ES2628739T3

ES2628739T3 - Amplificación por desplazamiento múltiple

Info

Publication number: ES2628739T3
Application number: ES15167348.0T
Authority: ES
Inventors: Mark W. Eshoo; John Picuri; Curtis Phillipson
Original assignee: Ibis Biosciences Inc
Current assignee: Ibis Biosciences Inc
Priority date: 2009-10-15
Filing date: 2010-10-15
Publication date: 2017-08-03
Anticipated expiration: 2030-10-15
Also published as: EP3225695A1; EP2488656A1; EP2488656A4; EP2957641A1; US9890408B2; EP2957641B1; WO2011047307A1; US20110118151A1; EP2488656B1

Abstract

Un método que comprende: poner en contacto una muestra de ácido nucleico con una reacción de mezcla que contiene una serie de cebadores de oligonucleótidos, una o más enzimas polimerasas y uno o más componentes que forman emulsiones, de manera que la mencionada mezcla de reacción contiene betaína y trehalosa; someter la mencionada mezcla de reacción a unas condiciones en las que el mencionado ácido nucleico se amplifica, para producir un producto amplificado, en una reacción de amplificación por desplazamiento múltiple, de manera que la reacción de amplificación por desplazamiento múltiple se lleva a cabo en forma de emulsión; y romper la mencionada emulsión, tras completar la mencionada reacción de amplificación por desplazamiento múltiple, añadiendo un compuesto que rompe emulsiones a la mencionada reacción para convertir la mencionada emulsión y separarla en fases acuosas e hidrofóbicas.

Description

DESCRIPCIÓN

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

5

15

25

35

45

55

65

es una estructura bicíclica. El puente 'bloquea' la ribosa en una conformación estructural 3'-endo, que se encuentra a menudo en la forma A del ADN o el ARN. Los nucleótidos del LNA pueden mezclarse con las bases de ADN o ARN en un oligonucleótido. La conformación o estructura de ribosa bloqueada mejora el apilamiento de las bases y la preorganización del esqueleto y tiene el efecto de aumentar considerablemente la estabilidad térmica (temperatura de fusión) de un dúplex de ADN. Dos ejemplos de LNAs son el clásico LNA que tiene un único puente de carbono (metileno) entre los carbonos 2' y 4' de la ribosa, y otro tipo de LNA se conoce como ENA y tiene un puente de etileno entre los carbonos 2' y 4' de la ribosa. Se considera que un nucleótido de LNA individual es un ejemplo de un nucleótido modificado que puede incorporarse a los cebadores de oligonucleótidos y ADN.

Tal y como se utiliza en el presente texto, el término 'amplificación por desplazamiento múltiple' hace referencia a un método isotérmico que no se basa en la PCR y que se basa en la hibridación o fijado ('annealing', en inglés) de hexámeros aleatorios a un ADN desnaturalizado, seguida de una síntesis de desplazamiento de cadena a una temperatura constante. Se ha aplicado a pequeñas muestras de ADN genómico, dando como resultado la síntesis de ADN con alto peso molecular y con un sesgo limitado de representación de secuencias. A medida que se sintetiza ADN mediante desplazamiento de cadena, tiene lugar un número cada vez más elevado de eventos o actividades de cebado, de manera que se crea una red de estructuras de ADN con múltiples ramas. Esta reacción puede catalizarse usando enzimas como ADN polimerasa Phi29 o los grandes fragmentos de ADN polimerasa Bst.

Tal y como se utiliza en el presente texto, el término 'ácido nucleico' hace referencia a una macromolécula de alto peso molecular que se compone de cadenas de nucleótidos que transportan información genética. Los ácidos nucleicos más comunes son el ácido desoxirribonucleico (ADN) y el ácido ribonucleico (ARN). Los monómeros que constituyen los ácidos nucleicos se llaman nucleótidos. Cada nucleótido se compone de tres componentes: una base nitrogenada heterocíclica, ya sea una purina o una pirimidina (también llamada 'base nucleica'); un azúcar pentosa y un fosfato. Los diferentes tipos de ácido nucleico difieren en la estructura del azúcar de sus nucleótidos; el ADN contiene 2-desoxirribosa, mientras que el ARN contiene ribosa.

Tal y como se utiliza en el presente texto, el término 'base nucleica' hace referencia a una base nitrogenada heterocíclica, ya sea una purina o una pirimidina, en un residuo de nucleótidos o en un ácido nucleico. En el presente texto, el término 'base nucleica' se usa para describir la longitud de un determinado cebador de oligonucleótidos según el número de residuos de nucleótidos incluidos en el cebador de oligonucleótidos.

Tal y como se utiliza en el presente texto, el término 'octámero' hace referencia a un polímero compuesto de ocho unidades. Más específicamente, el término 'octámero' se utiliza para describir un cebador que tiene ocho residuos de nucleótidos.

Tal y como se utiliza en el presente texto, el término 'polimerasa' hace referencia a una enzima que cataliza el proceso de replicación de los ácidos nucleicos. Más específicamente, la ADN polimerasa cataliza la polimerización de los desoxirribonucleótidos a lo largo de una cadena de ADN, de manera que la ADN polimerasa la 'lee' y la utiliza como plantilla o patrón. La molécula recién polimerizada es complementaria a la cadena molde y es idéntica a la cadena que acompaña a la plantilla.

