NO884847L - Polykationiske baerere for rensing av nukleinsyrer. - Google Patents

Description

1. Qppfinnelsesområdet

Oppfinnelsen vedrører polykationiske bærere og deres anvendelse for rensing av nukleinsyrer, immobilisering av nukleinsyrer for hybridiseringsprosedyrer, og selektiv separering av forholdsvis store hybridiserte polynukleotider fra oppløsning uten i vesentlig grad å fjerne uhybridiserte mindre polynukleotid- eller oligonukleotid-prober.

2. Beskrivelse av kient teknikk

I de senere år har det vært et dramatisk forsterket ønske å rense polynukleotidet og på en enkel måte å gjennomføre hybridiseringsreaksjoner for å detektere spesifikke nukleotidsekvenser i polynukleotider. Av denne grunn er det blitt utviklet tallrike metoder for separering av polynukleotider og deres hybrider og for detektering av spesifikke target-nukleotidsekvenser i polynukleotider under anvendelse av polynukleotid- eller oligonuklotid-prober.

På området med polynukleotider rensing anvendes prosedyrer enten for å rense polynukleotider før hybridisering eller å fjerne biologiske forurensninger som kunne innvirke på forskjellige biokjemiske prosedyrer. Historisk er det anvendt forskjellige metoder som f. eks fenolekstraksjon, etanolut-felling, gelelektroforese, gelpermeasjonskromatografi, og densitetsgradientsedimentasjon (Gilham, 1964; Scott&Kuhns, Analytical Biochem., 47, 471-478 [1971]; Cox&Leoning-Cook et al., [1973]; Shih&Martin, Biochemistry, 13:3411-3418

[1974]; Enea&Zinder, Science, 190:584-586 [1985]; Shih&Khoury, Biochemistry 15:487-493, [1976]; Longacre&Mach, J. Biol. Chem. 253:7500-7507 [1978]; Goldberg et al., Methods in Enzymol., 68:206-242 [1979]; Kreigh et al., Analytical Biochem., 134:288-294 [1983]; og Gautreau, et al., Analytical Biochem., 134:320-324 [1983]).

Mer nylig er det anvendt høytrykks-væskekromatografering for rensing i preparativ skala av enkle og dobbelt-trådede polynukleotider. Anionbytter-kolonner anvendt i denne metode inkluderer RPC-5 (Pearson et al., Biochem. biophys. Acta., 228, 770-774, [1971]), andre belagte bærere innlemmer Kel-F

(Shum og Crothers, Nucl. Acids Res., 5, 2297-2311, [1978])

eller silisiumbehandlede glasskuler (Narihara et al., J. Chromatog., 236, 513-518, [1982]) og dietylamino-etyl-derivatisert silika som f. eks Nukleogen<1>/ (Colpan og Riesner, J. Chromatog., 296, 339-353, 81984]; Hecker et al., J. Chromatog., 326, 251-261, [1985]; og Muller, Eur. J. Biochem., 155, 203-212, [1986]).

I tillegg inkluderer andre mer nylige rensemetoder både den selektive adsorpsjon av polynukleotider til overflater av spesialiserte bærere (Johnson et al., Biotechniques, 4, 64-70

[1986], Guenter et al., Fed. Proe, 44, 1622 (abs. 7086)

[1985] og immobilisering av polynukleotider ved hjelp av komplementære nukleinsyresekvenser (Nanibushan&Crothers, Eur. Pat. App. No. 130, 523 [1985]; Ruth et al., Fed. Proe. 44, 1622 (abs. 7088), 1985; Blakesley og Thompson, Int. Pat. App. No. PCT/US84/00508 [1985]).

De ovennevnte rensemetoder forsetter imidlertid å lide av en eller flere av de følgende begrensninger, særlig når de tilpasses et klinisk miljø. Disse begrensninger inkluderer at de er tidskrevende og arbeidskrevende, de gjenvinner ikke kvantivt de ønskede nukleotider, de er ikke forlikelige med kliniske prøver, eller de kan ikke lett tilpasses automa-tiserte systemer.

I tillegg til rensing av polynukleotider er faste bæerere blitt anvendt for separering av hybrider av et polynukleotid og en nukleotidkode fra uhybridiserte polynukleotid- eller oligonukleotid-prober. Hybridisering av polynukleotider i forbindelse med passende merkede polymere nukleotidprober har lenge vært anerkjent som en spesifikk og følsom metode for

V Nukleogen er et registrert varemerke for Macherey-Nagel, Duren, West Germany.

detetektering av entydig eller feileksprimert polynukleotid-targetsekvens. Denne evne tillater deteksjon av smittsom organismer som bakterier, virus, parasitter og sopp, genetiske sykdommer som sigdcelleanemi og forskjellige krefttyper. Den manglende evne til hurtig å fordelaktig å separere hybridiserte polynukleotider fra uhybridiserte polynukleotider har imidlertid begrenset bruken av hybridiseringsprosedyrer ved klinisk diagnose og innenfor forsknings-miljøet.

I mer enn 20 år har forskere arbeidet med å utvikle metoder for identifisering av nærværet av "target" polynukleotider under anvendelse av hybridisering. Disse metoder har stort sett vært basert på separering av polynukleotidhybrider fra uhybridiserte polynukleotid- eller oligonukleotid-probemolekyler. I 1963 og 1964 rapporterte Nygaard&Hall (Biochem. Biophys Res. Commun., 12 98 [1963]; J. Mol. Biol., 9, 125 [1964] en metode for separering av DNA/RNA hybrider ved filtrering gjennom nitrocellulose. Disse forskere fant at enkelt-trådet og dobbelt-trådet RNA ikke klebet til nitrocellulose, men at enkelt-trådet DNA eller DNA kompleksdannet til RNA klebet til nitrocellulose. En reaksjon mellom radiomerket RNA og umerket DNA kunne således overvåkes ved å måle mengden av radioaktivitet som ble fanget på filteret.

Denne prosedyre ble etterfulgt av en metode beskrevet av Gillespie og Spiegelman, (J. Mol. Biol., 12, 829 [1965]) hvori enkelt-trådet DNA ble immobilisert på nitrocellulose-filteret og hybridisert med en oppløsning inneholdende radiomerket RNA. Etter fjernelse av overskudd av RNA ble hybridiseringsgraden bestemt ved hjelp av mengden av radiomerking immobilisert på filteret.

Det følgende år rapporterte Denhardt (Biochem. Biophys. Res. Commun., 23, 641 [1966]) utviklingen av et lignende system hvorved enkelt-trådet DNA ble immobilisert på nitrocellulose, filteret ble "kapslet" for å redusere ikke-spesifikk bakgrunn, og det immobiliserte DNA hybridisert med en oppløsning inneholdende en passende radiomerket DNA-probe. Dette har forblitt en av de foretrukne hybridiseringsprosedyrer hittil. Denne prosedyre er imidlertid arbeidskrevende og tidkrevende og krever vanligvis mer enn et døgn å fullføre.

I tillegg til nitrocellulose har hydroksyapatitt vært anvendt for å separere enkelt-trådede og dobbelt-trådede poly-nukleotidspecies. Britten og Kohne, f. eks, (Carnegie Inst. Washington Yearbook, 65, 78 [1966]) anvendte hydroksyapatitt for å separere [^<2>P]-merket E. coli DNA-fragmenter som var hybridisert fra E. coli DNA-fragmenter som ikke var hybridisert. Disse metoder ble ytterligere raffinert av Brenner et al. (Anal. Biochem., 28, 447 [1969]), for å gjennomføre separeringer i prøverør.

Andre prosedyrer er blitt utviklet ved anstrengelser for ytterligere å forbedre immobilisering av DNA og RNA for hybridiseringreaksjoner. Disse inkluderer fiksering av DNA og RNA til cyanur-kloridaktivert papir (Hanger et al., Biochem. Biophys. Acta, 653, 344 [1981]) og aryldiazonium-cellulose papirer (Seed, Nucl. Acids Res., 10, 1799, [1982]).

Prosedyrer også beskrevet for visualisering av ikke-isotop-merkede biotinylerte prober hybridisert til DNA eller RNA immobilisert på nitrocellulose (Leary et al., Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A., 80, 4045 [1983]). Denne prosdyre er imidlertid ennå mer arbeidskrevende enn tidligere forskrifter som anvender radiomerking ettersom den krever ytterligere trinn med "kapsling" og vasking.

Ved anstrengelser for å forbedre deteksjon av "target"-polynukleotid under anvendelse av hybridisering, er det utviklet tallrike prosedyrer som anvender en dobbelt-(sandwich)-hybridisering. Vanligvis anvendes et immobilisert polynukleotid for å finne target-polynukleotidet etterfulgt av hybridisering med et annet polynukleotid som er merket (Dunn&Sambrook, Methods. Enzymol., 65, 468-478 [1980];

Palva, Journal Clin. Micro., 18, 92-100 [1983]; Virtanen et al., Lancet, 381-383 [1983]; Ranki et al., Gene, 21, 77-85

[1983]; Ranki&Soderland, U.S.P.N. 4.486.539 [1984]; Polsky-Cynkin et al., Clin Chem., 31, 1438-1443 [1985]; Ranki et Soderlund U.S.P.N. 4.563.419 [1986]).

Ved en anvendelse av sandwich-assayprosedyre gjennomføres begge hybridiseringsreaksjonene i oppløsning etterfulgt av separering på immobilisert streptavidin som separerer hele polynukleotid-sandwichen under anvendelse av en biotinmerket probe (Hansen&Jones, E.P.O. 0 139 489 [1985]).

Hybridiseringssystemene beskrevet i det foregående mangler fremdeles lett håndtering og hastighet for å gjøre hybridiserings-assayprosedyre sterkt anvendelig i et klinisk miljø. De er generelt tidkrevende, arbeidskrevende og mangler følsom-het. I tillegg er mange av dem uforlikelige med midler inneholdt de biologiske prøver og kan ikke lett automatiseres.

3. Definisjoner

Som anvendt i denne fremstilling blir følgende betegnelser definert som: nukleotid: en underenhet av en nukleinsyre bestående av en fosfatgruppe, en 5-karbonsukker og nitrogenholdig base. I RNA er 5-karbonsukkeret ribose. I DNA er det 2-deoksyribose. nukleotid multimer: en kjede av nukleotider knyttes sammen ved hjelp av fosfordiester-bindinger, eller en slik kjede hvori det er innført et eller flere ikke-nukeotid-elementer som gir ønskede egenskaper (f. eks detekterbarhet), kovalent bundet.

oliaonukleotid: en nukleotid multimer generelt på omtrent 10 til omtrent 100 nukleotider, men som kan ha lengde på mer enn 200 eller flere nukleotider. De syntetiseres vanligvis fra nukleotidmonomerer eller oppnås ved hjelp av enzymatiske midler.

<p>ol<y>nukleotid: en multimer generelt med lengde 100 nukleotider eller mer.

nukleotid probe: en nukleotidmultimer med en nukleotid-sekvens komplementær med en target-nukleinsyresekvens inneholdt i en annen nukleotid-multimer, vanligvis et polynukleotid, med diagnostisk betydning. Vanligvis er proben selektert til å være fullstendig komplementær til target-sekvensen. I enkelte tilfeller kan det imidlertid være tilstrekkelig eller endog ønskelig at et eller flere nukleotider i proben ikke er komplementær til den tilsvarende base i target-sekvensen. En nukleotid-probe er også vanligvis en mindre multimer enn multimeren inneholdende target-sekvenser. Typisk er det et oligonukletid, men kan være et polynukleotid og blir vanligvis merket med en kjemisk substituent som tillater dens deteksjon, f. eks ved radio-metrisk, kolorimetrisk, fluorometrisk, kjemiluminiscens-eller annen passende metode.

se<p>arerinasop<p>losnina: en oppløsning med en sammensetning som tillater immobilisering av en nukleotidmultimer, vanligvis et polynukleotid, eller hybrid derav til en kationisk fast bærer som beskrevet heri uten å binde forurensninger som i visse tilfeller inkluderer mindre polynukleotider og oligonukleotider. Når et polynukleotid blir hybridisert med en probe blir immobilisert har separe-ringsoppløsningen den ytterligere egenskap at den inhiberer binding av den fri nukleotidprobe til bæreren. vaskeo<pp>løsnina: en oppløsning med den sammesetning som tillater fjernelse av overskudd av nukleotid-probe eller forurensninger uten i vesentlig grad å fjerne en ønsket nukleotidmultimer, vanligvis et polynukleotid, eller en ønsket polynukleotidhybrid, fra overflaten fra en kationisk faststoffbærer som beskrevet heri. Sammensetningen av en vaskeoppløsning som i enkelte tilfeller være den samme som en separeringsoppløsning.

eluerinasoppløsnina: en oppløsning bestemt for å frigi en nukleotidmultimer som f. eks et polynukleotid, et hybridisert polynukleotid, eller en merket nukleotid-probe, eller en spesifikk merking fra overflaten av en kationisk fast bærer, idet den spesifikke frigivelse som skjer er avhengig av den ønskede type gjenvinning fra den faste bærer.

hvbridiseringsoppløsnina: en oppløsning bestemt for å tillate at en ønsket hybridisering foregår. Den ønskede hybridisering er typisk mellom et polynukleotid og en probe for en target-sekvens. Derfor, når hybridisering foregår ved et polynukleotid som på forhånd er immobilisert på en kationisk fast bærer, har denne oppløsning den ytterligere egenskap at den ikke spesifikke binding av nukleotid-proben til bæreren nedsettes i et minimum.

4. Oppsummering av oppfinnelsen

Den foreliggende oppfinnelse er basert på den erkjennelse at polykationiske faste bærere kan anvendes for selektivt å adsorbere nukleotid-multimer i henhold til deres størrelse, idet større multimerer blir mer fast bundet til bærere enn mindre. Den gjensidige bindingsvirkning antas i det minste delvis å være basert på de ioniske tiltrekningskrefter gjennom en positiv utladet bærer og det negativt ladede sukkerfosfat-hovedkjede i nukleotid-multimeren. Disse egenskaper kan anvendes ved porsjonsprosedyrer for både hurtig å rense polynukleotidet og separare hybrider derav fra komplekse oppløsninger.

En fremgangsmåte i henhold til oppfinnelsen tillater rensing av nukleotid-multimerer i oppløsninger inneholdende forskjellige bestanddeler av den organisme hvorfra multimerene er oppnådd inklusive multimerer med lavere molekylvekt, ved å adsorbere de ønskede multimerer til den polykationiske bærer. I tilfellet av kliniske prøver blir nukleotid-multimerene også fjernet fra andre bestanddeler i kroppsvæskene og vevene hvorfra multimerene skal separeres. Etter separering av den faste bærer fra oppløsningen kan multimerene elueres fra bæreren.

Ved en ytterligere fremgangsmåte i henhold til oppfinnelsen brukbar ved hybridiseringsprosedyrer for å detektere forholdsvis lange polynukleotider med kortere, merkede nukleotid-prober, kan den polykationiske bærer anvendes for å separere polynukleotider og hybrider derav med proben, fra den uhybridiserte probe. Ved en hittil foretrukket ut-førelsesform av denne metode tilsettes proben til en oppløsning inneholdende polynukleotider og hybridisering tillates å foregå før immobilisering. Etter hybridisering med proben bringes oppløsningen i kontakt med bæreren for å adsorbere polynukleotidene, inklusive eventuelle hybrider derav med proben. Ved en hittil mindre foretrukket ut-førelsesform blir den polykationiske bærer tilsatt til oppløsningen inneholdende polynukleotider for å adsorbere den til bæreroverflaten før tilsetningen av proben. I dette tilfelle foregår hybridisering på bæreroverflaten. Ved begge utførelsesformer vil de forholdsvis lange polynukleotider binde til bæreren ved gjensidig innvirkning mellom den kationiske overflate av bæreren og den negativt ladede polynukleotid-hovedkjede. Probe-nukleotider som ikke binder til polynukleotidet bindes ikke til bæreren og forblir i oppløsningen.

Bæreren, og enhver nukleotidprobe bundet som et hybrid med polynukleotidet, kan separeres fra oppløsningen ved av-setning, sentrifugering eller filtrering. Hvis partiklene er magnetiske, kan magnetseparering anvendes. Ved renseprose-dyrer kan nukleotid-multimeren utvinnes fra den faste bærer ved bruk av elueringsmetoder. I tilfellet med probe-assaybestemmelser kan nærværet av merking i den faste fase eller i oppløsning bestemmes og relateres til nærvær og mengde av en target-nukleinsyresekvens inneholdt de polynukleotidene i prøven for kvalitative og kvantitative bestemmelser av diagnostisk betydning.

I alle utførelsesformer av oppfinnelsen tilveiebringes en meget selektiv metode for separering av nukleotid-multimerer fra ikke-nukleotidholdig material og for separering av blandinger av nukleotid-multimerer basert på deres relative mengde. Følgelig kan en rekke forskjellige rense- og assay-bestemmelsesprosdyrer, inklusive kvalitative og kvantitative prosedyrer, gjennomføres i samsvar med oppfinnelsen.

5.Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Den velkjente teknikk med nukleinsyre-hybridisering utnytter evnen av enkelt-trådede nukleotid-multimerer til å kombinere (hybridisere) med komplementære tråder under passende betingelser. Denne oppfinnelse tilveiebringer en fremgangsmåte for å detektere nærværet av et polynukleotid som har dannet en hybrid med en nukleotid-probe. Oppfinnelsen tilveiebringer også en fremgangsmåte for rensing av nukleotid-multimerer og hybrider derav.

Enhver metode for rensing av nukleotid-multimerer eller hybridisering av polynukleotider i kliniske prøver må overvinne de vanskeligheter som bevirkes av biologiske forurensninger som kan forstyrre separeringen såvel som fremme nedbrytning av polynukleotider. Tilfellet med ribosomalt RNA ("rRNA") f. eks, krever rensing fjernelse av forskjellige proteiner fra rRNA hvormed rRNA vanligvis er kompleksdannet. I tillegg må forskjellige nukleaser og andre enzymer inaktiveres for å forhindre nedbrytning av rRNA.

