DE3850273T2 - Polykationische Träger zur Reinigung, Trennung und Hybridisierung von Nukleinsäure. - Google Patents

Polykationische Träger zur Reinigung, Trennung und Hybridisierung von Nukleinsäure.

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Description

  • 1.
  • Die Erfindung betrifft polykationische Träger und deren Verwendung zur Reinigung von Nucleinsäuren, zur Immobilisierung von Nucleinsäuren zu Hybridisierungsschritten und zur selektiven Abtrennung von relativ großen hybridisierten Polynucleotiden aus Lösungen, ohne daß in signifikanter Weise nicht-hybridisierte kleinere Polynucleotid- oder Oligonucleotidsonden entfernt werden.
    • 2. Beschreibung des Stands der Technik
  • In den letzten Jahren hat sich der Wunsch, Polynucleotide zu reinigen und in bequemer Weise Hybridisierungreaktionen zur Detektion von spezifischen Nucleotidsequenzen in Polynucleotiden durchzuführen, dramatisch ausgeweitet. Aus diesem Grund sind zahlreiche Verfahren zur Abtrennung von Polynucleotiden und deren Hybride und zur Detektion spezifischer Ziel-Nucleotidsequenzen in Polynucleotiden unter Anwendung von Polynucleotid- oder Oligonucleotidsonden entwickelt worden.
  • Im Bereich der Polynucleotidreinigung werden Arbeitsschritte angewandt, um entweder Polynucleotide vor der Hybridisierung zu reinigen oder die biologischen Verunreinigungen, welche verschiedene biochemische Arbeitsschritte stören könnten, zu entfernen. In der Vergangenheit wurden verschiedene Verfahren angewandt, wie die Phenolextraktion, Ethanolfällung, Gelelektrophorese, Gel-Permeationschromatographie und Dichtegradienten-Sedimentation (Gilham, 1964; Scott & Kuhns, Analytical Biochem., 47, 471-4780 (1971); Cox & Leoning-Cook et al., (1973); Shih & Martin, Biochemistry, 13, 3411-3418, (1974); Enea & Zinder, Science, 190, 584-586, (1975), Shih & Khoury, Biochemistry, 15, 487-493, (1976); Longacre & Mach, J. Biol. Chem., 253, 7500-7507, (1978); Goldberg et al., Methods in Enzymol., 68, 206-242, (1979); Kreig et al., Analytical Biochern., 134, 288-294, (1983); und Gautreau, et al., Analytical Biochem., 134, 320-324, (1983).
  • Seit kurzem wird die Hochdruckflüssigchromatographie für die Reinigung von einzel- und doppelsträngigen Polynucleotiden im präparativen Maßstab eingesetzt. Bei diesem Verfahren angewandte Anionenaustauschsäulen schließen folgende ein: RPC-5 (Pearson et al., Biochem. Biophys. Acta., 228, 770-774, (1971), andere beschichtete Träger, einschließend Kel-F (Shum und Crothers, Nucl. Acids Res., 5, 2297-2311, (1978) oder siliconisierte Glaskügelchen (Narihara et al., J. Chromatog., 236, 513- 518, (1982) und Diethylamino-ethyl-derivatisiertes Siliciumdioxid wie Nucleogen Anm.1/ (Colpan und Riesner, J. Chromatog., 296, 339-353, (1984); Hecker et al., J. Chromatog., 326, 251-261, (1985); und Müller, Eur. J. Biochem., 155, 203-212, (1986).
  • Darüberhinaus schließen neuere Verfahren der Reinigung sowohl die selektive Adsorption von Polynucleotiden an der Oberfläche von besonders entwickelten Trägern (Johnson et al., Biotechniques, 4, 64-70, (1986), Guenther et al., Fed. Proc., 44, 1622 (abs. 7086), (1985)) und die Immobilisierung von Polynucleotiden durch komplementäre Nucleinsäuresequenzen ein (Nanibhushan & Crothers, Eur. Pat. - Anmeldung Nr. 130 523, (1985); Ruth et al., Fed. Proc. 44, 1622 (abs. 7088), 1985; Blakesley und Thompson, Int. Pat.-Anmeldung Nr. PCT/US84/00508, (1985)) ein.
  • Die oben erwähnten Reinigungsverfahren leiden allerdings nach wie vor unter folgenden Beschränkungen, insbesondere wenn sie in klinischer Umgebung eingesetzt werden. Diese Beschränkungen sind: Sie sind zeitaufwendig oder arbeitsintensiv; sie gewinnen die gewünschten Polynucleotide nicht quantitativ zurück; sie sind mit klinischen Proben nicht verträglich; oder sie können nur schwer in automatisierte Systeme eingebunden werden.
  • In Ergänzung zur Reinigung von Polynucleotiden wurden Trägermaterialien zur Abtrennung von Hybriden eines Polynucleotids und einer Nucleotidsonde von nichthybridisierem Polynucleotid oder Oligonucleotidsonden verwendet. Die Hybridisierung von Polynucleotiden in Verbindung mit in geeigneter Weise markierten polymeren Nucleotidsonden ist schon lange als eine spezifische und sensitive Methode zur Detektion von einmaligen oder fehlexprimierten Polynucleotidzielsequenzen bekannt gewesen. Dieses Vermögen erlaubt die Detektion von infektiösen Organismen wie Bakterien, Viren, Parasiten und Pilzen; von genetischen Krankheiten wie Sichelzellanämie; und verschiedenen Krebsarten. Allerdings hat das Unvermögen, schnell und auf bequeme Weise hybridisierte Polynucleotide von nicht-hybridisierten Polynucleotiden zu trennen, die Anwendung von Hybridisierungsverfahren bei der klinischen Diagnose und im Umfeld der Forschung eingeschränkt.
  • Seit mehr als 20 Jahre arbeiten Forscher daran, unter Anwendung der Hybridisierung Verfahren zu entwickeln, mit denen man die Gegenwart von "Ziel"-Polynucleotiden
  • Anm.1/ Nucleogen ist ein eingetragenes Warenzeichen von Macherey-Nagel, Duren, West-Deutschland
  • nachweisen kann. Diese Methoden bezogen sich vornehmlich auf die Abtrennung von Polynucleotidhybriden vom nicht-hybridisierten Polynucleotid oder von Oligonucleotidsondenmolekülen. In den Jahren 1963 und 1964, Nygaard & Hall, (Biochem. Biophys. Res. Commun., 12, 98, (1963); J. Mol. Biol., 9, 125, (1964) wurde ein Verfahren zur Abtrennung von DNA/RNA-Hybriden durch Filtration mittels Nitrocellulose dargestellt. Diese Forschergruppe fand heraus, daß einzel- und doppelsträngige RNA nicht an Nitrocellulose haftet, aber daß einzelsträngige DNA oder mit RNA komplexierte DNA nicht an Nitrocellulose haftet. Folglich konnte eine Reaktion zwischen radioaktiv markierter RNA und nicht-markierter DNA durch Bestimmung der Menge der am Filter festgehaltenen Radioaktivität nachgewiesen werden.
  • Diesem Arbeitsverfahren folgte eines, das von Gillespie und Spiegelman, (J. Mol. Biol., 12, 829, (1965) beschrieben wurde, bei dem einzelsträngige DNA auf Nitrocellulosefiltern immobilisiert und mit einer radioaktiv markierte RNA enthaltenden Lösung hybridisiert wurde. Nach Entfernung des Überschusses an RNA wurde der Grad der Hybridisierung durch die auf dem Filter immobilisierte Menge an radioaktiver Markierung bestimmt.
  • Im nachfolgenden Jahr berichtete Denhardt (Biochem. Biophys. Res. Commun., 23, 641, (1966)) von der Entwicklung eines ähnlichen Systems, bei dem einzelsträngige DNA auf Nitrocellulose immobilisiert wurde, der Filter zur Verminderung eines nichtspezifischen Hintergrundes mit einer "Schutzkappe" versehen und die immobilisierte DNA mit einer eine geeignete, radioaktiv markierte DNA-Sonde enthaltenden Lösung hybridisiert wurde. Dies blieb bis jetzt einer der starker bevorzugten Hybridisierungsverfahren. Dieses Methode ist allerdings arbeitsintensiv und zeitaufwendig; sie erfordert normalerweise bis zum Abschluß mehr als einen Tag.
  • Neben Nitrocellulose wurde Hydroxyapatit zur Abtrennung von einzelsträngigen und doppelsträngigen Polynucleotidsorten verwendet. Zum Beispiel verwendeten Britten und Kohne (Carnegie "Ist. Wahington Yearbook, 65, 78, (1966)) Hydroxyapatit, um [³²P]-markierte E. coli-DNA-Fragmente, die hybridisiert waren, von E. coli-DNA Fragmenten, die nicht hybridisiert waren, zu trennen. Diese Verfahren wurden von Brenner et al. (Anal. Biochem., 28, 447, 1969)) weiter verbessert, um die Abtrennungen in Teströhrchen durchzuführen.
  • Andere Arbeitsweisen wurden entwickelt, wobei man sich bemühte, die Immobilisierung von DNA und RNA für Hybridisierungsreaktionen weiter zu verbessern.
  • Diese schließen die Fixierung von DNA und RNA an Cyanurchlorid-aktiviertes Papier (Hanger et al., Biochem. Biophys. Acta, 653, 344, (1981)) und an Aryldiazonium- Cellulose-Papier (Seed, Nucl. Acids Res., 10, 1799, (1982)) ein.
  • Es wurden ebenfalls Arbeitsschritte beschrieben, um nicht mit Isotopen markierte, biotinylierte, an DNA oder RNA, immobilisiert an Nitrocellulose, hybridisierte Sonden sichtbar zu machen (Leary et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80, 4045, (1983)). Diese Methode ist allerdings noch arbeitsintensiver als die vorausgehenden radioaktive Markierungen anwendenden Arbeitsvorschriften, da sie zusätzliche Schritte des Auftragens einer "Schutzkappe" und des Waschens erfordert.
  • Bei dem Bemühen, die Detektion von einem "Ziel"-Polynucleotid unter Anwendung der Hybridisierung zu verbessern, wurde eine Doppel(Sandwich)-Hybridisierung entwickelt. Für gewöhnlich wird ein immobilisiertes Polynucleotid angewandt, um das Ziel-Polynucleotid aufzuspüren, unter anschließender Hybridisierung mit einem zweiten Polynucleotid, das markiert ist (Dunn & Sambrook, Methods. Enzymol., 65, 468-478, (1980); Palva, Journal Clin. Micro., 18, 92-100, (1983); Virtanen et al., Lancet, 381-383, (1983); Ranki et al., Gene, 21, 77-85, (1983); Ranki & Soderland, U.S.P.N. 4486539, (1984); Polsky-Cynkin et al., Clin. Chem., 31, 1438-1443, (1985); Ranki & Soderlund U.S.P.N. 4 563 419, (1986)).
  • In einer Anwendung der Sandwich-Assaymethode werden beide Hybridisierungsreaktionen in Lösung durchgeführt, unter anschließender Abtrennung auf immobilisiertem Streptavidin, welches unter Anwendung einer mit Biotin markierten Sonde das gesamte Polynucleotid-Sandwich trennt (Hansen & Jones, E.P.O. 0 139 489, (1985)):
  • Den oben beschriebenen Hybridisierungssysteme mangelt es noch daran, daß sie nicht leicht genug zu handhaben und nicht schnell genug sind, um Hybridisierungs-Assayverfahren in breitem Umfang im klinischen Umfeld brauchbar zu machen. Im allgemeinen sind sie zeitaufwendig, arbeitsintensiv und mangelhaft bezüglich der Empfindlichkeit bzw. Sensitivität. Darüberhinaus sind viele mit in biologischen Proben vorliegenden Mitteln unverträglich, und sie können nur schwer automatisiert werden.
    • 3. Definitionen
  • Die in dieser Beschreibung verwendeten Begriffe sind wie folgt definiert:
    • Nucleotide
  • Eine Untereinheit einer Nucleinsäure, die aus einer Phosphatgruppe, ein Zucker mit 5 Kohlenstoffatomen und einer Stickstoff enthaltenden Base besteht. In RNA ist der Zucker mit 5 Kohlenstoffatomen Ribose. In DNA ist er D-Desoxyribose.
    • Nucleotidmultimer
  • Eine Kette aus Nucleotiden, die über Phosphodiesterbindungen verbunden sind.
    • Oligonucleotid
  • Ein Nucleotidmultimer mit im allgemeinen etwa 10 bis etwa 100 Nucleotiden, das aber auch 200 oder mehr Nucleotide lang sein kann. Sie werden für gewöhnlich aus Nucleotidmonomeren oder durch enzymatische Methoden erhalten.
    • Polynucleotid
  • Ein Nucleotidmultimer mit im allgemeinen etwa 100 oder mehr Nucleotiden in der Länge.
    • Nucleotidsonde
  • Ein Nucleotidmultimer mit einer Nucleotidesequenz, die komplementär zu einer Ziel-Nucleinsäuresequenz, die in einem zweiten Nucleotidmultimer, üblicherweise einem Polynucleotid mit diagnostischer Bedeutung, vorliegt, ist. Für gewöhnlich wird die Sonde so ausgewählt, daß sie zu der Zielsequenz ganz genau komplementär ist. Allerdings kann es in einigen Fällen angemessen oder gar wünschenswert sein, daß ein oder zwei Nucleotide in der Sonde nicht zu der korrespondierenden Base in der Zielsequenz komplementär sind. Eine Nucleotidsonde ist ebenfalls für gewöhnlich ein kleineres Multimer als das in der Zielsequenz enthaltene Multimer. Typischerweise ist sie ein Oligonucleotid, aber sie kann auch ein Polynucleotid sein, und sie ist für gewöhnlich mit einem chemischen Substituenten markiert, welcher ihre Detektion, z. B. mittels radiometrischen, kolorimetrischen, fluorimetrischen, Chemilumeneszenz- oder anderen geeigneten Verfahren, erlaubt.
    • Lösung zur Abtrennung
  • Eine Lösung mit einer Zusammensetzung, die die Immobilisierung eines Nucleotidmultimeren, fuhr gewöhnlich eines Polynucleotids, oder eines Hybrids davon an ein hier beschriebenes kationisches Trägermaterial erlaubt, ohne daß Verunreinigungen, in gewissen Fällen einschließlich kleinerer Polynucleotide und Oligonucleotide, gebunden werden. Wenn ein mit einer Sonde hybridisiertes Polynucleotid immobilisiert wird, hat die Abtrennungslösung bzw. Lösung zur Abtrennung die zusätzliche Eigenschaft, daß sie die Bindung der Nucleotidsonde an dem Träger inhibiert.
    • Waschlösung
  • Eine Lösung mit einer Zusammensetzung, die die Entfernung von überschüssigen Nucleotidsonden oder Verunreinigungen ermöglicht, ohne das eine gewünschtes Nucleotidmultimer, für gewöhnlich ein Polynucleotid oder ein gewünschtes Polynucleotidhybrid, von der Oberfläche eines hier beschriebenen kationischen Trägermaterials entfernt wird. Die Zusammensetzung einer Waschlösung kann in einigen Fällen die gleiche wie die Abtrennungslösung sein.
    • Elutionslösung
  • Eine Lösung, die entwickelt wurde, um ein Nucleotidmultimer, wie ein Polynucleotid, ein hybridisiertes Polynucleotid oder eine markierte Nucleotidsonde oder eine spezifische Markierung, von der Oberfläche eines kationischen Trägermaterials freizusetzen, wobei die spezifische Freisetzung in Abhängigkeit von der gewünschten Art der Rückgewinnung von dem Trägermaterial, die gewünscht wird, geschieht.
    • Hybridisierungslösung
  • Eine Lösung, die entwickelt wurde, um es möglich zu machen, daß eine gewünschte Hybridisierung auftritt. Die gewünschte Hybridisierung ist typischerweise die zwischen einem Polynucleotid und einer Sonde für die Zielsequenz. Wenn die Hybridisierung mit einem Polynucleotid geschieht, das vorausgehend auf einem kationischen Trägermaterial immobilisiert wurde, hat die Lösung folglich die zusätzliche Eigenschaft, daß sie die nicht-spezifische Bindung der Nucleotidsonde am Träger minimiert.
    • 4. Zusammenfassung der Erfindung
  • Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, daß polykationische Trägermaterialien verwendet werden können, um selektiv Nucleotidmultimere entsprechend ihrer Größe zu adsorbieren, wobei größere Multimere fester am Träger gebunden werden als kleinere. Es wird angenommen, daß die Bindungswechselwirkung zumindest teilweise auf der ionischen Anziehungskraft zwischen dem positiv geladenen Träger und dem negativ geladenen Zucker-Phosphat-Gerüst des Nucleotidmultimeren beruht. Diese Eigenschaften können in satzartigen Arbeitsschritten genutzt werden, um sowohl das Polynucleotid schnell zu reinigen als auch die Hybride davon aus komplexen Lösungen abzutrennen.
  • Ein erfindungsgemäßes Verfahren erlaubt die Reinigung von Nucleotidmultimeren in Lösungen, die verschiedene Bestandteile von Organismen, von denen die Multimere erhalten werden, einschließlich Multimere geringeren Molekulargewichtes, enthalten, indem die gewünschten Multimere an dem polykationischen Träger adsorbiert werden. Im Falle von klinischen Proben werden die Nucleotidmultimere ebenfalls von anderen Bestandteilen der Körperflüssigkeiten und der Gewebe, von denen die Multimere abzutrennen sind, entfernt. Nach der Abtrennung des Trägermaterials von der Lösung, können die Multimere von dem Träger entfernt werden.
  • In einer anderen erfindungsgemaßen Methode, die bei Hybridisierungsarbeitsschritten zur Detektion relativ langer Polynucleotide mit kürzeren, markierten Nucleotidsonden nützlich ist, kann der polykationische Träger verwendet werden, um Polynucleotide und Hybride derselben mit der Sonde von der nicht-hybridisierten Sonde abzutrennen. In einer derzeitig bevorzugten Ausführungsform dieser Methode wird die Sonde einer Polynucleotide enthaltenden Lösung hinzugesetzt und es ermöglicht, daß die Hybridisierung vor der Immobilisierung abläuft. Nach der Hybridisierung mit der Sonde wird die Lösung mit dem Träger in Kontakt gebracht, um die Polynucleotide, einschließlich jedweder Hybride derselben mit der Sonde, zu adsorbieren. In einer derzeitig weniger bevorzugten Ausführungsform wird der polykationische Träger der Polynucleotide enthaltenden Lösung hinzugesetzt, um diese an der Trägeroberfläche vor Zugabe der Sonde zu adsorbieren. In diesem Fall findet die Hybridisierung auf der Trägeroberfläche statt. In beiden Ausführungsformen binden die relativ langen Polynucleotide am Träger durch die Wechselwirkung zwischen der kationischen Oberfläche des Trägers mit dem negativ geladenen Polynucleotidgerüst. Sondenmoleküle, die nicht am Polynucleotid gebunden sind, werden nicht am Träger gebunden und verbleiben in der Lösung.
  • Der Träger und jede beliebige als ein Hybrid mit dem Polynucleotid gebundene Nucleotidsonde kann durch Dekantieren, Zentrifugieren oder Filtrieren von der Lösung abgetrennt werden. Wenn die Teilchen magnetisch sind, kann eine Abtrennung mittels eines magnetischen Feldes angewandt werden. Bei den Reinigungsarbeitsweisen kann das Nucleotidmultimer von dem Trägermaterial unter Verwendung von Elutionstechniken rückgewonnen werden. Im Falle von Sonden-Assays kann in der Probe für qualitative und quantitative Bestimmungen von diagnostischer Bedeutung die Gegenwart einer Markierung in der festen Phase oder in der Lösung bestimmt und zur Anwesenheit und Menge der innerhalb der Polynucleotide liegenden Ziel-Nucleinsäuresequenz in Beziehung gesetzt werden.
  • Bei allen Ausführungsformen der Erfindung wird eine hochselektive Methode zur Abtrennung von Nucleotidmultimeren von keine Nucleotide aufweisendem Material und zur Abtrennung von Mischungen aus Nucleotidmultimeren, basierend auf deren relative Länge, bereitgestellt. Demzufolge können eine Vielzahl von Reinigungs- und Assayverfahren, einschließlich qualitative und quantitative Arbeitsschritte, gemaß der Erfindung durchgeführt werden.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Reinigung eines Polynucleotids, welches in einer Lösung vorliegt, die ein Oligonucleotid enthält, das kleiner als das Polynucleotid ist, bereit, folgendes umfassend:
  • (a) Kontaktieren der Lösung mit einem Trägermaterial, welches Trägermaterial eine Vielzahl von Kationen besitzt, welche für die Wechselwirkung mit Anionen auf dem Polynucleotid unter Bedingungen zur Verfügung stehen, unter denen das Polynucleotid an dem Trägermaterial bindet, die aber zur Bindung des Oligonucleotids am Trägermaterial unzureichend sind; wobei das Trägermaterial in der Lage ist, Polynucleotide entsprechend ihrer Ladung oder Länge zu trennen, und folgendes ist:
  • ein magnetisches Amin-Trägermaterial;
  • ein magnetisches Propylamin-Trägermaterial;
  • ein magnetisches quaternäres Ammonium-Trägermaterial;
  • ein magnetisches Poly-D-lysin funktionalisiertes Trägermaterial;
  • ein Poly-D-lysin funktionalisiertes Polyurethan-Trägermaterial;
  • ein Spermin-Latex-Trägermaterial;
  • ein Tris-(2-aminoetyl)amin-Latex-Trägermaterial
  • ein perlenförmiges Tris-(2-aminoetyl)amin-Agarose-Trägermaterial;
  • oder
  • ein Tris-(2-aminoetyl)-Polyurethan-Trägermaterial; und
  • (b) Abtrennen des Oligonucleotids von dem Trägermaterial, wohingegen das Polynucleotid am Trägermaterial festgehalten wird.
