JP2001526381A - マトリックス補助レーザー脱着／イオン化質量分光分析による核酸の同定方法 - Google Patents

マトリックス補助レーザー脱着／イオン化質量分光分析による核酸の同定方法

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JP2001526381A JP2000524469A JP2000524469A JP2001526381A JP 2001526381 A JP2001526381 A JP 2001526381A JP 2000524469 A JP2000524469 A JP 2000524469A JP 2000524469 A JP2000524469 A JP 2000524469A JP 2001526381 A JP2001526381 A JP 2001526381A
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    • H01J49/0418—Sample holders or containers for laser desorption, e.g. matrix-assisted laser desorption/ionisation [MALDI] plates or surface enhanced laser desorption/ionisation [SELDI] plates

Abstract

(57)【要約】 本発明は、マトリックス補助レーザー脱着／イオン化質量分光分析による、異なる質量の前以て決定したプローブを用いた核酸分子中のヌクレオチド配列の検出方法に関する。本発明の方法の利点の一つは、異なるプローブのセットにより種々の未知の核酸分子を同時に特徴付けることができることである。さらに、本発明は、プローブおよび／またはプローブ支持体（任意に核酸分子が結合している）を含むキットに関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （技術分野） 本発明は、マトリックス補助レーザー脱着／イオン化質量分光分析による、異
なる質量の前以て決定したプローブを用いた核酸分子中のヌクレオチド配列の検
出方法に関する。本発明の方法の利点の一つは、異なるプローブのセットにより
種々の未知の核酸分子を同時に特徴付けることができることである。さらに、本
発明は、プローブおよび／またはプローブ支持体（任意に核酸分子が結合してい
る）を含むキットに関する。
【０００２】 核酸を正確に特徴付けることは非常に複雑で、高価につくものである。不明な
ＤＮＡはシークエンシングにより特徴付けることができる。これがＤＮＡを分析
するのに最も正確な方法である。しかしながら、ＤＮＡのシークエンシングは多
大な時間および労力を要し、全配列に関心がもたれる場合のみに必要であるにす
ぎない。非常に短いＤＮＡ部分(＜１０００ヌクレオ塩基)のみが一つの工程でシ
ークエンシングされ得る。１０００ヌクレオ塩基よりも長いＤＮＡ断片を一層大
きいスケールで分析しなければならない場合にはＤＮＡを分割することが必要と
なり、よりこの手法は高くつくことになる。
【０００３】 しかしながら、より低い解決ではあるが多くの言明を行うことができる。しか
しながら、現在までに記載された方法は、放射性物質を使用する必要があり、、
１つの分析にたった１つのプローブしか使えないという点で不利である。そのよ
うな従来技術の方法は、たとえば、種々の標的ＤＮＡのアレイを用いてある種の
情報を探求することを含む。何千もの標的ＤＮＡを含むアレイを固相に固定化し
、ついでプローブ（相補配列を持つ核酸）を用いてある配列の存在について全て
の標的ＤＮＡを一緒に調べることができる1,2。プローブと標的ＤＮＡとの一致 は、両核酸のハイブリダイゼーションにより確認することができる。プローブは
種々の長さのいかなる核酸配列であってもよい。最小限にしか互いに重複しない
、プローブ配列の至適ライブラリーを選択する様々な方法が存在する3,4。プロ ーブ配列は、特定の標的ＤＮＡを見つけ出すために特別に編成することができる
。この技術を利用した一つの方法は、オリゴフィンガープリンティングである。