Hybridisering inbefatter vanligvis et langt target-poly-nukleotidmolekyl, dvs et enkelt-trådet DNA eller RNA bestående av omtrent 100 eller flere nukleotider (baser). For å bestemme nærvær eller fravær av en spesiell basesekvens (target-sekvens) inne i angjeldende target-DNA eller RNA, blir nukleotid-probemolekyler syntetisert kjemisk eller isolert fra biologiske DNA eller RNA ved hjelp av en rekke forskjellige metoder kjent på området. Nukleotid-probene er komplementære med den ønskede basesekvens av target og blir vanligvis merket med en detekterbar kjemisk species. Merkingen av nukleotid-proben er imidlertid ikke absolutt nødvendig hvis hybriden kan detekteres ved hjelp av andre midler. Typisk er prober oligonukleotider med lengde 15 - 50 baser, selv om de kan ha lengde opptil flere hundre baser. Når target-sekvensen er tilstede vil nukleotid-proben binde til target ved hjelp av gjensidig basepar innvirkning. Ved fullført hybridisering blir hybridet vanligvis separert fra oppløsningen inneholdende uhybridiserte nukleotid-probe molekyler. Ved noen anvendelser kan det imidlertid værer tilstrekkelig bare å segregere de oppløselige og uoppløselige faser, f. eks ved sentrifugering eller andre metoder som konsentrerer immobilisert hybrid uten å fjerne bæreren fra det medium hvorfra polynukleotid-hybriden er blitt er blitt adsorbert. Når først hybriden er segregert eller separert fritt for uhybridisert probe detekteres hybriden ved hjelp av standard metode. Ved direkte merkingsmetoder inkluderer radioisotoper og enzymer, fluorescerende og kjemilumini-scerende molekyler. Indirekte merkinger er også kjent hvori en kjemisk species, som ikke er detekterbar i og av seg selv, kan detekteres når den binder til et ytterligere kompleks. Et eksempel på indirekte merking er deteksjon av biotin-merkinger under anvendelse av konjugater mellom streptavidin og enzymer.

Andre midler for deteksjon som ikke krever en merket nukleotid-probe kan anvende interkalatorer som er enestående for hybriden, samt antistoffer som er spesifikke for hybriden, sensitive gravimetriske midler, endringer i refleksjon av elektromagnetisk energi, eller metoder som vil tillate elektronisk detektsjon. I visse tilfeller kan det selvfølgelig være ønskelig å måle uhybridisert probe og slike prosedyrer er også innenfor oppfinnelsens ramme.

Når kationiske faste bærere og passende separeringsopp-løsninger anvendes ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen, binder polynukleotid-targetmolekyler til bæreren, men ubundne nukleotid-prober vil ikke i særlig grad binde til bæreren. Den nøyaktig teoretiske forklaring av dette fenomen er ikke helt klar og oppfinnerene ønsker ikke å bli bundet til noen spesiell teori, men den er utvilsomt relatert til gjensidige ladnings-ladninginnvirkninger og densiteten av kationer på overflaten av bæreren. En mulig mekanisme er at under moderate buffer-betingelser hjelper ladede områder i et langt polynukleotid operativt til å finner hverandre til overflaten av den kationiske faste bærer. I motsetning har kortere nukleotid-prober ikke den samme multiplisitet av ladnings-ladnings-bindingsområder og kan således være mindre sterkt bundet til bæreren. Uansett er evnen av disse bærere til selektivt å binde lange polynukleotider fremfor oligonukleotider eller polynukleotider klar. Dette vises i de etterfølgende eksempler og det spesielle egnethet av fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen for rensing og separering av forskjellige polynukleotid-blandinger påpekes. Til forskjell fra tidligere kjente metoder tillater fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen hurtig separering av nukleotid-multimerer på basis av denne lengde og lading, særlig i hybridiseringsprosedyrer.

Det er også innenfor rammen for oppfinnelsen at det som prober anvendes analoger av konvensjonelt DNA eller RNA som har en lavere negativ ladning i fosfat-hovedkjeden. Blant slike analoger kan nevnes metylfosfonatene beskrevet i Miller et al., Biochemistry, 25, 5092 [1986].

Enkelte forslag har vært fremsatt med hensyn til bruk av en nukleotid-proben som er kovalent bundet til magnetiske mikrokuler for seleksjon av en komplementær nukleotidtråd i oppløsning. Det er kjent på området at den kovalente binding av en nukleotid-multimer direkte til faste bærere kan skape steriske hindringer som er ugunstige for den riktige gjensidige virkning mellom komplementære tråder nødvendig for hybridisering (se Life Technologies, "Immobilization of Nucleic Acids" WO 85/ 04674 [10/24/85]). I fravær av en detaljert lære med hensyn til dette er metoden beskrevet av Whitehead ikke passende for rensing og hybridisering. Den foreliggende oppfinnelse omgår behovet for kovalent binding ved å basere seg på gjensidige ioniske virkninger for å bevirke separeringen. Ved en spesielt foretrukket utførelses-form av oppfinnelsen anvendes magnetiske mikrokuler med en polykationisk overflate for å fjerne nukleotid-multimerer og hybrider derav, fra oppløsning i hvilke som helst av de forskjellige prosdyrer som er beskrevet i det foregående. Fremgangsmåtene i henhold til den foreliggende oppfinnelse anvender to hovedelementer. Disse er de kationiske fast bærere og en eller flere av flere kontaktoppløsninger anvendt for å lette immobilisering, separering, vasking og eluerings-trinn i forbindelse med prosedyrer for rensing av nukleotid-multimerer og for assay-bestemmelse for target-sekvenser i polynukleotider basert på dannelse av hybrider med nukleotid-prober. Disse oppløsninger anvendes for immobilisering av polynukleotider, separering av polynukleotid-hybrider og nukleotid-prober, vasking av immobiliserte polynukleotider (inklusive hybrider mellom polynukleotider og nukleotid-prober) , eluering av immobiliserte polynukleotider (inklusive hybrider mellom polynukleotider og nukleotid-prober) eller eluering av et detekterbart element som korelateres med nærvær av den immobiliserte hybrid mellom polynukleotider og nukleotidprober.

En gjensidig virkning eksisterer mellom sammensetningen av den kationiske faste bærer og sammensetningen av kontaktopp-løsningen slik at sammensetningen av kontaktoppløsningen bestemmes ved delvis av sammensetningen av den kationiske faste bærer og vice versa.

Videre er der en nær gjensidig virkning mellom mange av kontaktoppløsningene etter som komponentene i en slik oppløsning kan overføres og modifiseres ved tilsetning av reagenser for å utvikle den sammensetning som trenges i det neste trinn av metoden.

For å klargjøre bruken av disse sammensetninger kan de generelt brytes ned til 3 bruksområder. Disse er: I. Rensing av polynukleotider eller nukleotid-multimerer. II. Immobilisering av polynukleotid etterfulgt av hybridisering typisk for testing for spesielle nukleotid-sekvenser inneholdt i de nevnte polynukleotider. III. Separering fra og deteksjon av hybrid mellom polynukleotider og nukleotid-prober forhåndsdannet i oppløsningen.

I avhengighet av hvilke av disse prosedyrer man ønsker gjennomført kan et forskjellig sett av kontaktoppløsninger være nødvendig. Generelt er trinnene og oppløsningene nyttigef for hver av disse prosedyrer, selv om et eller flere trinn og bruken av en eller flere oppløsninger ikke behøver å være nødvendig i hvert tilfelle, som følger:

I. Rensing av nukleotid- multimerer

(1) Immobilisering av nukleotid-multimeren, vanligvis et

polynukleotid, på den kationiske faste bærer i nærvær av en separasjons-oppløsning.

(2) Fjernelse av forurensninger under anvendelse av en

vaskeoppløsning og separering av den immobiliserte multimer på den kationiske faste bæerer og oppløsningsfase.

(3) Utvinning av multimeren av overflaten av den

kationiske faste bærer under anvendelse av en eluerings-oppløsning.

II Immobilisering av polynukleotider etterfulgt av hybridisering

(1) Immobilisering av polynukleotidet på den kationiske

faste bærer i nærvær av en separeringsoppløsning.

(2) Fjernelse av forurensninger under anvendelse av en

vaskeoppløsning (eventuell).

(3) Det immobiliserte polynukleotid bringes i kontakt

med en nukleotid-probe i en hybridiserings-oppløsning sammensatt for å nedsette immobilisering av uhybridisert nukleotid-probe til et minimum.

(4) Fjernelse av uhybridisert probe under anvendelse av

en vaskeoppløsning som nedsetter immobilisering av uhybridisert nukleotid-probe og separering av det immobiliserte hybrid på den kationiske bærer og i oppløsningsfasen til et minimum (eventuell).

(5) Utvinning av hybriden eller et detekterbart element

som korelateres med nærværet av det immobiliserte hybrid under anvendelse av en elueringsoppløsning (eventuell).

(6) Detektering av hybriden eller et detekterbart element assosiert med hybriden som korelateres med nærværet av hybriden, eller den uhybridiserte nukleotid-probe .

III. Separering oa detektering av hybrider dannet i oppløsning (1) Hybridiseringen i nærvær av en hybridiseringsopp-løsning mellom en nukleotid-probe og et polynukleotid som inneholder en basesekvens som komplementær til nukleotid-proben. (2) Hybridiseringsblandingen bringes i kontakt med en

kationisk fast bærer og en separeringsoppløsning slik at alle hybrider som er dannet tillates å binde til den kationiske faste bærer uten å tillate særlig immobilisering av den uhybridiserte nukleotid-probe.

(3) Fjernelse av uhybridisert probe under anvendelse av

en vaskeoppløsning som nedsetter immobilisering av uhybridisert nukleotid-probe til et minimum (eventuelt) .

(4) Gjenvinning av hybriden eller et detekterbart

element som korelaterer med nærværet av den immobiliserte hybrid under anvendelse av en elueringsoppløsning (eventuelt).

(5) Detektering av hybriden eller et detekterbart

element som korelaterer med nærværet av hybriden den uhybridiserte nukleotid-probe i trinn (3) .

Som det vil innses av den fagkyndige på området kan denne polykationiske bærer anvendes ved en rekke forskjellige assay-typer, inklusive direkte binding, konkurranse- og probe-forskyvnings-assaybestemmelse. I tillegg kan merkingene være enten direkte eller indirekte merkinger. Ved noen probe-forskyvnings-assaytyper kunne hybridisering bevirke at merkingen forekom i den ubundne fase i motsetning til den bundne fase. De foregående eksempler tjener bare til å illustrere en egenskap av den kationiske bærer til å skjelne mellom nukleotid-multimerer. Oppfinnelsen begrenses til noen spesiell assay-type.

Av hensyn til klarheten skal den videre beskrivelse av oppfinnelsen deles opp i elementer som vedrører sammensetningen av den kationiske faste bærer og sammensetningene av forskjellige kontakt-oppløsninger. Den fagkyndige på området vil imidlertid innse at faktisk utøvelse av oppfinnelsen vil bli utøvet etter trinn som prøvetagning og prøvebehandling for å frigi de nukleotid-multimerer som renses eller probe-behandles. F. eks er nødvendigheten av å gjennomføre cellelyse og prosedyrer for dette velkjent på området og en beskrivelse av slike prosedyrer er unødvendig for en fullstendig beskrivelse av oppfinnelsen.

Kationiske faste bærere

Den polykationiske bærer-matriks i henhold til oppfinnelsen kan selekteres fra en lang rekke forskjellige uorganiske og organiske materialer inkluderende, men ikke begrenset til metalloksyder, glasstyper, polyamider, polyestere, poly-olefiner, polysakkarider, polyglykoler og polyaminosyrer. Det grunnleggende krav er at matriks-bæreren ikke feilaktig skal adsorberer hverken forurensninger eller nukletid-prober under de anvendte betingelser.

Foretrukne bærere er dem som har et høyt forhold mellom overflate og volum for å nedsette mengden av nødvendig material. Slike forhold kan oppnås ved å anvende partikler, særlig partikler med mikrometer-størrelse, meget porøse materialer, som f. eks agarose, eller fibre med en liten diameter anordnet enten enkeltvis eller i en filtermatte. Anvendelsen av små partikler med mikrometer-størrelse foretrekkes.

I de etterfølgende eksempler er det vist at matriksen kan oppfatte et magnetisk reaktivt jernoksyd som beskrevet av Whitehead et al. (U.S.P.N. 4.554.088; 19. november, 1985), en lateks-mikrokule, en sefarosekule, eller en passende funksjonalisert membran, selv om oppfinnelsen ikke er begrenset til disse materialer.

Bæreren bør ha en kationisk modifisert overflate med tilstrekkelig ladningstettehet til å tillate adsorbsjonen av det ønskede polynukleotid under passende betingelser med hensyn til salt, detergent og temperatur. Det kan være nødvendig å bestemme ladningsdensiteten empirisk, men generelt er denne i området 0,01 - 10 mikroekvivalente pr. milligram bærer.

Ladningen kan innføres ved en rekke kationer som inkluderer, men ikke er begrenset til alkyl- og aryl-aminer, inkluderende primære aminer, sekundære aminer, tertiære aminer, kvarter-nære aminer såvel som guanidiner-iminer.

Eksempler på slike elementer inkluderer 3-aminopropyl, 2-aminoetyl-3-aminopropyl, tris-(2-aminoetyl)-amin, spermin, spermidin, pentametyl-2-aminoetyl-3-aminopropylgrupper og polymerer med aminfunksjonaliteter som polylysin, poly-arginin, polyetylenimin og polyallylamin.

Funksjonaliteter som vanligvis er til stede på overflaten av bærerne kan lett modifiseres med reagenser inneholdende kationiske funksjonaliteter. Tallrike prosedyrer er kjent på området for innføring av funksjonelle grupper på overflaten av nesten enhver matriks. Se f. eks Porath og Axen (methods in Enzymology, 44, 19-45. [1976]), og Goldman et al. (i "Biochemical Aspects of Reactions on Solid Supports", G. R. Stark, ed. Academic Press [1971]).

Delvis bestemmes sammensetningen av den kationiske bærer empirisk avhengig av dens anvendelse. En typisk forskrift for sammensetning av den faste bærer følger, men andre lignende prosedyrer kan også anvendes. Hvis den kationiske faste bærer skal anvendes bare for rensing av nukleotid-multimerer, blir target-multimeren festet med hensyn til deres evne til å binde til bæereren i buffere som inneholder mindre enn 0,6 M natriumfosfat, pH = 6,8, og med hensyn til deres evne til å bli eluert i mer enn 20 mM natriumfosfat, pH = 6,8. Hvis polynukleotidet ikke binder i mindre enn 0,6 M natriumfosfat, pH = 6,8 blir kationdensiteten øket eller antallet kationer ved de enkelte tilknytningssteder økes (f. eks erstattes en 3-aminopropylgruppe med en tris-(2-aminoetyl)-amingruppe). På den annen side, hvis polynukleotidet ikke kan elueres i buffere med mer enn 20 mM natriumfosfat, pH = 6,8, reduseres kationdensiteten eller antallet kationer ved enkelte tilknytningssteder reduseres.

Når bæreren skal anvendes for separering av polynukleotider fra nukleotid-prober er det ytterligere krav at nukleotid-proben ikke skal binder i særlig grad under betingelser som tilbakeholder hybriden. Disse betingelser kan testes ved overvåkning av bindingen av både polynukleotidet og nukleotid-proben mellom 20 mM og 0,6 M natriumfosfat, pH = 6,8, og selektering av en bufferkonsentrasjon som gir et maksimalt bindingsforhold mellom polynukleotid og nukleotidprobe. Hvis tilfredstillende bindingsforhold ikke kan oppnås blir overflatedensiteten og antallet kationer ytterligere modifisert.

Det bør bemerkes at generelt bør lengden av polynukleotidet i forhold til nukleotid-proben vanligvis være i forholdet mer enn 3-1 for god separering, og er foretrukket mer enn 5-1. Bruken av DNA eller RNA-analoger med mindre negative ladning i probe-hovedkjeden kan imidlertid tillate modifisering av dette kriterium. I tilfellet med noen probe-forskyvnings- og konkurranse-assaybestemmelser behøver imidlertid 3-1 forholdet ikke tilfredstilles og probe-konstruksjoner kan faktisk være lengre enn target.

Kontaktoppløsninger

I tillegg til den polykationiske bærer er separeringsopp-løsningen av særlig viktighet og bør sammensettes omhyggelig for å lette immobilisering og forhindre nedbrytning av nukleotid-multimerene og deres probe-hybrider. Kontaktopp-løsningene kan inkludere forskjellige buffere, og konsentra-sjonene av disse vil variere i avhengighet av den ønskede operasjon. Komponentene i oppløsningen og deres konsentra sjoner i oppløsningen er avhengig av et antall faktorer: det eventuelle behov for å inaktivere nukleaser, særlig i kliniske prøver; den ønskede polynukleotid-separering; og andre trinn ønsket etter separering. Hvis f. eks et etter-følgende enzym-deteksjonsskjema skal inkluderes kan protein-denatureringsmidler eller inhibitorer være nødvendig som en del av separeringsoppløsningen for maksimalt å nedsette endogen enzymaktivitet fra bakgrunnen.

Komponentene som er tilbake fra tidligere prosess-trinn må også tas i betraktning. F. eks vil i de fleste tilfeller separasjoner bli foretatt ved å fjerne polynukleotider fra biologisk material eller hybridiseringsreaksjoner. Forskjellige komponenter og reagenser som anvendes enten for å frigjøre polynukleotidene fra biologiske prøver eller som anvendes for å lette hybridisering (dvs hybridisering i aksellerert takt) vil bli tilbake som komponenter i den etterfølgende separeringsoppløsning.