  • Die vorliegende Erfindung umfaßt ebenfalls ein Assay zur Detektion eines eine Zielsequenz einhaltenden Polynucleotids in einer Lösung, von der bekannt ist oder angenommen wird, daß sie das Polynucleotid enthält, umfassend:
  • (a) Inkontaktbringen der Lösung mit einer Oligonucleotidsonde für die Zielsequenz, die kleiner als das Polynucleotid ist, unter Hybridisierungsbedingungen zur Bildung eines Hybrids zwischen der Sonde und der Zielsequenz, falls vorhanden;
  • (b) Kontaktieren der Lösung mit einem Trägermaterial mit eine Vielzahl von Kationen, welche für die Wechselwirkung mit Anionen auf dem Polynucleotid unter Bedingungen zur Verfügung stehen, unter denen das Polynucleotid an dem Trägermaterial bindet, die aber zur Bindung des Oligonucleotids am Trägermaterial unzureichend sind; wobei das Trägermaterial in der Lage ist, Polynucleotide entsprechend ihrer Ladung oder Länge zu trennen, und folgendes ist:
  • ein magnetisches Amin-Trägermaterial;
  • ein magnetisches Propylamin-Trägermaterial;
  • ein magnetisches quaternäres Ammonium-Trägermaterial;
  • ein magnetisches Poly-D-lysin funktionalisiertes Trägermaterial;
  • ein Poly-D-lysin funktionalisiertes Polyurethan-Trägermaterial;
  • ein Spermin-Latex-Trägermaterial;
  • ein Tris-(2-aminoetyl)amin-Latex-Trägermaterial
  • ein perlenförmiges Tris-(2-aminoetyl)amin-Agarose-Trägermaterial;
  • oder
  • ein Tris-(2-aminoetyl)-Polyurethan-Trägermaterial; und
  • (c) Detektieren der entweder an dem Trägermaterial gebundenen oder in der Suspension verbliebenen Menge des Polynucleotids oder der Sonde als qualitatives oder quantitatives Maß der Zielsequenz in der Lösung.
  • Das Assay der Erfindung kann ebenfalls angewandt werden, um ein Assay zur Detektion eines eine Zielsequenz enthaltenden Polynucleotids in einer Lösung, von der bekannt ist oder angenommen wird, daß sie das Polynucleotid enthält, bereitzustellen, umfassend:
  • (a) Inkontaktbringen der Lösung mit einem Trägermaterial mit einer Vielzahl von Kationen, welche für die Wechselwirkung mit Anionen auf dem Polynucleotid unter Bedingungen zur Verfügung stehen, unter denen das Polynucleotid an dem Trägermaterial bindet; wobei das Trägermaterial in der Lage ist, Polynucleotide entsprechend ihrer Ladung oder Länge zu trennen, und folgendes ist:
  • ein magnetisches Amin-Trägermaterial;
  • ein magnetisches Propylamin-Trägermaterial;
  • ein magnetisches quaternäres Ammonium-Trägermaterial;
  • ein magnetisches Poly-D-lysin funktionalisiertes Trägermaterial;
  • ein Poly-D-lysin funktionalisiertes Polyurethan-Trägermaterial;
  • ein Spermin-Latex-Trägermaterial;
  • ein Tris-(2-aminoetyl)amin-Latex-Trägermaterial
  • ein perlenförmiges Tris-(2-aminoetyl)amin-Agarose-Trägermaterial;
  • oder
  • ein Tris-(2-aminoetyl)-Polyurethan-Trägermaterial; und
  • (b) Kontaktieren des Trägermaterials und jedwedes daran gebundene Polynucleotid mit einer Lösung, die eine Oligonucleotidsonde, welche kleiner als das Polynucleotid ist, enthält, unter Hybridisierungsbedingungen zur Bildung eines Hybrids zwischen der Sonde und der Zielsequenz, falls vorhanden, wobei die Bedingungen jedoch für die Bindung zwischen der Oligonucleotidsonde und dem Trägermaterial unzureichend sind; und
  • (c) Detektieren der entweder an dem Trägermaterial gebundenen oder in der Suspension verbliebenen Menge des Polynucleotids oder der Sonde als qualitatives oder quantitatives Maß der Zielsequenz in der Lösung.
  • Die Erfindung stellt ebenfalls ein Kit zur Durchführung eines Assays für ein eine Zielsequenz enthaltendes Polynucleotid bereit, umfassend:
  • (a) eine Oligonucleotidsonde, die kleiner als das Polynucleotid für die Zielsequenz ist; und
  • (b) ein Trägermaterial mit einer Vielzahl von Kationen, welche für die Wechselwirkung mit Anionen auf dem Polynucleotid unter Bedingungen zur Verfügung stehen, unter denen das Polynucleotid an dem Trägermaterial bindet, die aber zur Bindung des Oligonucleotids am Trägermaterial unzureichend sind; wobei das Trägermaterial in der Lage ist, Polynucleotide entsprechend ihrer Ladung oder Länge zu trennen, und folgendes ist:
  • ein magnetisches Amin-Trägermaterial;
  • ein magnetisches Propylamin-Trägermaterial;
  • ein magnetisches quaternäres Ammonium-Trägermaterial;
  • ein magnetisches Poly-D-lysin funktionalisiertes Trägermaterial;
  • ein Poly-D-lysin funktionalisiertes Polyurethan-Trägermaterial;
  • ein Spermin-Latex-Trägermaterial;
  • ein Tris-(2-aminoetyl)amin-Latex-Trägermaterial
  • ein perlenförmiges Tris-(2-aminoetyl)amin-Agarose-Trägermaterial;
  • oder
  • ein Tris-(2-aminoetyl)-Polyurethan-Trägermaterial.
    • 5. Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Das wohlbekannte Verfahren der Nucleinsäurehybridisierung nutzt das Vermögen von einzelsträngigen Nucleotidmultimeren, unter geeigneten Bedingungen mit komplementären Strängen kombinieren (hybridisieren) zu können. Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Detektion der Gegenwart eines Polynucleotids, das mit einer Nucleotidsonde ein Hybrid gebildet hat, bereit. Die Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zur Reinigung von Nucleotidmultimeren und Hybriden derselben bereit.
  • Jedes Verfahren zur Reinigung von Nucleotidmultimeren oder zur Hybridisierung von Polynucleotiden in klinischen Proben muß die Schwierigkeiten und Probleme bewältigen, die durch biologische Verunreinigungen, welche sowohl die Abtrennung stören als auch den Abbau von Polynucleotiden fördern können, verursacht werden. Im Falle von ribosomaler RNA ("rRNA") erfordert z. B. die Reinigung die Entfernung von verschiedenen Proteinen von der rRNA, mit denen die rRNA normalerweise komplexiert ist. Zusätzlich müssen verschiedene Nucleasen und andere Enzyme inaktiviert werden, um den Abbau der rRNA zu verhindern.
  • Die Hybridisierung beinhaltet normalerweise ein langes Zielpolynucleotidmolekül, d. h. eine einzelsträngige DNA oder RNA mit etwa 100 oder mehr Nucleotiden (Basen). Um die Gegenwart oder Abwesenheit einer besonderen Basensequenz (Zielsequenz) in der Ziel-DNA oder -RNA zu bestimmen, werden Nucleotidsondenmoleküle chemisch synthetisiert oder aus DNA oder RNA biologischen Ursprungs mittels einer Vielzahl von dem Fachman bekannten Verfahren isoliert. Die Nucleotidsonden sind zu der gewünschten Basensequenz der Zielsequenz bzw. des Zielmoleküls komplementär und sind normalerweise mit einer detektierbaren chemischen Spezies markiert. Allerdings ist das Markieren der Nucleotidsonde nicht absolut notwendig, wenn das Hybrid mit anderen Mitteln detektiert werden kann. Typischerweise sind Sonden Oligonucleotide mit einer Länge von 15-50 Basen, obgleich sie bis zu mehreren hundert Basen lang sein können. Wenn die Ziel-Basensequenz vorhanden ist, bindet die Nucleotidsonde an der Zielsequenz durch Basenpaar-Wechselwirkung. Sofern die Hybridisierung abgeschlossen ist, wird das Hybrid für gewöhnlich von der Lösung, die nicht-hybridisierte Nucleotidsondenmoleküle enthält, abgetrennt. Allerdings kann es in einigen Anwendungen ausreichend sein, lediglich die lösliche und unlöslich Phase z. B. mittels Zentrifugation oder anderer Techniken zu entmischen, wodurch das immobilisierte Hybrid konzentriert wird, ohne daß der Träger von dem Medium, von dem das Polynucleotidhybrid adsorbiert wurde, entfernt wird. Sofern das Hybrid von der nicht-hybridisierten Sonde abgesondert oder abgetrennt wurde, wird das Hybrid durch Standardverfahren detektiert. Direkte Markierungsmethoden schließen Radioisotope, Enzyme, Fluoreszens- und Chemilumineszenzmoleküle ein. Indirekte Markierungen sind ebenfalls bekannt, bei denen eine chemische Spezies, die selbst nicht detektierbar ist, detektiert werden kann, wenn sie an einem anderen Komplex bindet. Ein Beispiel einer indirekten Markierung ist die Detektion von Biotin-Markierungen, bei denen Konjugate zwischen Streptavidin und Enzymen angewandt werden.
  • Bei anderen Mitteln zur Detektion, welche keine markierte Nucleotidsonde erfordern, könnten einzig auf Hybride bezogene Interkalatoren, für das Hybrid spezifische Antikörper, empfindliche gravimetrische Methoden, Änderungen in der Remmission bzw. im Reflexionsfaktor elektromagnetischer Energie oder Methoden, die eine elektronische Detektion ermöglichen könnten, zur Anwendung kommen. Natürlich kann es in gewissen Fällen wünschenswert sein, die nicht-hybridisierte Sonde zu bestimmen, und derartige Arbeitsweisen sind ebenfalls innerhalb des Umfangs der Erfindung.
  • Wenn kationische Trägermaterialien und geeignete Abtrennungslösungen gemäß dem Verfahren der Erfindung verwendet werden, binden die Polynucleotidzielmoleküle an dem Träger, aber ungebundene Nucleotidsonden zeigen keine signifikante Bindung am Träger. Die präzise theoretische Erklärung dieses Phänomens ist nicht gänzlich verstanden, und die Erfinder möchten sich nicht an irgendeine bestimmte Theorie binden, aber sie steht zweifelsohne mit Ladungs-Ladungs-Wechselwirkungen und der Dichte der Kationen auf der Oberfläche des Trägers im Zusammenhang. Eine mögliche Erklärung ist die, daß unter gemäßigten Pufferungsbedingungen vielfach geladene Regionen eines lange Polynucleotids sich in kooperativer Weise dabei unterstützen, an der Oberfläche des kationischen Trägermaterials zu binden. Im Gegensatz dazu, besitzen kürzere Nucleotidsonden nicht die gleiche Multiplizität von Ladungs- Ladungs-Bindungsregionen und könnten somit weniger stark an dem Träger gebunden sein. Dessen ungeachtet, steht die Fähigkeit dieser Träger, lange Polynucleotide gegenüber Oligonucleotiden oder Polynucleotiden selektiv zu binden, außer Frage. Dieses wird in den folgenden Beispielen gezeigt und macht die besondere Eignung des Verfahrens der Erfindung für die Reinigung und Trennung von verschiedenen Polynucleotidmischungen deutlich. Im Gegensatz zu Verfahren des Stands der Technik erlaubt das Verfahren der Erfindung die schnelle Trennung von Nucleotidmultimeren auf der Basis ihrer Lange und Ladung, am beachtenswertesten bei Hybridisierungsverfahren.
  • Es liegt ebenfalls innerhalb des Umfangs der Erfindung, als Sonden zu herkömmlicher DNA oder RNA analoge Moleküle, welche eine geringere negative Ladung in dem Phosphatgerüst besitzen, zu verwenden. Unter solchen analogen Molekülen können die in Miller et al., Biochemistry, 25, 5092, (1986) beschriebenen Methylphosphonate erwähnt werden.
  • Es wurden einige Vorschläge betreffs der Verwendung einer an magnetischen Mikrosphären bzw. -kügelchen gebundenen Nucleotidsonde für die Suche nach einem komplementären Nucleotidstrang in Lösung gemacht. Aber es ist im Fachbereich bekannt, daß die kovalente Bindung von Nucleotidmultimeren direkt am Trägermaterial zu Bedingungen der sterischen Hinderung führen können, welche für eine saubere Wechselwirkung zwischen komplementären Strängen, die für die Hybridisierung notwendig ist, ungünstig sind (siehe Life Technologies, "Immobilization of Nucleic Acids" (Immobilisierung von Nucleinsäuren), WO 851 04674 (24.10.85)). In Abwesenheit einer diesbezüglichen genauen Offenbarung ist das von Whithead beschriebene Verfahren für eine Reingigung und Hybridisierung ungeeignet. Die vorliegende Erfindung umgeht die Notwendigkeit einer kovalenten Bindung, indem man für die Ausführung der Trennung die ionischen Wechselwirkungen als Grundlage nimmt. Deshalb werden in einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung eine polykationische Oberfläche tragende, magnetische Mikrokügelchen verwendet, um die Nucleotidmultimeren und Hybride derselben auf jede beliebige der oben beschriebenen verschiedenartigen Vorgehensweisen aus einer Lösung zu entfernen.
  • Das Verfahren der vorliegenden Erfindung wendet zwei Hauptelemente an. Diese sind die kationischen Trägermaterialien und eine oder mehrere Kontaktlösungen, die zur Erleichterung der Immobilisierungs-, der Trennungs-, der Wasch- und der Elutionsschritte, die in Bezug zu Arbeitsweisen zur Reinigung von Nucleotidmultimeren und zur auf die Bildung von Hybriden mit Nucleotidsonden basierende Durchführung eines Assays für Zielsequenzen in Polynucleotiden stehen, eingesetzt werden. Diese Lösungen werden für die Immobilisierung von Polynucleotiden, die Trennung von immobilisierten Polynucleotidhybriden und Nucleotidsonden, das Waschen von immobilisierten Polynucleotiden (einschließlich Hybriden zwischen Polynucleotiden und Nucleotidsonden) oder das Eluieren von immobilisierten Polynucleotiden (einschließlich Hybriden zwischen Polynucleotiden und Nucleotidsonden) oder das Eluieren eines detektierbaren Elementes, welches mit der Gegenwart des immobilisierten Hybrids zwischen Polynucleotiden und Nucleotidsonden korreliert, eingesetzt.
  • Es besteht ein Wechselspiel zwischen der Zusammensetzung des kationischen Trägermaterials und der Formulierung der Kontaktlösung, so daß die Zusammensetzung der Kontaktlösung teilweise durch die, Zusammensetzung des kationischen Trägermaterials bestimmt wird, und umgekehrt.
  • Ferner besteht ein enges Wechselspiel zwischen vielen der Kontaktlösungen, da die Komponenten einer dieser Lösungen übertragen (carried over) und durch Zugabe von Reagenzien modifiziert werden könnten, um die Zusammensetzung zu erzeugen, die im nächsten Schritt des Verfahrens benötigt wird.
  • Um die Anwendungen dieser Formulierungen klarzustellen, können sie im allgemeinen in drei Anwendungsbereiche eingeteilt werden:
  • I. Reinigung von Polynucleotiden oder Nucleotidmultimeren
  • II. Immobilisierung von Polynucleotiden mit nachfolgender Hybridisierung, um typischerweise auf bestimmte innerhalb des Polynucleotids vorkommende Nucleotidsequenzen zu prüfen.
  • III. Die Abtrennung und Detektion von Hybriden zwischen Polynucleotiden und Nucleotidsonden, die sich in der Lösung vorausgehend gebildet haben.
  • In Abhängigkeit davon welche dieser Arbeitsschritte man ausführen möchte, könnte ein unterschiedlicher Satz an Kontaktlösungen erforderlich sein. Im allgemeinen sind die Schritte und Lösungen, die für jeden dieser Arbeitsschritte brauchbar sind, obgleich nicht in jedem Fall ein oder mehrere Schritte und die Anwendung von einer oder mehrerer Lösungen erforderlich sein könnten, wie folgt:
    • I. Reinigung von Nucleotidmultinieren
  • (1) Immobilisierung des Nucleotidmultimeren, für gewöhnlich ein Polynucleotid, auf dem kationischen Trägermaterial in Gegenwart einer ABTRENNUNGSLÖSUNG.
  • (2) Entfernung von Verunreinigungen unter Anwendung einer WASCH- LÖSUNG und Abtrennung des auf dem kationischen Trägermaterial befindlichen immobilisierten Multimeren und der Lösungsphase.
  • (3) Rückgewinnung des Multimeren von der Oberfläche des kationischen Trägermaterials unter Verwendung einer ELUTIONSLÖSUNG.
    • II. Immobilisierung von Polynucleotiden und anschließende Hybridisierung
  • (1) Immobilisierung des Polynucleotids auf dem kationischen Trägermaterial in Gegenwart einer ABTRENNUNGSLÖSUNG.
  • (2) Entfernung von Verunreinigungen unter Anwendung einer WASCHLÖSUNG (nach Bedarf).
  • (3) Kontaktieren des immobilisierten Polynucleotids mit einer Nucleotidsonde in einer HYBRIDISIERUNGSLÖSUNG, die entwickelt wurde, um die Immobilisierung der nicht-hybridiserten Nucleotidsonde zu minimieren.
  • (4) Entfernung der nicht-hybridisierten Sonde unter Anwendung einer WASCHLÖSUNG, welche die Immobilisierung der nicht-hybridisierten Nucleotidsonde und die Abtrennung des immobilisierten Hybrids auf dem kationischen Trägermaterial und in der Lösung minimiert (nach Bedarf).
  • (5) Rückgewinnung des Hybrids oder eines detektierbaren Elementes, welches mit der Gegenwart des immobilisierten Hybrids korreliert, unter Anwendung einer ELUTIONSLÖSUNG (nach Bedarf).
  • (6) Detektion des Hybrids oder eines mit dem Hybrid assoziierten detektierbaren Elementes, welches mit der Gegenwart des Hybrids korreliert, oder der nicht-hybridisierten Nucleotidsonde.
    • III. Abtrennung und Detektion von in der Lösung gebildeten Hybriden
  • (1) Hybridisierung zwischen einer Nucleotidsonde und einem Polynucleotid, das eine zur Nucleotidsonde komplementäre Basensequenz enthält, in Gegenwart einer Hybridisierungslösung
  • (2) Kontaktieren des Hybridisierungsgemisches mit einem kationischen Trägermaterial und einer ABTRENNUNGSLÖSUNG, um es möglich zu machen, daß jegliche gebildete Hybride das kationische Trägermaterial binden, ohne daß es zu einer signifikanten Immobilisierung der nichthybridisierten Nucleotidsonde kommt.
  • (3) Entfernung der nicht-hybridiserten Sonde unter Anwendung einer WASCHLÖSUNG, welche die Immobilisierung der nicht-hybridisierten Nucleotidsonde minimiert (nach Bedarf).
  • (4) Rückgewinnung des Hybrids oder eines detektierbaren Elementes, welches mit der Gegenwart des immobilisierten Hybrids korreliert, unter Anwendung einer ELUTIONSLÖSUNG (nach Bedarf).
  • (5) Detektion des Hybrids oder eines detektierbaren Elementes, welches mit der Gegenwart des, Hybrids korreliert, oder der nicht-hybridisierten Nucleotidsonde aus Schritt (3).
  • Wie der Fachmann erkennen wird, kann dieses polykationische Trägermaterial in einer Vielfalt von Assay-Ausführungen eingesetzt werden, wobei direkte Bindungs-, Kompetitions- und Sondenverdrängungs-Assays eingeschlossen sind. Außerdem können die Markierungen entweder direkter oder indirekter Art sein. In manchen Ausführungen von Sondenverdrängungs-Assays, könnte die Hybridisierung bedingen, daß die Markierung in der ungebundenen, anstelle der gebundenen Phase erscheint. Die obengenannten Beispiele dienen allein dazu, die eine Eigenschaft des kationischen Trägermaterials zu illustrieren, zwischen Nucleotidmultimeren zu unterscheiden. Die Erfindung ist nicht auf irgendein besonderes Assayverfahren beschränkt.
  • Der Klarheit wegen wird die weitere Beschreibung der Erfindung in Abschnitte, welche die Zusammensetzung des kationischen Trägermaterials und die Formulierung von verschiedenen Kontaktlösungen betreffen, untergliedert. Jedoch wird der Fachmann es richtig einzuschätzen wissen, daß der tatsächlichen Anwendung der Erfindung Schritte wie das Sammeln von Proben und die Probenbehandlung zur Freisetzung der zu reinigenden oder nachzuweisenden Nucleotidmultimere vorangehen. Zum Beispiel sind die Notwendigkeit, eine Lyse der Zellen durchzuführen und die dementsprechenden Verfahren auf dem Fachgebiet wohlbekannt, und eine Erläuterung solcher Verfahren ist für eine vollständige Beschreibung der Erfindung unnötig.