標的ＤＮＡのライブラリーを短い核酸プローブで走査する。通常、そのためのプ
ローブは８〜１２塩基の長さである。１つのプローブが、ナイロン膜に固定化さ
れた標的ＤＮＡライブラリーに同時にハイブリダイズされる。プローブは放射能
で標識されており、ハイブリダイゼーションは放射能の位置により判定される。
固定化されたＤＮＡアレイの走査にはまた、蛍光によりマーキングしたプローブ
もまた用いられている5。類似の方法が、ＤＮＡシークエンシングのマルチプル 化のために用いられている6,7。標的配列のクローニングのため、種々のベクタ ー系が用いられる。各一つのクローンを各クローニングベクターによりプールし
、配列決定反応が行い、断片をゲル上で分離し、ゲルをナイロン膜上にブロット
する。続いて、それぞれのクローニング系に属する配列が得られるように、クロ
ーニング系の種々の配列を固定化ＤＮＡとハイブリダイズさせる。ここで、クロ
ーニング系の走査はまた質量分光分析により検出可能なプローブによっても行う
ことができる。
【０００４】 標的ＤＮＡと配列特異的に相互作用することができるいかなる分子をもプロー
ブとして用いることができる。最も一般的に用いられているのはオリゴデオキシ
リボヌクレオチドである。しかしながら、この目的のためには、ペプチド核酸（
ＰＮＡ）9,10、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドまたはメチルホスホネー
トオリゴヌクレオチドなどの核酸のあらゆる修飾が適している。プローブの特異
性は非常に重要である。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは特に好ましい
わけではない、なぜなら、その構造が硫黄原子によって修飾されており、このこ
とはハイブリダイゼーションの特性にマイナスの影響を及ぼすからである。この
ことは、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが通常、ジアステレオマーなし
では合成されないという事実にもよる。過去には、メチルホスホネートオリゴヌ
クレオチドでも同様の純度に関る問題があったが、これらオリゴヌクレオチドは
、次第にジアステレオマーなしで合成されるようになってきている。メチルホス
ホネートオリゴヌクレオチドとホスホロチオエートオリゴヌクレオチドとの本質
的な違いは、前者が荷電していない骨格を有する結果、緩衝塩へのハイブリダイ
ゼーションの依存がより低減し、全体として、反発の低減により親和性が高くな
ることである。ペプチド核酸もまた荷電していない骨格を持ち、このことにより
同時に、核酸の骨格の一般的な糖−リン酸構造とは化学的特性が劇的に逸脱した
ものとなる。ＰＮＡの骨格は、通常のＤＮＡの糖−リン酸骨格の代りにアミド配
列を示す。ＰＮＡは、ＤＮＡに相補的である配列と非常によくハイブリダイズす
る。ＰＮＡ／ＤＮＡハイブリッドの融解温度は、対応するＤＮＡ／ＤＮＡハイブ
リッドよりも高く、緩衝塩に対するハイブリダイゼーションの依存度もまた比較
的低い。
【０００５】 マトリックス補助レーザー脱着／イオン化質量分光分析（Matrix-assistierte
Laser Desorptions/Ionisations Massenspektrometrie）（ＭＡＬＤＩ）は、生
体分子の分析のための新規で非常に効率的な方法である11。分析対象物分子を光
吸収マトリックス中に包埋する。マトリックスを短レーザーパルスにより蒸気化
し、かくして分析対象物は断片化されない形態で気相に移される。分析対象物の
イオン化はマトリックス分子のパルスにより達成される。負荷した電圧は、ゼロ
場飛行パイプでイオンを加速する。その質量が異なるため、イオンは異なって加
速される。小さなイオンは大きなイオンよりも早く検出器に到達する。飛行時間
はイオンの質量に変換される。技術的なハードの新規性は方法を有意に改善して
いる。ここで、遅発抽出（delayed extraction）（ＤＥ）12について言及してお
くのは有意義である。ＤＥの場合、加速電圧はレーザーパルス後の遅発によりオ
ンに切り替えられ、それによってパルス数が減るのでシグナルの解析が向上する