Kontaktoppløsningene har mange komponenter felles og i noen tilfeller kan deres sammensetninger være identiske. F. eks kan sammensetningen av vaskeoppløsningen og separeringsopp-løsningen være lik med hensyn til inhibering av nuklease-aktivitet, forhindring av binding av nukleotid-prober, og ved å hindre skadelige virkninger av substanser assosiert med hybridisering med aksellerert takt.

Det første trinn i sammensetningen av kontaktoppløsningene er avhengig av den ønskede bruk av den kationiske faste bærer. Det neste trinn er å sammensette kontaktoppløsningene. Generelt blir reagensene for sammensetningen valgt fra de følgende kategorier.

Enzymer - Disse anvendes delvis for å nedbryte og inhibere nukleaser, avbryte innvirkningen mellom protein/nukleinsyre og i enkelte tilfeller spalte merking som er assosiert med immobiliserte hybrider. De kan inkludere proteaser, di-esteraser, nukleaser og peptidaser.

Nukleaseinhibitorer - Disse midler anvendes for å forhindre nedbrytning av både polynukleotin-molekyler og nukleotin-prober. De inkluderer ribonuklease-inhibitorer som vanadyl-sulfat, vanadyl-ribosider og "RNAGuard" (human plasental ribonuklease inhibitorer, Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ, USA), deoksyribonuklease-inhibitorer og detergenter som natriumdodecylsulfat og litiumlauryl-sulfat som er generelle protein-denatureringsmidler.

Chelaterende midler - Disse substanser anvendes for chelatering av forskjellige metaller som når de er uchelatert er essentielle for aktiviteten av forskjellige enzymer.

F. eks krever mange deoksyribonuklease Ca<2+>for aktivitet.

Chelatering av metallioner er også viktig for optimalisering av hybridiseringsreaksjoner ettersom metaller som f. eks Mn<2+>kan forstyrre hybridiseringen. Chelaterende midler inkluderer etylen-diamintetraeddiksyre (EDTA) og etylen-glykol-bis(2-aminoetyl-eter)-N,N,N',N'-tetraeddiksyre (EGTA).

Detergenter - Disse substanser anvendes for å hjelpe til med å oppløse partikkelformet material, inhibere nukleaser, og redusere uønsket immobilisering av forurensninger og nukleotider til kationisk bærer under anvendelse av separe-ringsoppløsninger og vaskeoppløsninger. Detergenter kan også anvendes for å påskynde hybridiseringsreaksjoner<2>/. Under noen forhold kan en detergent anvendes for å hindre skadelig innvirkning av en annen detergent ved å danne blandede miceller. Substanser i detergentkategorien inkluderer natrium-dodecylsulfat, litium-laurylsulfat, N-lauroyl-sarcosin, natrium-diisobutyl-sulfosuccinat, "Triton" X-100, "Brij"," Tween"-20 og "Tween"-80<3>/.

Buffersalter - Disse substanser anvendes for opprett-holdelse av pH områder som er forlikelige med nukleotid-

<2>/ System for aksellerert takt er patentsøkt.

<3>/ "Triton", "Brij" og "Tween" er varemerker for ICI Amerika.

multimerenes stabilitet, hybridstabilitet og stabiliteten av midler anvendt som merkinger. Disse substanser anvendes også for å etablere den primære balanse mellom immobilisering av hybrider på den kationiske faste bærer tilbakeholdelse av nukleotid-prober i oppløsning under anvendelse av separe-ringsoppløsning. I tillegg anvendes den for å etablere selektiviteten i hybridiseringsoppløsningen. Konsentrasjonen av forskjellige salter kan også anvendes for å hjelpe til med eluering av hybrider eller en nukleotidprobe assosiert med et hybrid fra overflaten av bæreren. Slike substanser kan inkludere salter av kalium, natrium, kalsium, guanidin, klorid, fluorid, sulfat, fosfat, acetat, succinat, fytinsyre og tripoly-fosfat(men er ikke begrenset til disse).

Organiske løsningsmidler - Disse oppløsninger anvendes for å hjelpe til med å emulere forskjellige substanser, endre hybridiseringstemperaturen og betingelser, fjerne foruren-sende substanser og hjelpe til med å fjerne nukleotid-prober og hybrider under anvendelse av elueringsoppløsninger. Slike organiske løsningmidler kan inkludere metanol, etanol, isopropylalkohol, formamid og dimetylformamid.

Andre organiske og uorganiske substanser - Andre substanser kan anvendes i forskjellige kontaktoppløsninger for å meddele en ønsket egenskap. Disse inkluderer organiske og uorganiske syrer som eddiksyre og fosforsyre, hydrogenfluorid, svovel-syre og salpetersyre. De inkluderer også uorganiske substanser som kan anvendes for å fjerne merkingen fra en nukleotid-probe under anvendelse av en elueringsoppløsning. Disse kan inkludere periodat, blyacetat og mangandeoksyd.

De individuelle kontaktoppløsninger som kan anvende i spesifikke tilfeller blir generelt sammensatt som følger: Hybridiseringsoppløsning - Sammensatt generelt med en saltbuffer, detergenter, nuklease inhibitorer og chelaterende midler. Sammensetningen foretas for å lette hybridisering mellom et polynukleotid og nukleotid-prober. Videre, når polynukleotidet blir immobilisert før hybridiseringen velges sammensetningen til å utelukke særlig binding av nukleotid-proben til den kationiske bærer.

Separeringsoppløsning - Denne omfatter generelt en saltbuffer, detergenter og nukleaseinhibitorer slik at det tillates immobilisering av hybridet uten å tillate særlig immobilisering av nukleotid-proben.

Vaskeoppløsning - Sammensatt generelt med saltbuffer og detergenter slik at hybridet holdes immobilisert mens fjernelse av forurensninger og uhybridisert nukleotid-probe tillates.

Elueringsoppløsning - Omfatter generelt en saltbuffer, organiske løsningsmidler, detergenter og andre reagenser slik at det frigis et polynukleotid, en polynukleotid-hybrid, nukleotid-probe eller en merking assosiert med en hybrid fra overflaten av bæreren.

Deteksjonsoppløsninger - Sammensatt spesifikt for å detektere hybriden eller en spesifikt merking. Dens sammensetning er avhengig av deteksjonsmidlene og sammensettes i henhold til tidligere kjente metoder. Hvis merkingen f. eks er et enzym vil deteksjonsoppløsningen inneholde det selekterte enzym-substrat og andre reagenser.

Fagkyndige på området som har hatt fordelen med den foregående generelle beskrivelse vil også være i stand til å "skreddersy" komponentene i spesifikke kontaktoppløsninger til en lang rekke forskjellige prosdyrer og betingelser innenfor vanlig dyktighet på området, spesielt med henvisning til de etterfølgende eksempler. Materialer anvendt i de etterfølgende eksempler inkludert: magnetiske amin-mikrokuler ble oppnådd fra Advanced Magnetics, Inc. (Cambridge, MA, USA; "Biomag" M 4100, 50 mg/ml i vann);lysozym var kvalitet I fra Sigma, St. Louis, MO, USA; urea var enzymrenhet fra Bethesda Research Labs, Bethesda, MD, USA; "RNAGuard" (human placental ribonuklease-inhibitor) fra Pharmacia, Piscataway, NJ, USA; "Cytoscint" (flytende scintillasjonscocktail) fra WestChem, San Diego, CA, USA; polyetylenglykol 8000 fra Eastman-Kodak, Rochester, NY, USA; diisobutyl-sulfosuccinat (DIBSS), se eksempelene 7 og 12, anvendt i Gen-Probe, Inc. aksellerert takt-system (patentsøkt) fra Mona, IN, USA, hydroksyapatitt (HAP) og Zwittergent 3-14 var fra Behring-Diagnostics, Calbiochem Division, La Jolla, CA, USA; natriumdodecylsulfat (SDS) var fra Sigma, St. Louis, MO, USA; og likeledes "Trizma-base" (Tris); "Triton" X-100 var fra Fisher Diagnostics, Orangeburg, NY, USA; vanlig [<3>H]-rRNA (16S og 23S subenheter av E. Coli ribosom). rRNA av 16S subenhet er omtrent 1500 baser lang, 23S subenhet er omtrent 3000 baser. Alle andre reagenser var av reagensrenhet. Alle fosfatbuffer (PB) var natriumsaltet på pH 6,8 med mindre annet er angitt. Alle operasjoner er gjennomført ved romtemperatur i 1,5 ml skrukorklukkede polypropylen-mikrosentrifugerør med mindre annet er angitt.

Eksempel 1

Binding av rRNA magnetiske amin- mikrokuler

For å bedømme virkningen av forskjellige bufferkonsen-trasjoner på rRNA binding ble blandingen for separering fremstilt ved å kombinere 5 ulOf magnetiske amin-mikrokuler, 1 ul (1 pg) [<3>H]-rRNA og 100 eller 150 ulOf av reagensene angitt i det følgende i tabell 1. Reagensene inkluderer dem som ville bli anvendt i en fullstendig assay-forskrift og ble undersøkt for å bestemme deres virkning på rRNA-binding. Blandingene ble vortex-omrørt svakt i 2 sekunder og fikk stå i 5 - 10 minutter. De magnetiske amin-mikrokuler ble magnetisk pelletisert under anvendelse av en "Biomag" separator (Advanced Magnetics, INC., katalog #M4101) til bunnen av røret og supernatanten (ikke-binding) ble fjernet. De magnetiske amin-mikrokuler ble så vasket (en eller to ganger) ved vortexomrøring i 1 - 2 sekunder i 100 eller

150 ulOf av bufferen hvori bindingen hadde foregått, magnetisk pelletisering av de magnetiske amin-mikrokuler og fjerning av supernatantenene. De magnetiske amin-mikrokuler

ble så resuspendert i 100 eller 150 ulOf vaskebuffer og tilsatt til 15 ml "Cyntoscint" i 20 ml polypropylenrør og tilsvarende for ikke-bindings- og vaske-fraksjonen. Mengden av tritium i hver prove blir så bestemt under anvendelse av en "Nuclear Chicago" scintillasjonsteller.

Som vist i den følgende Tabell 1 er fjernelsen av rRNA ved adsorbsjon til magnetisk amin-mikrokuler følsom overfor endringer i buffer-konsentrasjonenl, men påvirkes ikke skadelig av andre reagenser som ville være til stede ved en fullstendig assay-forskrift. Viktigere er det at virkningen av reagenser som ikke nedsetter binding kan manipuleres ved å variere deres konsentrasjoner eller ved å tilsette andre reagenser i oppløsningen.

Eksempel 2

Binding av DNA til magnetiske amin- mikrokuler Denne undersøkelse ble foretatt for å bestemme virkningen av forskjellige buffer-konsentrasjoner og andre assay-reagenser på DNA-binding til magnetiske amin-mikrokuler. Metoden i Eksempel 1 ble anvendt, med unntagelse av at [<3>H]-cDNA mot rRNA fra Mycoplasma pneumonia ble anvendt i stedet for stam rRNA. cDNA var en blanding av cDNA som varierte i størrelse fra omtrent 400 - 1600 baser.

Som vist i Tabell 2 bindes cDNA til magnetiske amin-mikrokuler omtrent like godt som rRNA og graden av binding kan manipuleres ved variasjoner i buffer-konsentrasjoner såvel som tilsetning av andre reagenser.

<6>/HOAc innstilt til pH 4 med 5N NaOH. Endelig HOAc

konsentrasjon = 44 %.

<7>/ Vekt/volum diisobutyl-sulfosuccinat.

Eksempel 3

Eluerin<g>oa hybridisering av rRNA fra magnetiske amin-mikrokuler

Ved dette forsøk ble [<3>H]-rRNA eluert fra magnetiske amin-mikrokuler og hybridisert. I tillegg til materialene beskrevet i Eksempel 1 ble [*y<32>P]-ATP oppnådd fra Amersham Corp., Arlingtom Hts., IL, USA og T4 polynukleotid-kinase fra Bethesda Research Labs, Inc., Gaithersburg, MD, USA.

En probe ble syntetisert under anvendelse av en Applied Biosytems, Inc. Model 38OA DNA Syntetisator. Et deoksyoligonukleotid fremstilt med sekvensen

"5'-AGGACCCGTTAGTTAGGGCCGCCGT-3<1>" under anvendelse av standard fosforamiditt-kjemi (denne sekvens er komplementær til basene 1901 - 1926 av 23S subenhet av E. coli ribosom)

(probesekvens-patentsøkt). Oligomeren ble så merket på 5'-enden under anvendelse av [<32>P]-ATP og T4 polynukleotid-kinase i henhold til prosedyren til Maxam og Gilbert (Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A., 74, 560 (1977)).

[<3>H]-rRNA immobilisering, eluering og hybridisering: [<3>H]-rRNA ble immobilisert ved å kombinere 10 ul magnetisk amin-mikrokuler (50 mg/ml), 100 ul 0,14 M PB og 3 ulOf [<3>H]-rRNA (1 mg/ml). Blandingen ble svakt vortex-omrørt i 1 - 2 sekunder og fikk stå i 5 - 10 minutter. De magnetiske amin-

mikrokuler ble magnetisk pelletisert og supernatanten (ikke-binding) ble fjernet. De magnetiske amin-mikrokuler ble så vasket en gang med 100 plOf 0.14M PB og supernatanten fjernet.

For å eluere [<3>H]-rRNA ble 50 ulOf 0,6M PB tilsatt til de magnetiske amin-mikrokuler og blandingen ble vortex-omrørt i 1-2 sekunder. 5 mikroliter ble fjernet og radioaktiviteten bestemt (se Eksempel 1). Resten av oppløsningen fikk stå i 15 - 30 minutter ved romtemperatur. De magnetiske amin-mikrokuler så magnetisert i en 5 pl delmengde av supernatanten ble bestemt med hensyn til radioaktivitet. Den samme delmengde av supernatanten ble fjernet og anbragt i følgende hybridiseringsblanding i 25 yl eluert [<3>H]-rRNA i 0,6M PB (1,1 pmol), 0,5 pl [<32>P]-DNA-probe (0,23 pmol), 1,5 pl 1 % SDS, og 4 pl H2O inneholdende 31 pl oppløsning.

En kontroll-hybridisering ble også gjennomført under anvendelse av samme mengde (basert på radioaktivitet) av stam [<3>H]-rRNA: 1,8 pl stam [<3>H]-rRNA (1,1 pmol), 0,5 pl [<32>P]-DNA-probe (0,23 pmol), 14,8 pl 1,0M PB, 1,5 pl 1 % SDS, og 12,4 pl H2O som utgjorde totalt 31 pl oppløsning.

Hybridiseringsblandingene ble så inkubert i 3 timer ved 50°C. Hver blanding ble tilsatt til 5 ml 0,14 M PB inneholdende 2 % hydroksyapatitt (HAP) i et 7 ml polypropylen Scintillasjons-hetteglass. Etter vortex-blanding i 15 sekunder ble prøvene inkubert i 5 minutter ved 50°C. HAP ble så pelletisert ved sentrifugering i 2 minutter i en IEC klinisk benkesentrifuge (Needham Hts., MA, USA) ved 2000 X G. Supernatanten ble fjernet, 5 ml 0,14 M PB tilsatt og blandingen vortexblandet i 15 sekunder, etterfulgt av sentrifugering som beskrevet i det foregående. Supernatanten ble fjernet og HAP, ikke-bundet og vaske-oppløsningen ble bestemt med hensyn tilCerenkov [<32>P]-aktivitet for å bestemme prosent hybridisering, dvs prosent-andelen av probe-assosiert [<32>P]-tall bundet tilHAP.

Av [<3>H]-rRNA bundet til bæreren eluerte 80 %. Reaksjon av enten eluert rRNA eller stam rRNA med DNA-proben ga 31 % hybridsering. Resultatene indikerer at rensing av polynukleotider ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen ikke skader dem for ytterligere hybridisering eller andre undersøkelser.

Eksempel 4

Binding av rRNA i urin til magnetiske amin- mikrokuler

Dette forsøk ble foretatt for å bestemme virkningen av urin på rRNA-binding til magnetiske amin-mkrokuler. I tillegg til materialene beskrevet i Eksempel 3 ble friske urinprøver oppnådd fra frivillige.

Til 100 yl frisk urin ble tilsatt 200 yl 5 mM PB , 8m urea eller HOAc, pH 4 (iseddik ble innstilt til pH 4 med tilsetning av 0,28 ml 10N NaOH pr ml HOAc) såvel som lyl stam [<3>H]-rRNA (1 yg) og 5 yl magnetiske amin-mikrokuler. Blandingene ble opparbeidet som beskrevet i Eksempel 1, med unntagelse av at hver blandinge ble vasket med 200 yl 50 mM

PB.

Resultatene viste at i nærvær av urin vil urea, som anvendes med biologiske prøver for å frigi nukleinsyre og denaturere proteiner og nukleaser, nedsetter bindingen av [<3>H]-rRNA til 0,8 %. I urin pluss fosfatbuffere alene blir bare 13 % av [<3>H]-rRNA bundet til bæreren. Bare i kombinasjon med HOAc, pH 4 ble 100 % av rRNA bundet til de magnetiske amin-mikrokuler .

Eksempel 5

Binding av rRNA suspendert i soutum til magnetiske amin-mikrokuler

Denne undersøkelse ble foretatt for å bestemme de riktige kombinasjoner og konsentrasjoner av buffere og reagenser nødvendig for å binde [<3>H]-rRNA i mer komplekse biologiske prøver. Materialene beskrevet i Eksempel 4 pluss samlede, frosne sputa (hver samling inneholdende sputum fra flere pasienter) ble oppnådd, fra forskjellige sykehus. Sputumprøver ble først flytendegjort (umiddelbart før bruken) ved tilsetning av 1/10 volum av 0,5M ditiotreitol (DDT) etterfulgt av vortexblanding og inkubasjon i 10 - 15 minutter ved 22°C. En rekke forskjellige reagenser ble så tilsatt til 100 ul delprøver av det flytendegjorte sputum, sammen med en mikroliter stam [<3>H]-rRNA (1 pg) og 5 ul magnetiske amin-mikrokuler. Etter 5 minutters inkubasjon ved 22°C ble så prøvene behandlet som i Eksempel 1 (med den unntagelse at hver prøve ble vasket med 200 pl 50 mM PB) for å bestemme graden av [<3>H]-rRNA-binding. Resultatene er oppsummert i Tabell 3.