Tal y como se utiliza en el presente texto, el término 'cebador' (también llamado 'partidor' o 'primer') hace referencia a un oligonucleótido que es capaz de funcionar como el punto de inicio de la síntesis cuando es sometido a unas condiciones en las que se provoca la síntesis de un producto de la extensión del cebador que es complementario a una cadena de ácido nucleico (es decir, en presencia de nucleótidos y un agente inductor como la ADN polimerasa, y con una temperatura y un pH adecuados). Preferiblemente, el cebador tiene una sola cadena (es monocatenario) para obtener la máxima eficiencia en la amplificación, pero, alternativamente, puede ser de doble cadena. Si es de doble cadena (o bicatenario), primero se trata el cebador para separar sus cadenas antes de usarlo para preparar los productos de la extensión. Preferiblemente, el cebador es un oligodesoxirribonucleótido. El cebador debe ser lo suficientemente largo como para cebar la síntesis de los productos de extensión en presencia del agente inductor. Las longitudes exactas de los cebadores dependerán de muchos factores, incluyendo la temperatura, la composición del cebador, el uso del método y los parámetros utilizados para el diseño del cebador, tal y como se desvela en el presente texto.

Tal y como se utiliza en el presente texto, el término 'procesividad' hace referencia a la capacidad de una enzima para proseguir repetidamente con su función catalítica sin disociarse de su sustrato. Por ejemplo, la polimerasa Phi29 es una polimerasa altamente procesiva debido a su firme unión con el sustrato del ADN molde.

Tal y como se utiliza en el presente texto, el término 'perfilador' (o 'Profiler') es un término general que hace referencia a un ensayo usado para caracterizar un grupo de loci genéticos. Puede analizarse cualquier grupo de loci genéticos. Uno de los grupos más habituales de loci incluye normalmente un grupo central de alrededor de 13 loci marcadores STR que se conoce como el grupo CODIS ('Combined DNA Index System', en inglés, o Sistemas de Índice Combinado de ADN). En un determinado ensayo de perfilado, los STRs son caracterizados mediante un método de electroforesis capilar que detecta los productos de amplificación de STR marcados fluorescentemente. Los ejemplos de ensayos de perfilado específicos incluyen el ensayo AmpFLSTR® Profiler PlusTM y el ensayo AmpFLSTR® Identifiler® (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE UU), que tiene 3 loci marcadores STR adicionales.

imagen5

imagen6

imagen7

imagen8

5

15

25

35

45

55

65

1337) también provocan una preferencia por una conformación 3'-endo.

La modificación más habitual del ácido nucleico bloqueado es un puente de metileno de 2' a 4' que bloquea el anillo de ribosa en la conformación 3'-endo. Esta modificación se abrevia a menudo como 'ANB' ('Ácido nucleico bloqueado') o 'LNA' ('Locked nucleic acid', en inglés). Otro tipo de ácido nucleico bloqueado se denomina ENA, por sus siglas en inglés, y hace referencia al ácido nucleico con un puente de etileno. Esta modificación incluye un puente de etileno de 2' a 4'. La síntesis y preparación de los monómeros adenina, citosina, guanina, 5-metil-citosina, timina y uracilo con puentes de 2' a 4', junto con su oligomerización, y las propiedades de reconocimiento del ácido nucleico han sido descritas (Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630). Los monómeros con puentes de 2' a 4' y los métodos para prepararlos también se describen en WO 98/39352 y WO 99/14226. Los primeros análogos de los ácidos nucleicos con puentes de 2' a 4', fosforotioato-LNA y 2'-thio-LNA, también se han preparado y publicado (Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222). También se ha descrito la preparación de dúplex de oligodesoxirribonucleótidos con análogos de nucléosidos -con puentes de 2' a 4'-como sustratos para polimerasas de ácido nucleico (WO 99/14226). Además, la síntesis de 2'-amino-LNA -un nuevo análogo de oligonucleótidos de alta afinidad y limitado conformacionalmente-por medio de un manipulador también se ha descrito en la literatura de este campo (Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039). Además, se han preparado 2'-amino-y 2'metilamino-LNAs y se ha informado sobre la estabilidad térmica de sus dúplex con las cadenas de ARN y ADN complementarias (ver, por ejemplo, WO/2005/044976).

En algunas realizaciones, al menos algunos de los cebadores contienen al menos un residuo de nucleótidos con un puente de 2' a 4' o al menos dos residuos de nucleótidos con un puente de 2' a 4'. En otras realizaciones, los residuos de nucleótidos con un puente de 2' a 4' se localizan en las posiciones 2ª y 5ª de los cebadores de oligonucleótidos. Estas realizaciones de los sets de cebadores son hexámeros, heptámeros u octámeros, o cualquier combinación de estos.

En algunas realizaciones, los cebadores tienen secuencias aleatorias, con la excepción de que tienen bases nucleicas universales situadas específicamente, como la inosina. Las localizaciones específicas de las bases nucleicas de inosina se encuentran, preferiblemente, en las dos bases nucleicas terminales finales de un determinado cebador que contiene inosina.

En algunas realizaciones, uno o más ligamientos o enlaces de fosforotioato se incorporan a los cebadores en el extremo 3' de un determinado cebador con el objetivo de hacer que el cebador sea más resistente a la actividad nucleasa.

Kits de cebadores

En el presente texto también se desvelan kits (o equipos) que contienen cebadores.

En algunos ejemplos, los kits contienen una cantidad suficiente de una enzima polimerasa que tiene una alta procesividad. En algunas realizaciones, la polimerasa con una alta procesividad es polimerasa Phi29 o polimerasa Taq. En otras realizaciones, la polimerasa con una alta procesividad es una polimerasa obtenida mediante ingeniería genética cuya procesividad se ve aumentada en relación con la polimerasa nativa a partir de la cual se ha fabricado.