。ＭＡＬＤＩはペプチドおよびタンパク質の分析に完全に適している。核酸の分
析は一層難しい13。核酸に対する感度はペプチドに対する感度に比べて約１００
倍悪く、比例を上回る度合いで断片のサイズが大きくなるにつれて低減する。こ
の理由は、ペプチドやタンパク質のイオン化のためには一つの単一プロトンのみ
が捕獲されるだけでよいからである。何重にも負に荷電した骨格を有する核酸で
は、マトリックスによるイオン化プロセスは遥かに非効率的である。ＭＡＬＤＩ
の場合は、マトリックスの選択が極めて重要な役割を果たす。ペプチドの脱着の
場合は、極めて微細な結晶化という結果となる幾つかの非常に効率的なマトリッ
クスが見出されている。ＤＮＡの場合も現在までに幾つかの適当なマトリックス
が見出されているが、感度の差異はこの方法によっては低減することができなか
った。感度の差異は、ペプチドと類似するようになる仕方でＤＮＡを化学的に修
飾することによって低減することができる。ホスホロチオエートオリゴヌクレオ
チドは通常のリン酸骨格がチオリン酸によって置換されたものだが、簡単なアル
キル化の化学により電荷的に中性のＤＮＡに変換することができる14。この修飾
ＤＮＡに「電荷タグ」をカップリングさせると、ペプチドに認められるのと同レ
ベルまで感度が上昇する結果となる15,16。この修飾のために、ペプチドの脱着 に使用するのと同様のマトリックスを使用できる可能性が浮上する。電荷タグの
さらなる利点は、不純物に対する分析の耐性が上昇することであり、このような
不純物は非修飾の物質の検出を一層困難にするものである。ＰＮＡおよびメチル
ホスホネートオリゴヌクレオチドはＭＡＬＤＩにおいて調べられており、この方
法で分析することができる17,18,19。
【０００６】 コンビナトリアル合成20、すなわち前駆体の混合物から出発する物質ライブラ
リーの製造は、固相と液相の両方で行われる。とりわけ、コンビナトリアル固相
合成は早くから確立されているが、それはこの場合には副産物の分離が特に簡単
であるからである。担体（支持体）に結合された標的化合物のみが洗浄工程でも
保持され、リンカーの特異的な分解により合成の最後に単離される。簡単な方法
で、この技術は、固相上の多数の種々の化合物の同時合成を可能とし、それゆえ
、化学的に「純粋な」物質ライブラリーを得ることを可能とする21,22,23。それ
ゆえ、固相上でのコンビナトリアルの従来の合成法では合成されない化合物のク
ラスも、特に簡単な方法でのコンビナトリアル化学に適したものとなる。このこ
とが、それらが広く用いられる理由である。これは特にペプチド、核酸およびＰ
ＮＡライブラリーに当てはまる。
【０００７】 ペプチドの合成は、最初のＮ−保護アミノ酸（たとえば、Ｂｏｃ）を支持体に
結合させ、続いての脱保護、および第二アミノ酸と第一のアミノ酸のいまや遊離
になったＮＨ2基との反応によって行われる。反応しなかったアミノ官能基は、 次の合成サイクルにおいて引き続く反応のさらなる「キャッピング」工程で除去
される。第二のアミノ酸のアミノ官能基の保護基を除去し、次の成分をカップリ
ングすることができる。ペプチドライブラリーの合成では、アミノ酸の混合物を
１またはそれ以上の工程で用いる。ＰＮＡおよびＰＮＡライブラリーの合成も同
様である。
【０００８】 核酸ライブラリーは、通常、種々のホスホルアミダイトヌクレオシドの混合物
を用いた固相合成により得られる。このことは、市販のＤＮＡ合成機で合成プロ
トコールに変更を加えることなく行うことができる。さらに、ＰＮＡライブラリ
ーのコンビナトリアル合成について種々の研究が刊行されている24,25。これら の研究は、コンビナトリアル配列の構築、すなわち、配列中の単一の特定の塩基
が変性塩基によって置換されており、それゆえランダムな配列変異が得られるＰ
ＮＡの合成を扱っている。コンビナトリアルライブラリーの分析のための質量分
光分析法の使用は、繰り返し記載されてきてきる26,27,28,28。
【０００９】 ＤＮＡを固定化するための種々の方法が存在する。最もよく知られている方法
は、ストレプトアビジンでコーティングした表面へのビオチンで官能化したＤＮ
Ａの固相結合である30。この系の結合強度は、共有化学結合ではないにも係わら