Eksempel 6

Hybridiserin<g>av rRNA renset fra sputum

Ved dette forsøk ble [<3>H]-rRNA fjernet fra sputum og bundet

<8>/ Det vil si delvis nøytralisert HOAc.

<9>/ HOAc/urea, pH 5, ble fremstilt ved å kombinere 840 pl pH 4 HOAc (se Eksempel 4) med 320 mg urea (slutt-volum = 1 ml, [urea] = 5.33M, 66 % delvis nøy-tralisert HOAc).

til bæreren eluert og undersøkt for å bestemme om separa-sjonsmetoden anvendt i samsvar med oppfinnelsen uriktig nedsetter hybridiserbarheten.

En deoksynukleotid-probe med sekvensen

"5'-GGCCGTTACCCCACCTACTAGCTAAT-3'"(komplementær til basene 235 - 260 i 16S E. coli ribosom)<10>ble syntetisert og merket med [<32>p] som beskrevet i Eksempel 2.

Etter binding av [<3>H]-rRNA i sputum til magnetiske amin-mikrokuler og fjernelse av den ikke-bundne fraksjon (se Eksempel 5) ble de magnetiske amin-mikrokuler vasket en gang ved 1 M NaCl, 50 mM PB. Etter fjernelse av supernatant ble 50 ulOf 0,6M PB tilsatt og blandingen inkubert i 30 minutter ved 200°C eller i 15 minutter ved 72°C med leilighetsvis blanding. De magnetiske amin-mikrokuler ble så magnetisk pelletisert og prosentvis eluert [<3>H]-rRNA ble bestemt ved sammenligning av radioaktiviteten av delprøven av supernatanten med en delprøve av de magnetiske amin-mikrokuler før inkubasjonen (se det følgende).

Evnen av eluert [<3>H]-rRNA til å hybridisere til en komplementær DNA-probe (materialer) ble bestemt ved å sammenligne hybridiserbarheten av eluert rRNA med stam rRNA, både i target-overskudd og probe-overskudd. Følgende hybridiseringsblandinger ble fremstilt: (1) 30 pl eluert rRNA i 0,6 M PB (0,44 pmol), 1 pl DNA-probe (0,07 pmol), 4 pil % SDS, og 2,5 pl H2O, som utgjør totalt 37,5 pl. (2) 0,7 pl stam rRNA (0,44 pmol), 29,3 pl 0,6 M PB, 1 pl DNA-probe (0,07 pmol), 4 pl 1 % SDS, og 1,6 pl H2O som totalt utgjør 36,6 pl.

(3) 9,35 pl eluert rRNA i 0,6 M PB (0,14 pmol), 1 pl

DNA-probe (0,7 pmol) og 1,06 pl 1 % SDS som utgjør totalt 11,69 pl.

(4) =;22 pl stam rRNA (0,14 pmol), 9,13 pl 0,6 M PB, 1

<1>(VProbesekvens patensøkt.

ul DNA-probe (0,7 pmol) og 1,06 ul 1 % SDS som utgjør totalt 11,41 pl.

Hybridiseringsbehandlingene ble så inkubert i 2 timer ved 50°C, etterfulgt av isolasjon av hybrider på HAP som beskrevet i Eksempel 2. I target-overskudd viste eluert rRNA 67 % hybridiserbarhet i sammenligning med stam rRNA. I probe-overskudd viste eluert rRNA 65 % hybridiserbarhet sammenlignet med stam rRNA.

Eksempel 7

Gjenvinning av RNA/ DNA hybrider fra buffer- oppløsninger under anvendelse av magnetiske amin- mikrokuler

Dette forsøk ble gjennomført for å studere magnetiske amin-mikrokuler som en seperasjonsbærer for RNA/DNA-hybrider dannet i oppløsning. Materialene var de samme som dem som er beskrevet i Eksempel 3. I tillegg ble det anvendt en legionella spesifikk DNA-probe (gjennomsnittlig lengde 100 baser).

Evnen for magnetiske amin-mikrokuler til å separere RNA/DNA-hybrider ble undersøkt i to forskjellige systemer.

System 1: En RNA/DNA-hybrid ble dannet ved å kombinere 8 pl stam [<3>H]-rRNA (5 pmol), 1 pl deoksy-oligonukleotid-probe (0,5 pmol), 10 pl 0,28 M PB og 1 pl 1 % SDS, og inkubering av denne blanding i 1 K ved 50°C. Ytterligere ble det fremstilt en kontroll-blanding nøyaktig som hybrid-blandingen, med unntagelse av 8 pl target-RNA ble erstattet med 8 pl vann. Denne kontroll-blandingen ble også inkubert i 1 M time ved 50°C. Halvdelen av hver blanding (10 pl) ble tilsatt til 5 ml 2 % HAP i 0,14 M PB og opparbeides som beskrevet i Eksempel

2. Den annen halvdel av hver blanding ble tilsatt 200 pl

0,14 M PB + 10 pl magnetiske amin-mikrokuler og opparbeidet som beskrevet i Eksempel 1 (under anvendelse av 0,14 M PB for vasking).

System 2: En RNA/DNA-hybridblanding ble fremstilt ved å kombinere 4 yl legionella rRNA (2,5 fmol), 2 ul legionella-probe (1,3 fmol) og 196 ml inneholdende 44 % DIBSS, 30 mM PB og 3 % SDS. En kontroll-blanding ble fremstilt nøyaktig som hybrid-blandingen, med unntagelse av at de 4 pl target-RNA ble erstattet med 4 pl vann. Begge blandinger ble inkubert i 2 timer ved 72°C. En 50 pl delmengde av hver blanding ble tilsatt til 5 ml 2 % HAP i 0,14 M PB og opparbeide som beskrevet i Eksempel 2, med unntagelse av 72°C og to vaskinger. Ytterligere 20 pl av hver blanding ble tilsatt til en separasjonsblanding slik at de endelige betingelser var 150 pl totalt volum, inneholdende 18 % DIBSS, 3 % "Triton" X-100, 0,1 M PB og 10 pl magnetisk amin-mikrokuler. De magnetiske amin-mikrokuler ble så opparbeidet som beskrevet i Eksempel 1, med unntagelse av 72°C og to vaskinger (vasking 1 var 18 % DIBSS, 5 % "Triton" og 0,1 M PB, vasking 2 var 5 % "Triton", 0,1 M PB). Resultatene er vist i Tabell 4.

Dette resultat indikerer at de magnetiske amin-mikrokuler er i stand til å gjenvinne RNA/DNA-hybrider fra buffer-opp-løsninger mens uhybridisert probe etterlates i oppløsningen.

Eksempel 8

Gjenvinning av DNA/ DNA- hybrider fra oppløsning under anvendelse av magnetisk amin- mikrokuler

Dette forsøk ble foretatt for å studere magnetiske mikrokuler som en seperasjonsbærer for DNA/DNA-hybrider dannet i oppløsning. I tillegg til materialene beskrevet i Eksempel 2 ble det anvendt en syntetisk 36-base deoksy-oligonukleotid-probe komplementær til et 36-base område av cDNA beskrevet i Eksempel 2.

Oligonukleotidet ble merket med t<32>P] som beskrevet i Eksempel 3. En DNA/DNA-hybridblanding ble fremstilt ved å kombinere 20 yl cDNA-target (omtrent 20 fmol), 1 yl DNA-probe (omtrent 60 fmol) og 200 yl inneholdende 44 % DIBSS, 30 mM PB og 3 % SDS. En kontrollblanding ble fremstilt nøyaktig som hybrid-blandingen, unntatt at 20 yl target ble erstattet med 20 yl vann. Begge blandinger ble inkubert i 2 timer ved 60°C. En 5 0 yl delmengde av hver blanding ble tilsatt til enten 450 yl 2 % HAP i 0,08 M PB eller 450 yl 5 % "Triton", 45 mM PB pluss 10 yl magnetiske amin-mikrokuler. Hver seperasjons-blanding ble inkubert ved romtemperatur i 5 minutter, HAP eller mikrokulene ble pelletisert som beskrevet i de foregående eksempler og supernatanten ble fjernet. Pelleten ble vasket en gang ved romtemperatur med 500 yl enten 0,08 M PB (HAP) eller 5 % "Triton", 45 mM PB (mikrokule) som beskrevet i foregående eksempler. Alle fraksjoner ble så oppløst i 15 ml "Cytoscint" og radioaktivitet bestemt som beskrevet i det foregående. Resultatene i Tabell 5 kan sammenlignes gunstig med resultatene for system 2 i Eksempel 7 som indikerer at binding av hybrider er ladningsavhengig og uavhengig av target er RNA eller DNA.

Eksempel 9

Undersøkelse av elueringsbuffere for fjernelse av merkede nukleotid-prober assosiert med nukleinsyre-hybrider bundet til magnetiske amin- mikrokuler

Potensialet for forskjellige elueringsbuffere for fjernelse av merkede nukleotid-prober assosiert med DNA/RNA-hybrider bundet til magnetiske amin-mikrokuler ble demonstrert ved hjelp av følgende metoder.

Metode 1: En [<12>^I]-merket deoksy-oligonukleotid-probe (fremstilt ved standard metode) ble hybridisert til target-RNA i 0,5 M PB, pH 5 (30 minutter ved 60°C, 30 yl totalt volum). Deretter 1 ml 0,25 M PB, pH 5, 0,05 % "Triton" X-100 og 2,5 mg magnetiske amin-mikrokuler tilsatt, vortex-omrørt og inkubert i 5 minutter ved 60°C. Kulene ble vasket to ganger med 0,25 M PB, pH 5, 0,05 % "Triton" X-100. Mulige elueringsmidler ble testet ved å tilsette 100 yl til delmengder (5 %) av de magnetiske amin-mikrokuler, inkubering i 5 minutter ved 60°C, separering av supernatant fra kulene og måle mengden av [<125>I] tilstede i hver fraksjon under anvendelse av en •y-teller (Iso-Data, Palatine, IL, USA, Model 20/20 DM). Resultatene er oppsummert i Tabell 6.

Disse resultater viser at en lang rekke forskjellige reagenser er i stand til å fjerne merkede nukleotid-prober fra RNA/DNA-hybrider bundet til mikrokuler.

Metode 2: For å vise at andre elueringsreagenser er i stand til å fjerne merkede nukleotidprober assosiert med DNA/RNA-hybrider bundet til magnetiske amin-mikrokuler, ble følgende forskrift anvendt for å teste disse mulige elueringsreagenser.

En [<32>P]-merket deoksy-oligonukleotid-probe (fremstilt som beskrevet ovenfor) ble hybridisert til target-rRNA i 0,48 M PB (pH 5)/0,l % SDS (totalt volum 150 yl) i 30 minutter ved 60°C. Deretter ble 1 ml 0,15 M PB (pH 6,8)/5,0 % "Triton" X-100 og 2,5 mg magnetiske amin-mikrokuler tilsatt, vortex-omrørt og inkubert i 5 minutter ved 60°C. Mikrokulene ble vasket 3 ganger med 0,3 M PB (pH 6,8). Elueringsmidler ble så testet ved tilsetting av 300 yl av elueringsoppløsningen til de magnetiske amin-mikrokuler, inkubering i 5 minutter ved 60°C, separering av supernatant fra kulene og måling av mengden av [<32>P]i hver fraksjon under anvendelse av scintillasjonsteller (Delta 300 Scintillatio System, Searle Analytical, Inc., Des Plaines, IL, USA). Resultatene er oppsummert i Tabell 7.

Disse resultater viser at polyfosfater kan effektivt eluere nukleinsyre fra magnetiske amin-mikrokuler.

Eksempel 7

Bruk av magnetiske amin-mikrokuler som en fastfase-hvbridiseringsbærer

Ved dette forsøk ble target-rRNA bundet til magnetiske amin-mikrokuler og deretter hybridisert. Til 5<y>l magnetiske amin-mikrokuler ble tilsatt 100 yl 0,14 M PB og 2 yl stam [<3>H]-rRNA (2 yg, 1,26 pmol). Materialene var de samme som dem som er beskrevet i Eksempel 3. Blandingen ble inkubert i 10 minutter ved 22°C, de magnetiske amin-mikrokuler ble magnetisk pelletisert og supernatanten fjernet. Til de magnetiske amin-mikrokuler ble det tilsatt 20 yl 0,14 M PB og 0,5 yl prober (0,23 pmol). Som en kontroll ble hybrider dannet i en oppløsning av 2 yl stam [<3>H]-rRNA, 0,5 yl probe, 5 pl 0,28 M PB, 0,5 yl 1 % SDS og 2 pl H20. Begge hybridiseringsblandinger ble så inkubert i 3 timer ved 40°C. De magnetiske amin-mikrokuler ble vasket 3 ganger med 100 pl 0,14 M PB som beskrevet i Eksempel 1. Resultatene viser at graden av hybridisering av proben var 5 % i tilfellet av immobilisert rRNA sammenlignet med 20 % for hybridisering i oppløsningen (kontroll).

Eksempel 11

Bruk av magnetiske amin-mikrokuler for å rense nukleinsyrer fra cellelvsat

Dette forsøk ble foretatt for å vise at de magnetiske amin-mikrokuler beskrevet i det foregående kan anvendes for å rense RNA fra en rå prøve uten i særlig grad å redusere hybridiserbarhet. Metoden med rensing av rRNA ble undersøkt under anvendelse av rRNA fra Legionella pneumophilia. Materialene var de samme som dem som er beskrevet i Eksempel 5. I tillegg ble det anvendt en Legionella spesifikk-probe og Legionella pneumophilia organismer.

Cellelyse og frigivelse av rRNA ble oppnådd ved p kombinere 30 pl vann, 5 pl Legionella pneumophilia suspensjon (5 x IO<5>organisme) og 5 pl 24 % SDS, 0,08 M Tris-base, 0,08 EGTA og 0,08 M EDTA, etterfulgt av inkubasjon i 30 minutter ved 72°C. En fjerdedel av prøvene (10 pl) ble så assay-bestemt direkte på rRNA under anvendelse av følgende assay-blanding: 10 pl prøver + 114 pl 5,94 M PB + 1 pl DNA-probe<11>/ + 7 5 pl vann. Blandingen ble inkubert i 30 minutter ved 72°C og ble så analysert for hybrid-dannelse under anvendelse av HAP som beskrevet i Eksempel 2, med unntagelse av at HAP-bindings-trinnet ble foretatt ved 72°C i stedet for 50°C. Til ytterligere 10 pl ble det tilsatt 30 pl HOAc/urea (se eksempel 5), blandingen ble vortex-omrørt i 5 sekunder, 5 pl magnetiske amin-mikrokuler ble tilsatt og blandingen ble svakt vortex-omrørt (omtrent 3 sekunder). Etter inkubasjonen i 5 minutter i 22°C og etterfølgende vaskingen med 150 pl IM

H/ System med akselerert takt patentsøkt.

NaCl, 50 mM PB ved 22°C, ble det bundne rRNA eluert ved 50 yl 0,6 M PB (detaljer beskrevet i Eksempel 2). Elueringsmiddelet ble så assay-bestemt på rRNA med å kombinere 50 yl prøve,

109 yl 5,94 M PB, 1 yl DNA-probe og 40 yl vann, inkubering av blandingen i 30 minutter ved 72°C og analysering av hybrid-dannelsen under anvendelse av HAP (se eksempel 2). Resultatene ble oppsummert i Tabell 8.

Eksempel 12

Rensing av nukleinsyre fra sputum med magnetiske amin-mikrokuler

I dette forsøk ble bruken av magnetiske amin-mikrokuler for rensing av Legionella pneumophilia rRNA fra sputum og etterfølgende hybridiserbarhet av det nevnte rRNA ble demonstrert. Materialene var de samme som i Eksempel 7. En kombinert sputumprøve ble flytendegjort som beskrevet i Eksempel 5. Til 30 yl delmengder av denne sputumprøve eller 30 yl delmengder av vann ble det tilsatt 5 yl av en Legionella pneumophilia-suspensjon (2-10<6>, 2-10<5>eller 2-10<4>celler pr 5 yl). Under anvendelse av den samme prosedyre som beskrevet i Eksempel 11 ble cellene lysert, en halvdel av hver prøve ble hybridisert direkte (20 yl prøve og 65 yl vann anvendt her) og en halvdel hybridisert etter rensing av rRNA under anvendelse av magnetiske amin-mikrokuler (20 yl prøve og 60 yl HOAc/urea anvendt her). Hybrid-dannelse ble analysert under anvendelse av HAP (se Eksempel 2). Resultatene er vist i Tabell 9.

Eksempel 13

Aksellerert oppløsningshybridisering<12>/ av rRNA fra Legionella pneumophilia med separering hybridet på magnetiske amin- mikrokuler

I dette forsøk ble det demonstrert bruk av magnetiske amin-mikrokuler for deteksjon av Legionella pneumophilia rRNA i sputum med aksellerert oppløsningshybridisering. Materialene var de samme som dem som er beskrevet i Eksempel 11, med unntagelse av at individuelle sputa ble anvendt i stedet for den kombinerte sputa. Ytterligere ble 5 ml skrukorkrør anskaffet fra Vanguard (Sverige); glasskuler (0,2 - 0,3 mm) fra Glen Mills, Inc., Maywood, NJ, USA; ultralydrenseren fra Branson Equipment Co., Shelton, CT, USA (Model 1200) og Corning magnetiske separator-utstyr fra Advanced Magnetics, Inc. (katalog #M4700).

