ
    ゴヌクレオチドプローブからの標識を溶離溶液を用いて
    上記固体支持体から溶離し、溶離されたこれらのハイブ
    リッド、標識化されたオリゴヌクレオチドプローブ又は
    標識を定量的又は定性的に測定することによって、上記
    固体支持体にハイブリッドとして結合した上記オリゴヌ
    クレオチドプローブを検出する請求項34ないし36のいず
    れかに記載のアッセイ。
  38. 【請求項３８】上記溶離溶液が、50％ホルムアミド溶
    液、ホスフェート溶液、ピロホスフェート溶液、トリポ
    リホスフェート溶液及びフィチン酸溶液からなる群から
    選ばれたものである請求項37に記載のアッセイ。
  39. 【請求項３９】上記固体支持体が 磁性アミン固体支持体、 磁性プロピルアミン固体支持体、 磁性四級アンモニウム固体支持体、 磁性ポリ−Ｄ−リシン官能化固体支持体、 ポリ−Ｄ−リシン官能化ポリウレタン固体支持体、 スペルミンラテックス固体支持体、 トリス（２−アミノエチル）アミンラテックス固体支持
    体、 トリス（２−アミノエチル）アミンビーズ化アガロース
    固体支持体、 トリス（２−アミノエチル）アクリル固体支持体、及び トリス（２−アミノエチル）ポリウレタンアミン固体支
    持体 からなる群から選択されたものである請求項34ないし38
    のいずれかに記載のアッセイ。
  40. 【請求項４０】上記環境的条件が、上記ポリヌクレオチ
    ドが上記固体支持体に結合することを妨げないイオン性
    洗浄剤が存在することを含んでいる請求項34ないし39の
    いずれかに記載のアッセイ。
  41. 【請求項４１】上記生物学的試料が臨床検体である請求
    項34ないし40のいずれかに記載のアッセイ。
  42. 【請求項４２】上記臨床検体が体液及び組織からなる群
    から選ばれたものである請求項41に記載のアッセイ。
  43. 【請求項４３】上記臨床検体が尿検体、喀痰検体及びス
    ワブ検体からなる群から選ばれたものである請求項41又
    は42に記載のアッセイ。
  44. 【請求項４４】上記固体支持体が、粒子であって、磁界
    中でこれらの粒子が移動し、これにより磁石を用いて溶
    液から分離することが可能となるのに十分な程度に磁気
    で吸引されるものからなる、請求項34ないし43のいずれ
    かに記載のアッセイ。
  45. 【請求項４５】上記固体支持体が、金属酸化物、ガラ
    ス、ラテックス、ポリアミド、ポリエステル、ポリオレ
    フィン、多糖、ポリグリコール及びポリアミノ酸からな
    る群から選択された材料で形成されたものである請求項
    34ないし44のいずれかに記載のアッセイ。
  46. 【請求項４６】上記オリゴヌクレオチドプローブがDNA
    又はRNAのアナログであり、該アナログがアルキルホス
    ホネート及びアリールホスホネートからなる群から選ば
    れたものである請求項34ないし45のいずれかに記載のア
    ッセイ。
  47. 【請求項４７】不純な生物学的試料中のポリヌクレオチ
    ド上に存在する標的配列を検出するためのアッセイであ
    って、 （ａ）上記生物学的試料を、アンモニウムイオン、イン
    モニウムイオン及びグアニジニウムイオンからなる群か
    ら選択されたカチオンを複数有する固体支持体に、上記
    ポリヌクレオチドは固体支持体に結合し結合ポリヌクレ
    オチドを形成するが、上記ポリヌクレオチドよりも寸法
    の小さいオリゴヌクレチチドは固体支持体に結合しない
    ような環境的条件下で接触させる段階と、 （ｂ）上記標的配列とハイブリダイズし得、ハイブリダ
    イズしないときは上記固体支持体と結合しないような標
    識化オリゴヌクレオチドプローブを、上記結合ポリヌク
    レオチドに接触させ、上記固体支持体に結合したハイブ
    リッドを形成し、 （ｃ）上記固体支持体をハイブリダイズしていないオリ