ず、その強度に相当する。化学的に調製した表面に標的ＤＮＡを共有結合させる
ためには、標的ＤＮＡに対応する官能基が必要とされる。ＤＮＡ自体は、それに
適した官能基を有していない。標的ＤＮＡに適当な官能基を導入するための種々
の方法が存在する：２つの簡単に取り扱うことができる官能基は、第一級脂肪族
アミンとチオールである。そのようなアミンは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
エステルにより定量的に変換される。チオールは、適当な条件下で定量的にヨウ
化アルキルと反応する。一つの困難性は、そのような官能基をＤＮＡに導入する
ことである。最も容易な方法は、ＰＣＲのプライマーの導入である。記載された
方法は、５'修飾プライマー（ＮＨ2およびＳＨ）および２官能性リンカーを用い
ている31,32,33。
【００１０】 表面上に固定する場合には、その性質が最も重要である。これまでに記載され
た系は、主として珪素または金属（マグネチックビーズ）からなる。標的ＤＮＡ
を結合させるための他の方法は、表面固定化オリゴヌクレオチドにハイブリダイ
ズさせるために標的ＤＮＡ中の短い認識配列（たとえば、２０塩基）を用いるこ
とに基づいている34。酵素的変異体もまた、標的ＤＮＡ中へ化学的に活性化され
た位置導入のために記載されている35。ここでは、５'−ＮＨ2官能化を標的ＤＮ
Ａ上で酵素的に行っている。
【００１１】 上記のように、核酸の正確な分析に特に照準を定めた多くの方法が当該技術分
野で知られている。これらの方法は、通常、時間と労力を要するかおよび／また
は費用がかかるものである。
【００１２】 それゆえ、本発明の根底にある技術的な課題は、標的核酸の同定のための迅速
かつコスト効率の高い方法を提供することであった。
【００１３】 この技術的な課題は、請求の範囲に記載される実施態様により解決される。
【００１４】 従って、本発明は、下記工程を含む、核酸分子中のヌクレオチド配列の検出方
法に関する： （a）異なるヌクレオチド塩基配列のプローブのセットとの核酸分子のハイブリ ダイゼーションであって、その際、各プローブは他のすべてのプローブとは異な
る質量を有する； （b）ハイブリダイズしなかったプローブの分離； （c）レーザー光によりプローブの脱着を支援するマトリックスへのハイブリダ イズしたプローブの接触； （d）電導性物質からなるプローブ支持体上のマトリックスにより囲まれたハイ ブリダイズしたプローブの質量分光分析計での分析；および （e）配列を示す核酸分子の決定、その際、プローブ支持体上のプローブの位置 がそれと結合した核酸分子への割り当てを可能にする。
【００１５】 本発明の方法は、標的核酸のアレイを分析する方法（オリゴフィンガープリン
ティング）と核酸および修飾核酸の質量分光分析法とを有利な仕方で組み合わせ
たものである。それによって、多数の種々のプローブを用い、核酸分子中の１ま
たはそれ以上のヌクレオチド配列を検出することができる。これらの方法の組み
合わせはこれまでに行うことができなかった。というのは、プローブの質量によ
る識別からは配列に関して明解な結論を得ることができず、核酸の質量分光分析
の感度はオリゴフィンガープリンティング実験でのプローブ量に対応しなかった
からである。ある種の配列の検出を可能とする条件は、標的配列とのハイブリダ
イゼーションを可能とする方法においてプローブを用いることである。核酸分子
の決定は、プローブの一つでハイブリダイゼーションを試験することにより行う
ことができる。
【００１６】 所望のヌクレオチド配列をハイブリダイゼーション法により正確に決定するこ
とは常に可能とは限らないことは当業者には明らかである。というのは、ストリ
ンジェントなハイブリダイゼーション条件においてさえも、いわゆる「ミスマッ
チ」にも拘わらずプローブのハイブリダイゼーションが起こり得るからである（
たとえば、プローブのある最小の長さから、またはハイブリダイゼーションの間
に許容され得る１または複数のミスマッチの配置により）。プローブの所定のヌ
クレオチド配列では、核酸分子中の相補配列は、いくらかの部分は、実施態様の
ある種の推定によってしか決定することができないが、それは正確に相補的な配