    • KATIONISCHE TRÄGERMATERIALIEN
  • Die Matrix des polykationischen Trägermaterials der Erfindung kann aus einer breiten Palette von anorganischen und organischen Materialien ausgewählt werden, wobei Metalloxide, Gläser, Polyamide, Polyester, Polyolefine, Polysaccharide, Polyglykole und Polyaminosäuren eingeschlossen sind, man aber nicht auf diese beschränkt ist. Die grundsätzliche Anforderung ist, daß die Trägermatrix nicht in unzulässiger Weise entweder Verunreinigungen oder Nucleotidsonden unter den verwendeten Bedingungen adsorbiert.
  • Bevorzugte Träger sind solche mit einem großen Verhältnis von Oberfläche zu Volumen, um die Menge an benötigtem Material zu minimieren. Solche Verhältnisse können durch Verwendung von Teilchen, besonders Teilchen im um-Größenbereich, von hochporösen Materialien,, wie Agarose, oder von Fasern mit kleinem Durchmesser, die entweder einzeln oder innerhalb von Filtergeflechten angeordnet sind, erreicht werden. Die Anwendung von kleinen Teilchen im um-Größenbereich wird bevorzugt.
  • In den folgenden Beispielen, wurde gezeigt, daß die Matrix ein magnetisch ansprechendes Eisenoxid, wie von Whitehead, et al. (U.S.P.N. 4 554 088; Nov. 19, 1985) beschrieben, ein Latex-Mikrokügelchen, eine Sepharose-Perle, oder eine geeignete funktionalisierte Membran umfassen kann, wobei die Erfindung jedoch nicht auf diese Materialien beschränkt ist.
  • Der Träger sollte eine kationisch modifizierte Oberfläche von genügender Ladungsdichte aufweisen, um die Adsorption des gewünschten Polynucleotids unter angemessenen Bedingungen hinsichtlich Salz, Detergenz und Temperatur zu ermöglichen. Die Ladungsdichte muß gegebenenfalls empirisch ermittelt werden, befindet sich aber im allgemeinen im Bereich von 0,01-10 Mikro-Äquivalenten pro Milligramm Trägermaterial.
  • Die Ladungen können durch eine Auswahl von Kationen eingeführt werden, wobei Alkyl- und Arylamine einschließlich der primären Amine, sekundären Amine, tertiären Amine, quarternären Amine, als auch Guanidine und Imine eingeschlossen sind, man aber nicht darauf beschränkt ist.
  • Beispiele solcher Reste beinhalten 3-Aminopropylgruppen, 2-Aminoethyl-3- aminopropylgruppen, Tris(2-aminoethyl)amin, Spermin, Spermidin, Pentamethyl-2- aminoethyl-3-aminopropylgruppen und Polymere mit Aminofunktionen wie Polylysin, Polyarginin, Polyethylenimin und Polyallylamin.
  • Funktionale Reste, die gewöhnlicherweise auf der Oberfläche der Trägermaterialen vorhanden sind, können leicht mit Reagenzien, welche die kationischen Funktionen enthalten, modifiziert werden. Im Fachbereich sind zahlreiche Verfahren zur Einführung funktioneller Gruppen auf die Oberfläche fast jeder Matrix bekannt. Siehe zum Beispiel Porath und Axen (Methods in Enzymology, 44, 19-45 [1976]), und Goldman et al. (in "Biochemical Aspects of Reactions on Solid Supports", hrsg. von G. R. Stark, Academic Press [1971]).
  • Zum Teil wird die Zubereitungsform des kationischen Trägermaterials in Abhängigkeit von seinem Verwendungszweck empirisch bestimmt. Ein typisches Protokoll zur Zubereitung des Trägermaterials folgt, aber andere ähnliche Verfahren können ebenfalls eingesetzt werden. Wenn das kationische Trägermaterial nur für die Reinigung von Nucleotidmultimeren verwendet werden soll, werden Ziel-Multimere auf ihre Fähigkeit hin, das Trägermaterial in Puffern mit weniger als 0,6 M Natriumphosphat, pH = 6,8 zu binden, und auf ihre Fähigkeit hin, mit mehr als 20 mM Natriumphosphat, pH = 6,8 eluierbar zu sein, getestet. Wenn das Polynucleotid bei weniger als 0,6 M Natriumphosphat, pH = 6,8 nicht bindet, wird die Kationendichte erhöht oder die Menge von Kationen an einzelnen Befestigungsstellen erhöht. (Zum Beispiel durch Ersetzen einer 3-Aminopropylgruppe mit einem Tris(2- aminoethyl)amin.) Andererseits wird, wenn das Polynucleotid nicht in Puffern mit mehr als 20 mM Natriumphosphat, pH = 6,8, eluiert werden kann, die Kationendichte verringert oder die Menge von Kationen an einzelnen Befestigungsstellen reduziert.
  • Wenn das Trägermaterial zur Trennung von Polynucleotidhybriden und Nucleotidsonden verwendet werden soll, besteht die zusätzliche Anforderung, daß die Nucleotidsonde unter denjenigen Bedingungen, die das Hybrid festhalten, nicht signifikant gebunden wird. Diese Bedingungen können geprüft werden durch Verfolgen der Bindung von beiden, dem Polynucleotid und der Nucleotidsonde, zwischen 20 mM und 0,6 M Natriumphosphat, pH = 6,8 , und Auswählen einer Pufferkonzentration, die ein maximales Bindungsverhältnis von Polynucleotid zu Nucleotidsonde ergibt. Wenn zufriedenstellende Bindungsverhältnisse nicht erreicht werden können, werden die Oberflächendichte und die Menge der Kationen weiter modifiziert.
  • Es sollte erwähnt werden, daß im allgemeinen für eine gute Abtrennung die Lange des Polynucleotids zur Nucleotidsonde gewöhnlich im Verhältnis von größer als 3 zu 1 stehen sollte, und vorzugsweise bei größer als 5 zu 1 steht. Jedoch kann der Einsatz von DNA und RNA-Analoga, die im Rückgrat-Gerüst der Sonde eine geringere negative Ladung aufweisen, eine Lockerung dieses Kriteriums erlauben. Im Falle mancher Sonden-Verdrängungs- und Kompetitons-Assays aber, muß dem 3-zu-1- - Verhältnis nicht entsprochen werden, und tatsächlich können die Sonden- Konstruktionen länger als das Zielmolekül sein.
    • KONTAKTLÖSUNGEN
  • Neben dem polykationischen Trägermaterial ist die Abtrennungslösung von besonderer Bedeutung und sollte sorgfältig entwickelt werden, um die Immobilisierung zu erleichtern und eine Degradation bzw. einen Abbau der Nucleotidmultimere und ihren Hybriden mit Sonden zu verhindern. Die Kontaktlösungen können verschiedene Puffer enthalten, deren Konzentrationen in Abhängigkeit von der gewünschten Arbeitsweise variieren können. Die Bestandteile der Lösung und ihre Konzentration in der Lösung sind von einer Anzahl von Faktoren abhängig: Die Notwendigkeit, falls gegeben, Nucleasen zu inaktivieren, insbesondere in klinischen Proben; die gewünschte Polynucleotidtrennung; und weitere gewünschte Schritte nach der Trennung. Wenn zum Beispiel ein nachfolgendes enzymatisches Detektionsverfahren eingebunden werden soll, können proteindenaturierende Stoffe oder Inhibitoren als Teil der Abtrennungslösung erforderlich sein, um den durch endogene Enzymaktivität bedingten Hintergrund weitestgehend zu verringern.
  • Die Bestandteile, die von vorhergehenden Schritten enthalten bleiben, müssen ebenfalls berücksichtigt werden. Zum Beispiel werden in den meisten Fällen Abtrennungen durch Entfernen von Polynucleotiden aus biologischem Material oder Hybridisierungsreaktionen durchgeführt. Verschiedene Komponenten und Reagenzien, die eingesetzt werden, um entweder diese Polynucleotide aus biologischen Proben freizusetzen oder verwendet werden, um eine Hybridisierung zu erleichtern (d. h. Hybridisierung mit beschleunigter Rate), werden als Bestandteile der anschließenden Abtrennungslösung enthalten bleiben.
  • Die Kontaktlösungen haben viele Komponenten gemeinsam und in einigen Fällen können ihre Zusammensetzungen identisch sein. Zum Beispiel können die Zusammensetzung der Waschlösung und der Abtrennungslösung ähnlich sein, und zwar hinsichtlich der Inhibition von Nuclease-Aktivität, dem Verhindern der Bindung von Nucleotidsonden, und der Aufhebung von ungünstigen Effekten von Substanzen, die mit der Beschleunigung der Hybridisierungsrate zusammenhängen.
  • Der erste Schritt in der Formulierung der Kontaktlösungen ist abhängig von der gewünschten Verwendung des kationischen Trägermaterials. Der nächste Schritt ist die Zubereitung der Kontaktlösungen. Im allgemeinen werden die Reagenzien für die Zubereitung aus den folgenden Kategorien ausgewählt:
  • ENZYME - Diese werden teilweise eingesetzt, um Nucleasen zu degradieren und zu inhibieren, Protein/Nucleinsäure-Interaktionen zu unterbrechen, und in einigen Fällen, um die Markierung abzuspalten, welche mit den immobilisierten Hybriden assoziiert ist. Sie können Proteasen, Diesterasen, Nucleasen und Peptidasen umfassen.
  • NUCLEASEINHIBITOREN - Diese Mittel werden benutzt, um die Degradierung sowohl von Polynucleotidmolekülen als auch von Nucleotidsonden zu verhindern. Sie umfassen Ribonuclease-Inhibitoren wie Vanadylsulfat, Vanadylriboside und RNAGuardWZ (humaner plazentaler Ribonuclease-Inhibitor, Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ, USA), Desoxyribonuclease-Inhibitoren und Detergenzien wie Natriumdodecylsulfat und Lithiumlaurylsulfat, welche allgemeine proteindenaturierende Stoffe sind.
  • CHELATBILDENDE MITTEL - Diese Substanzen werden verwendet, um verschiedene Metalle in Chelatkomplexe einzubinden bzw. zu chelieren, welche, wenn nicht cheliert, essentiell für die Aktivität verschiedener Enzyme sind. Zum Beispiel benötigen viele Desoxyribonucleasen Ca²&spplus; für ihre Aktivität. Die Chelierung von Metallionen ist ebenfalls wichtig für die Optimierung von Hybridisierungsreaktionen, da Metalle wie Mn²&spplus; die Hybridisierung stören können. Die chelatbildenden Agenzien beinhalten Ethylendiaminotetraessigsäure (EDTA) und Ethylenglycol-bis-(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraesssigsäure (EGTA).
  • DETERGENZIEN - Diese Substanzen werden verwendet, um dabei zu helfen, teilchenförmiges Material in Lösung zu bringen bzw. zu solubilisieren, Nucleasen zu inhibieren und unerwünschte Immobilisierung von Verunreinigungen und Nucleotidsonden an das kationische Trägermaterial bei Anwendung von Abtrennungslösungen und Waschlösungen zu reduzieren. Detergenzien können auch verwendet werden, um Hybridisierungsreaktionen zu beschleunigen Anm. 2/. Unter manchen Umständen kann ein Detergenz eingesetzt werden, um durch Bildung gemischter Micellen nachteilige Wirkungen eines zweiten Detergenz aufzuheben. Die Substanzen in der Kategorie der Detergenzien umfassen Natriumdodecylsulfat, Lithiumlaurylsulfat, N-Lauroylsarcosin, Natriumdiisobutylsulfosuccinat, TritonR X-100, Brij®, Tween®-20 und Tween®-80 Anm. 3/.
  • PUFFERSALZE - Diese Substanzen werden verwendet, um pH- Bereiche aufrecht zu erhalten, welche mit der Stabilität von Nucleotidmultimeren, der Hybridstabilität und der Stabilität der Agenzien, die als Markierung eingesetzt werden, verträglich sind. Diese Substanzen werden ebenfalls gebraucht, um das primäre Gleichgewicht zwischen Immobilisierung der Hybride auf dem kationischen Trägermaterial und Zurückhalten der Nucleotidsonden
  • Anm. 2/ Angemeldetes Patent über ein System mit beschleunigter Rate.
  • Anm. 3/ Triton®, Breij® und Tween® sind eingetragene Warenzeichen von ICI Americas
  • in der Lösung bei der Anwendung von Abtrennungslösungen auszubilden. Zusätzlich werden sie verwendet, um die Stringenz in den Hybridisierungslösungen festzulegen. Die Konzentration verschiedener Salze kann ebenfalls verwendet werden, um die Elution von Hybriden oder einer mit einem Hybrid assoziierten Nucleotidsonde von der Oberfläche des Trägermaterials zu unterstützen. Solche Substanzen können Salze von Kalium, Natrium, Calcium, Guanidin, Chlorid, Fluorid, Sulfat, Phosphat, Acetat, Succinat, Phytinsäure und Tripolyphosphat einschließen.
  • ORGANISCHE LÖSUNGSMITTEL - Diese Lösungen werden verwendet, um dabei zu helfen, verschiedene Substanzen zu emulgieren, die Hybridisierungs-Temperaturen und -Bedingungen zu verändern, verunreinigende Substanzen zu entfernen, und bei der Entfernung von Nucleotidsonden und Hybriden unter Anwendung von Elutionslösungen unterstützend zu wirken. Solche organischen Lösungsmittel können Methanol, Ethanol, Isopropylalkohol, Formamid und Dimethylformamid einschließen.
  • ANDERE ORGANISCHE UND ANORGANISCHE SUBSTAN- ZEN - Andere Substanzen können in verschiedenen Kontaktlösungen verwendet werden, um eine gewünschte Eigenschaft zu vermitteln. Diese schließen organische und anorganische Säuren, wie Essigsäure, Phosphorsäure, Fluorwasserstoff, Schwefelsäure und Salpetersäure ein. Sie schließen ebenfalls anorganische Substanzen ein, welche gebraucht werden könnten, um die Markierung von einer Nucleotidsonde bei Anwendung einer Elutionslösung zu entfernen. Diese können Periodat, Bleiacetat und Mangandioxid einschließen.
  • Die einzelnen Kontaktlösungen, die in den speziellen Fällen verwendet werden können, werden im allgemeinen wie folgt zubereitet:
  • HYBRIDISIERUNGSLÖSUNG - Im allgemeinen mit einem Salzpuffer, Detergenzien, Nucleaseinhibitoren und chelatbildenden Mitteln zubereitet. Die Formulierung ist so beschaffen, daß eine Hybridisierung zwischen einem Polynucleotid und einer Nucleotidsonde erleichtert wird. Darüberhinaus wird, wenn das Polynucleotid vor der Hybridisierung immobilisiert wird, eine solche Formulierung gewählt, daß einer signifikanten Bindung der Nucleotidsonde an das kationische Trägermaterial vorgebeugt wird.
  • ABTRENNUNGSLÖSUNG - Enthält im allgemeinen einen Salzpuffer, Detergenzien und Nucleaseinhibitoren, wobei die Immobilisierung des Hybrids ermöglicht wird, ohne eine signifikante Immobilisierung der Nucleotidsonde zu gestatten.
  • WASCHLÖSUNG - Im allgemeinen mit einem Salzpuffer und Detergenzien zubereitet, wobei das Hybrid immobilisiert bleiben soll, während die Entfernung von Verunreinigungen und nichthybridisierten Nucleotidsonden ermöglicht wird.
  • ELUTIONSLÖSUNG - Enthält im allgemeinen einen Salzpuffer, organische Lösungsmittel, Detergenzien und andere Reagenzien, wobei ein Polynucleotid, ein Polynucleotidhybrid, eine Nucleotidsonde, oder eine Markierung, welche mit einem Hybrid assoziiert ist, von der Oberfläche des Trägermaterials freigesetzt werden soll.
  • DETEKTIONSLÖSUNG - Wird spezifisch dafür zubereitet, das Hybrid oder eine spezifische Markierung zu detektieren. Ihre Zusammensetzung ist abhängig von dem Detektionsmittel und wird gemäß Verfahren des Standes der Technik zubereitet. Zum Beispiel wird die Detektionslösung, wenn die Markierung aus einem Enzym besteht, das gewählte Substrat des Enzyms und andere Reagenzien enthalten.
  • Der Fachmann, der aus der vorangehenden allgemeinen Beschreibung Nutzen zieht, wird in der Lage sein, die Bestandteile von spezifischen Kontaktlösungen an eine breite Palette von Verfahren und Bedingungen, die unter Fachleuten wohlbekannt sind, anzupassen, insbesondere unter Bezugnahme auf die nachfolgenden Beispiele. Die in den nachfolgenden Beispielen verwendeten Materialien umfassen: Magnetische Mikrokügelchen, welche erhalten wurden von Advanced Magnetics, Inc. (Cambridge, MA, USA; Biomag M4100, 50 mg/ml in Wasser); Lysozym der Güteklasse I stammte von Sigma, St. Louis, MO, USA; Harnstoff der "Enzyme-Güterklasse" war von Bethesda Research Labs, Bethesda, MD, USA; RNAGuardWz (humaner plazentaler Ribonucleaseinhibitor) von Pharmacia, Piscataway, NJ, USA; CytoscintWz (flüssiger Szintillationscocktail) von WestChem, San Diego, CA, USA; Polyethylenglycol 8000 von Eastman-Kodak, Rochester, NY, USA; Diisobutylsulfosuccinat (DIBSS), siehe Beispiele 7 und 12, verwendet im Accelerated Rate System von Gene-Probe, Inc. (System mit beschleunigter Rate) (angemeldetes Patent), von Mona, IN, USA; Hydroxyapatit (HAP) und Zwittergent 3-14 waren von Behring-Diagnostics, Calbiochem Division, La Jolla, CA, USA; Natriumdodecylsulfat (SDS) von Sigma, St. Louis, MO, USA wie auch Trizma-Base (Tris); Triton X-100 war von Fisher Diagnostics, Orangeburg, NY, USA; [³H]-rRNA Stammlösung (16s- und 23s- Untereinheiten des E.coli-Ribosoms). Die rRNA der 16s-Untereinheit ist etwa 1500 Basen lang; die 23s-Untereinheit beträgt etwa 3000 Basen. Alle anderen Regenzien besaßen "per Analyse " -Qualität. Alle Phosphatpuffer (PB) bestanden aus dem Natriumsalz, pH 6,8, außer abweichend angegeben. Alle Arbeitsschritte wurden bei Raumtemperatur in 1,5 ml Polypropylen-Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubverschluß durchgeführt, außer abweichend aufgeführt.
    • Beispiel I Die Bindung von rRNA an magnetische Amin-Mikrokügelchen
  • Um die Auswirkungen von verschiedenen Pufferkonzentrationen auf die rRNA- Bindung zu bestimmen, wurden Gemische zur Abtrennung durch Vereinigen von 5 ul magnetischen Amin-Mikrokügelchen, 1 ul (1 ug) [³H]-rRNA und 100 oder 150 ul der nachstehend in Tabelle 1 aufgelisteten Reagenzien hergestellt. Die Reagenzien umfassen jene, welche in einem vollständigen Assayprotokoll verwendet werden würden, und wurden studiert, um ihren Effekt auf die rRNA-Bindung zu bestimmen. Die Gemische wurden 2 Sekunden lang leicht gevortext und 5-10 Minuten lang stehengelassen. Die magnetischen Amin-Mikrokügelchen wurden unter Verwendung eines BioMag-Separators (Advanced Magnetics, Inc. Katalog #M4101) magnetisch an den Boden des Röhrchens pelletiert bzw. absedimentiert, und die Überstände (nicht bindend) wurden entfernt. Die magnetischen Amin-Mikrokügelchen wurden dann (einmal oder zweimal) durch 1-2 Sekunden langes Vortexen in 100 oder 150 ul des Puffers, in dem die Bindung stattgefunden hat, gewaschen, wobei die magnetischen Amin-Mikrokügelchen magnetisch absedimentiert und die Überstände entfernt wurden. Die magnetischen Amin-Mikrokügelchen wurden dann in 100 oder 150 ul des Waschpuffers resuspendiert und zu 15 ml Cytoscint in 20 ml Polypropylenröhrchen zugegeben, ebenso wurde verfahren mit den nicht bindenden Fraktionen und den Waschfraktionen. Die Menge von Tritium in jeder Probe wurde dann unter Anwendung eines Nuclear-Chicago-Szintillationszählers ermittelt.
  • Wie in der nachstehenden Tabelle 1 gezeigt, ist die Entfernung von rRNA durch Adsorption an die magnetischen Amin-Mikrokügelchen anfällig gegen Veränderungen in der Pufferkonzentration, aber wird nicht in unzulässiger Weise von anderen Reagenzien, die in einem vollständigen Assayprotokoll vorhanden sein würden, betroffen. Noch wichtiger ist, daß die Effekte von Reagenzien, die die Bindung vermindern, durch Variation von deren Konzentrationen oder durch Beifügen anderer Reagenzien in die Lösung verändert werden kann.