    ゴヌクレオチドプローブから分離し、 （ｄ）ハイブリッドとして上記固体支持体に結合したオ
    リゴヌクレオチドプローブ或いはハイブリダイズしてい
    ないオリゴヌクレオチドプローブを定量的或いは定性的
    に測定することによって、上記標的配列の存在を検出す
    る段階と からなるアッセイ。
  48. 【請求項４８】上記ポリヌクレオチドと上記オリゴヌク
    レオチドプローブの長さの比が3:1より大である請求項4
    7に記載のアッセイ。
  49. 【請求項４９】上記ポリヌクレオチドは、長さ及び／又
    は電荷において上記オリゴヌクレオチドプローブと充分
    に異なるものである請求項47に記載のアッセイ。
  50. 【請求項５０】上記ハイブリッド、標識化された上記オ
    リゴヌクレオチドプローブ又は、標識化された上記オリ
    ゴヌクレオチドプローブからの標識を溶離溶液を用いて
    上記固体支持体から溶離し、溶離されたこれらのハイブ
    リッド、標識化されたオリゴヌクレオチドプローブ又は
    標識を定量的又は定性的に測定することによって、上記
    固体支持体にハイブリッドとして結合した上記オリゴヌ
    クレオチドプローブを検出する請求項47ないし49のいず
    れかに記載のアッセイ。
  51. 【請求項５１】上記溶離溶液が、50％ホルムアミド溶
    液、ホスフェート溶液、ピロホスフェート溶液、トリポ
    リホスフェート溶液及びフィチン酸溶液からなる群から
    選ばれたものである請求項50に記載のアッセイ。
  52. 【請求項５２】上記固体支持体が、下記のものからなる
    群： 磁性アミン固体支持体、 磁性プロピルアミン固体支持体、 磁性四級アンモニウム固体支持体、 磁性ポリ−Ｄ−リシン官能化固体支持体、 ポリ−Ｄ−リシン官能化ポリウレタン固体支持体、 スペルミンラテックス固体支持体、 トリス（２−アミノエチル）アミンラテックス固体支持
    体、 トリス（２−アミノエチル）アミンビーズ化アガロース
    固体支持体、 トリス（２−アミノエチル）アクリル固体支持体、及び トリス（２−アミノエチル）ポリウレタンアミン固体支
    持体 から選択されたものである請求項47ないし51のいずれか
    に記載のアッセイ。
  53. 【請求項５３】上記環境的条件が、ポリヌクレオチドが
    固体支持体と結合するのを妨げないイオン性洗浄剤を存
    在させることを含む請求項47ないし52のいずれかに記載
    のアッセイ。
  54. 【請求項５４】上記生物学的試料が臨床検体である請求
    項47ないし53のいずれかに記載のアッセイ。
  55. 【請求項５５】上記臨床検体が体液及び組織からなる群
    から選ばれたものである請求項54に記載のアッセイ。
  56. 【請求項５６】上記臨床検体が尿検体、喀痰検体及びス
    ワブ検体からなる群から選ばれたものである請求項54又
    は55に記載のアッセイ。
  57. 【請求項５７】上記固体支持体が、金属酸化物、ガラ
    ス、ラテックス、ポリアミド、ポリエステル、ポリオレ
    フィン、多糖、ポリグリコール及びポリアミノ酸からな
    る群から選択された材料で形成されたものである請求項
    47ないし56のいずれかに記載のアッセイ。
  58. 【請求項５８】上記固体支持体が、粒子であって、磁界
    中でこれらの粒子が移動し、これにより磁石を用いて溶
    液から分離することが可能となるのに十分な程度に磁気
    で吸引されるものからなる、請求項47ないし57のいずれ
    かに記載のアッセイ。
  59. 【請求項５９】上記オリゴヌクレオチドプローブがDNA
    又はRNAのアナログであり、該アナログがアルキルホス
    ホネート及びアリールホスホネートからなる群から選ば
    れたものである請求項47ないし58のいずれかに記載のア
    ッセイ。
  60. 【請求項６０】不純な生物学的試料中のポリヌクレオチ
    ド上に存在し得る標的配列を検出するためのキットであ