列とは別に、その配列が正確には相補的でない配列も決定できるからである。従
って、ヌクレオチド配列はまた、９０％よりも高い相同性、特に好ましくは９５
％よりも高い相同性の程度を示す相同なヌクレオチド配列をも含む。本発明は、
上記の全ての態様を含む。
【００１７】 ハイブリダイゼーション条件に依存して、本発明の方法は、特定のヌクレオチ
ド配列かまたは類似の配列を有するヌクレオチド配列群のいずれかを検出するの
に用いることができる。たとえば、ストリンジェントなハイブリダイゼーション
条件が選択されれば、用いられるプローブはそのヌクレオチド塩基配列と正確に
相補的な核酸配列とのみハイブリダイズすることができる。しかしながら、スト
リンジェントでないハイブリダイゼーション条件が選択されると、用いられるプ
ローブは選択された条件下でのハイブリダイゼーションを依然として可能とする
仕方なで該ヌクレオチド塩基配列から逸脱したあらゆるヌクレオチド配列を検出
することができる。そのようにして、本発明の方法はまた、ある配列のホモログ
、変異体または対立遺伝子を検出するのにも用いることができる。当業者であれ
ばストリンジェントな条件およびストリンジェントでない条件がどういうもので
あるか知っている（たとえば、Sambrookら、『A Laboratory Manual』第２版、C
SH Press, Cold Spring Harbor(1989年)；HamesおよびHiggins編『Nucleic Acid
Hybridization, A Practical Approach』IRL Press, Oxford(1985年))。ストリ
ンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、たとえば、６×ＳＳＣ、５×De
nahardt試薬、０.５％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌ変性ＤＮＡ中、６５℃での
ハイブリダイゼーション、および０.１×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ中、６５℃での
洗浄である。ストリンジェントでないハイブリダイゼーション条件は、上記の条
件とたとえば、ハイブリダイゼーションおよび洗浄が、たとえば５０℃のより低
い温度および／またはＳＳＣの量が、たとえば１×もしくは２×ＳＳＣに増加さ
せて行われる。
【００１８】 本発明の方法はまた、標的ＤＮＡ中の幾つかの異なる配列の検出を可能にし、
その際、それら異なる配列は異なるプローブに相補的である。理想的には、たと
えば、重複する配列を持つプローブを用いた場合、標的核酸の全ヌクレオチド配
列を検出または解明し得る。
【００１９】 本発明の方法ではまず最初に、選択された条件下でプローブにハイブリダイズ
し得る配列を示すプローブ支持体にプローブが適用されているかどうかを決定す
ることができる。もし適用されておれば、プローブ核酸はさらに調べ、特徴付け
ることができる。本発明の方法では、プローブの一部のみを本発明の分析に用い
るなければならないので、用いなかった核酸はさらに標準法、たとえばシークエ
ンシング法により調べることができる。
【００２０】 本発明の方法はまた、２回以上、同時にまたは連続的に行うことができ、その
際、ハイブリダイゼーション条件を変えることができる。この方法では、特定の
配列の探求を開始する前に、たとえば、標的ＤＮＡアレイにおいて、どれだけの
およびいかなる標的ＤＮＡが高い相同性を示すかを決定することが可能である。
【００２１】 ある位置にハイブリダイズしたプローブを、プローブ支持体上の固定化した試
料に割り当てることは、好ましくは、データ処理システムを用いて行う。かかる
データ処理システムは、プローブ支持体上のある位置でそれぞれ記録したスペク
トルを同じ場所に位置する標的ＤＮＡに割り当てるものである。
【００２２】 上記のように、プローブ支持体は電導性の物質からなる。これにはまた、マト
リックスによって囲まれたハイブリダイズしたプローブが配置されるプローブ支
持体の表面が含まれる。この表面は、物質に関してプローブ支持体と異なってい
てよい。
【００２３】 質量分光分析のためのプローブを直接または間接に固定化する表面は、質量分