En algunos ejemplos, los kits contienen una cantidad suficiente de una polimerasa adicional, además de la polimerasa de alta procesividad, para mejorar las características de la reacción de amplificación. En algunos ejemplos, la polimerasa adicional es polimerasa Pol I de E. coli.

En algunos ejemplos, los kits contienen una cantidad suficiente de pirofosfatasa que cataliza la conversión de pirofosfatasa en dos equivalentes de fosfato. Se sabe que el pirofosfato inhibe las reacciones polimerasas.

En algunos ejemplos, los kits contienen, además, desoxinucleótidos trifosfatos, amortiguadores (o tampones) y aditivos de amortiguadores, como solutos compatibles, incluyendo trehalosa y betaína, en concentraciones optimizadas para una amplificación por desplazamiento múltiple.

El kit puede incluir componentes para preparar mezclas de reacción de PCR con emulsión. Estos componentes que forman emulsiones pueden incluir un detergente o una combinación de un detergente y un polímero hidrofóbico.

En algunos ejemplos, el detergente que se proporciona con el kit es un detergente no iónico. El detergente no iónico puede ser Tween 20, Tween 40, Tween 80, Triton X-100 o Triton X-102, o cualquier combinación de estos compuestos. El detergente puede estar presente en la mezcla de reacción en unos niveles de entre alrededor de un 0,05% y alrededor de un 3% (p/v). Un polímero hidrofóbico que se prefiere para su inclusión en el kit es el polidimetilsiloxano. Este polímero se incluye en el kit en una cantidad suficiente como para preparar unas mezclas de reacción que tienen un ratio de alrededor de 4:1 de polidimetilsiloxano y solución acuosa. Pueden proporcionarse otros polímeros hidrofóbicos con el kit, como aceite mineral, por ejemplo.

imagen9

imagen10

Para investigar los efectos que tienen los solutos compatibles sobre la sensibilidad de la reacción de amplificación, se desarrollaron mezclas de reacción de amplificación, tal y como se muestra en la Tabla 1.

Tabla 1 – Mezclas de Amplificación

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Mezcla 1: Concentración Final

5 µL de ADN molde de disolución hasta la extinción, como se explica más adelante: Variable

Tris HCl: 0,04025 M

Tris Base: 0,00975 M

Cloruro de Magnesio: 0,012 M

Sulfato de Amonio: 0,01 M

100 mM de preparación de dNTP (25 mM cada uno/a): 2 mM cada uno/a

DTT: 0,004 M

Preparación con un par de Cebadores: 0,05 mM

Enzima diluida en tampón: 0,5 unidades/ µL

Mezcla 2 (0,8 M de Trehalosa): Concentración Final

Tris HCl: 0,04025 M

Tris Base: 0,00975 M

Cloruro de Magnesio: 0,012 M

Sulfato de Amonio: 0,01 M

Trehalosa: 0,6 M

100 mM de preparación de dNTP (25 mM cada uno/a): 2 mM cada uno/a

DTT: 0,004 M

Preparación con un par de Cebadores: 0,05 mM

Enzima diluida en tampón: 0,5 unidades/ µL

5

15

25

Mezcla 3 (0,8 M de Trehalosa + 0,8 M de Betaína): Concentración Final

Tris HCl: 0,04025 M

Tris Base: 0,00975 M

Cloruro de Magnesio: 0,012 M

Sulfato de Amonio: 0,01 M

Betaína: 0,6 M

Trehalosa: 0,6 M

100 mM de preparación de dNTP (25 mM cada uno/a): 2 mM cada uno/a

DTT: 0,004 M

Preparación con un par de Cebadores: 0,05 mM

Enzima diluida en tampón: 0,5 unidades/ µL

Preparación A8 / Preparación B5

Tris, pH 7,5 50,00 mM MgCl2 9,00 mM (NH4)2SO4 7,50 mM

35

Betaína 0,60 M Ácido poliadenílico tratado con ultrasonidos 1,00 Ng/ul Trehalosa 0,60 M

100 mM de preparación de dNTP (25 mM cada uno/a) 2,00 mM DTT 4,00 mM Cebadores 15,00 uM

45

Phi29 0,43 u/ul Pol1 0,01 u/ul Pirofosfatasa 0,00007 u/ul BSA 0,23 ug/ul DMSO 2,50% Tween-40 1,00% 55 La Figura 1 muestra los resultados de un experimento de 'disolución hasta la extinción' en el que 1 nanogramo de la muestra SC35495 de ADN humano se diluyó sucesivamente y se añadió a las mezclas de reacción que se muestran en la Tabla 1 para una amplificación previa a un análisis de alelos mediante métodos conocidos. Las reacciones de amplificación se realizaron de la siguiente manera: las mezclas de reacción de la Tabla 1 (1, 2 y 3) se prepararon y se sometieron a las siguientes condiciones de amplificación durante un período de 6 horas en un termociclador:

1) 30º C durante 4 minutos; 2) 15º C durante 15 segundos; 3) repetir pasos 1 y 2 un total de 150 veces;

65 4) 90º C durante 3 minutos; y 5) conservar a 4º C.

El ADN amplificado resultante se analizó para obtener una identificación de alelos usando un método de análisis basado en la espectrometría de masas en el que los pares de cebadores específicos se usan después para obtener productos de amplificación específicos adicionales mediante una PCR de loci. Estos productos de

5 amplificación específicos tienen longitudes de hasta alrededor de 140 bases nucleicas que son adecuadas para realizar un análisis de composición de bases mediante espectrometría de masas, de una manera similar a la que se desvela en Jiang et al. (Clin Chem., 2007, 53, 195-203). La Figura 1 muestra claramente que las mezclas de reacción 2 y 3 producen ADN amplificado cuyas asignaciones alélicas ('allele calls', en inglés) pueden realizarse con niveles de concentración tan bajos como 2 picogramos.