    • Tabelle 1
  • Reagenziensystem % an die Mikrokügelchen gebundener [³H]-rRNA
  • H&sub2;O 94
  • 50 mM PB 99
  • 100 mM PB 98
  • 140 mM PB 92
  • 200 mM PB 89
  • 300 mM PB 14
  • 1 M NaCl 99
  • 1 M NaCl + 50 mM PB 95
  • Tris, PEG Anm. 4/ 99
  • Saccharose, Lysozym Anm. 5/ 99
  • 8 M Harnstoff 74
  • 4 M Harnstoff 97
  • 1% Triton X-100 100
  • 5% Triton X-100 47
  • 1% Zwittergent 3-14 98
  • 5% Zwittergent 3-14 78
  • 2 M Harnstoff + 1 M LiCl 73
  • 10 mM EDTA in 50 mM PB 86
  • 500 U/ml RNAGuardWz 100
  • 67% HOAc 37
  • Anm. 4/ 0,1 M (pH 7,5), 1M NaCl, 2,5% Polyethyienglycol
  • Anm. 5/ 7% Saccharose, 0,08 M Olycin (pH 9,0 w/ NaOH), 8 mM EDTA, 25 mM DTT, 2 mg/ml Lysozym
    • Tabelle 1 (fortgesetzt)
  • Reagenziensystem % an die Mikrokügelchen gebundener [³H]-rRNA
  • 50% HOAc 75
  • 33% HOAc 79
  • 20% HOAc 99
  • p H 4 NaOAc Anm. 6/ 95
  • 18% DIBSS Anm. 7/ 25
  • 18% DIBSS, 50 mM PB 35
  • 18% DIBSS, 5% Triton X-100, 50 mM PB 90
  • 18% DIBSS, 1% SDS, 5% Triton X-100, 50 mM PB 80
    • Beispiel 2
  • Die Bindung von DNA an magnetische Amin-Mikrokügelchen
  • Diese Untersuchung wurde entwickelt, um die Effekte verschiedener Pufferkonzentrationen und anderer Assay-Reagenzien auf die DNA-Bindung an magnetische Amin-Mikrokügelchen zu bestimmen. Das Verfahren aus Beispiel 1 wurde verwendet, außer daß eine [³H]-cDNA gegen die rRNA aus Mycoplasma pneumonia anstelle von rRNA aus Stocklösungen verwendet wurde. Diese cDNA bestand aus einem Gemisch von cDNAs im Größenbereich von etwa 400 bis 1600 Basen.
  • Wie in Tabelle 2 gezeigt, bindet die cDNA ungefähr so gut wie die rRNA an die magnetischen Amin-Mikrokügelchen, und das Ausmaß der Bindung kann durch Variation in den Pufferkonzentrationen sowie durch Zugeben anderer Reagenzien beeinflußt werden.
    • Tabelle 2
  • Reagenziensystem % an die Mikrokügelchen gebundener [³H]-rDNA
  • H&sub2;O 100
  • 0,05 M PB 100
  • 10,10 M PB 99
  • 0,15 M PB 99
  • 18% DIBSS, 5% Triton X-100, 100 mM PB 0
  • 14,5% DIBSS, 3,75% Triton X-100, 75 mM PB 0
  • 9% DIBSS, 2,5% Triton X-100, 50 mM PB 89
  • 4% DIBSS, 5% Triton X-100, 50 mM PB 100
  • Anm. 6/ HOAc auf pH 4 eingestellt mit w/5N NaOH. Endkonzentration für HOAc = 44%
  • Anm. 7/ Gew./Vol. Diisobutylsulfosuccinat
    • Beispiel 3 Die Elution und Hybridisierung von rRNA von magnetischen Amin-Mikrokügelchen
  • In diesem Experiment wurde t³H]-rRNA von magnetischen Amin-Mikrokügelchen eluiert und hybridisiert. In Ergänzung zu den in Beispiel 1 beschriebenen Materialien, wurde [³²P]-ATP von Amersham Corp., Arlington Hts., IL, USA, und T4- Polynucleotid-Kinase von Bethesda Research Labs, Inc., Gaithersburg, MD, USA, bezogen.
  • Eine Sonde wurde unter Verwendung eines Applied Biosystems, Inc. Modell 380A DNA-Synthesizers synthetisiert. Ein Desoxyoligonucleotid mit der Sequenz "5' - AGGACCGITATAGTTAGGGCCGCCGT - 3'" wurde unter Verwendung von standardmäßiger Phosphoramidit-Chemie hergestellt (Diese Sequenz ist komplementär zu den Basen 1901 - 1926 der 23s-Untereinheit des E.coli-Ribosoms) (Angemeldetes Patent für die Sondensequenz). Das Oligomer wurde dann am 5' -Ende unter Anwendung von [³²P]-ATP und T4-Polynucleotidkinase nach dem Verfahren von Maxam und Gilbert (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 74, 560 (1977)) markiert.
  • Immobilisierung von [³H]-rRNA, Elution und Hybridisierung: [³H]-rRNA wurde mittels der Kombination von 10 ul der magnetischen Amin-Mikrokügelchen (50 mg/ml), 100 ul 0,14 M PB und 3 ul [³H]-rRNA (1 mg/ml) immobilisert. Das Gemisch wurde 1-2 Sekunden lang leicht gevortext und 5-10 Minuten lang stehengelassen. Die magnetischen Amin-Mikrokügelchen wurden magnetisch pelletisiert bzw. absedimentiert, und der Überstand (nicht Gebundenes) wurde entfernt. Die magnetischen Amin-Mikrokügelchen wurden dann einmal mit 100 ul 0, 14 M PB gewaschen und der Überstand wurde entfernt.
  • Um die [³H]-rRNA zu eluieren, wurden 50 ul 0,6 M PB zu den magnetischen Amin- Mikrokügelchen zugegeben, und das Gemisch wurde 1-2 Sekunden lang gevortext. Fünf Mikroliter wurden abgenommen und einer Radioaktivitätsmessung im Zähler unterzogen (siehe Beispiel 1). Der Überrest der Lösung wurde 15 - 30 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die magnetischen Amin-Mikrokügelchen wurden dann magnetisch absedimentiert, und ein 5 ul - Aliquot des Überstands wurde einer Radioaktivitätsmessung im Zähler unterzogen. Ein anderes Aliquot des Überstands wurde abgenommen und in das folgende Hybridisierungsgemisch eingebracht: 25 ul eluierte [³H]-rRNA in 0,6 M PB (1,1 pmol), 0,5 ul [³²P]-DNA- Sonde (0,23 pmol), 1,5 ul 1% SDS und 4 ul H&sub2;O, insgesamt also 31 ul Lösung.
  • Eine Kontroll-Hybridisierung wurde ebenfalls unter Verwendung der gleichen Menge (bezogen auf die Radioaktivität) der [³H]-rRNA-Stammlösung durchgeführt: 1,8 ul Stammlösung von [³H]-rRNA (1,1 pmol), 0,5 ul [³²P]-DNA-Sonde (0,23 pmol), 14,8 ul 1,0 M PB, 1,5 ul 1% SDS und 12,4 ul H&sub2;O, insgesamt also 31 ul Lösung.
  • Die Hybridisierungsgemische wurden dann 3 Stunden lang bei 50ºC inkubiert. Jedes Gemisch wurde zu 5 ml 0, 14 M PB, welcher 2% Hydroxyapatit (HAP) enthielt, in einem 7 ml Szintillationsgefäß aus Polypropylen zugegeben. Nach 15 Sekunden langem Vortexen wurden die Proben 5 Minuten lang bei 50ºC inkubiert. Das HAP wurde dann mittels 2 Minuten langer Zentrifugation in einer klinischen IEC Tischzentrifuge (Needham Hts., MA, USA) bei 2000 x G absedimentiert. Der Überstand wurde abgenommen, 5 ml 0, 14 M PB zugegeben und das Gemisch 15 Sekunden lang gevortext, gefolgt von einer Zentifugation, wie oben beschrieben. Der Überstand wurde abgenommen, und das HAP, die nicht bindende Fraktion und die Waschlösungen wurden hinsichtlich Cerenkov-[³²P]-Aktivität einer Zählung unterzogen, um den Prozentsatz an Hybridisierung, d. h. den Prozentsatz der [³²P]-Counts bzw. -Zähleinheiten, welche mit der an das HAP gebundenen Sonde assoziiert sind, zu bestimmen.
  • Von der an dem Träger gebundenen [³H]-rRNA eluierten 80%. Die Reaktion von entweder der eluierten rRNA oder der rRNA aus der Stammlösung mit der DNA- Sonde ergab 31% Hybridisierung. Die Ergebnisse weisen darauf hin, daß die Reinigung von Polynucleotiden nach dem Verfahren der Erfindung diese nicht für eine weitere Hybridisierung und andere Untersuchungen beschädigt.
    • Beispiel 4 Die Bindung von rRNA in Urin an magnetische Amin-Mikrokügelchen
  • Dieses Experiment wurde vorgenommen, um den Effekt von Urin auf die Bindung von rRNA an magnetische Amin-Mikrokügelchen zu untersuchen. Neben den in Beispiel 3 beschriebenen Materialien wurden frische Urinproben von Freiwilligen erhalten.
  • Zu 100 ul frischem Urin wurden 200 ul 50 mM PB, 8 M Harnstoff oder HOAc, pH 4 (Eisessig wurde mit der Zugabe von 0,28 ml 10 N NaOH pro ml HOAc auf pH 4 gebracht), sowie 1 ul [³H]-rRNA-Stammlösung (1 ug) und 5 ul magnetische Amin- Mikrokügelchen zugegeben. Die Gemische wurden aufbereitet, wie in Beispiel 1 beschrieben, außer daß jede mit 200 ul 50 mM PB gewaschen wurde.
  • Die Ergebnisse zeigten, daß in der Gegenwart von Urin, der Harnstoff, welcher bei biologischen Proben verwendet wird, um Nucleinsäuren freizusetzen und Proteine und Nucleasen zu denaturieren, die Bindung von [³H]-rRNA auf 0,8% vermindert. In Urin plus Phosphatpuffer allein, banden nur 13% der [³H]-rRNA an das Trägermaterial. Nur in Verbindung mit HOAc, pH 4 banden 100% der rRNA an die magnetischen Amin-Mikrokügelchen.
    • Beispiel 5 Die Bindung von in Sputum bzw. Auswurf suspendierter rRNA an die magnetischen Amin-Mikrokügelchen
  • Diese Untersuchung wurde unternommen, um geeignete Kombinationen und Konzentrationen von Puffern und Reagenzien zu bestimmen, die nötig sind, um [³H]rRNA in komplexeren biologischen Proben zu binden. Die bei Beispiel 4 beschriebenen Materialien sowie gesammelte, gefrorene Sputa (jede Sammeleinheit enthielt Sputum von mehreren Patienten) wurden von verschiedenen Hospitälern erhalten.
  • Die Sputumproben wurden zuerst (unmittelbar vor Gebrauch) verflüssigt, und zwar durch Zugeben von 1/10 Volumen an 0,5 M Dithiothreitol (DTT), gefolgt von Vortexen und 10 - 15 Minuten langer Inkubation bei 22ºC. Eine Palette von Reagenzien wurden dann zu Aliquots von 100 ul des verflüssigten Sputums zugegeben, zusammen mit 1 Mikroliter [³H]-rRNA-Stammlösung (1 ug) und 5 ul der magnetischen Amin-Mikrokügelchen. Nach 5 Minuten Inkubation bei 22ºC, wurden die Proben dann bearbeitet wie in Beispiel 1 (mit der Ausnahme, daß jede mit 200 ul 50 mM PB gewaschen wurde), um das Maß der [³H]-rRNA-Bindung zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengefaßt. Tabelle 3 Reagenzien-Systeme zur Entfernung von [³H1-rRNA aus Sputum mit magnetischen Amin-Mikrokügelchen Probenzusammensetzung Endkonzentrationen Harnstoff gebunden an magnetische Amin-Mikrokügelchen 100 Sputum Anm. 8/ Das heißt, teilweise neutra[isierte HOAc.
    • Beispiel 6 Die Hybridisierung von aus Sputum gereinigter rRNA
  • In diesem Experiment, wurde die aus dem Sputum entfernte und an das Trägermaterial gebundene [³H]-rRNA eluiert und untersucht, um zu bestimmen, ob das in der Erfindung angewandte Abtrennungsverfahren die Hybridisierbarkeit unzulässig verringert.
  • Eine Desoxynucleotidsonde mit der Sequenz "5' - GGCCGTTACCCCACCTACTAGCTAAT- 3'" (komplementär zu den Basen 235 - 260 des 16s E.coli-Ribosoms Anm. 101 wurde synthetisiert und mit [³²P] markiert, wie in Beispiel 2 beschrieben.
  • Nach der Bindung von [³H]-rRNA in Sputum an die magnetischen Amin- Mikrokügelchen und Entfernen der nicht-bindenen Fraktion (siehe Beispiel 5) wurden die magnetischen Amin-Mikrokügelchen einmal mit 1M NaCl, 50 mM PB gewaschen. Nach Entfernen des Überstands, wurden 50 ul 0,6 M PB zugegeben und das Gemisch 30 Minuten lang bei 22ºC oder 15 Minuten lang bei 72ºC unter gelegentlichem Rühren inkubiert. Die magnetischen Amin-Mikrokügelchen wurden dann magnetisch absedimentiert und der Prozentsatz an eluierter [³H]-rRNA wurde durch den Vergleich der Radioaktivität eines Aliquots aus dem Überstand mit einem Aliquot von den magnetischen Amin-Mikrokügelchen vor der Inkubation bestimmt (siehe untenstehend).
  • Die Fähigkeit der eluierten [³H]-rRNA, an eine komplementäre DNA-Sonde (siehe Materialien) zu hybridisieren, wurde bestimmt durch den Vergleich der Hybridisierbarkeit von eluierter rRNA mit der rRNA aus der Stammlösung, sowohl unter Überschuß des Zielmoleküls als auch Überschuß der Sonde. Die folgenden Hybridisierungsgemische wurden hergestellt:
  • (1) 30 ul eluierte rRNA in 0,6 M PB (0,44 pmol), 1 ul DNA-Sonde (0,07 pmol), 4 ul 1% SDS und 2,5 ul H&sub2;O, insgesamt 37,5 ul.
  • (2) 0,7 ul Stammlösungs rRNA (0,44 pmol), 29,3 ul 0,6 M PB, 1 ul DNA-Sonde (0,07 pmol), 4 ul 1% SDS und 1,6 ul H&sub2;O, insgesamt 36,6 ul.
  • Anm. 9/ HOAc/ Harnstoff, pH 5, hergestellt durch Mischen von 840 ul pH 4 HOAc (siehe Beispiel 4) mit 320 mg Harnstoff (Endvolumen = 1 ml, [Harnstoff] = 5,33M, 66% teilweise neutralisierte HOAc).
  • Anm. 10/ Patent bezüglich der Sondersequenze angemeldet.
  • (3) 9,35 ul eluierte rRNA in 0,6 M PB (0,14 pmol), 1 ul DNA-Sonde (0,7 pmol) und 1,34 ul 1% SDS, insgesamt 11,69 ul.
  • (4) 0,22 ul rRNA aus der Stammlösung (0,14 pmol), 9,13 ul 0,6 M PB, 1 ul DNA-Sonde (0,7 pmol) und 1,06 ul 1% SDS, insgesamt 11,41 ul.
  • Die Hybridisierungsgemische wurden dann 2 Stunden lang bei 50ºC inkubiert, worauf die Isolation von Hybriden auf HAP wie in Beispiel 2 beschrieben folgte. Bei Überschuß des Ziels zeigte die eluierte rRNA 67% Hybridisierbarkeit im Vergleich zur rRNA aus der Stammlösung. Bei Überschuß der Sonde zeigte die eluierte rRNA 65% Hybridisierbarkeit im Vergleich zur rRNA aus der Stammlösung.
    • Beispiel 7 Gewinnen von RNA/DNA-Hybriden aus Pufferlösungen unter Anwendung von magnetischen Amin-Mikrokügelchen
  • Dieses Experiment wurde entworfen, um die magnetischen Amin-Mikrokügelchen als Träger zur Abtrennung für in Lösung gebildete RNA/DNA-Hybride zu untersuchen. Die Materialien waren die gleichen wie in Beispiel 3 beschrieben. Darüberhinaus wurde eine für Legionella spezifische DNA-Sonde (mittlere Lange 100 Basen) eingesetzt.
  • Die Eignung der magnetischen Amin-Mikrokügelchen zur Abtrennung von RNA/DNA-Hybriden wurde in zwei verschiedenen Systemen untersucht.
  • System 1: Ein RNA/DNA-Hybrid wurde gebildet durch Vereinigen von 8 ul Stammlösungs-[³H]-rRNA (5 pmol), 1 ul Desoxyoligonucleotidsonde (0,5 pmol), 10 ul 0,28 M PB und 1 ul 1% SDS und 1,5 Stunden lange Inkubation dieses Gemisches bei 50ºC. Zusätzlich wurde ein Kontrollgemisch exakt wie das Hybridgemisch hergestellt, mit der Ausnahme, daß die 8 ul Ziel-RNA mit 8 ul Wasser ersetzt wurden. Dieses Kontrollgemisch wurde ebenfalls 1,5 Stunden lang bei 50ºC inkubiert. Die Hälfte von jedem Gemisch (10 ul) wurde zu 5 ml 2%-igem HAP in 0, 14 M PB zugegeben und wie in Beispiel 2 beschrieben weiterbearbeitet. Die andere Hälfte von jedem Gemisch wurde zu 200 ul 0, 14 M PB und 10 ul magnetischen Amin-Mikrokügelchen zugegeben und weiterbearbeitet, wie in Beispiel 1 beschrieben (unter Verwendung von 0,14 M PB zum Waschen).
  • System 2: Ein RNA/DNA-Hybridgemisch wurde zubereitet durch Zusammenfügen von 4 Nil Legionella-rRNA (2,5 fmol), 2 ul Legionella-Sonde (1,3 fmol) und 196 ul, die 44% DIBSS, 30 mM PB und 3% SDS enthielten. Ein Kontrollgemisch wurde exakt wie das Hybridgemisch zubereitet, außer daß die 4 ul Ziel-RNA durch 4 ul Wasser ersetzt wurden. Beide Gemische wurden 2 Stunden lang bei 72ºC inkubiert. Ein Aliquot von 50 ul aus jedem Gemisch wurde zu 5 ml 2%-igem HAP in 0,14 M PB zugegeben und wie in Beispiel 2 weiterbearbeitet, mit der Ausnahme, daß bei 72ºC verfahren wurde und zweimal gewaschen wurde. Ein anderes 50 ul Aliquot aus jedem Gemisch wurde zu einer Abtrennungslösung zugesetzt, so daß die Endbedingungen bei 150 ul Gesamtvolumen lagen, enthaltend 18% DIBSS, 5% Triton X-100, 0,1 M PB und 10 ul der magnetischen Amin-Mikrokügelchen. Die magnetischen Amin-Mikrokügelchen wurden dann wie in Beispiel 1 beschrieben weiterbearbeitet, außer daß bei 72ºC und mit zwei Waschungen verfahren wurde (Waschung 1 mit 18% DIBSS, 5% Triton und 0,1M PB; Waschung 2 mit 5% Triton, 0, 1 M PB). Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4 Verfahren zur Abtrennung % gebunden System 1 Hybrid Kontrolle HAP Magnetische Amin-Mikrokügelchen
  • Dieses Ergebnis zeigt, daß die magnetischen Amin-Mikrokügelchen geeignet sind, um RNA/DNA-Hybride aus Pufferlösungen zurückzugewinnen, während die nichthybridiserte Sonde in der Lösung verbleibt wird.
    • Beispiel 8 Gewinnen von DNA/DNA-Hybriden aus Lösungen unter Anwendung von magnetischen Amin-Mikrokügelchen
  • Dieses Experiment wurde unternommen, um die magnetischen Mikrokügelchen als Träger zur Abtrennung von in Lösung gebildeten DNA/DNA-Hybriden zu untersuchen. In Ergänzung zu den in Beispiel 2 beschriebenen Materialien, wurde eine synthetische Desoxyoligonucleotidsonde von 36 Basen, die komplementär zu einer 36 Basen langen Region der in Beispiel 2 beschriebenen cDNA war, verwendet.
  • Das Oligonucleotid wurde wie in Beispiel 3 beschrieben mit [³²P] markiert. Ein DNA/DNA-Hybridgemisch wurde hergestellt durch Vereinigen von 20 ul Ziel-cDNA (etwa 20 fmol), 1 ul DNA-Sonde (etwa 60 fmol) und 200 ul, enthaltend 44% DIBSS, 30 mM PB und 3% SDS. Ein Kontrollgemisch wurde exakt wie das Hybridgemisch zubereitet, außer daß die 20 ul Zielmolekül durch 20 ul Wasser ersetzt wurden. Beide Gemische wurden 2 Stunden lang bei 60ºC inkubiert. Ein 50 ul Aliquot aus jedem Gemisch wurde entweder zu 450 ul 2%-igem HAP in 0,08 M PB oder zu 450 ul 5% igem Triton, 45 mM PB plus 10 ul der magnetischen Amin- Mikrokügelchen zugegeben. Jedes Abtrennungsgemisch wurde bei Raumtemperatur 5 Minuten lang inkubiert, das HAP oder die Mikrokügelchen wurden wie in den vorhergehenden Beispielen beschrieben absedimentiert, und die Überstände wurden entfernt. Die Pellets bzw. Niederschläge wurden einmal bei Raumtemperatur mit 500 ul 0,08 M PB (HAP) oder mit 5% Triton, 45 mM PB (Mikrokügelchen) wie in den vorhergehenden Beispielen beschrieben gewaschen. Alle Fraktionen wurden dann in 15 ml Cytoscint gelöst und wie bereits beschrieben einer Radioaktivitätszählung unterzogen. Die Ergebnisse in Tabelle 5 lassen sich gut vergleichen mit denen für das System 2 in Beispiel 7, was zeigt, daß die Bindung von Hybriden ladungsabhängig ist und nicht davon betroffen wird, ob das Ziel aus RNA oder DNA besteht. Tabelle 5 Verfahren zur Abtrennung % gebunden Hybrid Kontrolle Netto % Hybridisierung HAP Magnetische Amin-Mikrokügelchen
  • Verfahren zur % gebunden Netto % Abtrennung Hybrid Kontrolle Hybridisierung
  • HAP
  • Magnetische Amin- Mikrokugelchen
    • Beispiel 9 Untersuchung von Elutionspuffern zur Entfernung von markierten Nucleotidsonden, welche mit an magnetischen Amin-Mikrokügelchen gebundenen Nucleinsäurehybriden assoziiert sind
  • Das Potential von verschiedenen Elutionspuffern zur Entfernung von markierten Nucleotidsonden, welche mit an magnetischen Amin-Mikrokügelchen gebundenen DNA/RNA-Hybriden assoziiert sind, wurde mittels der nachfolgenden Verfahren gezeigt.