光分析のためのプローブ支持体として働き得るような仕方で構成されていなけれ
ばならない（図２）。このことは、プローブ支持体が電導性の物質からできてい
なければならないことを意味する。というのは、イオン化したプローブ分子の安
定な加速を達成するために所定の電圧を負荷しなければならないからである。非
電導性の表面は静電的な荷電に導くであろうが、このことは電圧の逸脱のために
質量のシフトが観察されることおよび質量の割り当てが不可能であることを意味
している。 本発明の好ましい態様を以下に記載するが、実施例にも記載してある。
【００２４】 本発明の方法の好ましい態様では、工程（a）に従って核酸分子を担体の表面 に移す。適当な担体は、たとえば、ストレプトアビジン、アミノ基、ＳＨ基また
はエポキシ基で官能化した「マグネチックビーズ」、プラスチックビーズまたは
ガラスビーズである。 特に好ましい態様では、担体の表面は電導性物質からなるプローブ支持体の表
面である。この態様は比較的複雑でない仕方で方法を行うことを可能にする。と
いうのは、ハイブリダイゼーションが起こった後に核酸分子をプローブ支持体に
移す必要がないからである。
【００２５】 本発明の方法の特に好ましい態様では、その表面に核酸分子を有する担体を、
電導性物質からなるプローブ支持体に工程（c）の前に適用する。結合は、たと えば、マトリックス自体によって、またはマトリックスにニトロセルロースを加
えることによって達成できる。 同様に特に好ましい態様において、ハイブリダイズしたプローブを工程（c） においてマトリックスと接触させる前、接触させた後または接触させる間に固定
化核酸分子から除去し、電導性物質からなるプローブ支持体に適用する。この態
様において、ハイブリダイズした核酸分子とプローブとの複合体を変性させ、プ
ローブのみをプローブ支持体に適用する。変性は、たとえばアルカリ変性または
加熱変性などの公知の方法により、または酸性のマトリックス溶液自体により行
うことができる。
【００２６】 他の好ましい態様において、プローブ支持体は、ガラスをコーティングした金
属表面かまたは標的ＤＮＡの固相結合を可能とする化学的に修飾した表面のいず
れかを有する。 本発明の方法のさらに好ましい態様において、プローブ支持体の表面上への核
酸分子の固定化は、ＮＨ2−官能基、エポキシ−官能基若しくはＳＨ−官能基を 介し、シリケートもしくはシランでのプローブ支持体表面のコーティングによっ
て、タンパク質−基質相互作用、タンパク質−タンパク質相互作用もしくはタン
パク質−核酸相互作用、または２つの疎水性成分間の相互作用によって行う。
【００２７】 プローブ支持体が、たとえば金でコーティングされている場合には、標的ＤＮ
Ａのカップリングは、標的ＤＮＡの分子生物学的製造の際に導入したＳＨ−官能
基またはＮＨ2−官能基により達成できる。この逆の態様、すなわち、修飾ＤＮ Ａを官能化した金粒子に結合することも可能である。たとえば、企業のNanoprob
es Inc.、ストーニー・ブルック、ニューヨークは、ストレプトアビジンを結合 したまたはアミノ官能基を結合した金ナノ粒子を販売している。以前にも記載し
たように、他の可能性は、プローブ支持体の金属表面をガラスでコーティングす
ることである。２官能性リンカー（たとえば、ＳＩＡＢ、Pierce Chemical、ロ ックビル、イリノイ、米国）に結合した標的ＤＮＡのＳＨ−官能基によるカップ
リングは、アミノ−官能基によりガラス表面に対して達成できる。他の態様は、
金属表面をトリメトキシ−３−アミノプロピルシランで直接コーティングするこ
とである。このアミノ官能基に上記２官能性リンカーにより標的ＤＮＡを引き続
きカップリングすることができる。
【００２８】 特に好ましい態様において、タンパク質−基質相互作用は、ビオチン−ストレ
プトアビジン結合または抗体−抗原結合である。ＭＡＬＤＩプローブ支持体は通
常、金属（たとえば、鉄）からなり、さらに修飾しないことにはタンパク質もＤ
ＮＡ分子も固定化することができない。固定化の一つの可能性は、鉄表面に金を
コーティングすることであるが、これにたとえばＳＨ−官能基を結合させること
ができる。２官能性リンカーは、ＳＨ−官能基および標的ＤＮＡの官能化に対応