    って、 （ａ）上記標的配列とハイブリッドを形成し得るオリゴ
    ヌクレオチドプローブ、及び （ｂ）アンモニウムイオン、インモニウムイオン及びグ
    アニジニウムイオンからなる群から選択されたカチオン
    を複数有する固体支持体であって、上記不純な生物学的
    試料中において、環境的条件下で上記ハイブリッドは結
    合するが、上記オリゴヌクレオチドプローブは結合しな
    いような固体支持体、 からなるキット。
  61. 【請求項６１】上記ポリヌクレオチドと上記オリゴヌク
    レオチドプローブの長さの比が3:1より大である請求項6
    0に記載のキット。
  62. 【請求項６２】上記ポリヌクレオチドは、長さ及び／又
    は電荷において上記オリゴヌクレオチドプローブと充分
    に異なるものである請求項60に記載のキット。
  63. 【請求項６３】上記固体支持体が、下記のものからなる
    群： 磁性アミン固体支持体、 磁性プロピルアミン固体支持体、 磁性四級アンモニウム固体支持体、 磁性ポリ−Ｄ−リシン官能化固体支持体、 ポリ−Ｄ−リシン官能化ポリウレタン固体支持体、 スペルミンラテックス固体支持体、 トリス（２−アミノエチル）アミンラテックス固体支持
    体、 トリス（２−アミノエチル）アミンビーズ化アガロース
    固体支持体、 トリス（２−アミノエチル）アクリル固体支持体、及び トリス（２−アミノエチル）ポリウレタンアミン固体支
    持体 から選択されたものである請求項60ないし62のいずれか
    に記載のキット。
  64. 【請求項６４】上記環境的条件下において上記ポリヌク
    レオチドが上記固体支持体と結合するのを妨げないイオ
    ン性洗浄剤を更に含む請求項60ないし63のいずれかに記
    載のキット。
  65. 【請求項６５】上記固体支持体に結合したハイブリッド
    を溶離し得る溶離溶液を更に含む請求項60ないし64のい
    ずれかに記載のキット。
  66. 【請求項６６】上記溶離溶液が、ホスフェート溶液、ピ
    ロホスフェート溶液、トリポリホスフェート溶液、フィ
    チン酸溶液、及び50％フォルムアミド溶液からなる群か
    ら選択されたものである請求項65に記載のキット。
  67. 【請求項６７】上記オリゴヌクレオチドプローブが検出
    に便利なように標識化されたものである請求項60ないし
    66のいずれかに記載のキット。
  68. 【請求項６８】上記オリゴヌクレオチドプローブがDNA
    又はRNAのアナログであり、該アナログがアルキルホス
    ホネート及びアリールホスホネートからなる群から選ば
    れたものである請求項60ないし67のいずれかに記載のキ
    ット。
  69. 【請求項６９】固体支持体が粒子からなることを特徴と
    する請求項60ないし68のいずれかに記載のキット。
  70. 【請求項７０】上記粒子が約１μｍのサイズを有するも
    のである請求項69に記載のキット。
  71. 【請求項７１】固体支持体が繊維からなるものである請
    求項60ないし68のいずれかに記載のキット。
  72. 【請求項７２】固体支持体が膜からなるものである請求
    項60ないし68のいずれかに記載のキット。
  73. 【請求項７３】上記粒子が磁界中で移動し、これによっ
    て磁石を用いた該粒子の溶液からの分離が可能になるの
    に十分な程度に、上記粒子が磁気で引き付けられるもの
    である請求項69又は70に記載のキット。
  74. 【請求項７４】上記固体支持体が、金属酸化物、ガラ
    ス、ラテックス、ポリアミド、ポリエステル、ポリオレ
    フィン、多糖、ポリグリコール及びポリアミノ酸からな
    る群から選ばれた材料から形成されたものである請求項
    60ないし73のいずれかに記載のキット。
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