  • Verfahren 1: Eine mit [¹²&sup5;I] markierte Desoxyoligonucleotid-Sonde (hergestellt nach Standardverfahren) wurde mit einer Ziel-RNA in 0,5 M PB, pH 5 hybridisiert (30 Minuten bei 60ºC, 30 ul Gesamtvolumen). Dann wurden 1 ml 0,25 M PB, pH 5, 0,05% Triton X-100 und 2,5 mg magnetische Amin-Mikrokügelchen zugegeben, gevortext und 5 Minuten lang bei 60ºC inkubiert. Die Kügelchen wurden zweimal mit 0,25 M PB, pH 5, 0,05% Triton X-100 gewaschen. Potentielle Elutionsmittel wurden durch Zugeben von je 100 ul zu Aliquots (5%) der magnetischen Amin- Mikrokügelchen, fünfminütiger Inkubation bei 60ºC, Abnehmen des Überstands von den Kügelchen und Messen der Menge des in jeder Fraktion vorhandenen [¹²&sup5;I] unter Anwendung eines Gamma-Zählers (Iso-Data, Palatine, IL, USA, Modell 20/20DM) getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 zusammengefaßt.
    • Tabelle 6
  • Elutionsmittel eluierter Prozentsatz
  • 0,25 M PB, pH 5, 0,01% SDS, 50% Formamid 95
  • 3M NaOAc, pH 5 95
  • 0,25 M PB, pH 5, 0,01% SDS, 50% DMSO 85
  • 0,1 M NaOAc, pH 5, 1% SDS, 1 M Guanidinium-HCl 70
  • 0,1 M NaOAc, pH 5, 1% SDS, 1 M Natriumpropionat 68
  • 0,1 M NaOAc, pH 5, 0,01% SDS, 1 M Natriumpyrophosphat 65
  • 1 M Natriumcitrat, pH 5 60
  • 0,25 M PB, pH 5, 5%SDS 56
  • 0,1 M NaOAc, pH 5, 1% SDS, 0,1M MgCl&sub2; 40
  • Diese Ergebnisse zeigen, daß eine breite Auswahl von Reagenzien dazu in der Lage ist, markierte Nucleotidsonden aus RNA/DNA-Hybriden, die an Mikrokügelchen gebunden sind, zu entfernen.
  • Verfahren 2: Um zu zeigen, daß andere Elutionsreagenzien zur Entfernung von markierten Nucleotidsonden, welche assoziiert sind mit an magnetischen Amin- Mikrokügelchen gebundenen DNA/RNA-Hybriden, befähigt sind, wurde die folgende Vorgehensweise eingeschlagen, um diese potentiellen Elutionsreagenzien zu testen.
  • Eine mit [³²P] markierte Desoxyoligonucleotid-Sonde (hergestellt wie beschrieben, siehe oben) wurde 30 Minuten lang bei 60ºC mit einer Ziel-rRNA in 0,48 M PB (pH 5)/ 0, 1% SDS (Gesamtvolumen 150 ul) hybridisert. Es wurden dann 1 ml 0, 15 M PB (pH 6,8)1 5,0% Triton X-100 und 2,5 mg der magnetischen Amin- Mikrokügelchen zugegeben, gevortext und 5 Minuten lang bei 60ºC inkubiert. Die Mikrokügelchen wurden dreimal mit 0,3 M PB (pH 6,8) gewaschen. Dann wurden die Elutionsreagenzien durch Zugeben von 300 ul aus der Elutionslösung zu den magnetischen Amin-Mikrokügelchen, 5 Minuten langem Inkubieren bei 60ºC, Abnehmen des Überstandes von den Kügelchen und Messung der in jeder Fraktion vorhandenen Menge [³²P] unter Verwendung eines Szintillationszählers (Delta 300 Scintillation Systems, Searle Analytical, Inc., Des Plaines, IL, USA) getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 zusammengefaßt.
    • Tabelle 7
  • Elutionsmittel eluierter Prozentsatz
  • 0,05 M Phytinsäure, pH 8,0 91
  • 0,05 M Tripolyphosphat, pH 8,0 87
  • 0,3 M PB (pH 6,8), 50% Formamid 86
  • Diese Ergebnisse zeigen, daß Polyphosphate in effektiver Weise Nucleinsäuren von magnetischen Amin-Mikrokügelchen eluieren können.
    • Beispiel 10 Verwendung von magnetischen Amin-Mikrokügelchen als Festphasen- Hybridisierungs-Trägermaterial
  • In diesem Experiment wurde Ziel-rRNA an magnetische Amin-Mikrokügelchen gebunden und dann hybridisiert. Zu 5 ul magnetischen Amin-Mikrokügelchen wurden 100 ul 0, 14 M PB und 2 ul Stammlösungs-[³H]-rRNA (2 ug, 1,26 pmol) zugegeben. Die Materialien waren dieselben wie die in Beispiel 3 beschriebenen. Das Gemisch wurde 10 Minuten lang bei 22ºC inkubiert, die magnetischen Amin-Mikrokügelchen magnetisch pelletiert, und der Überstand entfernt. Zu den magnetischen Amin- Mikrokügelchen wurden 20 ul 0, 14 M PB und 0,5 ul Sonde (0,23 pmol) zugegeben. Als eine Kontrolle wurden Hybride in einer Lösung von 2 ul Stammlösungs-[³H]rRNA, 0,5 ul Sonde, 5 ul 0,28 M PB, 0,5 ul 1% SDS und 2 ul H&sub2;O gebildet. Beide Hybridisierungsgemische wurden dann 3 Stunden lang bei 40ºC inkubiert. Die magnetischen Amin-Mikrokügelchen wurden dreimal mit 100 ul 0, 14 M PB gewaschen, wie in Beispiel 1 beschrieben. Die Ergebnisse zeigen, daß das Ausmaß der Hybridisierung der Sonde im Fall der immobilisierten rRNA 5% betrug, im Vergleich zu 20% bei einer Hybridisierung in Lösung (Kontrolle).
    • Beispiel 11 Verwendung der magnetischen Amin-Mikrokügelchen zur Reinigung von Nucleinsäuren aus Zellysaten
  • Dieses Experiment wurde unternommen, um zu zeigen, daß die obenstehend beschriebenen magnetischen Amin-Mikrokügelchen verwendet werden können, um RNA aus rohen Proben ohne signifikante Verringerung der Hybridisierbarkeit zu reinigen. Das Verfahren zur Reinigung von rRNA wurde unter Verwendung von rRNA aus Legionella pneumophilia untersucht. Die Materialien waren die Gleichen wie die in Beispiel 5 beschriebenen. Zusätzlich wurden eine Legionella-spezifische Sonde und Legionella pneumophilia-Organismen bezogen; San Diego, CA, USA.
  • Die Zellyse und das Freisetzen der rRNA wurden durch Vereinigen von 30 ul Wasser, 5 ul Legionella pneumophilia-Suspension (5 · 10&sup5; Organismen) und 5 ul 24 % SDS, 0,08 M Tris-base, 0.08 M EGTA und 0,08 M EDTA, gefolgt von 30 Minuten langer Inkubation bei 72ºC bewerkstelligt. Ein Viertel der Probe (10 ul) wurde dann direkt auf rRNA untersucht, wobei die folgende Assay-Mischung verwendet wurde: 10 ul Probe + 114 ul 5,94 M PB + 1 ul DNA-Sonde Anm. 11/ + 75 ul Wasser. Das Gemisch wurde 30 Minuten lang bei 72ºC inkubiert und wurde dann auf Bildung von Hybriden untersucht, wobei HAP wie in Beispiel 2 beschrieben eingesetzt wurde, außer daß der HAP-Bindungsschritt bei 72ºC anstatt bei 50ºC durchgeführt wurde. Zu weiteren 10 ul der Probe wurden 30 ul HOAc/Harnstoff (siehe Beispiel 5) zugegeben, die Mischung wurde 5 Sekunden lang gevortext, 5 ul der magnetischen Amin-Mikrokügelchen wurden zugegeben und das Gemisch wurde (etwa 3 Sekunden lang) leicht gevortext. Nach 5 Minuten langem Inkubieren bei 22ºC und anschließendem Waschen mit 150 ul 1M NaCl, 50 mM PB bei 22ºC, wurde die gebundene rRNA mit 50 ul 0,6 M PB eluiert (Details beschrieben in Beispiel 2). Das Eluat wurde dann auf rRNA untersucht mittels Zusammengeben von 50 ul der Probe, 109 ul 5,94 M PB, 1 ul DNA-Sonde und 40 ul Wasser, Inkubation der Mischung für 30 Minuten bei 72ºC und Analysieren der Hybridbildung unter Verwendung von HAP (siehe Beispiel 2). Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 zusammengefaßt.
  • Anm. 11/ Patent für das System mit beschleunigter Rate angemeldet.
    • Tabelle 8
  • % Hybridisierung
  • Direktes Assay 30
  • Mikrokügelchen-Assay 21 mit Reinigung, Elution
    • Beispiel 12 Reinigung von Nucleinsäuren aus Sputum mit den magnetischen Amin- Mikrokügelchen
  • In diesem Experiment wurde die Verwendung von magnetischen Amin- Mikrokügelchen zur Reinigung von Legionella pneumophilia - rRNA aus Sputum und die anschließende Hybridisierbarkeit dieser rRNA gezeigt. Die Materialien waren die Gleichen wie diejenigen in Beispiel 7. Eine gesammelte Sputum-Probe wurde wie in Beispiel 5 beschrieben verflüssigt. Zu 30 ul Aliquots aus dieser Sputum-Probe oder 30 ul Aliquots von Wasser wurden 5 ul einer Legionella pneumophilia-Suspension (2·10&sup6;, 2·10&sup5; oder 2·10&sup4; Zellen pro 5 ul) zugegeben. Unter Verwendung des selben Verfahrens wie in Beispiel 11 beschrieben, wurden die Zellen lysiert. Eine Hälfte von jeder Probe wurde direkt hybridisert (hier wurden 20 ul Probe und 65 ul Wasser verwendet) und eine Hälfte wurde nach Reinigung der rRNA unter Verwendung der magnetischen Amin-Mikrokügeichen hybridisiert (hier wurden 20 ul Probe und 60 ul MOAc/Harnstoff verwendet). Die Hybridbildung wurde unter Verwendung von HAP (siehe Beispiel 2) analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 gezeigt. Tabelle 9 % Hybridisierung Wasser 10&sup6; Organismen Hintergrund (keine Organismen)
    • Beispiel 13 Beschleunigte Hybridisierung Anm. 12/ von rRNA aus Legionella pneumophilla in Lösung mit Abtrennung des Hybrids auf magnetischen Amin-Mikrokügelchen
  • In diesem Experiment wurde die Verwendung von magnetischen Amin- Mikrokügelchen zur Detektion von Legionella pneumophilia- rRNA in Sputum mit beschleunigter Hybridisierung in Lösung gezeigt. Die Materialien waren dieselben wie in Beispiel 11 beschrieben, außer daß inidividuelle Sputa statt vereinigter bzw. gesammelter Sputa verwendet wurden.
  • Zusätzlich erworben wurden 5 ml Röhrchen mit Schraubverschluß von Vanguard (Schweden); Glasperlen (0,2 - 0,3 mm) von Glen Mills, Inc., Maywood, NJ, USA; der Ultraschall Cleaner von Branson Equipment Co., Shelton, CT, USA (Modell 1200); und das "Corning magnetic separator rack" von Advanced Magnetics, Inc. (Katalog Nr. #M4700).
  • Individuelle Sputa wurden wie in Beispiel 5 für vereinigte Sputa beschrieben verflüssigt. Die flüssigen Sputa wurden dann mit Legionella pneumophilia versetzt bzw. bekeimt (siehe Beispiel 10), so daß 0, 1 ml 10&sup4; Organismen enthielten. In 5 ml Röhrchen wurden 100 ul Glasperlen (mit Säure gereinigt), 100 ul Lysepuffer (20% SDS, 10 mM EDTA, 10 mM EGTA, 50 mM Tris, pH 8,0) zugegeben, sowie 0,1 ml des versetzten Sputums oder 0, 1 ml Negativ-Kontrolle (1 mg/ml Kalbsthymus-DNA in 0, 1% SDS), alles in dreifacher Ausführung. Die Proben wurden 15 Minuten lang bei 72ºC mit Ultraschall behandelt bzw. sonifiziert, 2 ml Sondenlösung (44% DIBSS, 50 mM PB, pH 6,8, 10 000 cpm Legionella-spezifische DNA-Sonde pro 2 ml) wurden zugegeben, die Mischung wurde gevortext und dann 1 Stunde lang bei 72&sup0;C inkubiert. Die Hybride wurden dann gemäß einem der folgenden Verfahren isoliert (alles in dreifacher Ausführung):
  • 1. HAP, Zentrifugation - 2 ml Abtrennungslösung (5% HAP in 0,26 M PB, pH 6,8, 0,02% SDS) wurde zu jedem Röhrchen zugegeben, die Röhrchen wurden 5 x invertiert bzw. umgedreht, 5 Minuten lang bei 72ºC inkubiert, 20 x invertiert, dann 2 Minuten lang bei 2000 xg zentifugiert. Der Überstand wurde abdekantiert und verworfen, 4,5 ml Waschlösung (0,14 M PB, pH 6,8, 0,02% SDS) wurden zugegeben, jedes Röhrchen wurde 20 Sekunden lang gevortext, und das HAP wurde pelletiert bzw. abzentrifugiert und der Überstand wie oben beschrieben dekantiert. Jedes Röhrchen wurde dann in einem Berthold Gamma-Zähler auf Radioaktivität gemessen.
  • Anm. 12/ Patent für das System mit beschleunigter Rate angemeldet.
  • 2. Magnetische Amin-Mikrokügelchen, Zentrifugation - 2,75 ml magnetische Abtrennungslösung (9,5% Triton, 0,15 M PB, pH 6,8 , 150 l der magnetischen Amin-Mikrokügelchen pro 2,75 ml Lösung) wurden in jedes Röhrchen zugegeben, und die Röhrchen wurden wie im Verfahren 1 weiter bearbeitet, mit den folgenden Ausnahmen: Die Waschlösung bestand aus 18% DIBSS, 5% Triton, 0,1 M PB; nach dem Zugeben der Waschlösung wurden die Röhrchen invertiert, um die magnetischen Amin-Mikrokügelchen wieder zu vermischen.
  • 3. Magnetische Amin-Mikrokügelchen, magnetische Abtrennung - Dieses Verfahren ist exakt wie Verfahren 2, außer daß die Zentrifugation durch eine magnetische Abtrennung unter Verwendung des "Corning magnetic separator rack" ersetzt wird. Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 gezeigt. Tabelle 10 Verfahren % gebundene cpm Kontrolle Hybrid Hybrid:Kontrolle
  • Verfahren 1 = HAP, Zentrifugation. Verfahren 2 = magnetische Amin- Mikrokügelchen, Zentrifugation. Verfahren 3 = magnetische Amin-Mikrokügelchen, magnetische Abtrennung. Die Kontrollwerte stellen den Mittelwert aus 4 getrennten Bestimmungen, jede in dreifacher Ausfertigung durchgeführt, dar. Die Hybridwerte stellen den Mittelwert aus 30 getrennten Messungen (30 individuelle Sputa) dar, wobei jede dreifach ausgeführt wurde.
    • Beispiel 14 Verwendung von magnetischen Propylamin-Mikrokügelchen zur Abtrennung von rRNA
  • Um zu zeigen, daß das Verfahren der Erfindung nicht auf die Eigenschaften von einem einzigen Typ von magnetischen kationischen Mikrokügelchen als Trägeroberfläche beschränkt ist, sondern andere Kationen beinhaltet, wurde [³H]rRNA aus definierten Puffern mit magnetischen Propylamin-Mikrokügelchen entfernt. Die Materialien waren die gleichen wie die in Beispiel 1 beschriebenen, außer daß als Mikrokügelchen magnetische N-3-Aminopropylsilan-Mikrokügelchen (Advanced Magnetics, Inc., Spezialanfertigung) verwendet wurden.
  • Das hier verwendete Verfahren zur Entfernung von [³H]-rRNA war exakt das selbe wie das in Beispiel 1 verwendete, außer das magnetische Propylamin-Mikrokügelchen anstelle der magnetischen Amin-Mikrokügelchen verwendet wurden. In 140 mM PB banden 93% der rRNA an die Mikrokügelchen. In einer Lösung von 100 mM PB + 1 M NaCl wurden 83% gebunden.
    • Beispiel 15 Verwendung von magnetischen Mikrokügelchen mit quarternärem Ammonium zur Abtrennung von rRNA
  • Magnetische Mikrokügelchen mit quarternärem Ammonium wurden synthetisiert, um das Verfahren der Erfindung mit anderen polykationischen Trägermaterialien weiter zu untersuchen. Magnetische Amin-Mikrokügelchen (BioMag M4100) wurden von Advanced Magnetics, Inc. erworben. Iodomethan stammte von Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI, USA, und 2,6-Lutidin stammte von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA. Andere Materialien waren von "per Analyse"-Qualität.
  • Magnetische Amin-Mikrokügelchen (250 mg, 5,0 ml) wurden in 10 ml Wasser verdünnt. Die Mikrokügelchen wurden magnetisch abgetrennt und durch Suspendieren in 20 ml 50% (v/v) Ethanol/Wasser gewaschen, gefolgt von der magnetischen Abtrennung. Dieser Waschvorgang wurde zweimal mit absolutem Ethanol wiederholt. Die gewaschenen Mikrokügelchen wurden dann in 20 ml absolutem Ethanol resuspendiert. Iodomethan (250 ul, 4 mmol) und 2,6-Lutidin (24,5 ul, 210 umol) wurden unter Rühren zugegeben; Das Rühren wurde über Nacht bei Raumtemperatur fortgesetzt. Die Mikrokügelchen wurden dann magnetisch abgenommen, 4mal mit 20 ml Wasser wie oben beschrieben gewaschen und in 5 ml Wasser zur Lagerung bei 4ºC resuspendiert.
  • Die magnetischen quarternären Amin-Mikrokügelchen wurden denn verwendet, um [³H]-rRNA und [³²P]-Desoxyoligonucleotide aus definierten Puffern zu entfernen, wobei die Eignung des Trägermaterials, zwischen RNA-Polynucleotiden und DNA- Oligonucleotiden in Lösung zu unterscheiden, untersucht werden sollte. Das Desoxyoligonucleotid war das in Beispiel 8 beschriebene 36-mer. Alle anderen Materialien waren dieselben wie in Beispiel 1 beschrieben.
  • Die Bindung wurde unter Verwendung des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens bestimmt, und die Ergebnisse sind in Tabelle 11 gezeigt. Tabelle 11 Reagenziensystem % gebundene [³H]-rRNA % gebundene [³²P]-DNA
    • Beispiel 16 Verwendung von magnetischen mit Poly-D-lysin funktionalisierten Mikrokügelchen zur Abtrennung von rRNA
  • In Ergänzung zu den oben in Beispiel 14 und 15 beschriebenen kationischen Derivaten, wurden die magnetischen Mikrokügelchen mit Poly-D-lysin derivatisiert.
  • Materialien: Magnetische Mikrokügelchen mit terminalen Carboxylresten wurden von Advanced Magnetics, Inc. (Biomag M4125, etwa 250 Äquivalent-Einheiten (uequiv.) von Carboxylgruppen pro Gramm enthaltend) bezogen. Poly-D-lysin, mit durchschnittlichem Polymerisationsgrad von 68 monomeren Einheiten, stammte von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA. N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) von Pierce Chemical Co., Rockford, IL, USA; und N-Hydroxysuccinimid (NHS) war von Eastman-Kodak Co., Rochester, NY, USA.
  • Zehn Milliliter einer 20 mg/ml Suspension von magnetischen Mikrokügelchen mit terminalen Carboxylresten wurden in ein gläsernes, mit Teflon beschichtetes Reagenzglas mit Schraubverschluß überführt. Die Mikrokügelchen wurden magnetisch abgetrennt und nacheinander mit 0,1 N NaOH (10 ml), 0,1 M EDTA (10 ml, pH 7), Wasser (2 · 10 ml), 50% Dioxan/Wasser (10 ml) und trockenem Dioxan (3 · 10 ml) gewaschen. Die Mikrokügelchen wurden dann in trockenem, NHS (250 mg) enthaltendem Dioxan (10 ml) resuspendiert. Als nächstes wurde DCC (400 mg) zugegeben. Das Reagenzglas wurde mit Folie abgedeckt, um Licht fernzuhalten, und die Suspension wurde durch Rotation mit vertikaler Rotationstonne 15 Stunden lang
  • Anm. 13/ BB = Natriumboratpuffer
  • gemischt. Nach einer magnetischen Abtrennung wurden die mit NHS modifizierten Mikrokügelchen nacheinander mit Dioxan (3 · 10 ml), Methanol (3 · 10 ml) und trockenem Dioxan (3 · 10 ml) gewaschen und in trockenem Dioxan (10 ml) resuspendiert. Ein Milliliter der resultierenden Suspension von mit NHS modifizierten Mikrokügelchen wurde magnetisch abgetrennt, mit verdünnter, wäßriger HCl (pH 4,3) gewaschen und in 0,5 ml einer Lösung von 0,2 M NaHCO&sub3; / 0,4 M NaCl / 0,05% NaN&sub3;, enthaltend Poly-D-lysin (7 mg), resuspendiert. Nach 2 Stunden wurde ein Aliquot einer Lösung von 1 M Ethanolamin/HCl (pH 8,4, 100 ul) zugegeben, um nicht abreagierte NHS-Estergruppen abzudecken. Die Mikrokügelchen wurden magnetisch abgetrennt, mit Wasser (2 · 1 ml) gewaschen und in Wasser (0,5 ml) resuspendiert.