10 En otro experimento, el ADN amplificado resultante se analizó utilizando un procedimiento de fluorescencia con el ProfilerTM con el objetivo de determinar una serie de alelos STR ('repetición(es) corta(s) en tándem') que se conoce como el grupo CODIS ('Combined DNA Index System', en inglés, o Sistemas de Índice Combinado de ADN). Los pares de cebadores específicos se usaron después para obtener productos de amplificación específicos

15 adicionales mediante una PCR de los loci de interés. Estos productos de amplificación se sometieron después al procedimiento de fluorescencia con el 'Profiler'. En las tablas 2 y 3 se incluyen diez de los trece loci STR centrales del CODIS (las abreviaturas de los marcadores de la columna de los loci son las siguientes: D3S = D3S1358; D8S = D8S1179; D21S = D21S11; D18S = D18S51; D5S = D5S8181; D13S = D13S317; y D7S = D7S820, mientras que vWA indica el gen del factor de Von Willebrand; TPOX indica el gen de la peroxidasa del tiroides; FGA indica el gen

20 de la cadena alfa del fibrinógeno; y AMEL indica el gen de la amelogenina). La columna situada más a la izquierda indica la cantidad de ADN utilizada en las reacciones de amplificación. Los números que aparecen debajo de los loci indican el número de asignaciones alélicas realizadas en el análisis de acuerdo con el método con el ProfilerTM. El objetivo es realizar dos asignaciones alélicas para tantos loci como sea posible con la menor cantidad posible de ADN antes de llevar a cabo la amplificación, ya que la capacidad de hacer esto proporcionaría la capacidad de

25 obtener muestras forenses útiles de ADN a partir de cantidades pequeñas de tejidos.

Tabla 2: Sensibilidad de la Mezcla de Reacción 1

30

35

40

45

50

55

60

Cantidad de ADN (pg): D3S vWA FGA AMEL D8S D21S D18S D5S D13(H) D7S

1000: 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2

500: 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2

250: 2 1 2 1 1 2 1 2 2 2

125: 1 2 2 2 2 2 1 2 2 1

63: 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0

31: 1 1 2 1 0 2 0 0 0 1

16: 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0

8: 0 0 2 0 0 0 0 0 2 0

4: 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0

2: 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0

Tabla 3: Sensibilidad de la Mezcla de Reacción 3

5

15

25

Cantidad de ADN (pg): D3S vWA FGA AMEL D8S D21S D18S D5S D13(H) D7S

1000: 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2

500: 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2

250: 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2

125: 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2

63: 2 2 2 2 1 1 1 2 2 2

31: 2 2 1 2 1 2 2 1 2 2

16: 2 0 2 1 1 1 1 1 0 0

8: 2 2 0 0 0 0 1 0 0 0

4: 2 0 0 0 1 0 0 1 0 1

2: 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0

Las tablas 2 y 3 muestran claramente que la mezcla 3, que contiene solutos añadidos, mejora considerablemente la sensibilidad respecto a la obtenida utilizando la mezcla 1, que no tiene solutos. Por lo tanto, la mezcla 3 genera más producto a partir de muestras de trazas de ácido nucleico tan pequeñas como 2 picogramos y proporciona 5 o más

35 asignaciones de allelos para muestras de trazas tan pequeñas como 4 picogramos.

Ejemplo 2: Efectos de los Solutos Compatibles a la hora de mantener el Equilibrio Alélico en la Reacción de Amplificación

El equilibrio alélico es una medida que indica el ratio de cantidad de detección del alelo menor (también llamado 'alelo menos común') vs. el alelo mayor (también llamado 'alelo más común'). Es deseable mantener el equilibrio alélico de una determinada muestra de ADN, cuando esta se amplifica, para obtener una representación precisa del equilibrio alélico de la muestra original.

45 Se amplificó una muestra de ADN humano, denominada SC35495, de acuerdo con las condiciones descritas en el Ejemplo 1. En este ejemplo, las cantidades de los alelos detectados se cuantificaron utilizando el kit QuantifierTM (Applied Biosystems), que está disponible comercialmente. Los valores de estas cantidades se convirtieron a Log2 para proporcionar una medida más intuitiva del equilibrio. Estos valores se muestran en la Figura 2, en la que se puede ver que la mezcla 3 (A4) es la mejor mezcla para conservar la mejor representación del equilibrio alélico. Esto indica que la inclusión de los solutos compatibles betaína y trehalosa a la mezcla de reacción mejora el equilibrio alélico / representación de la reacción de amplificación en comparación con las mezclas de reacción sin solutos o únicamente con trehalosa.

Ejemplo 3: Efectos de los Solutos Compatibles a la hora de mantener la Calidad de la Reacción de 55 Amplificación

La calidad de la reacción de amplificación puede describirse desde un punto de vista para proporcionar una medida combinada de una óptima amplificación progresiva ('x' veces), un alto porcentaje de amplificación del ácido nucleico diana analizado y un rendimiento óptimo en el ensayo con el ProfilerTM.