Individuelle sputa ble flytendegjort som beskrevet i Eksempel 5 for kombinerte sputa. De flytendegjorte sputa ble deretter podet med Legionella pneumophilia (se Eksempel 10) slik at 0,1 ml inneholdt 10<4>organismer. Til 5 ml rør ble tilsatt 100 pl glassekuler (syrevasket), 100 ul lysebuffer (20 % SDS, 10 mM EDTA, 10 mM EGTA, 50 mM Tris, pH 8,0) og 0,1 ml podet sputum eller 0,1 ml negativ kontroll (1 mg/ml kalvetymus DNA i 0,1 % SDS), alle i triplo. Prøvene ble så ultralydbehandlet i 15 minutter ved 72°C, 2 ml probe-oppløsning (44 % DIBSS,

<12>/ Aksellerert taktsystem patentsøkt.

50 mM PB, pH 6,8, 10.000 cpm Legionella spesifikk DNA-probe pr 2 ml) ble tilsatt, blandingen ble vortex-omrørt og deretter inkubert i en time ved 72°C. Hybridene ble så isolert ved hjelp av en av de følgende prosedyrer (alle in triplo): 1. HAP, sentrifugering - 2ml av separeringsopp-løsning (5 % HAP i 0,26 M PB, pH 6,8, 0,02 % SDS) ble tilsatt til hvert rør, rørene ble snudd 5 ganger, inkubert med 72°C i 5 minutter, invertert 20 ganger, deretter centrofugert i 2 minutter ved 2000 xg. Supernatanten ble avdekantert og kastet, 4,5 ml vaskeløsning (0,14 M PB, pH 6,8, 0,02 % SDS) ble tilsatt, hvert rør ble fort tekstbehandlet i 20 sekunder, og HAP ble pelletisert og supernatanten ble dekantert som beskrevet i det foregående. Hvert rør ble så bestemt med hensyn til radioaktivitet i en Berthold gammateller. 2. Magnetiske amin-mikrokuler, sentrifugering - 2,75 ml magnetisk separeringsoppløsning, 9,5 % "Triton", 0,15 M PB, pH 6,8, 150 ul magnetiske amin-mikrokuler pr 2,7 5 ml oppløsning) tilsatt hvert rør, og rørene ble opparbeidet som i prosedyre en med følgende unntagelse: vaskeoppløsning var 18 % DIBSS, 50 % "Triton", 0,1 M PB, etter tilsetning av vaskeoppløsning ble rørene snudd for fornyet blanding av de magnetiske amin-mikrokuler. 3. Magnetiske amin-mikrokuler, magnetisk separering - denne prosedyre var nøyaktig lik prosedyre 2 med den unntagelse at den ved sentrifugering erstattes med magnetisk separering under anvendelse av Corning magnetisk separatorutstyr. Resultatene er vist i Tabell 10.

Metode 1 = HAP, sentrifugering. Metode 2 = magnetiske amin-mikrokuler, sentrifugering. Metode 3 = magnetiske amin-mikrokuler, magnetisk separering. Kontrollverdiene repren- senterer gjennomsnittet av 4 separate bestemmelser, hvert foretatt in triplo. Hybrid-verdier representerer gjennomsnittet av separate bestemmelser (30 enkeltsputa) hvert foretatt in triplo.

Eksempel 14

Bruk av magnetiske propylamin-mikrokuler for separering av rR NA

For å vise at fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen ikke er begrenset til egenskapene av en enkelt type av magnetiske kationiske mikrokuler som en bæreroverflate, men inkluderer andre kationer, ble [<3>H]-rRNA fjernet fra definerte buffere med magnetiske propylamin-mikrokuler. Materialene var de samme som dem som er beskrevet i Eksempel 1, med unntagelse av at mikrokulene er N-3-aminopropylsilan-magnetiske mikrokuler (Advanced Magnetics, Inc., spesiell bestilling).

Metoden anvendes her for fjernelse av [<3>H]-rRNA var nøyaktig den samme som anvendt i Eksempel 1, med unntagelse av at magnetiske propylamin-mikrokuler ble anvendt i stedet for magnetiske amin-mikrokuler. I 140 mM PB, bandt 93 % av rRNA til mikrokulene. I en oppløsning av 100 mM PB + 1 M NaCl ble 83 % bundet.

Eksempel 15

Bruk av magnetiske kvaternære ammonium-mikrokuler for separering av rRNA.

Magnetiske kvaternære ammonium-mikrokuler ble syntetisert for ytterligere å studere fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen med andre polykationiske bærere. Magnetiske amin-mikrokuler ("Biomag" M4100) ble anskaffet fra Advanced Magnetics, Inc. Jodmetan var fra Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wl, USA og 2,6-lutidin var fra Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA. Andre materialer var av reagensrenhet.

Magnetiske amin-mikrokuler (250 mg, 5,0 ml) ble fortynnet i 10 ml vann. Mikrokulene ble separert magnetisk og vasket i en suspensjon i 20 ml 50 % (volum/volum) etanol/vann etterfulgt av magnetisk separering. Denne vaskeprosess ble gjentatt to ganger med 20 ml absolutt etanol. De vaskede mikrokuler ble så resuspendert i 20 ml absolutt etanol. Jodmetan (250 pl, 4 mmol) og 2,6-lutindin (24,5 pl, 210<p>mol) ble tilsatt under omrøring; omrøring ble fortsatt over natten ved romtemperatur. Mikrokulene ble så fjernet magnetisk, vasket 4 ganger med 20 ml som beskrevet i det foregående og resuspendert i 5 ml vann for lagring ved 4°C.

De magnetiske kvaternære amin-mikrokuler ble så anvendt for å fjerne [<3>H]-rRNA og [<32>P]-deoksy-oligonukleotider fra definerte buffere for å undersøke evnen i bæreren til å skjelne RNA-polynukleotidet fra det DNA-oligonukleotider i oppløsning. Deoksy-oligonukleotidet var den 36mer som er beskrevet i Eksempel 8. Alle andre materialer var de samme som dem som er beskrevet i Eksempel 1.

Bindingen ble bestemt under anvendelse av prosdyren bestemt i Eksempel 1 og resultatene er vist i Tabell 11.

Eksempel 16

Bruk av magnetiske poly-D-lysin-funksjonaliserte mikrokuler for separering av rRNA

I tillegg til de kationiske derivater beskrevet ovenfor i eksemplene 14 og 15 ble manetiske mikrokuler derivatisert med<13>/ BB = natriumborat-buffer.

poly-D-lysiner.

Materialer: karboksylavsluttede magnetiske mikrokuler ble anskaffet fra Advanced Magnetics, Inc. ("Biomag" M4125, inneholdende omtrent 250 mekv karboksylgruppe pr gram). Poly-D-lysin, gjennomsnittlig polymerisasjonsgrad 68 monomeren-heter var fra Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA. N,n'-dicykloheksyl-karbodiimid (DCC) var fra Pierce Chemical Co., Rockford, IL, USA; og N-hydroksysuccinimid (NHS) var fra Eastman-Kodak Co., Rochester, NY, USA.

Ti milliliter av en 20 mg/ml suspensjon av karboksylavsluttede magnetiske mikrokuler ble overført til et teflon-foret glass-testrør med skrukork. Mikrokulen ble separert magnetisk og vasket i rekkefølge 0,1 N NaOH (10 ml), 0,1 M EDTA (10 ml, pH), vann (2-10 ml), 50 % dioksan/vann (10 ml), og tørt dioksan (3*10 ml). Mikrokulene ble så resuspendert i tørt dioksan (10 ml) inneholdende NHS (250 mg). Deretter ble DCC tilsatt (400 mg); røret ble dekket med folie for utelukkelse av lys og suspensjonen ble blandet ved ende-snuing og rotasjon i 16 timer. Etter magnetisk separering ble de NHS-modiserte mikrokuler vasket i rekkefølge med dioksan (3'10 ml), metanol (3*10 ml) og tørt dioksan (3*10 ml) og resuspendert i tørt dioksan (lOml) en milliliter av den resulterende suspensjon av NHS-modifiserte mikrokuler ble separert magnetisk, vasket med fortynnet vandig HC1 (pH 4,3), og resuspendert i en 0,5 ml oppløsning av 0,2 M NaHCO3/0,4 M NaCl/0,05 % NaN3inneholdende poly-D-lysin (7 mg). Etter 2 timer ble delmengden av en oppløsning av 1 M etanolamin HC1 (pH 8,4, 100 yl) tilsatt for å eliminere ureagerte NHS-estergrupper. Mikrokulene ble separert magnetisk, vasket med vann (2*1 ml) og resuspendert i vann (0,5 ml).

De poly-D-lysin-funksjonaliserte magnetiske mikrokuler ble vist å fremvise bindende skjelning mellom rRNA og et syntetisk oligonukleotid (26 mer) som følger: [<3>H]-merket rRNA fra E. coli og et [<32>P]-endemerket syntetisk oligonukleotid ble oppnådd.

Til et 1,5 ml polypropylenrør med skrukork ble det tilsatt poly-D-lysin-funksjonalisert mikrokuler(5 pl), buffer (0,1 M natriumfosfat, pH 6,8/o,75 M NaCl, 0,5 ml) og en delmengde fra enten en oppløsning av [<3>H]-rRNA eller en oppløsning av [<32>P]-oligonukleotid. Resulterende suspensjoner ble blandet ved vortex-blanding gjentatte ganger i løpet av en periode på 10 minutter. Supernatantene ble fjernet ved magnetisk separering og overført til hetteglass inneholdende scintillasjonsfluid (5 ml, "Betagel"-coktail). Radioaktiviteten ble så kvantifisert i scintillasjonstelling:

[<32>P]-oligonukleotid bundet til mikrokule: 0 - 3 %

[<3>H]-rRNA bundet til mikrokuler: 7 8 - 82 %.

Eksempel 17

Bruk av magnetiske amin-mikrokuler ved en kjemilumineserende ikke- isotop- assav

For å vise evnen til magnetiske amin-mikrokuler til å kunne anvendes som en seperasjonsbærer for et ikke-isotop-assay-system ble separering av hybrider dannet under anvendelse av en syntetisk deoksyoligonukleotid-probe merket med en kjeminluminiscerende akridiniumester undersøkt. I tillegg til materialene gjengitt i Eksempel 1 ble en deoksy-oligonukleotid-probe (33 mer) spesifikk for Chlamydia trachomatis rRNA syntetisert og merket med en kjeminluminiscerende akridinum-ester (AE) som beskrevet i US-patentansøkning med løpenummer 105.080 med tittel "Acridinium Ester Labeling and Purification og Nucleotide Probes", inngikk 2. oktober, 1987 av Arnold, et al. Chlamydia trachomatis rRNA ble anvendt og assay-rør var 12 • 75 mm polystyrenrør. Alle andre komponenter var av reagensenhet.

Den AE-merkede probe ble hybridisert til sitt target-RNA (i dette tilfelle, Chlamydia trachomatis) ved hjelp av følgende prosedyre:

Hybridiseringsblanding

200 pl hybridiseringsbuffere (0,1 M litiumsuccinat, pH 5,2, 10 % litium-dodecyl-sulfat, 2 mM EDTA og 2 mM EGTA)

1 pl RNA (IO<-3>pg)

1 pl AE-probe (0,125 pmol).

Kontrollblandingen var den samme som hybridiseringsblandingen med unntagelse av at den inneholdt vann i stedet for RNA. Blandingen ble inkubert i 30 minutter ved 60oC, 2 ml separeringsoppløsning inneholdende 0,4 M PB, pH 6,0, 5 %

(volum/volum) "Triton" X-100, 8 % (vekt/volum) DIBSS og

2,5 mg magnetiske amin-mikrokuler ("Biomag" M4100) ble tilsatt, blandingen ble vortex-omrørt og inkubert i ytterligere 5 minutter ved 60°C. De magnetiske amin-mikrokuler ble så magnetisk trukket til siden av røret, supernatanten ble dekantert og de magnetiske amin-mikrokuler ble vasket tre ganger med 2 ml 0,4 M PB, pH 6,0 forvarmet til 60°C, (vaskebuffer tilsatt, vortex-omrøring, magnetisk separering, dekantering). Den bundne probe ble eluert fra magnetiske amin-mikrokuler ved tilsetning av 300 ul elueringsbuffer inneholdende 0,2 M PB, pH 6,0, 50 % formamid, vortexblanding og inkubering i 5 minutter ved 60°C. De magnetiske amin-mikrokuler ble magnetisk trukket til siden av røret og oppløsningen ble overført til et nytt assayrør. Kjemiluminiscensen av hver prøve ble så målt i en Berthold Clinilumat Model LB9502 (Wildbad, West Germany) ved automatisk injeksjon av 200 pl 0,25 N HN03, 0,1 % H202, etterfulgt etter et sekunds forsinkelse av 200 pl 1 N NaOH og avlesning av kjemiluminiscensen i 5 sekunder (resultater gitt i "relative lysenheter", eller rlu)

RESULTATER:

Disse resultater viser at de magnetiske amin-mikrokuler klart kan separere hybridisert fra uhybridisert probe i et assay-system under anvendelse av en ikke-isotopmerking. Det sees her en meget lav bakgrunn (mindre enn 0,01 % av tilført rlu) og meget distinkt signal selv ved en meget lav konsentrasjon (IO-<3>pg) target-RNA.

Eksempel 18

Bruk av magnetiske amin-mikrokuler i en kjemiluminisert ikke-isotop- assav med en klinisk prøve

For å demostrere evnen til magnetiske amin-mikrokuler til å kunne anvendes som en seperasjonsbærer for et ikke-isotop-assaysystem i nærvær av en klinisk prøve, ble AE-proben beskrevet i Eksempel 17 anvendt for å detektering av en fortynningsrekke av target-rRNA i kliniske media. I tillegg til materialene angitt i Eksempel 17, ble strupe-avstrykningsmaterial oppnådd og anbragt i 3 % litium-dodecylsulfat, 30 mM PB (pH 6,8), 1 mM EDTA og og EGTA (dette vil i det følgende enkelt omtales som "strupeavstryk"). AE-proben blir hybridisert i strupeavstryk-materialet til synkende mengder av sitt target-rRNA (i dette tilfelle Chlamydia trachomatis) i henhold til følgende prosedyre:

50 ul strupeavstryk

6 pl 4,8 M PB (pH 4,7)

2 pl AE-probe (1 pmol)

2 pl RNA (3-10<-3>, 3-10<-2>, 3-10"<1>pg)

Kontrollblandingen var den samme som hybridiseringsblandingen med unntagelse av at den innholdt vann i stedet for RNA. Blandingene ble inkubert i60 minutter ved 60°C og en tredjedel av hver blanding ble så separert, vasket og eluert og beskrevet i Eksempel 17.

Disse resultater viser at de magnetiske amin-mikrokuler klart kan separere hybridisert fra uhybridiset probe i nærvær av klinisk prøve ved et assay-system som anvender en ikke-isotop-merking. Kontrollen er høyere her enn i Eksempel 17, i det minste delvis pga en større mengde av proben anvendt i dette eksempel.

Eksempel 19

Syntese av ytterligere polykationiske bærere

De følgende bærere ble syntetisert for ytterligere å demonstrere bruken av kationiske bærere i hybridsepareringen.

(a) Spermine lateks mikrokuler:

Spermine ble valgt i dette eksempel pga at det er et polyamin med adskilte kationer som tilsvarer polynukleotidets anioner. Lateks-amin-mikrokuler (2,5 % faststoff, 1 p midlere diameter, 0,125 mekv/g) ble anskaffet fra Polysciences, Inc., Warrington, PA, USA. 1,4-butanediol, diglysidyl-eter og spermin var fra Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI, USA. Et "Millititer " 96 filtreringssett og 0,22 u "Durapore"-filtere var en gave fra Millipore Filter Corporation, Bedford, MA, USA. Alle andre materialer var av reagensrenhet.

Mikrokulene ble først aktivert med 1,4-butandiol-diglysidyl-eter: 25 mg (1 ml) lateks-amin-mikrokuler ble filtrert på et 0,22 u "Durapore"-filter. Mikrokulene ble så resuspendert i 150 ul 0,6 N NaOH inneholdt 2 mg/ml NaBH4 og den tykke oppslemning ble overført til et glass-testrør hvortil 1,4-butandiol-diglycidyleter (150 pl) ble sakte tilsatt under omvirvling. Blandingen ble vortex-blandet i kort tid hvert tiende minutt en periode på 1 time etterfulgt av tilsetning av 1 ml vann. Mikrokulene ble så filtrert som beskrevet i det foregående og vasket med vann (2 ml).

De aktiverte mikrokuler ble så omsatt med spermin. De epoksyd-modifiserte mikrokuler fra reaksjonen ovenfor ble suspendert i 1 ml 0,1 M NA2CO3, pH = 11,6, og 75 pl spermin (oppvarmet til 50°C) ble tilsatt under omrøring. Etter omsetning i 12 timer ved romtemperatur ble mikrokulene filtrert, vasket med vann (2 ml), og resuspendert i vann (800 pl).

(b) Syntese av Tris (2-aminoetyl) amin-lateks-mikrokuler

(" Tris- Lateks") : Tris-(2-aminoetyl)-amin ble anskaffet fra Aldrich Chemical

Co., Milwaukee, WI, USA. Denne forbindelse ble valgt pga at dens kationer er anordnet i omtrent samme avstand fra hverandre som polynukleotidanionene.

Tris-(2-aminoetyl)-amin (50 pl) ble tilsatt til aktiverte mikrokuler i henhold til prosedyren beskrevet i del (a) i dette eksempel, ovenfor.