  • Es wurde wie nachfolgend geschildert nachgewiesen, daß die mit Poly-D-lysin- Funktionen ausgestatteten magnetischen Mikrokügelchen bei der Bindung eine Unterscheidung zwischen rRNA und einem synthetischen Oligonucleotid (26-mer) vornehmen, und zwar wie folgt:
  • Es wurden eine mit [³H] markierte rRNA aus E.coli und ein mit [³²P] endmarkiertes synthetisches Oligonucleotid erhalten.
  • Zu einem 1,5 ml Polypropylenröhrchen mit Schraubverschluß wurden die mit Poly-D- lysin-Funktionen ausgestatteten Mikrokügelchen (5 ul), ein Puffer (0,1 M Natriumphosphat, pH 6,8 / 0,75 M NaCl, 0,5 ml) und ein Aliquot entweder aus einer Lösung von [³H]-rRNA oder aus einer Lösung des [³²P]-Oligonucleotids zugegeben.
  • Die resultierenden Suspensionen wurden durch wiederholtes Vortexen über eine Dauer von 10 Minuten gemischt. Die Überstände wurden mittels magnetischer Abtrennung entfernt und in Gefäße überführt, welche Szintillationsflüssigkeit enthielten (5 ml, BetagelWz-Cocktail) Die Radioaktivität wurde dann durch eine Szintillationszählung quantifiziert:
  • An die Mikrokügelchen gebundenes [³²P]-Oligonucleotid: 0 - 3%
  • An die Mikrokügelchen gebundene [³H]-rRNA : 78 - 82%
    • Beispiel 17 Verwendung von magnetischen Amin-Mikrokügelchen in einem nicht-radioaktiven Chemolumineszenz-Assay
  • Um die Eignung von magnetischen Amin-Mikrokügelchen zum Gebrauch als Abtrennungs-Trägermaterial in einem nicht-radioaktiven Assay-System zu zeigen, wurde die Abtrennung von Hybriden, die unter Verwendung einer synthetischen Desoxyoligonucleotid-Sonde, welche mit einem chemolumineszenten Acridiniumester markiert worden war, gebildet wurden, untersucht. Neben den in Beispiel 1 aufgezählten Materialien wurde eine für Chlamydia trachomatis - rRNA spezifische Desoxyoligonucleotid-Sonde (33-mer) synthetisiert und mit einem chemolumineszenten Acridiniumester (AE) markiert, wie beschrieben in der U.S. Patentanmeldung Ser. Nr. 105 080 mit dem Titel "Acridinium Ester Labeling and Purification of Nucleotide Probes", (Acridiniumestermarkierung und Reinigung von Nucleotidsonden) eingereicht am 2. Oktober 1987 durch Arnold et al., eine Chlamydia trachomatis-rRNA wurde verwendet, und als Assay-Röhrchen dienten 12 · 75 mm Polystyrol-Röhrchen. Alle anderen Komponenten waren von analysenreiner Qualität.
  • Die mit AE markierte Sonde wurde nach dem folgenden Verfahren an ihre Ziel-RNA (in diesem Fall aus Oilamydia trachomatis) hybridisiert:
  • Hybridisierungsgemisch:
  • 200 ul Hybridisierungspuffer (0,1 M Lithiumsuccinat, pH 5,2 10% Lithiumdodecylsulfat, 2 mM EDTA und 2 mM EGTA)
  • 1 ul RNA (10-- ug)
  • 1 ul AE-Sonde (0,125 pmol)
  • Die Kontrollmischung war gleich mit der Hybridisierungsmischung, außer daß sie Wasser anstelle von RNA enthielt. Die Mischungen wurden 30 Minuten lang bei 60ºC inkubiert, 2 ml der Abtrennungslösung, welche 0,4 M PB, pH 6,0, 5% (v/v) Triton X-100, 8% (w/v) DIBSS und 2,5 mg der magnetischen Amin-Mikrokügelchen (BioMag M4100) enthielt, wurden zugegeben, die Mischungen wurden gevortext und weitere 5 Minuten lang bei 60ºC inkubiert. Die magnetischen Amin-Mikrokügelchen wurden dann magnetisch an den Rand des Röhrchens gezogen, der Überstand wurde abdekantiert und die magnetischen Amin-Mikrokügelchen wurden dreimal mit 2 ml auf 60ºC vorgewärmtem 0,4 M PB, pH 6,0, gewaschen (Zugeben des Waschpuffers, Vortexen, Magnetische Abtrennung, Dekantieren). Die gebundene Sonde wurde dann von den magnetischen Amin-Mikrokügelchen durch Zugabe von 300 ul 0,2 M PB, pH 6,0, 50% Formamid enthaltendem Elutionspuffer eluiert, wobei gevortext und 5 Minuten lang bei 60ºC inkubiert wurde. Die magnetischen Amin-Mikrokügelchen wurden magnetisch an den Gefäßrand gezogen und die Lösung wurde in ein neues Assay-Gefäß überführt. Die Chemolumineszenz jeder Probe wurde dann in einem Berthold Clinilumat Modell LB9502 (Wildbad, BRD) durch automatische Injektion von 200 ul 0,25 N HNO&sub3;, 0,1% H&sub2;O&sub2;, gefolgt von 200 ul 1 N NaOH nach einer Verzögerung von einer Sekunde und Erfassen der Chemolumineszenz über 5 Sekunden, gemessen (Die Ergebnisse sind in "relativen Licht-Einheiten (bzw.-Units)" oder rlu angegeben).
  • ERGEBNISSE:
  • Kontrolle - 160 rlu
  • 10&supmin;³ ug rRNA - 3929 rlu
  • Diese Ergebnisse zeigten, daß die magnetischen Amin-Mikrokügelchen die hybridisierte von der nicht-hybridisierten Sonde in einem Assay-System, in dem eine nicht-radioaktive Markierung verwendet wird, deutlich abtrennen können. Wir sehen hierbei einen sehr geringen Hintergrundwert (weniger als 0,01% der Eingangs-rlu) und, selbst bei sehr geringer Konzentration (10&supmin;³ ug) der Ziel-RNA, ein sehr deutliches Signal.
    • Beispiel 18 Verwendung von magnetischen Amin-Mikrokügelchen in einem nicht-radioaktiven Chemolumineszenz-Assay mit klinischen Proben
  • Um die Eignung der magnetischen Amin-Mikrokügelchen zur Verwendung als Abtrennungs-Trägermaterial für ein nicht-radioaktives Assay-System bei Gegenwart einer klinischen Probe zu zeigen, wurde die in Beispiel 17 beschriebene AE-Sonde verwendet, um eine Verdünnungsreihe von Ziel-rRNA in klinischen Medien zu detektieren. Neben den in Beispiel 17 aufgeführten Materialien wurde Abstrichmaterial aus dem Rachenraum von Freiwilligen erhalten und in 3% Lithiumdodecylsulfat, 30 mM PB (pH 6,8), 1 mM EDTA und EGTA gebracht (Im folgenden wird dies einfach als "Kehl-Abstrich" bezeichnet). Die AE-Sonde wurde nach dem folgenden Verfahren in dem Kehl-Abstrichmaterial gegen sinkende Mengen ihrer ZielrRNA (in diesem Falle Chlamydia trachomatis) hybridisiert:
  • 50 ul Kehl-Abstrich
  • 6 ul 4,8 M PB (pH 4,7)
  • 2 ul AE-Sonde (1 pmol)
  • 2 ul RNA (3 · 10&supmin;³, 3 · 10&supmin;², 3 · 10&supmin;¹ ug)
  • Der Kontrollansatz war der gleiche wie die Hybridisierungsmischung, außer daß er Wasser anstelle von RNA enthielt. Die Ansätze wurden 60 Minuten lang bei 60ºC inkubiert und ein Drittel von jedem wurde dann abgetrennt, gewaschen und eluiert, wie in Beispiel 17 beschrieben.
  • ERGEBNISSE:
  • Kontrolle - 4049 rlu
  • 10&supmin;³ ug rRNA - 9500 rlu
  • 10&supmin;² ug rRNA - 61000 rlu
  • 10&supmin;¹ ug rRNA - 657000 rlu
  • Diese Ergebnisse zeigen, daß die magnetischen Amin-Mikrokügelchen die hybridisierte von der nicht-hybridisierten Sonde unter der Gegenwart einer klinischen Probe in einem Assay-System, das eine nicht-radioaktive Markierung einsetzt, deutlich abtrennen können. Der Kontrollwert hier ist höher als in Beispiel 17, zumindestens teilweise, aufgrund einer größeren Menge an eingesetzter Sonde in dieser Probe.
    • Beispiel 19 Synthese von zusätzlichen Polykationischen Trägermaterialien
  • Die nachfolgenden Träger wurden synthetisiert, um die Verwendung von kationischen Trägern für die Trennung von Hybriden weiter zu zeigen.
    • (a) Spermin-Latexmikrokügelchen
  • In diesem Beispiel wurde Spermin-Latex gewählt, weil dies ein Polyamin ist, dessen Kationen räumlich so angeordnet, sind, daß sie mit den Anionen eines Polynucleotids korrespondieren. Die Latex-Amin-Mikrokügelchen (2,5% Festphase, 1 um durchschnittlicher Durchmesser, 0,125 mÄquiv./g) wurden von Polysciences, Inc., Warrington, PA, USA erworben. 1,4-Butandiol-diglycidylether und Spermin waren von Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI, USA. Eine Millititer -96- Filtrationseinheit und 0,22 u DuraporeR-Filter wurden von der Millipore Filter Corporation, Bedford, MA, USA gestiftet. Alle anderen Materialien waren von p.A.-Qualität.
  • Die Mikrokügelchen wurden zuerst mit 1,4-Butandiol-diglycidylether aktiviert: 25 mg (1 ml) Latex-Amin-Mikrokügelchen wurden auf einem 0,22 u DuraporeR-Filter abfiltriert. Die Mikrokügelchen wurden dann in 150 ul 0,6 N NaOH, enthaltend 2 mg/ml NaBH&sub4;, resuspendiert, und die Aufschlämmung wurde in ein Reagenzglas aus Glas überführt, in das langsam unter Schwenken 1,4-Butandiol-diglycidylether (150 ul) zugegeben wurden. Die Mischung wurde alle 10 Minuten über eine Dauer von 1 Stunde kurz gevortext, gefolgt von der Zugabe von 1 ml Wasser. Die Mikrokügelchen wurden dann wie oben beschrieben abfiltriert und mit Wasser gewaschen (2 ml).
  • Die aktivierten Mikrokügelchen wurden dann mit dem Spermin zum Reagieren gebracht. Die mit Epoxid modifizierten Mikrokügelchen aus der obenstehenden Reaktion wurden in 1 ml 0, 1M Na&sub2;CO&sub3;, pH = 11,6, suspendiert, und es wurden 75 ul Spermin (angewärmt auf 50ºC) unter Mischen zugegeben. Nach 12-stündigem Reagieren bei Raumtemperatur, wurden die Mikrokügelchen abfiltriert, mit Wasser (2 ml) gewaschen, und in Wasser (800 ul) resuspendiert.
    • (b) Synthese von Tris-(2-aminoethvl)-amin-Latexmikrokügelchen ("Tris-Latex")
  • Tris-(2-aminoethyl)-amin wurde von Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI, USA bezogen. Diese Verbindung wurde gewählt, weil ihre Kationen in etwa im selben Abstand voneinander angeordnet sind wie die Anionen eines Polynucleotids.
  • Tris-(2-aminoethyl)-amin (50 ul) wurde nach dem in Teil (a) dieses Beispiels beschriebenen Verfahren, siehe oben, zu den aktivierten Mikrokügelchen zugegeben.
    • (c) Synthese von Tris-(2-aminoethvl)-amin-Sepharose 4B ("Tris-Sepharose")
  • Tresyl-aktivierte Sepharose 4B wurde von Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Schweden, bezogen. Gefriergetrocknete tresyl-aktivierte Sepharose 4B (1 g) wurde auf einem 0,22 u DuraporeR-Filter (Millipore Corp., Bedford, MA, USA) mit 1 mM HCl (200 ml) über eine Dauer von 45 Minuten gewaschen. Das Gel wurde dann in ein 15 ml-Polypropylenröhrchen mit Schraubverschluß überführt, welches, 5 ml 0, 1 M NaHCO&sub3; (pH 8)/ 0,5 M NaCl und 200 ul Tris-(2-aminoethyl)-amin enthielt. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur über eine Dauer von 2 Stunden durch langsame Rotation in einer vertikalen Rotationstrommel gemischt. Das Gel wurde durch Filtration wiedergewonnen und mit 10 ml 0,1 M NaHCO&sub3; (pH 8)/0,5 M NaCl, gefolgt von 50 ml 0, 1 M Tris (pH 8) gewaschen. Das abgewandelte Gel wurde dann in ein 15 ml-Röhrchen mit Schraubverschluß überführt und in 10 ml 0,1 M Tris (pH 8) über eine Dauer von 4 Stunden mittels Rotation in einer vertikalen Rotationstrommel weiter gewaschen. Das Gel wurde abfiltriert und mit 10 ml 0, 1M Natriumacetat (pH 4) / 0,5 M NaCl, gefolgt von 10 ml 0,1 M Tris (pH 8)1 0,5 M NaCl, gewaschen. Dieser Waschzyklus wurde zweimal wiederholt. Das Gel wurde dann zur Lagerung bei 4ºC in 5 ml 0,1 M Tris (pH 8)1 0,5 M NaCl / 0,02% Natriumazid suspendiert.
    • (d) Synthese von Tris-(2-aminoethyl)-amin-Acryl-Mikrokügelchen ("Tris-Acryl- Mikrokügelchen")
  • Materialien: Tosyl-aktivierte Acryl-Mikrokügelchen wurden erworben von Kirkegaard & Perry Labs, Inc., Gaithersburg, MD, USA (durchschnittliche Teilchengröße 3 um).
  • Ein Milliliter der aktivierten Mikrokügelchen (10%-ige Suspension) wurde in ein 1,5- ml-Polypropylenröhrchen mit Schraubverschluß überführt. Die Mikrokügelchen wurden durch 5 Minuten lange Zentrifugation bei 10 000 Upm in einer Tomy-Seiko Mikrozentrifuge (Modell MR-15A, Tokyo, Japan) abgetrennt; der Überstand wurde entfernt. Als nächstes wurden 0, 1 M NaHCO&sub3; (0,9 ml) und Tris-(2-aminoethyl)-amin (0, 1 ml) zugegeben, und die Mikrokügelchen wurden durch Vortexen resuspendiert. Der Inhalt des Röhrchens wurde 16 Stunden lang durch Rotation in einer vertikalen Rotationstrommel vermischt. Die Amin-modifizierten Mikrokügelchen wurden durch Zentrifugation entfernt, mit Wasser (5 · 1 ml) gewaschen und in 20 mM mit Natriumphosphat gepufferter, 0,02% NaN&sub3; enthaltender Kochsalzlösung (1 ml) resuspendiert.
    • =(e) Funktionalisierung einer hydrophilen Membran auf Polyurethanbasis mit Tris-(2-aminoethyl)-amin und mit Poly-D-lysin ("Tris-Polyurethan- Membran" und "Poly-D-lysin-Polvurethan-Membran")
  • Eine HPI Affinitäts-Membran (auf Basis von hydrophilem Polyurethan) wurde von Amicon Corp., Danvers, MA, USA, erworben. Die ungefähre Porengröße und Dicke dieser Membran wurden als 1,2 Micron (um) bzw. zwölf Tausendstel Inch angegeben. 2-Fluor-1-methylpyridiniumphosphat (FMP) wurde von Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI, USA bezogen; Poly-D-lysin (durchschnittlich 68 Monomere pro Molekül) war von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA.
  • Die verfügbaren Hydroxylgruppen auf der Membran wurden mittels einer Abwandlung eines von T.T. Ngo, Biotechnology, 4, 134 [1986], beschriebenen Verfahrens mit FMP aktiviert. Quadrate von 1 · 1 cm aus der Membran wurden in ein 15 ml- Flachbodengefäß mit Schraubverschluß überführt und zweimal mit trockenem Acetonitril (5 ml) gewaschen. Die Quadrate wurden dann in trockenem Acetonitril (4 ml) suspendiert, welches redestilliertes Triethylamin (80 ul) enthielt; und eine Lösung von FMP (200 mg) in trockenem, Triethylamin (100 ul) enthaltendem, Acetonitril (10 ml) wurde unter Rühren tropfenweise zugegeben. Der Inhalt des Gefäßes wurde dann auf einer rotierenden Plattform eine Stunde lang geschwenkt, wonach die Lösung entfernt wurde und die Membranstücke aufeinanderfolgend mit Acetonitril (2 · 5 ml), Aceton (5 ml), 50 : 50 Aceton/wäßrige 5 mM HCl (5 ml) und wäßriger 5 mM HCl (5 ml) gewaschen wurden. Die FMP-aktivierten Membranquadrate wurden dann auf zwei Glasgefäße aufgeteilt und mit 5 ml 0,5 M NaHCO&sub3;, welches entweder Tris-(2-aminoethyl)-amin (100 ul) oder Poly-D-lysin (50 mg) enthielt, behandelt. Der Inhalt jedes Gefäßes wurde auf einer rotierenden Plattform 15 Stunden lang gemischt. Schließlich wurden die mit Amin abgewandelten Membranstücke aufeinanderfolgend mit 1 M NaCl (3 · 5 ml), 0,1 M Natriumphosphatpuffer pH 7 (3 · 5 ml) und Wasser (3 · 5 ml) gewaschen, und wurden dann auf einen Bogen 3MM-Papier (Whatman Ltd., Maidstone, England) zum Trocknen aufgelegt und bei Raumtemperatur trocken gelagert.
    • Beispiel 20 Abtrennung von Nucleinsäuren mit Spermin-Latexmikrokügelchen
  • Spermin-Latexmikrokügelchen wurden wie in Beispiel 19 beschrieben hergestellt. Die Stammlösung von [³H]-rRNA war aus E.coli, wie obenstehend beschrieben. [y ³²P]- ATP war von New England Nuclear Research Products, Inc., Boston, MA, USA; und T4-Polynucleotidkinase war von Bethesda Research Labs, Inc., Gaithersburg, MD, USA. BetagelWz (flüssiger Szintillationscocktail) stammte von West Chem, San Diego, CA.
  • Synthese und Markierung der Sonde: Ein Desoxynucleotid mit der Sequenz "5' -GGCCGTTACCCCACCTACTAGCTAAT-3'" wurde unter Verwendung eines Applied Biosystems, Inc., Modell 380A DNA-Synthesizers (Foster City, CA, USA) bei Anwendung von standardmäßiger Phosphoramidit-Chemie hergestellt Anm. 141 (Diese Sequenz ist komplementär zu den Basen 235-260 der 23s-Untereinheit des E. coli -Ribosoms). Dieses Oligomer wurde am 5'-Ende unter Verwendung von y [³²P]- ATP und T4-Polynucleotidkinase nach dem Verfahren von Maxam und Gilbert (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 74, 560 [1977]) markiert.
  • Immobilisierungen von [³H]-rRNA und [³²P]-DNA: 0,5 ml Testpuffer, 20 ul Spermin-Latexmikrokügelchen und 0,5 ul entweder der [³H]-rRNA (14 000 CPM) oder des [³²P] DNA-Oligomers (15 000 CPM) wurden vermischt und fünf Minuten lang bei 50ºC inkubiert. Die Mikrokügelchen wurden dann durch zweiminütige Zentrifugation bei 13 000 Upm in einer Tomy Seiko Modell MR-15A Mikrozentrifuge (Tokyo, Japan) pelletiert. Die Überstände wurden entfernt und zu 15 ml BetageiWz in 20 ml-Polypropylenröhrchen zugegeben. Die Menge von [³H] oder [³²P] in jeder Probe wurde durch Einsatz eines Nuclear-Chicago-Szintillationszählers ermittelt.
  • Die Ergebnisse sind in Tabelle 12 gezeigt. Bei Konzentrationen zwischen 200 mM und 400 mM PB entfernten die Spermin-Latex-Mikrokügelchen die Ziel- Polynucleotide maximal und banden die Sonden-Oligonucleotide in minimaler Weise. Diese bevorzugte Auswahl setzte sich bei höheren Pufferkonzentrationen fort. Tabelle 12 Pufferstärke % [³H]-rRNA gebunden an Spermin-Latex % [³²P]-DNA-Oligomer, gebunden an Spermin-Latex Anm. 141 Angemeldetes Patent über die Sequenz der Sonde.