En la Figura 3 se muestran los resultados de las determinaciones de cantidad del ADN molde amplificado mediante tres mezclas de reacción, de acuerdo con las condiciones descritas en el ejemplo 1, usando 0,1 nanogramos de ADN molde (panel A) y 1 nanogramo de ADN molde (panel B). Queda claro que la mezcla 3 (A4) produce el ADN más amplificado. Además, se descubrió que la mezcla 3 (A4) produce menos picos o máximos 65 externos de compuestos 'no molde' detectados en el ensayo con QuantifierTM (no se muestra) y en los geles de agarosa al 1% (no se muestra) que los observados con las otras dos mezclas. Así, la inclusión de betaína y

trehalosa en la mezcla de reacción mejora considerablemente la calidad de una reacción de amplificación en comparación con la de las mezclas que no tienen solutos o que únicamente tienen trehalosa.

Ejemplo 4: Efectos de la Inclusión de una Polimerasa de ADN adicional sobre la Reacción de Amplificación

5

Para evaluar los efectos de aumentar la acción de la polimerasa Phi29, se añadieron individualmente enzimas polimerasas adicionales a la mezcla de amplificación 3 junto con 15 picogramos de ADN molde de la muestra humana SC35495. Las muestras se amplificaron como se indica en el Ejemplo 1. El ADN amplificado resultante se analizó en el ensayo del ProfilerTM y se realizaron y calcularon las asignaciones alélicas. La Tabla 4

10 muestra los resultados e indica que la adición de polimerasa Pol I da como resultado una media de cuatro asignaciones alélicas adicionales en el experimento, además de indicar que la adición de polimerasa Pol I es una modificación positiva de la mezcla de amplificación.

Tabla 4: Efectos de una Enzima Polimerasa Adicional sobre la Amplificación del Genoma Completo según la 15 Medición de las asignaciones alélicas de Mezclas Amplificadas

Enzima Adicional Incluida en la Muestra: Asignaciones Alélicas Experimento 1 Asignaciones Alélicas Experimento 2 Promedio de Asignaciones Alélicas

Ninguna: 13 12 12,5

Fragmento Klenow: 11 7 9

Polimerasa T4: 11 9 10

Polimerasa T7: 14 13 13,5

Polimerasa BstE: 14 9 11,5

Polimerasa Pol I: 18 15 16,5

La adición de la Polimerasa Pol I aumenta todavía más la producción o cosecha del ADN amplificado y también mejora el genotipado de las cantidades muy pequeñas de ADN. La adición de una enzima adicional, 20 pirofosfatasa, resulta útil porque se sabe que la acumulación de pirofosfatasa durante el proceso de amplificación

inhibe las reacciones de las polimerasas.

Ejemplo 5: Diseño y Estudio de las Modificaciones Individuales de Cebadores de Oligonucleótidos

25 Se diseñó una serie de unidades o motivos de cebadores para mejorar la calidad, la sensibilidad y el equilibrio de la reacción de amplificación. Las modificaciones incluían la inclusión de bases nucleicas de inosina en posiciones específicas de los cebadores de hexámeros, heptámeros y octámeros. Se incorporaron ligamientos de fosforotioato modificado a estos cebadores en los dos ligamientos terminales más -hacia-3'. Se descubrió que la colocación más efectiva de las bases nucleicas de inosina se daba en las posiciones quinta y sexta de los cebadores

30 de hexámeros, en las posiciones sexta y séptima de los cebadores de heptámeros y en las posiciones séptima y octava de los cebadores de octámeros. Estos cebadores que contenían bases nucleicas de inosina produjeron un producto menos amplificado que los cebadores correspondientes que no contenían inosina. Sin embargo, se descubrió que el producto total amplificado presentaba una mayor proporción del ADN molde, lo cual indicaba que la inclusión de inosinas en los cebadores mejora la calidad de la amplificación.

35 La posición de los residuos de nucléotidos modificados de LNA de los cebadores de heptámeros se examinó al detalle cambiando sistemáticamente la posición de una o dos modificaciones de LNA (L) en heptámeros aleatorios, tal y como se muestra en la Tabla 5. Los símbolos de la Tabla 5 son los siguientes: N = A, T, C o G; I = inosina; NI = nitroindol; L = LNA (versiones bloqueadas de A, C, T o G). En este experimento, las mejoras en la

40 amplificación progresiva o escalonada se obtienen con los cebadores que tienen LNA sustituido en la posición 2, la posición 4, la posición 5, las posiciones 1 y 4, y las posiciones 2 y 5. Las sustituciones del LNA se toleraron bien en todas las posiciones, de manera que solamente la posición más 3' mostró un ligero efecto negativo (LNA-7). Los cebadores que tienen residuos sustituidos de LNA en dos posiciones muestran un mayor aumento de amplificación escalonada en comparación con aquellos que solo tienen un único residuo sustituido de LNA. Además, al sustituir los

45 residuos de inosina en las posiciones más 3' de un cebador de LNA sustituido en las posiciones 2 y 5, mejoró aún más la amplificación escalonada (LNA-11 y LNA-12). En algunas realizaciones, se usan NLNNLIN o N de 7 partes con un fosforotioato entre las posiciones de nucleótidos 6 y 7.