(c) Syntese av Tris-(2-aminoetyl)-aminsefarose 4B ("Tris-sefarose")

Tresyl-aktivert sefarose 4B ble anskaffet fra Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Sweden. Frysetørket tresyl-aktivert separose 4B (lg) ble vasket på et 0,22 u "Durapore"

(Millipore Corp. Bedford, MA, USA) filter med en mM HC1

(200 ml) i løpet av en periode på 45 minutter. Gelen ble så overført til et 15 ml polypropylenrør med skrukork inneholdende 5 ml 0,1 M NaHC03(pH 8)/0,5 M NaCl, og 200 ul Tris-(2-aminoetyl)-amin. Suspensjonen ble blandet ved romtemperatur ved sakte ende-over-ende-rotasjon i en periode på 2 timer. Gelen ble samlet ved filtrering og vasket i 10 ml 0,1 M NaHC03(pH 8)/0,5 M NaCl, etterfulgt av 5 0 ml 0,1 M Tris (pH 8). Den derivatiserte gel ble så overført til et 15 ml rør med skrukork og vasket videre i 10 ml 0,1 M Tris (pH 8) ved ende-over-ende-rotasjon i 54 timer. Gelen ble filtrert, og vasket i 10 ml 0,1 M natriumacetat (pH 4)/0,5 M NaCl, etterfulgt av 10 ml 0,1 M Tris (pH 8)/0,5 M NaCl. Denne vaskesyklus ble gjentatt to ganger. Gelen ble så suspendert for lagring ved 4°C i 5 ml 0,1 M Tris (pH 8)/0,5 M NaCl/ 0,02 % natriumazid.

(d) Syntese av Tris-(2-aminoetyl)-aminakryl-mikrokuler

(" Tris- akrvl- mikrokuler")

Materialer: Tosyl-aktiverte akryl-mikrokuler ble anskaffet fra Kirkegaard&Perry Labs, Inc, Gaithersburg, MD, USA

(midlere partikkelstørrelse 3 u)

En milliliter aktivert mikrokuler (10 % suspensjon) ble overført til et 1,5 ml polypropylenrør med skrukork. Mikrokulene ble separert ved sentrifugering ved 10.000 omdreininger pr minutt i 5 minutter i en Tomy-Seiko Micro-sentrifuge (modell MR-15A, Tokyo, Japan). Supernatanten ble fjernet. Deretter ble det tilsatt 0,1 M NaHCC>3 (0,9 ml) og tris-(2-aminoetyl)-amin (0,1 ml), og mikrokulene ble resuspendert ved hjelp av vortex-blanding. Innholdet av hvert rør ble blandet ved ende-over-ende-rotasjon i 16 timer. De amin-modifiserte mikrokulerDle fjernet ved sentrifugering og vasket med vann (5*1 ml) og resuspendert i 20 mM natrium-fosf at-buf f eret saltløsning inneholdende 0,02 % NaN3(1 ml).

(e) Funksjonalisering med en hydrofil polyuretan-basert membran med Tris-(2-aminoetyl)-amin og med poly-D-lysin ("Tris-polyuretan-membran" og "poly-D-lysin-polyuretan-membran")

HPI-affinitetsmembran (hydrofil polyuretan-basis) ble oppnådd fra Amicon Corp., Danvers, MA, USA. Den omtrentlige porestør-relse og tykkelsen av denne membran var angitt som 1,2 mikrometer henholdsvis 0,3 mm. 2-fluor-l-metylpyridinium-fosfat (FMP) ble anskaffet fra Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI, USA. Poly-D-lysin (gjennomsnittlig 68 monomerer pr molekyl) var fra Sigma Chemical Co., St. Louis,

MO, USA.

De tilgjengelige hydroksyl-grupper på membranen ble aktivert FMP ved en modifisering av en prosdyre rapportert av T.T. Ngo, Biotechnology, 4, 134 [1986]. 1 • 1 cm kvadrater av membranen ble overført til et 15 ml flatbunnet hetteglass med skrukork og vasket to ganger med tørt acetonitril 85 ml). Kvadratene ble så suspendert i tørt acetonitril (4 ml) inneholdende redestillert rent trietylamin (80 ul), og en oppløsning av FMP (200 mg) i tørt acetonitril (10 ml) inneholdende trietylamin (100 ul) ble tilsatt dråpevis under omvirvling. Inneholdet i hetteglasset ble så omvirvlet på en roterende plattform i en time, hvoretter oppløsningen ble fjernet og membranstykkene ble vasket i rekkefølge med acetonitril (2 • 5 ml), aceton (5 ml), 50:50 aceton/vandig 5 mM HC1 (5 ml) og vandig 5 mM HC1 (5 ml). De FMP-aktiverte membrankvadrater ble så fordelt mellom to hetteglass behandlet med 5 ml 0,5 M NaOHCC>3inneholdende enten tris-(2-aminoetyl)-amin (100 pl) eller poly-D-lysin (50 mg). Innholdet i hvert hetteglass ble blandet på en roterende plattform i 15 timer. Til slutt ble de amin-derivatiserte membranstykker vasket i rekkefølge med 1 M NaCl (3*5 ml), 0,1 M natriumfosfat-buffer pH 7 (3*5 ml) og vann (3 • 5 ml), og ble så avsugd tørt på et ark av 3 MM papir (Whatman Ltd., Maidstone, England) og lagret tørt ved romtemperatur.

Eksempel 20

Separering av nukleinsyrer ved spermine lateks mikrokuler Spermine-lateksmikrokuler ble fremstilt som beskrevet i Eksempel 19. Stamtre [<3>H]-rRNA var fra E. coli som beskrevet ovenfor. [<32>]-ATP var fra New England Nuclear Research Products, Inc., Boston, MA, USA, og T4 polynukleotid-kinase var fra Bethesda Research Labs, Inc., Gaithersburg, MD, USA. "Betagel TM" (flytende scintillasjonscoktail) var fra Westchem, San Diego, CA.

Probesyntese og merking: et deoksynukleotid med sekvensen "5'-GGCCGTTACCCCACCTACTAGCTAAT-3'" ble stilt under anvendelse av en Applied Biosystems, Inc. Model 380A DNA-syntetisator (Foster City, CA, USA) under anvendelse av standard fosforamiditt-kjemi<14>/. (Denne sekvens er komplementær til basene 235 - 260 i 23S subenheten av E. coli ribosom). Denne oligomer ble merket på 5'-ende under anvendelse av [•y"'<32>P]-ATP og T4-polynukleotid-kinase i henhold til prosedyren i Maxam og Gilbert (Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 74, 560

[1977] ) .

[<3>H]-rRNA og [<32>P]-DNA immobiliseringer: 0,5 ml testbuffer, 20 pl spermin-lateks-mikrokuler og 0,5 pl av enten [<3>H]-rRNA

(14.000 CPM) eller [<32>P]-DNA-oligomer (15.000 CPM) ble blandet og inkubert ved 50°C i 5 minutter. Mikrokulene ble så pelletisert ved sentrifugering ved 13.000 omdreininger pr<14>/Probesekvens patentsøkt.

minutt i 2 minutter i en Tomy Seiko Model MR-15A Microcentri-fuge (Tokyo, Japan). Supernatantene ble fjernet og tilsatt til 15 ml "Betagel" i 20 ml polypropylenrør. Mengden av [<3>H]-eller [<32>P]i hver prøve bestemt under anvendelse av en Nuclear Chicago scintillasjonsteller.

Resultatene ble vist i Tabell 12. Ved konsentrasjoner mellom 200 mM og 400 mM PB fjernet spermin-lateks-mikrokuler maksimalt target-polunukleotider og probe-oligonukleotider ble minimalt bundet. Den prefererte seleksjon fortsatte inn i buffer-konsentrasj oner.

Eksempel 21

Seperasion av nukleinsyrer med Tris- lateks- mikrokuler Tris-lateks-mikrokuler ble fremstilt som beskrevet i Eksempel 19 ovenfor. Antall materialer er som beskrevet i Eksempel 20.

Manipulasjoner var som beskrevet i det foregående under anvendelse av Tris-lateks-mikrokule i stedet for spermin-lateks-mikrokuler. Resultater er vist i Tabell 13. Som med spermin-lateks, viste Tris-lateks-mikrokulene optimal seleksjon av polynukleotid-target over oligonukleotid-prober ved 200 mM - 400 mM PB.

Eksempel 22

Separering av nukleinsyre med. Trls- sefarose

Tris-sefarose ble fremstilt som beskrevet i Eksempel 19. Andre materialer er beskrevet i Eksempel 20. Tris-sefarose (100 yl) ble tilsatt til 0,5 ml 0,3 M PB og 0,5 yl av enten [<3>H]-rRNA eller [<32>P]-DNA-oligomer. Innholdene ble inkubert ved 60°C i 15 minutter med hyppig virvling for suspendering av gel. Gelen ble pelletisert ved sentrifugering ve 13.000 omdreininger pr minutt i 30 sekunder og supernatanten ble fjernet og overført til et 20 ml polypropylen-hetteglass inneholdende 15 ml av "Betagel". Gelen ble vasket to ganger med 2,5 ml 0,3 M PB, vaskeløsningene ble separert ved sentrifugering og overført til polypropylen-hetteglass inneholdende "Betagel" som beskrevet i det foregående. Til slutt ble gelen suspendert til 0,5 ml 0,3 M PB og likeledes overført til et polypropylen-hetteglass inneholdende 15 ml "Betagel". Mengden av [<3>H]eller [<32>P] i hver prøve ble bestemt ved hjelp av scintillasjonstelling som beskrevet ovenfor. Resultatene i Tabell 14 viser den prefererte binding av RNA-polynukleotid fremfor DNA-oligonukleotid.

Eksempel 23

Separering av nukleinsyrer ved Tris- akrvl- mikrokuler Bindings-skjeining av tris-(2-aminoetyl)-aminderivatiserte akryl-mikrokuler (beskrevet i Eksempel 19, ovenfor) for rRNA i forhold til syntetisk oligonukleotid ble påvist. [<3>H]-rRNA fra E. coli og et [<32>P] ende-merket oligonukleotid (26 mer) er beskrevet i Eksempel 20. Til et 1,5 ml polypropylenrør med skrukork ble tilsatt: tris-(2-aminoetyl)-amin modifisert mikrokulesuspensjon (7 pl), natriumfosfat-buffer (pH 6,8,

200 ul, i området fra 0,1 - 0,4 M), og enten en oppløsning av [<3>H]-rRNA eller en oppløsning av [<32>P]-merket oligonukleotid (1 yl). Suspensjonen ble oppvarmet ved 50°C i ti minutter og ble så overført til en brønn i en mikrotiter-filtreringsmani-fold (0,22 u porestørrelse, Millipore, Inc., Bedford, MA, USA). Vakuum ble utøvet og mikrokulene ble vasket på filteret med samme buffer (200 pl). Undertrykket ble avlastet og mikrokulene ble så resuspendert i 20 mM natriumfosfat-bufferet saltløsning (200 pl) og overført til et hetteglass inneholdende scintillasjonscocktail (10 ml, "Betagel"). Radioaktiviteten som forble bundet til mikrokulene ble kvantitert ved hjelp av scintillasjonstelling. Data er oppsummert i Tabell 15.

Eksempel 24

Separering av nukleinsyrer med poly-D-lysin polyuretan-membran og Tris- polvuretan- membran

De poly-D-lysin-modifiserte membranstykker som er beskrevet i Eksempel 19 i det foregående, ble vist og fremviser lignende bindingsskjeining for rRNA versus et syntetisk oligonukleotid (19 mer) som allerede beskrevet i det foregående.

[<3>H]-rRNA fra E. coli og [<32>P]-endemerket oligonukleotid (19

mer) ble anvendt. Stykker av amin-modifisert membran ble anbragt på toppen av tre ark av 3 MM papir (Whatman, Ltd., Maidstone, England) i en spalte-avtrykksinnretning (J.M. Speciality Parts, San Diego, CA, USA). 1 pl delmengder av enten [<3>H]-rRNA eller [<32>P]-merket oligonukleotid ble fortynnet i 200 pl av enten buffer A (0,1 M natriumfosfat

(pH 6,8)/0,15 M NaCl/0,02 % SDS/0,1 % "Triton" X-100) eller buffer B (0,1 M natriumfosfat (pH 6,8)/0,45 M NaCl/ 0.02 % SDS/0,1 % "Triton" X-100). De resulterende oppløsninger ble så fylt inn i passende brønner i spalte-avtrykksinnretningen og ført gjennom stykkene av amin-modifisert membran ved hjelp av kapillar-virkning. Membranstykkene ble så fjernet fra spalte-avtrykksinnretningen, vasket med samme buffer (enten buffer A eller buffer B, 2 • 2 ml), og overført til et hetteglass inneholdende 5 ml scintillasjonscocktail ("Betagel"). Radioaktiviteten bundet til membran-stykkene ble kvatititert ved hjelp av scintillasjonstelling. Resultatene er gitt i Tabell 16.

Eksempel 25

Bruk av Tris-lateks-mikrokuler med en biotinylert DNA-probe ved en kolorimetrisk Assav- bestemmelse

For å bestemme gjennomførbarheten av fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen for en kolorimetrisk hybridiseringsassay ble tris-lateks-mikrokuler anvendt i forbindelse med en biotinmerket DNA-probe for Mycoplasma pneumoniae rRNA: (a) Syntese av en biotin- merket DNA- oliaomer komplementær

til et område 1 Mvcoplasma pneumoniae rRNA:

Materialer: Biotinyl-E-aminokapronsyre-N-hydroksysuccinimid-ester (Biotim-X-NHS) ble anskaffet fra Calbiochem-Behring Corp., San Diego, CA, USA.

5-allylamin UTP, terminal deoksynukleotid-transferase, og 5x forlengelsesbuffer var produktet fra Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD, USA. "Bio-Gel" P-60 (100-100 mesh) var fra Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, USA, og Sephadex G-25 (medium) var fra Pharmacia Fine Chemicals, Piscatawqay, NJ. Andre materialer som ble anvendt er beskrevet i de foregående eksempler 19 og 20. En deoksyribo-nukleotid-probe med lengde 36 nukleotider, komplementære til en sekvens til stede i 16S subenheten av rRNA fra Mycoplasma pneumoniae ble anvendt. Denne oligomer var merket på r'-enden med [<32>P]som beskrevet i Eksempel 20.

Forlenaelsesreaksion med allvlamin UTP: 9 pmol [<32>P]-oligomer ble omsatt med 0,1 mM allylamin UTP og 40 enheter terminal

deoksynukleotid-transferase i 40 ul av 1 x forlengelsesbuffer ved 37°C i en time. Den forlengede oligomer ble renset på en "Bio-Gel" P-60 kolonne (0,7 • 10 cm) under eluering ved 0,1 M PB/2 mM EDTA. Oligomeren ble så avsaltet ved å føre den gjennom en Sephadex G-25, og eluering med 0,2 M trietyl-ammonium-bikarbonat (TEAB, pH 8).

Reaksjon med biotin- X- NHS: Den allylamin UTP-forlengede oligomer, oppløst i 150 ul 0,1 M NaHC03(pH 8,8)/0,02 % SDS, ble behandlet fire ganger med 10 pl biotin-X-NHS (30 mM stamløsning i DMSO) ved 60 minutters mellomrom. Den biotinylerte oligomer ble renset på en kolonne av Sephadex G-25 (0,7 • 10 cm) under eluering med 0,1 M PB/2 mM EDTA/0,02 %

SDS.

(b) Immobili sering av den biotinvlerte DNA- probe- rRNA- hvbrid på " Tris- lateks": En stamløsning av rRNA (1 ug/ul) fra Mycoplasma pneumoniae ble anvendt. En suspensjon av tris-lateks ble fremstilt som beskrevet i Eksempel 19.

Andre materialer var av reagensrenhet.

Hybridiserings-reaksjonsblandingen var som følger: Hvbrid: 1 ul rRNA (1 ug), 10 pl bitinylert DNA-probe (0,1 pmol), 0,4 pl 1 % SDS, 2,4 pl 1 M PB, og 6,2 pl H20 som totalt utgjør 20 pl.

Probe- kontroll: 10 pl biotinylert DNA-probe (0,1 pmol), 0,4 pl 1 % SDS, 2,4 pl 1 M PB, og 7,2 pl H20 som totalt utgjør 20 pl.

Hybridiseringsblandingene ble inkubert ved 60°C i en time etterfulgt av tilsetning av 0,5 ml 0,4 M PB/0,02 % SDS/1,0 % "Triton" X-100 såvel som 10 pl tris-lateks (vandig suspensjon) . Innholdene ble blandet og inkubert ved 60°C i 5 minutter. Tris-lateks-mikrokulene ble pelletisert ved sentrifugering ved 13.000 omdreininger pr minutt i 2 minutter. Mengden av [<32>P] som forble bundet til mikrokulene bestemt ved hjelp av scintillasjonstelling under anvendelse av Cerenkov-stråling.

I hybridforsøket bandt 61 % av den totale radioaktivitet til tris-lateksen, emns i probe-kontrollen bandt bare 5 %. Dette reflekterer en 56 % hybridisering i det førstnevnte forsøk. (c) Den biotinvlerte DNA- probe- rRNA- hvbrid ble ikke- isotopt detektert på Tris- lateks: Reagenser for fremstil-lingen av et avidin-alkalisk fosfatase kompleks ble anskaffet fra Vector Laboratories., Burlingame, CA, USA. Bovint serum-albumin (BSA), nitro blå-tetrazoliumsalt (NBT), 5-brom-4-klor-3-indolylfosfat (BCIP) og "Tween"-20 var produktet fra Sigma Chemical Co., St. Louis., MO, USA. Andre materialer er beskrevet i eksemplene 19 og 20.