    • Beispiel 21 Abtrennung von Nucleinsäuren mit Tris-Latex-Mikrokügelchen
  • Tris-Latex-Mikrokügelchen wurden wie in Beispiel 19 obenstehend beschrieben hergestellt. Andere Materialien sind in Beispiel 20 beschrieben.
  • Die Vorgehensweise war dieselbe wie oben beschrieben, wobei Tris-Latex- Mikrokügelchen anstelle von Spermin-Latex-Mikrokügelchen verwendet wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 13 gezeigt. Wie mit Spermin-Latex, zeigten die Tris-Latex- Mikrokügelchen ein Optimum in der Auswahl der Polynucleotidziele gegenüber Oligonucleotidsonden bei 200 mM bis 400 mM PB. Tabelle 13 Pufferstärke % [³H]-rRNA gebunden an Tris-Latex % [³²P]-DNA-Oligomer, gebunden an Tris-Latex
    • Beispiel 22 Abtrennung von Nucleinsäuren mit Tris-Sepharose
  • Tris-Sepharose wurde wie in Beispiel 19 beschrieben hergestellt. Die anderen Materialien sind in Beispiel 20 beschrieben. Tris-Sepharose (100 ul) wurde zu 0,5 ml 0,3 M PB zugegeben und zu 0,5 ul entweder der [³H]-rRNA oder des [³²P]-DNA- Oligomers. Der Inhalt wurde 15 Minuten lang bei 60ºC unter häufigem Schwenken, um das Gel zu suspendieren, inkubiert. Das Gel wurde durch 30 Sekunden lange Zentrifugation bei 13 000 Upm pelletiert, und der Überstand wurde entfernt und in ein 20 ml-Polypropylengefaß enthaltend 15 ml BetagelWz, überführt. Das Gel wurde zweimal mit 0,5 ml 0,3 M PB gewaschen; die Waschungen wurden durch Zentrifugation abgetrennt und in BetagelWz enthaltende Polypropylengefäße, wie oben beschrieben, überführt. Schließlich wurde das Gel in 0,5 ml 0,3 M PB suspendiert und ebenfalls in ein Polypropylengefäß, enthaltend 15 ml BetagelWz, überführt. Der Gehalt an [³H] oder [³²P] in jeder Probe wurde durch eine Szintillationszählung wie oben beschrieben ermittelt. Die Ergebnisse in Tabelle 14 zeigen die bevorzugte Bindung des RNA-Polynucleotides gegenüber dem DNA-Oligonucleotid.
    • Tabelle 14
  • Probe Prozent gebunden an Gel
  • [³H]-rRNA 75,1%
  • [³H]-rRNA 80,6%
  • [³²P]-DNA (26-mer) 0,54%
  • [³²P]-DNA (26-mer) 0,71%
    • Beispiel 23 Abtrennung von Nucleinsäuren mit Tris-Acryl-Mikrokügelchen
  • Es wurde die Unterscheidung in der Bindung von rRNA gegenüber einem synthetischen Oligonucleotid durch die mit Tris-(2-aminoethyl)-amin abgewandelten Acryl-Mikrokügelchen (beschrieben in Beispiel 19, obenstehend) gezeigt. [³H]-rRNA aus E.coli und ein mit [³²P] endmarkiertes Oligonucleotid (26-mer) sind in Beispiel 20 beschrieben. In ein 1,5 ml-Polypropylenröhrchen mit Schraubverschluß wurden zugegeben: mit Tris-(2-aminoethyl)-amin modifizierte Mikrokügelchensuspension (7 ul), Natriumphosphatpuffer (pH 6,8, 200 ul, im Bereich von 0,1 - 0,4 M), und entweder eine Lösung von [³H]-rRNA oder eine Lösung von [³²P]-markiertem Oligonucleotid (1 ul). Die Suspension wurde 10 Minuten lang auf 50ºC erhitzt und dann in eine Vertiefung auf ein Mikrotiter-Filtrations-Sammelrohr (manifold) überführt. (0,22 u Porengröße, Millipore, Inc., Bedford, MA, USA. Ein Vakuum wurde angelegt, und die Mikrokügelchen wurden auf dem Filter mit dem gleichen Puffer (200 ul) gewaschen. Das Vakuum wurde aufgehoben, und die Mikrokügelchen wurden dann in 20 mM mit Natriumphosphat gepufferter Kochsalzlösung (200 ul) resuspendiert, und in ein Gefäß überführt, welches Szintillationscocktail enthielt (10 ml, BetagelWz). Die an den Mikrokügelchen gebunden gebliebene Radioaktivität wurde durch Szintillationszählung quantifiziert. Die Daten sind in Tabelle 15 zusammengefaßt. Tabelle 15 Puffer PROZENT GEBUNDEN [³H]-rRNA [³²P]-DNA-Sonde
    • Beispiel 24 Trennung von Nucleinsäuren mit Poly-D-lysin-Polyurethanmembran und Tris- Polyurethanmembran
  • Es wurde gezeigt, daß die mit Poly-D-lysin modifizierten Membranstücke, beschrieben in Beispiel 19, siehe oben, eine ähnliche Unterscheidung in der Bindung für rRNA gegenüber einem synthetischen Oligonucleotid (19-mer) ausüben, wie es bereits obenstehend dargelegt wurde.
  • [³H]-rRNA aus E.coli und ein mit [³²P] endmarkiertes Oligonucleotid (19-mer) wurden verwendet. Stücke einer mit Amin modifizierten Membran wurden auf drei Bögen 3MM-Papier (Whatman, Ltd., Maidstone, England) in einer "slot blotting"- Vorrichtung (J.M. Specialty Parts, San Diego, CA, USA) positioniert. 1 ul Aliquots von [³H]-rRNA oder dem mit [³²P] markierten Oligonucleotid wurden entweder in 200 ul Puffer A (0,1 M Natriumphosphat (pH 6,8) / 0,15 M NaCl / 0,02% SDS / 0,1% Triton X-100) oder Puffer B (0,1 M Natriumphosphat (pH 6,8) / 0,45 M NaCl / 0,02% SDS / 0, 1% Triton X-100) verdünnt. Die resultierenden Lösungen wurden dann in passende Vertiefungen des "slot-blotters" eingefüllt und mittels Kapillarkräften durch die Stücke der Amin-modifizierten Membran hindurchgeleitet. Die Membranstücke wurden dann aus dem "slot-blotter" entfernt, mit dem selben Puffer gewaschen (entweder Puffer A oder Puffer B, 2 · 2 ml), und in Gefäße überführt, welche 5 ml Szintillationscocktail (BetagelWz) enthielten. Die an die Membranstücke gebundene Radioaktivität wurde durch Szintillationszählung quantifiziert; Die Ergebnisse sind in Tabelle 16 dargestellt. Tabelle 16 Amin-Modifikator Puffer Prozent gebunden [³H]-rRNA [³²P]-DNA-Sonde Poly-D-lysin Tris-(2-aminoethyl)amin
    • Beispiel 25 Verwendung von Tris-Latex-Mikrokügelchen mit einer biotinylierten DNA-Sonde in einem Colorimetrie-Assay
  • Um die Durchführbarkeit des Verfahrens dieser Erfindung für einen colorimetrischen Mybridisierungs-Assay zu bestimmen, wurden Tris-Latex-Mikrokügelchen zusammen mit einer Biotin-markierten DNA-Sonde gegen Mycoplasma pneumoniae-rRNA verwendet:
    • (a) Synthese eines Biotin-markierten DNA-Oligomers. das komplementär zu einer Region der Mycoplasma pneumoniae - rRNA ist
  • Materialien: Biotinyl-E-Aminocapronsäure-N-hydroxysuccinimidester (Biotin-X- NHS) wurde von Calbiochem-Behring Corp., San Diego, CA, USA erworben. 5- Allylamin-UTP, Terminale Desoxynucleotid-Transferase und 5 · "Tailing"-Puffer waren Produkte von Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD, USA. Bio- Gel P-60 (100-100 Mesh) war von Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, USA; und Sephadex G-25 (mittel) war von Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ. Andere verwendete Materialien sind in den Beispielen 19 und 20, siehe oben, beschrieben. Eine Desoxyribonucleotid-Sonde von 36 Nucleotiden Länge, komplementär zu einer in der 16s-Untereinheit der rRNA von Mycoplasma pneumoniae vorhandenen Sequenz, wurde eingesetzt. Dieses Oligomer wurde wie in Beispiel 20 beschrieben am 5' - Ende mit [³²P] markiert.
  • Schwanzbildungs- bzw. Tailing-Reaktion mit Allylamin-UTP: 9 pmol des [³²P]- Oligomers wurden mit 0, 1 mM Allylamin-UTP und 40 Units Terminaler Desoxynucleotid-Transferase in 50 ul 1 · Tailing-Puffer 1 Stunde lang bei 37&sup0;C zum Reagieren gebracht. Das geteilte Oligomer wurde auf einer Bio-Gel P-60 Säule (0,7 · 10 cm) gereinigt, wobei mit 0, 1 M PB/2 mM EDTA eluiert wurde. Das Oligomer wurde dann beim Durchlaufen einer Sephadex G-25-Säule entsalzt, wobei mit 0,2 M Triethylammoniumbicarbonat eluiert (TEAB, pH 8) wurde.
  • Reaktion mit Biotin-X-NHS: Das mit Allylamin-UTP geteilte Oligomer, gelöst in 150 ul 0,1 M NaHCO&sub3; (pH 8,8) / 0,02% SDS, wurde viermal in 60 Minuten- Intervallen mit 10 ul Biotin-X-NHS (30 mM Stammlösung in DMSO) behandelt. Das biotinylierte Oligomer wurde auf einer Säule mit Sephadex G-25 (0,7 · 10 cm) gereinigt, wobei mit 0, 1 M PB / 2 mM EDTA / 0,02% SDS eluiert wurde.
    • (b) Immobilisierung des biotinylierten DNA-Sonden-rRNA-Hybrids auf "Tris-Latex"
  • Eine Stammlösung von rRNA (1 ug/ul) aus Mycoplasma pneumoniae wurde verwendet. Eine Suspension von Tris-Latex wurde wie in Beispiel 19 beschrieben hergestellt. Die anderen Materialien waren von analysenreiner Qualität.
  • Die Mischungen für die Hybridisierungsreaktion waren folgenderweise beschaffen:
  • Hybrid: 1 ul rRNA (1 ug), 10 ul biotinylierte DNA-Sonde (0,1 pmol), 0,4 ul 1% SDS, 2,4 ul 1 M PB und 6,2 ul H&sub2;O, insgesamt 20 ul.
  • Sonden-Kontrolle: 10 ul biotinylierte DNA-Sonde (0,1 pmol), 0,4 ul 1% SDS, 2,4 ul 1 M PB und 7,2 ul H&sub2;O, insgesamt 20 ul.
  • Die Hybridisierungsmischungen wurden eine Stunde lang bei 60ºC inkubiert, gefolgt von der Zugabe von 0,5 ml 0,4 M PB / 0,02% SDS 11,0% Triton X-100 sowie 10 Htl Tris-Latex (wäßrige Suspension). Die Ansätze wurden gemischt und 5 Minuten lang bei 60ºC inkubiert. Die Tris-Latex-Mikrokügelchen wurden durch 2 Minuten lange Zentrifugation bei 13 000 Upm pelletiert. Die Menge an [³²P], welche an die Mikrokügelchen gebunden blieb, wurde durch Szintillationszählung unter Benutzung der Cerenkov-Strahlung bestimmt.
  • In dem Hybridisierungsexperiment banden 61% der gesamten Radioaktivität an das Tris-Latex, während es in der Sonden-Kontrolle nur 5% waren. Dies spiegelt eine 56%-ige Hybridisierung in dem erstgenannten Experiment wieder.
    • (c) Das biotinylierte DNA-rRNA-Hybrid wurde auf Tris-Latex nichtradioaktiv detektiert
  • Die Reagenzien zur Herstellung eines Avidin-alkalische Phosphatase-Komplexes wurden erworben von Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA. Rinderserumalbumin (BSA), Nitroblau-Tetrazoliumsalz (NBT), 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat (BCIP) und Tween-20 waren Produkte von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA. Andere Materialien sind in den Beispielen 19 und 20 beschrieben.
  • Zwei Proben von Tris-Latex, das entweder mit biotinyliertem DNA-Sonden/rRNA- Hybrid oder mit biotinylierter DNA-Sonde allein (wie in diesem Beispiel obenstehend beschrieben) inkubiert worden war, wurden auf einem Millititer 96-Filtrations- Apparat abfiltriert, wobei Durapore R (Millipore Corp., Bedford, MA, USA) - Filter eingesetzt wurden. Jede Probe der abgefilterten Feststoffe wurde in 200 ul 3% BSA in 0,1 M Tris (pH 7,5) I 0,1 M NaCl / 3 mM MgCl&sub2; / 0,05% Tween-20 resuspendiert, in ein 1,5 ml-Polyethylen-Röhrchen mit Schraubverschluß überführt und 1 Stunde lang bei 44ºC inkubiert. Die Proben wurden dann wie oben beschrieben abfiltriert, und die filtrierten Feststoffe wurden in 200 ul Streptavidinalkalischen Phosphatase-Komplex (zubereitet in mit Phosphat gepufferter Kochsalzlösung nach den Angaben des Herstellers) resuspendiert. Nach 10 Minuten wurden die Proben filtriert und zweimal mit 200 ul 0,1 M Tris (pH 7,5)1 0,1 M NaCl / 3 mM MgCl&sub2; / 0,05% Tween-20 und dann einmal mit 0,1 M Tris (pH 9,5) / 0,1 M NaCl / 50 mM MgCl&sub2; gewaschen. Die abfiltrierten Feststoffe wurden dann in 200 ul 0,33 mg/ml (NBT) und 0,17 mg/ml (BCIP) enthaltendem 0,1 M Tris (pH 9,5)1 0,1 M NaCl / 50 mM MgCl&sub2; resuspendiert. Die Farbentwicklung wurde 10 Minuten lang im Dunkeln von statten gehen gelassen. Die Latex-Teilchen wurden dann durch Filtration entfernt und zweimal mit 0,1 M NaCl / 3 mM MgCl&sub2; / 0,05% Tween-20 gewaschen.
  • Ein blaues auf der Oberfläche der Tris-Latex-Mikrokügelchen befindliches Präzipitat war bei der Hybrid-Probe innerhalb von etwa 2 Minuten leicht zu erkennen. Dies war klar zu unterscheiden von der sehr bleichen Farbentwicklung, die bei der Probe mit der biotinylierten Sonde allein beobachtet wurde.
    • Beispiel 26 Verwendung von Tris-Sepharose mit einer biotinylierten Sonde in einem Colorimetrie-Assay ohne Isotope
  • Das Hybridisierungssystem von Beispiel 25 wurde mit Tris-Sepharose anstelle von Tris-Latex-Mikrokügelchen angewandt.
    • (a) Die hybridisierte biotinylierte Sonde wurde auf Tris-Sepharose immobilisiert
  • Kleine 0, 1 ml Tris-Sepharose enthaltende Säulen (hergestellt wie in Beispiel 19 beschrieben) wurden unter Verwendung von 1 cm³ Tuberculin-Spritzen hergestellt. Hybridisierungsmischungen (hergestellt wie in Beispiel 25 (b) beschrieben) wurden in 0,5 ml 0,25 M PB/ 0,02% SDS 11,0% Triton X-100 gelöst und tropfenweise durch die Tris-Sepharose-Säule über eine Dauer von 5 Minuten durchlaufen gelassen. Die Säulen wurden dann zweimal mit 0,5 ml des selben Puffers gewaschen. Die Menge des an die Säule gebunden bleibenden [³²P] wurde mit einer Szintillationszählung wie in Beispiel 25(b) beschrieben bestimmt. Die Tris-Sepharose zeigte eine besonders präzise Auswahl des Hybrides gegenüber der Sonde. Von dem Hybrid wurden 81% an Tris-Sepharose gebunden, wohingegen 0,0% der Sonden-Kontrolle gebunden wurden. (Die Menge an [³²P], die in der Sondenkontrolle gebunden blieb, war nicht über das Hintergrundsignal hinaus meßbar).
    • (b) Die biotinylierte Sonde wurde ohne Isotope detektiert
  • Die Materialien waren wie in Beispiel 21(c) beschrieben. Kleine Säulen von Tris- Sepharose wurden hergestellt und behandelt, wie in diesem Beispiel obenstehend beschrieben. Der Avidin-alkalische Phosphatase-Komplex (0,5 ml, hergestellt wie in Beispiel 25 (c) beschrieben) wurde dann tropfenweise durch die Säule geleitet. Nach 10 Minuten wurde die restliche Avidin-alkalische Phosphatase-Lösung unter leichtem positiven Druck herausgepreßt. Das Gel wurde zweimal mit 0,5 ml 0, 1 M Tris (pH 7,5) / 0,1 M NaCl / 3 mM MgCl&sub2; und einmal mit 0,1 M Tris (pH 9,5)/ 0,1 M NaCl / 50 mM MgCl&sub2; gewaschen. NBTIBCIP-Farbreagenz (0,5 ml, siehe Beispiel 25) wurde dann langsam durch das Gel geleitet. Nach 10 Minuten wurde das verbleibende Reagenz herausgepreßt, und das Gel wurde zweimal mit 0,5 ml 0, 1 M Tris (pH 7,5)/ 0,1 M NaCl / 3 mM MgCl&sub2; gewaschen.
  • Eine blaue Farbentwicklung war bei der Hybrid-Probe innerhalb von etwa 2 Minuten zu sehen. Dies war einfach zu ,unterscheiden von der Probe mit der Sonde allein, welche nach einer 10 Minuten langen Dauer der Farbentwicklung nur schwach blau war. Bemerkung: Dieser Träger benötigte keinen "capping"-Schritt mit 3% BSA, wie er bei dem vorhergehenden Trägermaterial (Beispiel 25 (c)) erforderlich gewesen war.
    • Beispiel 27 Verwendung von Tris-Sepharose mit einer mit alkalischer Phosphatase markierten DNA-Sonde in einem Colorimetrie-Assay
  • Die Nützlichkeit des in Beispiel 19 beschriebenen kationischen Trägers wurde in einem colorimetrischen Hybridisierungs-Assay weiter gezeigt, wobei ein Konjugat aus alkalischer Phosphatase 1 Desoxyoligonucleotid-Sonde verwendet wurde.
  • Materialien: Ein mit alkalischer Phosphatase markiertes synthetisches Oligonucleotid (26-mer), komplementär zu rRNA aus E. coli (im- folgenden bezeichnet als die "ZielrRNA"), wurde durch eine Abwandlung des von Jablonski et al., Nucl. Acids Res., Vol. 14, S. 6115 (1986) beschriebenen Verfahrens hergestellt. Die Oligonucleotidsequenz wurde so gewählt, daß sie eine minimale Kreuz-Hybridisierung mit rRNA von Candida albicans (im folgenden bezeichnet als die "Nicht-Ziel-rRNA") aufwies. Die Ziel- und die Nicht-Ziel-rRNA wurden isoliert und gereinigt. Die Farbstoffe NBT und BCIP wurden oben in Beispiel 25 beschrieben. Andere Materialien waren analysenrein.
  • Hybridisierungscocktails wurden in 1 ,5 ml Polypropylen-Mikrozentrifugenröhrchen durch Zugabe des Oligonucleotid-alkalische Phosphatase-Konjugates (10 ul, 1 pmol), von Verdünnungen entweder von Ziel- oder Nicht-Ziel-rRNA (1 ul, 1 - 0,0001 ug), von 4,8 M Natriumphosphatpuffer (2 ul, pH 6,8), von Natriumdodecylsulfat (0,4 ul, 1%-ige Lösung v/v) und sterilem Wasser (13,6 ul) zubereitet: die Gesamtvolumina betrugen 20 ul. Diese Cocktails wurden 30 Minuten lang bei 50ºC hybridisiert. Als nächstes wurden 0,3 M Natriumphosphat (0,5 ml, pH 6,8) und Tris-Sepharose (etwa 30 ul Bettvolumen) zugegeben, und die Inhalte wurde durch Schütteln in einem Wasserbad 10 Minuten lang bei 50ºC gemischt. Die Röhrchen wurden dann kurz in einer Mikrozentrifuge abzentrifugiert und die Überstände wurden mit einer Pasteur- Pipette abgenommen. Die Tris-Sepharose-Pellets wurden dann in Folge mit 0,3 M Natriumphosphatpuffer (3 x 0,5 ml), gefolgt von 50 mM Tris HCl (pH 8) 1 0,1 M NaCl / 1 mM MgCl&sub2; / 0,1 mM ZnCl&sub2; (2 · 0,5 ml), gewaschen. Die Pellets wurden dann in 300 Nil einer Lösung von 0,1 M Tris HCl (pH 9,5)1 0,1 M NaCl / 50 mM MgCl&sub2;, welche NBT (0,33 mg/ml) und BCIP (0,25 mg/ml) enthielt, resuspendiert und vier Stunden lang bei 42ºC inkubiert. Auf den Tris-Sepharose- Pellets war eine blau-violette Färbung sichtbar, die von den Hybridisierungsreaktionen mit so wenig wie 0,001 ug von der Ziel-rRNA resultierte. Keine Färbung war erkennbar auf den Tris-Sepharose-Pellets der Kontrollen mit so viel wie 1,0 ug von der Nicht-Ziel-rRNA
    • Beispiel 28 Verwendung der Poly-D-lysin-Polyurethanmembran mit einer alkalische Phosphatase-markierten DNA-Sonde in einem Colorimetrie-Assay
  • In diesem Experiment wurde die Verwendbarkeit einer kationischen Membran als Abtrennungs-Trägermaterial in einem colorimetrischen Assay gezeigt.