する他の官能基を有するカップリングに適している。たとえば、標的ＤＮＡがビ
オチンで官能化されている場合には、リンカーはストレプトアビジンでカップリ
ングしなければならない。標的ＤＮＡがＮＨ2−官能化されている場合は、リン カーはＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル−官能基を有していてよい。
【００２９】 他の特に好ましい態様において、タンパク質−核酸相互作用は、遺伝子３２、
タンパク質結合単一ＤＮＡへの核酸の非特異的な結合である。 本発明の方法の他の好ましい態様において、用いるプローブは、質量タグを有
する核酸である。この態様によれば、プローブはまた、たとえば５'末端と３'末
端などの異なる位置に位置した幾つかの標識を有していてもよい。質量タグの数
および位置の組み合わせにより、あるいは状況により電荷タグとの組み合わせに
より、本発明の方法の柔軟性と感度が有意に向上する。 特に好ましい態様において、質量タグはまた電荷タグでもあり、一方、核酸は
他の特に好ましい態様においてさらに電荷タグを有する。
【００３０】 電荷タグの付加は、Gutら11 , 12の方法により行われ得る。アミノ官能化基質(1
ｍＭ)を、氷上のトリメチルアミン／ＣＯ2緩衝液(ｐＨ＝８.５、２００ｍＭ)に ０℃で、ω−トリメチルアンモニウムヘキサン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ジルエステル(ＣＴ)と共に添加する。３０分後、揮発性の緩衝液及び溶媒を真空
除去する。アミノ官能化基質は、たとえば、質量が異なる種々のプローブを用い
てコンビナトリアル法により製造したライブラリーであってよい。基質ライブラ
リーの質量は、ＣＴの長さおよび官能化を変えることにより、所定の量にて変え
ることができる(図２)。コンビナトリアル合成の際に、２００Ｄａの範囲で質量
が異なる６４個のプローブを含むプローブライブラリーが製造されるので(図４)
、質量／電荷タグは各２００Ｄａの単位で質量を増加させる。このことは、最初
のコンビナトリアル合成生成物は可能な限り最小の電荷タグで生成され、第２の
ものは質量が２００Ｄａ多い質量／電荷タグで生成され、第３のものはさらに２
００Ｄａ多い質量／電荷タグで生成される等々のことを意味する。理論的には、
この範囲は任意に、用いる質量分光分析計が、２つの隣り合ったプローブの間の
差異を無視できる限り、そして、その合成を実際に利用できる限り、増大するこ
とができる。１０核酸塩基のプローブでは、２６００〜２８００Ｄａの範囲の基
礎質量を達成される。現在のところ利用可能な質量分光分析計では、充分な質量
精度で使用できる質量範囲は、４０００Ｄａ以下である。従って、６４プローブ
の７集団を用いることができる(全部で４４８プローブ)。この態様で得られた結
果を図５および図６に示す。
【００３１】 自動合成装置におけるペプチドの合成は、Ｃ末端からＮ末端へ行われ、核酸の
合成は３'末端から５'末端へ向かって進められる。１または２の官能化により質
量をシフトさせることを目的として、１または２の末端に第一級アミノ官能基を
結合することができる。代りに、コンビナトリアル法により製造されたプローブ
ライブラリーの質量はまた、所定の質量の幾つかの構築ブロック(たとえば、Ｐ ＮＡのコンビナトリアル合成におけるアミノ酸)をコンビナトリアル構築ブロッ クを導入する前に適用することによりシフトさせ得る。第一のコンビナトリアル
合成は支持体上で直接開始される。第二のコンビナトリアル合成ではまず、たと
えば２つのバリンをカップリングする。バリンは９９Ｄａの質量を有する。２つ
のバリンを用いることにより、第二のコンビナトリアル合成から第一のコンビナ
トリアル合成へ１９８Ｄａだけ質量を変えることができる。第三のコンビナトリ
アル合成では、最初に４つのバリンがカップリングされており、このことは、こ
の集団の質量は３９６Ｄａ高いことを意味する、等々。可能な必要な電荷タグは
、その後にＮ末端に上記方法によりさらに付加することができる。他の可能性は
、電荷タグを最初に固相に結合し、その後、コンビナトリアル合成を続けること
である。