Tabla 5: Determinación del Posicionamiento Óptimo de los Residuos de LNA en los Cebadores

5

10

15

20

25

30

35

40

5': Posición del Residuo de Nucleótidos del (los) Cebador(es) 3'

Cebador: 1 2 3 4 5 6 7 Número de Amplificaciones con respecto al Control

Control: N N N N N N N 1

LNA-1: L N N N N N N 0,9

LNA-2: N L N N N N N 1

LNA-3: N N L N N N N 0.9

LNA-4: N N N L N N N 1,1

LNA-5: N N N N L N N 1,4

LNA-6: N N N N N L N 1

LNA-7: N N N N N N L 0,7

LNA-8: L N N L N N N 7,6

LNA-9: L N N L N N L 0,2

LNA-10: L N N L N I I 4,8

LNA-11: N L N N L I I 9,3

LNA-12: N L N N L N N 4,1

LNA-13: L N N L N NI I No hay

Ejemplo 6: Investigación Preliminar de los Detergentes en la Producción Obtenida en las Reacciones de Amplificación por Desplazamiento Múltiple

45 El desarrollo de una formulación de una emulsión para una reacción de amplificación por desplazamiento múltiple requiere investigar los efectos de la presencia de detergentes y aceites en la formación de la emulsión y confirmar que estos componentes no tienen efectos negativos en las producciones de la reacción. Las reacciones de amplificación por desplazamiento múltiple se llevaron a cabo usando 10 pg de un genoma estándar de Klebsiella

50 pneumoniae en un volumen de reacción de 50 µL utilizando un set estandarizado de cebadores, 2 mM de dNTPs, 3,7 unidades por reacción de Polimerasa Pol I y 18,3 unidades por reacción de polimerasa Phi29. En las reacciones se incluyeron concentraciones variables de diferentes detergentes. Una prueba se llevó a cabo usando polidimetilsiloxano sin detergentes. Las producciones de las reacciones se determinaron usando una PCR cuantitativa (QPCR). Los resultados se muestran en la Tabla 6.

55 Tabla 6: Producciones de las Mezclas de las Reacciones de Amplificación por Desplazamiento Múltiple que contienen Detergentes y Polidimetilsiloxano

60

65

5

10

15

20

25

30

Componente de Emulsión Añadido: Cantidad Concentración de la Producción (ng/µL)

Polidimetilsiloxano: 80 µL 15,3

Tween 20: 0,1% 99,8

Tween 40: 0,1% 113,0

Tween 80: 0,1% 64,7

Triton-X 100: 0,1% 95,4

Triton-X 102: 0,1% 112,4

Tween 20: 0,05% 74,8

Tween 40: 0,05% 59,8

Tween 80: 0,05% 64,3

Triton-X 100: 0,05% 62,4

Triton-X 102: 0,05% 67,2

Se descubrió que la adición de polidimetilsiloxano reducía la producción total agitando durante 5-10 segundos. La adición de un 0,05% de detergentes no afectaba a la producción de forma apreciable, pero las concentraciones de un 0,1% aumentaban la producción con todos los detergentes, excepto Tween 80.

35 Se realizó un segundo experimento similar con detergentes con concentraciones de entre un 0,1% y un 1,0%. Los resultados se muestran en la Tabla 7.

Tabla 7: Producciones de las Mezclas de las Reacciones de Amplificación por Desplazamiento Múltiple que contienen Detergentes

40

45

50

55

60 5

Componente de Emulsión Añadido: Concentración Concentración de la Producción (µg/µL)

Tween 20: 0,5% 57,9

Tween 40: 0,1% 54,6

Triton-X 100: 0,1% 47,2

Triton-X 102: 0,1% 48,4

Tween 20: 0,5% 61,9

Tween 40: 0,5% 78,7

Triton-X 100: 0,5% 52,0

Triton-X 102: 0,5% 63,0

Tween 20: 1,0% 65,3

Tween 40: 1,0% 60,5

Triton-X 100: 1,0% 44,1

Triton-X 102: 1,0% 45,7

15

25

35

45

55

65

En estos experimentos se identificó a Tween 40 como el mejor reactivo.

Ejemplo 7: Efectos de los Detergentes sobre el Equilibrio en las Reacciones de Amplificación por Desplazamiento Múltiple

Se investigaron los efectos de Tween 20, Tween 40, Tween 80 (#P9416-50ML, P1504-500ML y P518850ML, respectivamente, en el catálogo Sigma), Triton X-100 y Triton X-102 (#T8787-50ML y X102-500ML en el catálogo Sigma) en relación con la amplificación de las muestras de prueba de ADN. Tras completar la reacción de amplificación, se rompió la emulsión añadiendo una cantidad excesiva de cloroformo. Las producciones de la amplificación se evaluaron en presencia de detergentes de entre un 0,05% y un 1% (p/v). Los resultados se muestran en las Figuras 4 y 5. Se determinó que Tween 40 tiene los efectos más favorables sobre la producción.

El ADN amplificado que se obtuvo -tal y como se ha descrito previamente-en presencia y ausencia de Tween 40 se usó como ADN molde para un ensayo en el que se utilizó el kit de amplificación de PCR AmpFLSTR® Identifiler® siguiendo las instrucciones del fabricante (Applied Biosciences, Foster City, CA, EE UU). En la Figura 6 se muestran los resultados obtenidos en el análisis del locus FGA utilizando ADN amplificado de una reacción de amplificación por desplazamiento múltiple en ausencia de detergente y en presencia de un 0,5% y un 1% de Tween

40. Queda claro que el equilibrio entre los dos alelos del locus (19 y 23) mejora enormemente en presencia de un 1% de Tween 40.

El equilibrio mejorado de la detección de alelos también provocó menos casos de alelos no detectados ('abandonos') en el análisis. La Tabla 8 muestra la relación entre los 'abandonos' de alelos y la presencia de Tween 40 en la mezcla de reacción.