To prøver av tris-lateks inkubert enten med biotinylert DNA-probe /rRNA-hybr id eller med biotinylert DNA-probe alene (som beskrevet i dette eksempel ovenfor) ble filtrert på et millititer "96 filtreringsapparat" under anvendelse av "Durapore" R (Millipore Corp, Bedford, MA, USA) filtre. Hver prøve av filtrerte faststoffer ble resuspendert i 200 pl 3 % BSA i 0,1 M Tris (pH 7,5)/0,l M NaCl/3 mM MgCl2/0,05 % "Tween"-20, overført til et 1,5 ml polyetylenrør med skrukork og inkubert ved 44°C i en time. Prøvene ble så filtrert som beskrevet i det foregående og de filtrerte faststoffer ble resuspendert i 200 pl streptavidin-alkalisk fosfase kompleks (fremstilt i fosfatbufferet saltløsning i henhold til fabrikantens forskrifter). Etter 20 minutter ble prøvene filtrert og vasket to ganger med 200 pl 0,1 M Tris (pH 7,5)/ 0,1 M NaCl/ 3 mM MgCl2/0,05 % "Tween"-20, og deretter en gang med 200 pl 0,1 M Tris (pH 9,5)/0,l M NaCl/50 mM MgCl2. De filtrerte faststoffer ble så resuspendert i 200 pl 0,1 M Tris (pH 9,5)/0,l M NaCl/ 50 mM MgCl2inneholdende 0,33 mg/ml (NBT) og 0,17 mg/ml (BCIP). Fargeutviklingen fikk foregå i 10 minutter i mørke. Lateks-partiklene ble så fjernet ved filtrering og vasking to ganger med 0,1 M NaCl/3 mM MgCl2/0,05 % "Tween"-20.

Et blått bunnfall, avsatt på overflaten av tris-lateks-mikrokulene, var lett synlig for hybridprøven i løpet av omtrent 2 minutter. Dette var klart forskjellig fra den meget svake fargeutvikling iaktatt for prøven med biotinylert probe alene.

Eksempel 26

Bruk av Tris-Sepharose med en biotinylert probei en kolorimetrisk ikke- isotop- assav

Hybridiseringssystemet i Eksempel 25 ble anvendt med Tris-Sepharose-gel i stedet for tris-lateks-mikrokuler.

(a) Den hybridiserte biotinvlerte probe ble immobilisert på

Tris- Sepharose:

Små kolonner inneholdende 0,1 ml Tris-Sepharose (fremstilt som beskrevet i Eksempel 19) ble fremstilt under anvendelse av 1 cc tuberkulin-sprøyter. Hybridiseringsblandinger (som beskrevet i Eksempel 25(b) ble oppløst i 0,5 ml 0,25 M PB/0,02 % SDS/1,0 % "Triton" X-100, og passert dråpevis gjennom Tris-Sepharose-kolonnen i løpet av en 5 minutters periode. Kolonnene ble så vasket to ganger med 0,5 ml av den samme buffer. Mengden av [<32>P] som forble bundet til kolonnen ble bestemt ved hjelp av scintillasjonstelling som ble beskrevet i Eksempel 25(b). Tris-Sepharose fremviste spesiell nøyaktig seleksjon av hybrid fremfor probe. Av hybridet ble 81 % bundet til Tris-Sepharose mens 0,0 % av kontroll-proben ble bundet (mengden av [<32>P] som forble bundet i kontroll-proben var ikke målbar i forhold til bakgrunnen).

(b) Den blotinylerte probe ble ikke- isotopt detektert Materialene var som beskrevet i Eksempel 21 (c). Små kolonner av Tris-Sepharose ble fremstilt og behandlet med hybridiserings-reaksjonsblandinger som beskrevet tidligere i dette eksempel. Det avidin-alkaliske fosfatase kompleks

(0,5 ml, fremstilt som beskrevet i Eksempel 25 (c) ble så ført dråprevis gjennom kolonnen. Etter 10 minutter ble den resterende avidin-alkaliske fosfatase-oppløsning køet ut under svakt overtrykk. Gelen ble vasket to ganger med 0,5 ml 0,1 M Tris (pH 7,5)/0,l M NaCl/3 mM MgCl2og en gang med 0,1 M Tris (pH 9,5)/o,l M NaCl/50 mM MgCl2. NBT/BCIP fargereagens (0,5 ml, se Eksempel 25) ble så ført sakte gjennom gelen. Etter 10 minutter ble det resterende reagens skjøvet ut og gletet ble vasket to ganger med 0,5 ml 0,1 Tris (pH 7,5)/0,l M NaCl/3 mM MgCl2.

Blåfargeutvikling var synlig for hybridprøven i løpet av omtrent 2 minutter: Denne kunne lett skjelnes fra prøven med proben alene, som bare var svakt blå etter en 10 minutters periode med fargeutvikling. Bemerk: Denne bærer krevet ikke "kapslings-trinnet" med 3 % BSA som var nødvendig med den tidligere bærer (Eksempel 25(c)).

Eksemepel 27

Bruk av Tris-Sepharose med en alkalisk fosfatase-merket DNA-probe i en kolorimetrisk assav

Brukbarheten av de kationiske bærer beskrevet i Eksempel 19 ble ytterligere demonstrert en kolorimetrisk hybridiserings assay under anvendelse av et alkalisk fosfatase/deoksyoligo-nukleotidprobe-konj ugat.

Materialer: Et alkalisk fosfatase-merket syntetiske oligonukleotid (26 mer), komplementært til rRNA fra E. coli (i det følgende referert som "ikke-target rRNA") ble fremstilt ved en modifisering beskrevet av E. Jablonski et al., Nucl. Acids Res., Vol. 14, p 6115 (1986). Oligonukleotid-sekvensen valgt for å fremvise minimal kryss-hybridisering til rRNA fra Candida albicans (idet følgende benevnt "ikke-target-rRNA"). Target- og ikke-target-rRNA ble isolert og renset. NBT- og BCIP-fargestoffer er beskrevet i det foregående Eksempl 25. Andre materialer var av reagensrenhet.

Hybridiseringscocktailer ble fremstilt i 1,5 ml polypropylen-mikrosentrifugerør ved tilsetning av oligonukleotid-alkalisk fosfatase-konjugatet (10 ul, 1 pmol), fortynninger av enten target- eller ikke-target-rRNA (1 pl, 1 - 0,0001 pg) , 4,8 M natriumfosfat-buffer (2 pl, pH 6,8), natriumdodecyl-sulfat (0,4 pl og 1 % oppløsning volum/volum) og sterilt vann (13,6 pl): totale volum var 20 pl. Disse cocktailer ble hybridisert ved 50°C i 30 minutter. Deretter ble 0,3 M natiumfosfat (0,5 ml, pH 6,8) og Tris-Sepharose (omtrent 30 pl lagvolum) tilsatt, og inneholdene ble blandet ved rysting i et vannbad ved 50°C i ti minutter. Rørene ble så rotert en kort stund i mikrosentrifugen og supernatanten ble trukket av ved hjelp av en pasteur-pipette. Tris-Sepharose-pelletene ble så vasket i rekkefølge med 0,3 M natriumfosfat-buf fer (3 • 0,5 ml) etterfulgt av 50 mM Tris HC1 (pH 8)/0,l m NaCl/ 1 mM MgCl2/1 mM ZnCl2(2 • 0,5 ml). Pelletene ble så resuspendert i 300 pl av en oppløsning 0,1 M Tris HC1 (pH 9,5)/0,l M NaCl/50 mM MgCl inneholdende NBT (0,33 mg/ml) og BCIP (0,24 mg/ml) og inkubert ved 42°C i fire timer. Blå-fiolettfarging var synlig på tris-sepharose-pelletene som skrev seg fra hybridiseringsreaksjoner med så lite som 0,001 pg target-rRNA. Ingen farging var sylig på Tris-Sepharose-pelleter fra kontrollene med så mye som 1,0 pg ikke-target rRNA.

Eksempel 28

Bruk av poly-D-lysin polyuretan-membran med. en alkalisk fosfatase merket DNA-probe i en kolorimetrisk assay-bestemmelse

Med dette forsøk ble brukbarheten av en kationisk membran som separasjonsbærer ved den kolirimetrisk assay demonstrert.

Hybridiseringsreaksjoner ble gjennomført som beskrevet i Eksempel 27. Til disse reaksjoner ble tilsatt 300 ul fortynningsbuffere (0,1 M natriumfosfat (pH 6,8)/0,45 M NaCl/ 0,02 % SDS/0,1 % "Triton" X-100). De resulterende opp-løsninger ble passe ført gjennom stykker av poly-D-lysin-membran ved kapillar-virkning under anvendelse av en spalte-avtrykksinnretning som beskrevet i Eksempel 24. Membran-stykkene ble så fjernet fra spalte-avtrykksapparatet og vasket med fortynningsbufferen (2-2 ml) og assay-buffer (2-amino-2metylpropandiol HCl (pH 10,2)/0,1 M NaCl,

2 • 4 ml). Deretter ble membranstykkene neddykket i assay-buffere (10 ml) inneholdende NBT (0,33 mg/ml) og BCIP

(0,25 mg/ml). Etter 10 minutter ga spalte-avtrykk behandlet med hybridiseringsreaksjoner inneholdende 1 ug eller target-rRNA mørkblåfiolett farging mens kontroller inneholdende 1 pg ikke-target-rRNA ikke ga noen farging.

Denne kolorimetriske assay krever ikke forhybridisering, fiksring og blokkeringstrinn som er typisk assosiert med spalte-avtrykksassay-bestemmelser og representerer hver for en vesentlig forbedring i forhold til tidligere teknikk.

Eksempel 29

Bruk av poly-D-lysin polyuretan-membran i en kjemilumineserende ikke- isotop- assav

Brukbarheten av den kationiske membran-seperasjonsbærer beskrevet i Eksempel 19 ble demonstrert i en kjemilumineserende ikke-isotop-hybridiseringsassay under anvendelse av en akridiniumester (AE) merket DNA-probe. Metoder for utvikling og deteksjon av kjemilumineserende akridiniumester-merkede oligonukleotid-prober ble gjennomført som beskrevet i US-patentansøkning med løpenummer 105.080 med tittel "Acridinium Ester Labeling and Purification of Nucleotide Probes", inngikk 2. oktober 1987, som innlemmes som henvisning. Et akridiniumester (AE) merket oligonukleotid (26 mer) komplementær til en sekvens i rRNA fra E. coli ble fremstilt ved å innlemme en enkel akridiniumester pr probemolekyl. Andre materialer og reagenser er beskrevet i de tidligere eksempler 19 og 27.

Hybridiseringscocktailer ble fremstilt i 1,5 ml polypropylen mikrosentrifugerør: AE-merket probe (2 ul, 1,5 • 10^ relative lette enheter, "RLU"), 1 % SDS (volum/volum, lul), 1 M natriumfosfat-buffer (pH 4,9, 5 ul), og enten target- eller

ikke-target-rRNA (1 pg/pl, 1 pl), totalt reaksjonsvolum 9 pl. Inneholdende i hvert rør ble inkubert ved 60°C i 30 minutter. Separeringsbuffere (0,6 ml, 0,1 M natriumfosfat pH 6,8/0,15 M NaCl/0,02 % SDS/0,1 % "Triton" X-100) ble tilsatt og de

resulterende oppløsninger ble overført ved hjelp av kapillar-virkning på stykker av poly-D-lysin-modifisert membran under anvendelse av en spalte-avtrykksinnretning som tidligere beskrevet. Stykkene av membran under hver spalte ble inviduelt vasket i separeringsbuffere (3 • 2 ml), og ble så kuttet opp i 0,25 cm<2>stykker og overført til 12 • 75 mm polypropylenrør (Sarsted, Vest-Tyskland) inneholdende 200 pl vann. Inneholdene i hvert rør ble kvantifisert for relativ kjemiluminesens som omtalt i det foregående. Spesifikt ble det anvendt et CliniLumat Model LB 950f2 Luminometer (Berthold, Wildbad, Vest-Tyskland) med en dobbelt injeksjons-syklus: Injeksjon i 1 - 0,25 H HN03/0,1 % H202(200 pl), Injeksjon # 2 - 2 M kaliumfosfat-buffer (pH 13,2, 200 pl). Resultatene er gitt i Tabell 17.

Eksempel 30

Bruk av Tris-Sepharose i en kjemilumineserende ikke-isotop-hvbridiserinasassav

Acridiniumester-merket oligonukleotid-probe/rRNA-hybridiseringsreaksjoner ble gjennomført som beskrevet i Eksempel 29. Delmengder fra disse reaksjoner ble overført til rene 1,5 ml polypropylen-mikrosentrifugerør og fortynnet med 0,3 M natriumfosfatbuffere (pH 6,8, 0,5 ml). Deretter ble Tris-Sepharose (30 yl lagvolum, fremstilt som beskrevet i Eksempel 19) tilsatt og inneholdene ble blandet ved forsiktig vortexblanding ved romtemperatur i 10 minutter. Etter en kort sentrifugering i mikrosentrifuge ble supernatanten fjernet og de resulterende Tris-Sepharose-pelleter ble vasket med 0,3 M natriumfosfater (pH 6,8, 2 • 0,5 ml) og deretter suspendert i 0,3 M natriumfosfat (pH 6,8, 0,5 ml). Delmengder av de resulterende suspensjoner (0,4 ml) ble overført til 12 • 75 mm polypropylenrør og 30 % hydrogenperoksyd tilsatt (0,5 yl). Kjemiluminesens ble målt som beskrevet i Eksempel

29 med unntagelse av at en enkelt injeksjon av 2 N NaOH

(200 yl) ble anvendt for å initiere kjemiluminesens-reaksjonen. Resultater er gitt i Tabell 18.

Den fagkyndige vil innse at de metoder og preparater som er beskrevet i det foregående kan anvendes for rensing av nukleinsyrer og detektere target-nukleotidsekvenser DNA og RNA avledet fra en lang rekke kilder inklusive smittemidler som bakterier, virus og sopp, kreftceller og celler som kan gi informasjon om genetiske sykdommer som sigdcelleanemi. Følgelig er rammen for oppfinnelsen bare begrenset ved henvisninger til de vedføyde patentkrav.

Claims (109)

1. Fremgangsmåte for rensing av nukleotidmultimerer i en oppløsning inneholdende forurensninger, karakterisert ved trinnene: a. oppløsningen bringes i kontakt med en polykationisk fast bærer for ikke-kovalent binding av multimeren til bæreren uten særlig binding av forurensningene, og b. bæreren og bundne multimerer adskilles fra oppløsningen.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at bæreren behandles for utvinning av multimeren.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 2, karakterisert ved at bæreren behandles med en elueringsoppløsning for desorbering av multimerene etterfulgt av separering av elueringsoppløsningen og den faste bærer.

4. Fremgangsmåte som angitt i krav 3, karakterisert ved at det som elue-ringsoppløsning anvendes en oppløsning valgt fra gruppen bestående av fosfat, pyrofosfat, tripolyfosfat, fytinsyre og 50 % formamid.

5. Fremgangsmåte som angitt i krav 3, karakterisert ved at multimerene utvinnes fra elueringsoppløsningen.

6. Fremgangsmåte som angitt i krav 4, karakterisert ved at multimerene utvinnes fra elueringsoppløsningen.

7. Fremgangsmåte som angitt i et eller flere av kravene 1-6, karakterisert ved at den faste bærer vaskes etter separering fra oppløsningen inneholdende forurensningene.

8. Fremgangsmåte som angitt i krav 7, karakterisert ved at oppløsningen inneholdende multimerene og forurensningene er en separeringsoppløsning.

9. Fremgangsmåte som angitt i krav 1 - 6, karakterisert ved at multimerene er polynukleotider.

10. Fremgangsmåte som er angitt i krav 9, karakterisert ved at forurensningene inkluderes mindre nukleotidmultimerer enn de bundne polynukleotider.

11. Fremgangsmåte som er angitt i krav 1-6, karakterisert ved at den faste bærer utgjøres av partikler.

12. Fremgangsmåte som er angitt i krav 11, karakterisert ved at den faste bærer omfatter partikler med mikrometerstørrelse.

13. Fremgangsmåte som er angitt i krav 1-6, karakterisert ved at den faste bærer består av fibre.

14. Fremgangsmåte som er angitt i krav 1-6, karakterisert ved at den faste bærer er en membran.

15. Fremgangsmåte som angitt i krav 12, karakterisert ved at den faste bærer omfatter magnetisk reaktive partikler og at adskillingen lettes ved utsetning for et magnetfelt.

16. Fremgangsmåte som angitt i krav 13, karakterisert ved at den faste bærer består av magnetisk reaktive fibre med mikrometer-størrelse og at adskillingen lettes ved utsettelse for et magnetfelt.

17. Fremgangsmåte som angitt i krav 14, karakterisert ved at membranen er magnetisk reaktiv og adskilling lettes ved utsettelse for et magnetfelt.

18. Fremgangsmåte som angitt i krav 1-6, karakterisert ved at den kationiske ladning meddeles ved hjelp av alkyl- eller aryl-aminer, guanidiner eller iminer.

19. Fremgangsmåte som angitt i krav 18, karakterisert ved at den faste bærer er metalloksyd, glass, polyamid, polyester, polyolefin, polysakkarid, polyglykol eller polyaminosyre.

20. Fremgangsmåte for assaydetektering av en target-nukleotidsekvens i en testoppløsning, karakterisert ved trinnene: a. en merket nukleotid-probe for targetsekvensen bringes i kontakt med testoppløsningen under hybridiserende betingelser til å danne et hybrid mellom nukleotid-proben og target i testoppløsningen. b. en polykationisk fast bærer bringes i kontakt med testoppløsningen for å bevirke dannelse av en bundet fase og en fri fase. c. den bundne fase eller den fri fase detekteres som kvalitativ eller kvantitativ måling av target i testoppløsningen.

21. Fremgangsmåte for assay-detektering av en target-nukleotidsekvens i et polynukleotid, karakterisert ved trinnene: a. tilsetning til en oppløsning inneholdende poly nukleotid som forventes å inneholde target-sekvensen av en nukleotid-probe for targetsekvensen, under hybridiserende betingelser for å danne en hybrid mellom proben og targetsekvensen hvis denne er til stede. b. Polynukleotidene inklusive eventuelle hybrider med proben og uhybridisert probe i oppløsning kombineres med den polykationisk fast bærer. c. den faste bærer adskilles fra oppløsningen inneholdende uhybridisert probe, og d. nærværet av eventuell ubundet probe eller probe bundet til den faste bærer som en kvantitativ eller kvalitativ måling av target-polynukleotidsekvensen i testoppløsningen detekteres.