  • Die Hybridisierungsreaktionen wurden wie in Beispiel 27 beschrieben durchgeführt. Zu diesen Reaktionen wurden 300 ul Verdünnungspuffer (0, 1 M Natriumphosphat (pH 6,8)/ 0,45 M NaCl / 0,02% SDS / 0,1% Triton X-100) zugegeben. Die resultierenden Lösungen wurden unter Wirkung von Kapillarkräften durch Poly-D- lysin-Membranstücke durchgeleitet, wobei ein "Slot-Blotter"-Apparat wie in Beispiel 24 beschrieben zur Anwendung kam. Die Membranstücke wurden dann aus dem Slot- Blotter entnommen und mit Verdünnungspuffer (2 · 2 ml) und Assay-Puffer (2- Amino-2-methylpropandiol HCl (pH 10,2)/ 0,1 M NaCl, 2 · 4 ml) gewaschen. Dann wurden die Membranstücke in Assay-Puffer (10 ml), der NBT (0,33 mg/ml) und BCIP (0,25 mg/ml) enthielt, eingetaucht. Nach 10 Minuten ergaben die Spuren, die mit Hybridisierungsreaktionen, welche 1 ug Ziel-rRNA enthielten, behandelt worden waren, eine dunkle blau-violette Färbung, wohingegen die Kontrollen, welche 1 ug der Nicht-Ziel-rRNA enthielten, keine Färbung aufwiesen.
  • Dieses colorimetrische Assay erforderte keine Vorhybridisierungs-, Fixierungs- und Abblockschritte, die normalerweise mit Slot-Blot-Assays verbunden sind, und stellt somit eine deutliche Verbesserung über die vorhandenen Techniken hinaus dar.
    • Beispiel 29 Verwendung einer Poly-D-lysin-Polyurethanmembran in einem Chemolumineszenz- Assay ohne Isotope
  • Die Verwendbarkeit des in Beispiel 19 beschriebenen kationischen Membran- Abtrennungsträgermaterials wurde in einem keine Isotope verwendenden Chemolumineszenz-Hybridisierungsassay gezeigt, wobei eine mit Acridiniumester (AE) markierte DNA-Sonde eingesetzt wurde.
  • Die Verfahren zur Erzeugung und Detektion von chemolumineszenten, mit Acridiniumester markierten Oligonucleotidsonden wurden wie in der U.S. Patentanmeldung Ser. Nr. 105 080, betitelt " Acridium Ester Labeling and Purification of Nucleotide Probes", eingereicht am 2. Oktober 1987, durch den Bezug daruf hier einbezogen, beschrieben durchgeführt. Ein zu einer Sequenz in der rRNA von E.coli komplementäres, mit Acridiniumester (AE) markiertes Oligonucleotid (26-mer) wurde durch Einbindung eines einzigen Acridiniumesters pro Sondenmolekül hergestellt. Andere Materialien und Reagenzien sind in den Beispielen 19 und 27 obenstehend beschrieben.
  • Die Hybridisierungscocktails wurden in 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen aus Polypropylen zusammengestellt: die AE-markierte Sonde (2 ul, 1,5 · 10&sup6; relative Licht- Einheiten, "RLU's"), 1% SDS (v/v, 1 ul), 1 M Natriumphosphatpuffer (pH 4,9, 5 ul), und entweder Ziel- oder Nicht-Ziel-rRNA (1 ug/ul, 1 ul), gesamtes Reaktionsvolumen 9 ul. Der Inhalt jedes Röhrchens wurde 30 Minuten lang bei 60ºC inkubiert. Der Abtrennungspuffer (0,6 ml, 0, 1 M Natriumphosphat pH 6,8 / 0,15 M NaCl / 0,02% SDS / 0, 1% Triton X-100) wurde zugegeben, und die resultierenden Lösungen wurden durch Kapillarkräfte auf Stücke einer mit Poly-D-lysin modifizierten Membran überführt, wobei ein Slot-blotter-Apparat wie obenstehend beschrieben verwendet wurde. Die Membranstücke unterhalb jedes Slots bzw. jeder Spur wurden einzeln in Abtrennungspuffer (3 · 2 ml) gewaschen, und wurden dann in Stücke von 0,25 cm² geschnitten und in 12 · 75 mm großen Polypropylenröhrchen (Sarsted, BRD) überführt, welche 200 ul Wasser enthielten. Der Inhalt jedes Röhrchens wurde wie obenstehend erwähnt bezüglich seiner relativen Chemolumineszenz quantifiziert. Im genaueren wurde ein CliniLumat Modell LB 9502 Luminometer (Berthold, Wildbad, BRD) mit einem Zyklus von zwei Injektionen verwendet: Injektion #1- 0,25 M HNO&sub3; / 0,1% H&sub2;O&sub2; (200 ul), Injektion #2- 2 M Kaliumphosphatpuffer (pH 13,2, 200 ul). Die Ergebnisse sind in Tabelle 17 dargestellt.
    • Tabelle 17
  • Auf die Membran aufgebrachte Probe Relative Chemolumineszenz
  • Abtrennungspuffer allein 27 291
  • Hybridisierungsreaktionen, 21 807
  • Nicht-Ziel-rRNA 51 292
  • 18 961
  • Hybridisierungsreaktionen, 192 058
  • Ziel-rRNA 286 842
  • 242 625
    • Beispiel 30 Verwendung von Tris-Sepharose in einem nicht-radioaktiven chemolumineszenten Hybridisierungs-Assay
  • Hybridisierungsreaktionen zwischen Acridiniumester-markierter Oligonucleotidsonde und rRNA wurden wie in Beispiel 29 beschrieben durchgeführt. Aliquots aus diesen Reaktionen wurden in saubere 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen aus Polypropylen überführt und mit 0,3 M Natriumphosphatpuffer (pH 6,8 , 0,5 ml) verdünnt. Als nächstes wurde Tris-Sepharose (30 ul Bettvolumen, hergestellt wie in Beispiel 19 beschrieben) zugegeben, und der Inhalt wurde durch 10 Minuten langes vorsichtiges Vortexen bei Raumtemperatur gemischt. Nach einem kurzen Lauf in einer Mikrozentrifuge wurden die Überstände entfernt, und die resultierenden Tris- Sepharose-Pellets wurden mit 0,3 M Natriumphosphat (pH 6,8 , 2 · 0,5 ml) gewaschen und dann in 0,3 M Natriumphosphat (pH 6,8, 0,5 ml) suspendiert. Aliquots der resultierenden Suspensionen (0,4 ml) wurden in 12 · 75 mm großen Polypropylenröhrchen überführt, und 30% Wasserstoffperoxid wurde zugegeben (0,5 ul). Die Chemolumineszenz wurde wie in Beispiel 29 beschrieben gemessen, außer daß eine einzelne Injektion von 2 N NaOH (200 ul) verwendet wurde, um die Chemolumineszenzreaktion zu intiieren. Die Ergebnisse sind in Tabelle 18 dargestellt.
    • Tabelle 18
  • An die Tris-Sepharose gebundene Probe Relative Chemolumineszenz
  • Kontrolle (kein Ziel) 637
  • Ziel (E. coli - rRNA) 97071
  • Nicht-Ziel (C. albicans - rRNA) 702
  • Der Fachmann wird es richtig einzuschätzen wissen, daß die obenstehend beschriebenen Verfahren und Zusammensetzungen eingesetzt werden können, um Nucleinsäuren zu reinigen und um Ziel-Nucleotidsequenzen in DNA und RNA zu detektieren, welche aus einer weiten Palette von Quellen herstammen können, wobei infektiöse Agenzien wie Bakterien, Viren und Pilze, Krebszellen und Zellen, die Informationen über genetische Erkrankungen wie Sichelzellanämie liefern können, mit eingeschlossen sind. Folglich wird der Umfang der Erfindung lediglich durch die Bezugnahme auf die angemeldeten Patentansprüche begrenzt.

Claims (47)

1. Verfahren zur Reinigung eines Polynucleotids, welches in einer Lösung vorliegt,
die ein Oligonucleotid enthält, das kleiner als das Polynucleotid ist, umfassend:
(a) Kontaktieren der Lösung mit einem Trägermaterial, welches Trägermaterial eine Vielzahl von Kationen besitzt welche für die Wechselwirkung mit Anionen auf dem Polynucleotid unter Bedingungen zur Verfügung stehen, unter denen das Polynucleotid an dem Trägermaterial bindet, die aber zur Bindung des Oligonucleotids am Trägermaterial unzureichend sind; wobei das Trägermaterial in der Lage ist, Polynucleotide entsprechend ihrer Ladung oder Lange zu trennen, und folgendes ist:
ein magnetisches Amin-Trägermaterial;
ein magnetisches Propylamin-Trägermaterial;
ein magnetisches quaternäres Ammonium-Trägermaterial;
ein magnetisches Poly-D-lysin funktionalisiertes Trägermaterial;
ein Poly-D-lysin funktionalisiertes Polyurethan-Trägermaterial;
ein Spermin-Latex-Trägermaterial;
ein Tris-(2-aminoetyl)amin-Latex-Trägermaterial
ein perlenförmiges Tris-(2-aminoetyl)amin-Agarose-Trägermaterial;
oder
ein Tris-(2-aminoetyl)-Polyurethan-Trägermaterial: und
(b) Abtrennen des Oligonucleotids von dem Trägermaterial, wohingegen das Polynucleotid am Trägermaterial festgehalten wird.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, das ferner die Behandlung des Trägermaterials zur Rückgewinnung des Polynucleotids umfaßt.
3. Verfahren gemäß Anspruch 2, bei dem das Trägermaterial mit einer Elutionslösung behandelt wird, um das Polynucleotid unter anschließender Abtrennung der Elutionslösung von dem Trägermaterial zu desorbieren.
4. Verfahren gemäß Anspruch 3, bei dem die Elutionslösung eine Phosphatlösung, Pyrophosphatlösung, Tripolyphosphatlösung, Phytinsäurelösung oder 50% iges Formamid umfaßt.
5. Verfahren gemäß Anspruch 3 oder 4, bei dem das Polynucleotid aus der Elutionslösung wiedergewonnen wird.
6. Verfahren gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem das Trägermaterial nach der Abtrennung der das Oligonucleotid enthaltenden Lösung gewaschen wird.
7. Verfahren gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem das Trägermaterial in Form einer Suspension vorliegt.
8. Verfahren gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem das Trägermaterial Teilchen umfaßt.
9. Verfahren gemäß Anspruch 8, bei dem die Teilchen eine Größe von etwa 1 um besitzen.
10. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7, bei dem das Trägermaterial Fasern umfaßt.
11. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7, bei dem das Trägermaterial eine Membran ist.
12. Verfahren gemäß Anspruch 8 oder 9, bei dem die Teilchen magnetisch sind.
13. Verfahren gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Kationen Alkyl- oder Arylamine oder -imine sind.
14. Verfahren gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem das Trägermaterial ein Metaloxid-, Glas-, Polyamid-, Polyester-, Polyolefin-, Polysaccharid-, Polyglykol- oder ein Polyaminosäureträger ist.
15. Assay zur Detektion eines eine Zielsequenz enthaltenden Polynucleotids in einer Lösung, von der bekannt ist oder angenommen wird, daß sie das Polynucleotid enthält, umfassend:
(a) Inkontaktbringen der Lösung mit einer Oligonucleotidsonde für die Zielsequenz, die kleiner als das Polynucleotid ist, unter Hybridisierungsbedingungen zur Bildung eines Hybrids zwischen der Sonde und der Zielsequenz, falls vorhanden;
(b) Kontaktieren der Lösung mit einem Trägermaterial mit eine Vielzahl von Kationen, welche für die Wechselwirkung mit Anionen auf dem Polynucleotid unter Bedingungen zur Verfügung stehen, unter denen das Polynucleotid an dem Trägermaterial bindet, die aber zur Bindung des Oligonucleotids am Trägermaterial unzureichend sind; wobei das Trägermaterial in der Lage ist, Polynucleotide entsprechend ihrer Ladung oder Länge zu trennen, und folgendes ist:
ein magnetisches Amin-Trägermaterial;
ein magnetisches Propylamin-Trägermaterial;
ein magnetisches quaternäres Ammonium-Trägermaterial;
ein magnetisches Poly-D-lysin funktionalisiertes Trägermaterial;
ein Poly-D-lysin funktionalisiertes Polyurethan-Trägermaterial;
ein Spermin-Latex-Trägermaterial;
ein Tris-(2-aminoetyl)amin-Latex-Trägermaterial
ein perlenförmiges Tris-(2-aminoetyl)amin-Agarose-Trägermaterial;
oder
ein Tris-(2-aminoetyl)-Polyurethan-Trägermaterial; und
(c) Detektieren der entweder an dem Trägermaterial gebundenen oder in der Suspension verbliebenen Menge des Polynucleotids oder der Sonde als qualitatives oder quantitatives Maß der Zielsequenz in der Lösung.
16. Assay zur Detektion eines eine Zielsequenz enthaltenden Polynucleotids in einer Lösung, von der bekannt ist oder angenommen wird, daß sie das Polynucleotid enthält, umfassend:
(a) Inkontaktbringen der Lösung mit einem Trägermaterial mit einer Vielzahl von Kationen, welche für die Wechselwirkung mit Anionen auf dem Polynucleotid unter Bedingungen zur Verfügung stehen, unter denen das Polynucleotid an dem Trägermaterial bindet; wobei das Trägermaterial in der Lage ist, Polynucleotide entsprechend ihrer Ladung oder Länge zu trennen, und folgendes ist:
ein magnetisches Amin-Trägermaterial;
ein magnetisches Propylamin-Trägermaterial;
ein magnetisches quaternäres Ammonium-Trägermaterial;
ein magnetisches Poly-D-lysin funktionalisiertes Trägermaterial;
ein Poly-D-lysin funktionalisiertes Polyurethan-Trägermaterial;
ein Spermin-Latex-Trägermaterial;
ein Tris-(2-aminoetyl)amin-Latex-Trägermaterial
ein perlenförmiges Tris-(2-aminoetyl)amin-Agarose-Trägermaterial;
oder
ein Tris-(2-aminoetyl)-Polyurethan-Trägermaterial; und
(b) Kontaktieren des Trägermaterials und jedwedes daran gebundene Polynucleotid mit einer Lösung, die eine Oligonucleotidsonde, welche kleiner als das Polynucleotid ist, enthält, unter Hybridisierungsbedingungen zur Bildung eines Hybrids zwischen der Sonde und der Zielsequenz, falls vorhanden, wobei die Bedingungen jedoch für die Bindung zwischen der Oligonucleotidsonde und dem Trägermaterial unzureichend sind; und
(c) Detektieren der entweder an dem Trägermaterial gebundenen oder in der Suspension verbliebenen Menge des Polynucleotids oder der Sonde als qualitatives oder quantitatives Maß der Zielsequenz in der Lösung.
17. Assay gemäß Anspruch 15 oder 16, bei dem das Trägermaterial in Form einer Suspension vorliegt.
18. Assay gemäß mindestens einem der Ansprüche 15 bis 17, bei dem die Oligonucleotidsonde markiert ist.
19. Assay gemäß mindestens einem der Ansprüche 15 bis 18, bei dem der Detektionsschritt (c) folgendes umfaßt
(i) Abtrennen des Trägermaterials von der nicht-hybridisierten Sonde; und
(ii) Detektieren der Gegenwart jedweder derart abgetrennten und/oder am Polynucleotid auf dem Trägermaterial gebundenen Sonde.
20. Assay gemäß mindestens einem der Ansprüche 15 bis 18, bei dem der Detektionsschritt (c) folgendes umfaßt:
(i) Abtrennen des Trägermaterials von der nicht-hybridisierten Sonde;
(ii) Behandeln des Trägermaterials mit einer Elutionslösung zur Entfernung jedweden zwischen der Sonde und dem Ziel gebildeten Hybrids und/oder jedweder Sonde; und
(iii) Detektieren der Gegenwart der derart eluierten Sonde.
21. Assay gemäß Anspruch 20, bei dem die Hybridelutionslösung 50%iges Formamid, Phosphatlösung, Pyrophosphatlösung, Tripolyphosphatlösung oder Phytinsäurelösung ist.
22. Assay gemäß mindestens einem der Ansprüche 15 bis 21, bei dem das Polynucleotid mindestens 3mal größer als die Oligonucleotidsonde ist.
23. Assay gemäß Anspruch 22, bei dem das Polynucleotid mindestens 5mal größer als die Oligonucleotidsonde ist.
24. Assay gemaß mindestens einem der Ansprüche 15 bis 23, bei dem die Sonde ein zur DNA oder RNA analoges Molekül ist, das eine geringere negative Ladung im Phosphatgerüst als die Phosphatdiester nativer DNA oder RNA besitzt.
25. Assay gemäß Anspruch 24, bei dem das analoge Molekül Methylphosphonat ist.
26. Assay gemaß mindestens einem der Ansprüche 15 bis 25, bei dem das Trägermaterial vor der Detektion der Oligonucleotidsonde gewaschen wird.
27. Assay gemäß mindestens einem der Ansprüche 15 bis 26, bei dem das Trägermaterial Teilchen mit einer Größe von etwa 1 um umfaßt.
28. Assay gemäß Anspruch 27, bei dem die Teilchen magnetisch sind. 30
29. Assay gemäß Anspruch 27 oder 28, bei dem die Teilchen Metaloxid-, Glas-, Polyamid-, Polyester-, Polyolefin-, Polysaccharid-, Polyglykol- oder Polyaminosäureteilchen sind.
30. Assay gemäß mindestens einem der Ansprüche 15 bis 26, bei dem das Trägermaterial Faser umfaßt.
31. Assay gemäß mindestens einem der Ansprüche 15 bis 26, bei dem das Trägermaterial eine Membran ist.
32. Assay gemäß mindestens einem der Ansprüche 15 bis 31, bei dem die Kationen Alkyl- oder Arylamine oder -imine sind.
33. Kit für die Durchführung des Assay für ein eine Zielsequenz enthaltendes Polynucleotid, umfassend:
(a) eine Oligonucleotidsonde, die kleiner als das Polynucleotid für die Zielsequenz ist; und
(b) ein Trägermaterial mit eine Vielzahl von Kationen, welche für die Wechselwirkung mit Anionen auf dem Polynucleotid unter Bedingungen zur Verfügung stehen, unter denen das Polynucleotid an dem Trägermaterial bindet, die aber zur Bindung des Oligonucleotids am Trägermaterial unzureichend sind; wobei das Trägermaterial in der Lage ist, Polynucleotide entsprechend ihrer Ladung oder Länge zu trennen, und folgendes ist:
ein magnetisches Amin-Trägermaterial;
ein magnetisches Propylamin-Trägermaterial;
ein magnetisches quaternäres Ammonium-Trägermaterial;
ein magnetisches Poly-D-lysin funktionalisiertes Trägermaterial;
ein Poly-D-lysin funktionalisiertes Polyurethan-Trägermaterial;
ein Spermin-Latex-Trägermaterial;
ein Tris-(2-aminoetyl)amin-Latex-Trägermaterial
ein perlenförmiges Tris-(2-aminoetyl)amin-Agarose-Trägermaterial;
oder
ein Tris-(2-aminoetyl)-Polyurethan-Trägermaterial; und
34. Kit gemäß Anspruch 33, das ferner ein Elutionslösung umfaßt, welche in der Lage ist, Hybrid-Polynucleotid von dem Trägermaterial zu eluieren.
35. Kit gemäß Anspruch 34, bei dem die Hybridelutionslösung 50%iges Formamid, Phosphatlösung, Pyrophosphatlösung, Tripolyphosphatlösung oder Phytinsäurelösung ist.
36. Kit gemaß mindestens einem der Ansprüche 33 bis 35, bei dem die Sonde derart ausgewählt wird, daß das Zielpolynucleotid mindestens 3mal größer als die Sonde ist.
37. Kit gemäß Anspruch 36, bei dem das Zielpolynucleotid mindestens 5mal größer als die Sonde ist.
38. Kit gemäß mindestens einem der Ansprüche 33 bis 37, bei dem die Sonde ein zur DNA oder RNA analoges Molekül ist, das eine geringere negative Ladung im Phosphatgerüst als die Phosphatdiester nativer DNA oder RNA besitzt.
39. Kit gemäß Anspruch 38, bei dem das analoge Molekül ein Methylphosphonatanalogon ist.
40. Kit gemäß mindestens einem der Ansprüche 34 bis 39, bei dem die Sonde zur Ermöglichung der Detektion eine Markierung aufweist.
41. Kit gemäß mindestens einem der Ansprüche 33 bis 40, bei dem das Trägermaterial Teilchen umfaßt.
42. Kit gemäß Anspruch 41, bei dem die Teilchen eine Größe von etwa 1 um besitzen.
43. Kit gemäß Anspruch 41 oder 42, bei dem die Teilchen magnetisch sind.
44. Kit gemäß mindestens einem der Ansprüche 41 bis 43, bei dem die Teilchen Metaloxid-, Glas-, Polyamid-, Polyester-, Polyolefin-, Polysaccharid-, Polyglykol- oder Polyaminosäureteilchen sind.
45. Kit gemäß mindestens einem der Ansprüche 33 bis 40, bei dem das Trägermaterial Fasern umfaßt.
46. Kit gemaß mindestens einem der Ansprüche 33 bis 40, bei dem das Trägermaterial eine Membran ist.
47. Kit gemäß mindestens einem der Ansprüche 33 bis 46, bei dem die Kationen Alkyl- oder Arylamine oder -imine sind.
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