Tabla 8: Efectos de Tween 40 en una Mezcla de Amplificación inicial sobre los 'Abandonos' de Alelos en el Ensayo con Identifiler®

Concentración de Tween 40 (% p/v): Asignaciones Alélicas Abandonos

0,0: 20 11

0,5: 24 7

1,0: 25 6

Ejemplo 8: Reacciones de Amplificación por Desplazamiento Múltiple en Emulsiones de Agua en Aceite

Sin estar sujetos a ninguna teoría en particular, se cree que llevar a cabo las reacciones de amplificación en soluciones que contienen un detergente en forma de emulsión da como resultado la captura de moléculas individuales de ácido nucleico molde en las microgotitas de la emulsión. Esto contribuye a la amplificación del ácido nucleico molde, a la vez que se minimiza la interferencia de las moléculas de ácido nucleico de fondo y la competencia entre las moléculas individuales de la plantilla de ADN. También se cree que el formato de emulsión proporciona una amplificación más eficiente de los fragmentos más pequeños, o con pocas copias, del genoma diana.

Se descubrió que las soluciones acuosas con un 0,5-1% de detergente (Tween 20, 40, 80; Triton-X 100, 102) mezcladas con un volumen 4 veces excesivo de polidimetilsiloxano en un homogeneizador tipo 'Bead Beater' (Biospec Products Inc., Bartlesville, OK, EE UU) durante 15 segundos formaban emulsiones que eran estables en el ciclo de amplificación elegido que se describe en el Ejemplo 6. Esto indica que la emulsión de Tween 40 / polidimetilsiloxano es compatible con la reacción de amplificación por desplazamiento múltiple.

Se descubrió que las reacciones de amplificación por desplazamiento múltiple en emulsiones basadas en polidimetilsiloxano que contienen un 0,5% de Tween 40 y un 1% de Triton X-100 producen productos con una amplificación considerable, tal y como lo demuestran los geles de electroforesis (no se muestra).

Las muestras de ADN amplificado obtenidas de las emulsiones de polidimetilsiloxano que contienen un 0,5% y un 1% de Tween 40 se analizaron con el ensayo de Identifiler® para determinar si los 'abandonos' de alelos se podían reducir. Este sería un resultado particularmente deseable, ya que, en el caso del ensayo de Identifiler®, es poco probable que un individuo pueda ser identificado en una investigación forense si en el ensayo se obtiene un perfil alélico incompleto debido a los abandonos causados por una mala representación y/o equilibrio en una reacción inicial de amplificación por desplazamiento múltiple.

Los resultados que se muestran en la Tabla 9 indican que una concentración de Tween 40 de un 1% (p/v) en una emulsión de polidimetilsiloxano proporciona una buena representación y equilibrio en las reacciones de amplificación por desplazamiento múltiple. En el caso del Tween 40 de un 1%, los abandonos se eliminaron por completo. Por lo tanto, la emulsión de Tween 40 / polidimetilsiloxano supone una mejora muy útil para la

5 amplificación por desplazamiento múltiple. Las personas versadas en la materia sabrán reconocer que, a pesar de que la representación y el equilibrio se evaluaron utilizando un kit de ensayo de STR humano disponible comercialmente, el ADN que se obtiene utilizando las reacciones de amplificación por desplazamiento múltiple descritas en el presente texto también es útil para otras aplicaciones, como, por ejemplo, la identificación de virus o bacterias de muestras que contienen cantidades ínfimas del ADN de esos virus o bacterias.

10 Tabla 9: Efectos del Tween 40 en una Mezcla inicial de Amplificación de Emulsión sobre los Abandonos de Alelos en un Ensayo con Identifiler®

Concentración de Tween 40 (% p/v): Asignaciones Alélicas Abandonos

0,0: 20 11

0,5: 28 3

1,0: 31 0

15 Los ejemplos precedentes ilustran que el uso de polimerasas, la inclusión de solutos, detergentes y polímeros hidrofóbicos compatibles y las modificaciones de cebadores mejoran individual y colectivamente la sensibilidad de la amplificación, a la vez que preservan la representación de la muestra de ácido nucleico original y producen productos de amplificación de alta calidad.

20 Ejemplo 9: Estudio sobre los Efectos de la Concentración de DMSO y el Tiempo de Desnaturalización sobre el Equilibrio Alélico

Para analizar los efectos que tienen la concentración de DMSO y el tiempo de desnaturalización sobre el

25 equilibrio alélico de la amplificación por desplazamiento múltiple, se amplificaron tres muestras de ADN de 62,5 pg (SC3) utilizando un protocolo estándar que se denomina WGA_4 y que incluye un ciclo de desnaturalización de 10 minutos. También se sometió una cuarta muestra de ADN de 62,5 pg al mismo protocolo, con la excepción de que se utilizó un periodo de desnaturalización de 3 minutos con una temperatura de 95º C. Se llevó a cabo una reacción de amplificación -utilizando el WGA_5-que contenía DMSO en una concentración de un 5% y otra que contenía DMSO

30 en un 10%. El ADN amplificado se analizó usando un ensayo de Identifiler® y se determinó el equilibrio alélico de cada muestra. Los resultados de este experimento se muestran en la Tabla 10.

35

40

45

Tabla 10: Efectos de la Concentración de DMSO y el Tiempo de Desnaturalización sobre el Equilibrio Alélico en Muestras Amplificadas

Muestra: Tiempo de Desnaturalización (minutos) Concentración de DMSO (%) Equilibrio Alélico

1: 10 0 1,90

2: 10 5 1,44

3: 10 10 1,77

4: 3 0 2,55

Los datos que se muestran en la Tabla 10 señalan que con un periodo de tiempo de 10 minutos para la

50 desnaturalización de la muestra de ADN y con una concentración de DMSO de un 5% en la reacción de amplificación por desplazamiento múltiple se obtiene un equilibrio alélico de 1,44. En algunas realizaciones, se usa un tiempo de desnaturalización de un minuto a 95º C.