22. Fremgangsmåte for assay-detektering av en target-nukleotidsekvens i et polynukleotid, karakterisert ved trinnene: a. til en oppløsning innholdende polynukleotid som forventes å inneholde targetsekvensen tilsettes en nukleotid-probe for targetsekvensen, idet proben er en mindre nukleotidmultimer enn de polynukleotider som assaybestemmes, under hybridiserende betingelser for å danne en hybrid mellom proben og targetsekvensen hvis denne er til stede, b. polynukleotidene, inklusive eventuelle hybrider med proben og uhybridisert probe i oppløsning kombineres med en polykationisk fast bærer for ikke-kovalent binding av polynukleotidene og hybridene med proben uten særlig binding av den uhybridiserte probe c. den faste bærer adskilles fra oppløsningen inneholdende uhybridisert probe, og d. nærværet av eventuell probe bundet til den faste bærer detekteres som en indikasjon på nærvær og/eller mengde av targetsekvens i polynukleotidene er bundet til bæreren.

23. Fremgangsmåte for assaydetektering av en target-nukleotidsekvens i et polynukleotid, karakterisert ved trinnene: a. til en oppløsning inneholdende polynukleotid som forventes å inneholde targetsekvensen tilsettes en nukleotid-probe for targetsekvensen, under hybridiserende betingelser for å danne en hybrid mellom proben og targetsekvensen hvis denne er til stede b. polynukleotidene, inklusive eventuelle hybrider med proben og uhybridisert probe kombineres i en oppløsning med en polykationisk fast bærer c. den faste bærer adskilles fra oppløsningen inneholdende uhybridisert probe, og d. hybriden, den merkede prøve eller merkingen elueres fra den faste bærer under anvendelse av en elueringsopp-løsning, og e. nærværet av eventuell ubundet probe eller probe bundet til den faste bærer detekteres som en kvantitativ eller kvalitativ måling av target-polynukleotidsekvensen i testoppløsningen.

24. Fremgangsmåte som er angitt i krav 23, karakterisert ved at hybrid-eluerings-oppløsningen er valgt fra gruppen bestående av 50 % formamid, fosfat, pyrofosfat, tripolyfosfat og fytinsyre.

25. Fremgangsmåte som er angitt i krav 22, karakterisert ved at polynukleotidene som probe-behandles er minst omtrent 3 ganger større multimerer enn proben.

26. Fremgangsmåte som angitt i krav 22, karakterisert ved at polynukleotidene som probe er minst omtrent 5 ganger større multimerer enn proben.

27. Fremgangsmåte som angitt i krav 20 - 23, karakterisert ved at proben er en analog av DNA og RNA med en lavere negativ ladning i fosfat-hovedkjeden enn fosfatdiesterne av nativt DNA eller RNA.

28. Fremgangsmåte som angitt i krav 27, karakterisert ved at analogen er mettet metylfosfonat.

29. Fremgangsmåte som angitt i krav 20 - 23, karakterisert ved at segregeringen av den faste bærer omfatter og fjerne den fra oppløsningen inneholdende uhybridisert probe.

30. Fremgangsmåte som angitt i krav 20 - 23, karakterisert ved at proben er en analog av DNA eller RNA med en lavere negativ ladning i fosfat-hovedkjeden enn fosfatdiesterne av nativt DNA eller RNA og readskillelsen av den faste bærer omfatter å fjerne den fra oppløsningen inneholdende uhybridisert probe.

31. Fremgangsmåte som angitt i krav 20 - 23, karakterisert ved at probene er en analog av DNA eller RNA med en lavere negativ ladning i fosfat-hovedkjeden enn fosfatdiesterne av nativt DNA eller RNA og hvori adskillelsen av den faste bærer omfatter at den fjernes fra oppløsningen inneholdende uhybridisert probe og hvori proben har en merking som tillater dens deteksjon.

32. Fremgangsmåte som angitt i krav 30, karakterisert ved at den faste bærer vaskes før detekteringen av proben.

33. Fremgangsmåte som angitt i krav 31, karakterisert ved at den faste bærer vaskes før detekteringen av proben.

34. Fremgangsmåte som angitt i krav 20 - 23, karakterisert ved at proben har en merking som tillater dens deteksjon.

35. Fremgangsmåte som angitt i krav 20 - 23, karakterisert ved at den faste bærer består av partikler.

36. Fremgangsmåte som angitt i krav 35, karakterisert ved at den faste bærer omfatter partikler med mikrometerstørrelsen.

37. Fremgangmåte som angitt i krav 20 - 23, karakterisert ved at den faste bærer består av fibre.

38. Fremgangsmåte som angitt i krav 20 - 23, karakterisert ved at den faste bærer er en membran.

39. Fremgangsmåte som angitt i krav 36, karakterisert ved at den faste bærer består av magnetisk reaktive partikler og adskillingen oppnås ved å utsette partiklene for et magnetfelt.

40. Fremgangsmåte som angitt i krav 37, karakterisert ved at den faste bærer omfatter magntisk reaktive fibre og adskilling oppnås ved å utsette fibrene for et magnetfelt.

41. Fremgangsmåte som angitt i krav 38, karakterisert ved at bæreren er en magnetisk reaktiv membran og adskilling oppnås ved å utsette membranen for et magnetfelt.

42. Fremgangsmåte som angitt i krav 20 - 23, karakterisert ved at den kationiske ladning med eller ved hjelp av alkylaminer, arylaminer, guadininer eller iminer.

43. Fremgangsmåte som angitt i krav 42, karakterisert ved at adskillingen av den faste bærer omfatter å fjerne den fra oppløsningen inneholdende uhybridisert probe.

44. Fremgangsmåte som angitt i krav 43, karakterisert ved at den faste bærer omfatter partikler med en mikrometerstørrelse.

45. Fremgangsmåte som angitt i krav 43, karakterisert ved at den faste bærer omfatter fibre.

46. Fremgangsmåte som angitt i krav 43, karakterisert ved at den faste bærer er en membran.

47. Fremgangsmåte som angitt i krav 44, karakterisert ved at partiklene er magnetisk reaktive og adskillingen oppnås ved å utsette partiklene for et magnetfelt.

48. Fremgangsmåte som angitt i krav 45, karakterisert ved at fibrene er magnetisk reaktive og adskillingen oppnås ved å utsette partiklene for et magnetfelt.

49. Fremgangsmåte som angitt i krav 46, karakterisert ved at membranen er magnetisk reaktiv og adskillingen oppnås ved å utsette partiklene for et magnetfelt.

50. Fremgangsmåte som angitt i krav 47, karakterisert ved at partiklene er metalloksyd, glass, polyamid, polyester, polyolefin, polysakkarid, polyglykol eller polyaminosyre.

51. Fremgangsmåte som angitt i krav 48, karakterisert ved at fibrene er metalloksyd, glass, polyamin, polyester, polyolefin, polysakkarid, polyglykol eller polyaminosyre.

52. Fremgangsmåte som angitt i krav 49, karakterisert ved at membranen er metalloksyd, glass, polyamid, polyester, polyolefin, polysakkarid, polyglykol eller polyaminosyre.

53. Fremgangsmåte for assay-detektering av en target-nukleotid-sekvens i et polynukleotid, karakterisert ved trinnene: a. en oppløsning inneholdende polynukleotider som forventes å inneholde target-sekvensen bringes i kontakt med en polykationisk fast bærer for ikke-kovalent binding av polynukleotidene til den faste bærer. b. den faste bærer og bundne polynukleotider bringes i kontakt med en oppløsning inneholdende en nukleotid-probe for targetsekvensen, idet proben er en mindre nukleotid-multimer enn polynukleotidene som assay-bestemmes, under hybridiserende betingelser for å danne en hybrid mellom proben og mulig tilstedeværende target, uten i særlig grad å binde den uhybridiserte probe til den faste bærer. c. den faste bærer adskilles fra oppløsningen inneholdende uhybridisert probe, og d. nærværet av hybrid, enten kvalitativt eller kvantitativt, detekteres som et mål på target-sekvens i polynukleotidene.

54. Fremgangsmåte for assay-detektering av en targetnukleo-tidsekvens i et polynukleotid, karakterisert ved trinnene: a. en oppløsning inneholdende polynukleotider som forventes å inneholde targetsekvensen bringes i kontakt med en polykationisk fast bærer for ikke-kovalent binding av polynukleotidene til den faste bærer b. den faste bærer og bundne polynukleotider bringes i kontakt med en oppløsning inneholdende en nukleotid-probe for target-sekvensen, idet proben er en mindre nukleotid-multimer enn polynukleotidene som assay-bestemmes, under hybridiserende betingelser for å danne en hybrid mellom proben og target-sekvensen er til stede, uten særlig binding av uhybridisert probe til den faste bærer c. den faste bærer adskilles fra oppløsningen inneholdende uhybridisert probe, og d. hybriden, den merkede probe eller merkingen elueres fra den faste bærer under anvendelse av en elueringsopp-løsning. e. nærværet av hybriden, detekteres enten kvantitativt eller kvalitativt som en måling av target-sekvens i polynukleotider.

55. Fremgangsmåte som angitt i krav 53 eller 54, karakterisert ved at polynukleotidene som probe-bestemmes er minst omtrent 3 ganger større multimer enn proben.

56. Fremgangsmåte som angitt i krav 53 eller 54, karakterisert ved at polynukleotidene som probe-bestemmes er minst 5 ganger større multimerer enn proben.

57. Fremgangsmåte som angitt i krav 53 eller 54, karakterisert ved at proben er en analog av DNA eller RNA med en lavere negativ ladning i fosfat-hovedkjeden enn fosfatdiesterne av nativt DNA eller RNA.

58. Fremgangsmåte som angitt i krav 53, karakterisert ved at analogen er et metylfosfonat.

59. Fremgangsmåte som angitt i krav 54, karakterisert ved at analogen er et metylfosfonat.

60. Fremgangsmåte som angitt i krav 58, karakterisert ved at adskillingen av den faste bærer omfatter å fjerne den fra oppløsningen inneholdende uhybridisert probe.

61. Fremgangsmåte som angitt i krav 59, karakterisert ved at adskillingen av den faste bærer omfatter å fjerne den fra oppløsningen inneholdende uhybridisert probe og hvori analogen er et metylfosfonat.

62. Fremgangsmåte som angitt i krav 60, karakterisert ved at den faste bærer vaskes før detektering av proben.

63. Fremgangsmåte som angitt i krav 61, karakterisert ved at den faste bærer vaskes før detekteringen av proben.

64. Fremgangsmåte som angitt i krav 53 eller 54, karakterisert ved at proben har en merking som tillater dens detektering.

65. Fremgangsmåte som angitt i krav 53 eller 54, karakterisert ved at den faste bærer består av partikler.

66. Fremgangsmåte som angitt i krav 65, karakterisert ved at den faste bærer består av partikler med mikrometerstørrelse.

67. Fremgangsmåte som er angitt i krav 53 eller 54, karakterisert ved at den faste bærer består av fibre.

68. Fremgangsmåte som angitt i krav 53 eller 54, karakterisert ved at den faste bærer er en membran.

69. Fremgangsmåte som angitt i krav 66, karakterisert ved at den faste bærer består av magnetisk reaktive partikler og adskilling oppnås ved å utsette partiklene for et magnetfelt.

70. Fremgangsmåte som angitt i krav 67, karakterisert ved at den faste bærer består av magnetisk reaktive partikler og adskilling oppnås ved å utsette partiklene for et magnetfelt.

71. Fremgangsmåte som angitt i krav 68, karakterisert ved at den faste bærer omfatter magnetisk reaktive partikler og at adskilling oppnås ved å utsette partiklene for et magnetfelt.

72. Fremgangsmåte som angitt i krav 53 eller 54, karakterisert ved at den kationiske ladning meddeles ved hjelp av alkylaminer, arylaminer, guanidiner eller iminer.

73. Fremgangsmåte som angitt i krav 72, karakterisert ved at segregeringen av den faste bærer for å fjerne den fra oppløsningen inneholdende uhybridisert probe.

74. Fremgangsmåte som angitt i krav 72, karakterisert ved at den faste bærer omfatter partikler med mikrometerstørrelse.

75. Fremgangsmåte som angitt i krav 72, karakterisert ved at den faste bærer omfatter fibre.

76. Fremgangsmåte som angitt i krav 72, karakterisert ved . at den faste bærer er en membran.

77. Fremgangsmåte som angitt i krav 74, karakterisert ved at partiklene er magnetisk reaktive og at adskillingen oppnås ved å utsette partiklene for et magnetfelt.

78. Fremgangsmåte som angitt i krav 75, karakterisert ved at fibrene er magnetisk reaktive og adskillingen oppnås ved å utsette fibrene for et magnetfelt.

79. Fremgangsmåte som angitt i krav 76, karakterisert ved at membranen er magnetisk reaktivt og adskillingen oppnås ved å utsette membranen for et magnetfelt.

80. Fremgangsmåte som angitt i krav 77, karakterisert ved at partiklene er metalloksyd, glass, polyamid, polyester, polyolefin, polysakkarid, polyglykol eller polyaminosyre.

81. Fremgangmåte som angitt i krav 78, karakterisert ved at fibrene er metalloksyd, glass, polyamid, polyester, polyolefin, polysakkarid, polyglykol eller polyaminosyre.

82. Fremgangsmåte som angitt i krav 79, karakterisert ved at membranene er metalloksyd, glass, polyamid, polyester, polyolefin, polysakkarid, polyglykol eller polyaminosyre.

83. Sett for assay-bestemmeIse av en target-nukleotid-sekvens-oppløsning inneholdende polynukleotider som forventes å inneholde target-sekvensen, karakterisert ved : a. en nukleotid-probe for targetsekvensen, og b. en polykationisk bærer som kan separere polynukleotider i samsvar med deres ladning eller lengde.

84. Sett for å assay-bestemmelse av en target-nukleotid-sekvens i en oppløsning inneholdende polynukleotider som forventes å inneholde target-sekvensen, karakterisert ved : a. en nukleotid-probve for target-sekvensen b. en polykationisk bærer som i stand til å separere polynukleotider i samsvar med deres ladning eller lengde, og c. en hybrid-elueringsoppløsning.

85. Sett for assay-bestemmelse av en target-nukleotid-sekvens i en oppløsning inneholdende polynukleotid som forventes å inneholde target-sekvensen, karakterisert ved : a. en nukleotid-probe for target-sekvensen, idet proben er en mindre nukleotid-multimer enn polynukleotidene som skal assay-bestemmes, og b. en polykationisk bærer i stand til ikke-kovalent binding av polynukleotidene og hybrider derav med proben uten særlig binding av den uhybridiserte probe.

86. Sett for assay-bestemmelse av en target-nukleotid-sekvens i en oppløsning innholdende polynukleotider som forventes å inneholde sekvensen, karakterisert ved : a. en nukleotid-probe for target-sekvensen er en mindre nukleotid-multimer enn polynukleotidene som skal assay-bestemmes, og b. en polykationisk bærer i stand til ikke-kovalent binding av polynukleotidene og hybrider der med proben uten i særlig grad å binde den uhybridiserte probe, og c. en hybrid-elueringsoppløsning.

87. Sett som angitt i krav 84 eller 86, karakterisert ved at hybrid-eluerings-oppløsningen er valgt fra gruppen bestående av 50 % formamid, fosfat, pyrofosfat, tripolyfosfat og fytinsyre.

88. Sett som angitt i krav 85, karakterisert ved at proben er valgt slik at polynukleotidene som probes er minst omtrent 3 ganger større enn proben.

89. Sett som angitt i krav 85, karakterisert ved at polynukleotidene som probes er minst omtrent 5 ganger større enn proben.

90. Sett som angitt i krav 83 - 86, karakterisert ved at proben er en analog av DNA eller RNA med en lavere negativ ladning i fosfat-hovedkjeden enn fosfatdiesteren av nativt DNA eller RNA.

91. Sett som angitt i 90, karakterisert ved at analogen er et metylfosfonat.

92. Sett som angitt i krav 83 - 86, karakterisert ved at proben har en merking for å tillate dens detektering.

93. Sett som angitt i krav 83 - 86, karakterisert ved at den faste bærer består av partikler.

94. Sett som angitt i krav 93, karakterisert ved at den faste består av partikler med mikrometerstørrelse.

95. Sett som angitt i krav 83 - 86, karakterisert ved at den faste bærer består av fibre.

96. Sett som angitt i krav 83 - 86, karakterisert ved at den faste bærer er en membran.

97. Sett som angitt i krav 94, karakterisert ved at partiklene er magnetisk reaktive.

98. Sett som angitt i krav 95, karakterisert ved at fibrene er magnetisk reaktive.

99. Sett som angitt i krav 96, karakterisert ved at membranen er magnetisk reaktiv.

100. Sett som angitt i krav 83-86, karakterisert ved at den kationisk ladning meddeles av alkylamin, arylaminer, guanidiner eller iminer.

101. Sett som angitt i krav 100, karakterisert ved at den faste bærer består av partikler.

102. Sett som angitt i krav 100, karakterisert ved at den faste bærer består av fibre.

103. Sett som angitt i krav 100, karakterisert ved at den faste bærer en membran.

104. Sett som angitt i krav 101, karakterisert ved at partiklene er magnetisk reaktive.

105. Sett som angitt i krav 102, karakterisert ved at partiklene er magnetisk reaktive.

106. Sett som angitt i krav 103, karakterisert ved at partiklene er magnetisk reaktive.

107. Sett som angitt i krav 103, karakterisert ved at partiklene er et metalloksyd, glass, polyamid, polyester, polyolefin, polysakkarid, polyglykol eller polyaminosyre.

108. Sett som angitt i krav 104, karakterisert ved at fibrene er metalloksyd, glass, polyamid, polyester, polyolefin, polysakkarid, polyglykol eller polyaminosyre.

109. Sett som angitt i krav 105, karakterisert ved at membranen er metalloksyd, glass, polyamid, polyester, polyolefin, polysakkarid, polyglykol eller polyaminosyre.