Ejemplo 10: Estudios adicionales sobre los Efectos de la Concentración de DMSO y el Tiempo de 55 Desnaturalización sobre el Equilibrio Alélico

El experimento que se describe en el Ejemplo 9 se perfeccionó con periodos adicionales de tiempo de desnaturalización de entre cero y diez minutos y con concentraciones de DMSO de entre un 1% y un 5% utilizando un protocolo estandarizado de amplificación por desplazamiento múltiple denominado WGA_1. Este protocolo comprende el paso de añadir 400 µL de polidimetilsiloxano y agitar la mezcla de reacción durante dos periodos de

5 30 segundos para obtener una emulsión. Tras completar la reacción de amplificación por desplazamiento múltiple, la emulsión se rompió añadiendo 250 µL de cloroformo, mezclándola en el vórtex y centrifugándola. El equilibrio alélico de los productos de reacción se analizó utilizando el ensayo de IdentifilerTM.

15

20

25

30

35

Tabla 11: Investigación adicional sobre los Efectos de la Concentración de DMSO y el Tiempo de 10 Desnaturalización sobre el Equilibrio Alélico en Muestras Amplificadas

1: 0 0 2,06

2: 1 0 1,37

3
3: 0 1,93

4: 5 0 1,60

5: 10 0 2,23

6: 3 1 1,67

7: 3 2,5 1,23

8: 3 5 1,33

Los datos que se muestran en la Tabla 11 indican que un periodo de tiempo de 3 minutos para la desnaturalización de la muestra de ADN y una concentración de un 2,5% de DMSO en la reacción de amplificación por desplazamiento múltiple dan como resultado un mejor balance alélico de 1,23.

40 Ejemplo 11: Experimento de Disolución hasta la Extinción: Amplificación de Muestras diluidas de ADN mediante Amplificación por Desplazamiento Múltiple con un 2,5% de DMSO

Este experimento analiza la capacidad que tienen las condiciones de la reacción de amplificación por

45 desplazamiento múltiple para producir un producto de amplificación con un buen equilibrio alélico y una buena cosecha. Las muestras de ADN que se habían diluido desde 500 pg hasta 7,8 pg se amplificaron en mezclas de reacción que contenían DMSO en un 2,5%. Los resultados que indican la cosecha y el equilibrio de la amplificación se muestran en la Tabla 10.

50 Tabla 12: Efectos de la Concentración de la Muestra de ADN inicial sobre la Cosecha y el Equilibrio Alélico

55

5

15

Cantidad Inicial de ADN (pg): Número de Amplificaciones (Promedio) Promedio de Abandonos Promedio de Equilibrio Alélico

500: 2,69 x 103 0 0,56

250: 4,90 x 103 0 0,78

125: 8,46 x 103 0 1,01

62,5: 1,60 x 104 0,67 1,67

31,3: 2,39 x 104 4,33 4,74

16,6: 4,05 x 104 11,00 8,14

7,8: 6,99 x 104 13,67 8,73

Los resultados que se muestran en la Tabla 12 indican que con el método de amplificación por desplazamiento múltiple se obtienen de promedio una amplificación escalonada y un equilibrio alélico satisfactorios con cantidades iniciales de ADN de hasta 125 pg.

25 Ejemplo 12: Comparación del Equilibrio Alélico de la Amplificación con Emulsión que incluye DMSO con un Kit de Amplificación del Genoma completo disponible comercialmente

El equilibrio alélico obtenido mediante reacciones de amplificación por desplazamiento múltiple con emulsión de 150 pg de ADN con un 2,5% y un 5% de DMSO se comparó con el equilibrio alélico de la misma muestra de ADN de 150 pg amplificada con GenomiphiTM, un kit de amplificación del genoma completo que está disponible comercialmente. Los resultados se muestran en la Tabla 13 y en la Figura 7. En la Tabla 13, en la columna de 'Condiciones', A, B y C representan tres pruebas con condiciones de reacción idénticas. El gráfico de barras de la Figura 7 muestra los datos correspondientes a la media de las tres pruebas.

35 Tabla 13: Resultados de la Comparación de la Reacción de Amplificación con Emulsión -que contiene DMSOcon la Reacción con Genomiphi

45

55

Muestra: Condiciones Concentración de DMSO (%) Número de Amplificaciones Abandonos Equilibrio Promedio

1: eWGA A 2,5 1,31 x 104 0 0,64

2: eWGA B 2,5 1,40 x 104 0 0,67

3: eWGA C 2,5 1,26 x 104 0 0,43

4: eWGA A 5,0 8,84 x 103 0 1,16

5: eWGA B 5,0 9,33 x 103 0 0,65

6: eWGA C 5,0 7,41 x 103 0 0,59

7: Genomiphi A 0 6,58 x 103 0 1,28

8: Genomiphi B 0 6,31 x 103 3 1,21

9: Genomiphi C 0 6,55 x 103 0 1,34

10: Sin alterar A 0 - 1 0,51

11: Sin alterar B 0 - 4 0,52

12: Sin alterar C 0 - 0 0,40

Los resultados que se muestran en la Tabla 13 y en la Figura 7 indican que el método de amplificación con emulsión desarrollado con DMSO con una concentración de un 2,5% da como resultado un equilibrio alélico que es 65 similar al de la muestra de ADN no amplificada y que es un equilibrio alélico mucho mejor que el que se obtiene

utilizando el kit GenomiphiTM, que está disponible comercialmente.

imagen11

imagen12

Claims

imagen1

imagen2