【００３２】 別の方法としては、検出範囲を縮小することができるように同じ極性のいくつ
かの一定の荷電を同時に結合することである。質量分光分析計では、２つの電荷
を有する分子は、相当する半分の質量で観察される。このことは、質量分光分析
計の解析度が質量が大きくなるにつれて極端に低減する場合には有利である得る
。所定の正の電荷をプローブに適用させる方法は以前に言及されている。負の所
定の電荷も同様の利点を有する。 正および負の電荷は、同様の方法により製造することができる。
【００３３】 従って、質量タグと関連して記載したことは、電荷タグの局在、数およびコン
ビナトリックスにも当てはまる。それゆえ、分析の感度は、核酸プローブのライ
ブラリーの５'または３'末端にて電荷タグすることにより向上させることができ
る。このことは、ランダム化されていない位置へアルキルホスホネート基を導入
することにより(下記参照)中性電荷が別の仕方で生成される場合には、特に当て
はまる。電荷タグの付加と必然的に関連している質量タグの付加により、ホスホ
ロチオエート基の開裂により生じる断片の分析が容易になる。ある位置での好ま
しい開裂を得るために、ホスホロセレノエートもまた用いることができる。 本発明の方法の他の好ましい態様では、プローブは修飾した核酸分子である。 特に好ましい態様では、これらの修飾した核酸分子は、ＰＮＡ、アルキル化ホ
スホロチオエート核酸またはアルキルホスホネート核酸である。
【００３４】 別の好ましい態様では、本発明のプローブは、コンビナトリアル固相合成によ
り製造される。これは、たとえば、ＰＮＡ純物質の合成にも商業的に利用されて
いる一般的なＢｏｃ固相合成により行われる。この場合、アデニン、グアニン、
シトシン若しくはチミンの塩基の４つとも全て、または、そのうちの１つより多
くが、これらが導入されない場合には確定したプローブＰＮＡの配列内の選択さ
れた位置で隣り合わせで導入される。このことは、固相合成の工程において１つ
のみならず幾つかの合成構築単位を用いることにより起こる。これらの位置をい
くつか変えることにより、ＰＮＡライブラリーが生成される。ＰＮＡ合成の後、
遊離の末端アミノ官能基において電荷タグを付加することができる。これにより
、ＭＡＬＤＩによるＰＮＡ分析の動的範囲が向上する。
【００３５】 それゆえ、特に好ましい態様では、種々の構築ブロックは、その質量、または
、それから合成されたプローブの質量が質量分光分析により区別できるような仕
方で固相合成においてマーキングされる。このマーキングは、塩基に対応する仕
方でその骨格に異なる質量修飾を導入することにより達成される（図７）。この
ようにして、合成したプローブは、その配列に特異的な質量を得る。もしもプロ
ーブがＭＡＬＤＩ標的に固定化した標的ＤＮＡに結合すれば、ＭＡＬＤＩ実験で
アクセス可能な質量についての情報は、ハイブリダイズしたＰＮＡプローブの配
列に関する疑う余地のない結論を引き出すことを可能にする。
【００３６】 本発明の方法の他の特に好ましい態様では、塩基構築ブロックは、メチル基、
エチル基、プロピル基、分枝状若しくは直鎖状アルキル基、ハロゲン置換された
分枝状若しくは直鎖状アルキル基、アルコキシアルキル基、アルキルアリール基
、アリールアルキル基、アルコキシアリール基またはアリールオキシアルキル基
、または、その重水素化若しくは他の仕方での同位体変異体でマーキングされる
。非修飾の構築ブロックを用いることにより、分子の質量はせいぜい塩基組成に
関する決論を引き出すことができるだけで、その配列については決論を引き出す
ことができないので、ＰＮＡライブラリー内のいずれかのランダムな位置で特徴
的である質量タグを付加した構築ブロック(すなわち、骨格で置換されたＰＮＡ モノマー)を用いる。このように、位置ｘにおけるある塩基の合成構築ブロック は、位位置ｙにおけるものとは異なる質量を持つので、塩基の同じ全体組成を有
する異なる配列のものでさえも分子質量により識別することができる。対応する
置換基は、ライブラリー合成の上記性質に基づいていずれかの可能な配列が所定
の質量に明確に対応するように数値により選択される。
【００３７】 核酸プローブライブラリーの合成は合成機により、種々のヌクレオシド誘導体
(通常、ホスホルアミダイト)の混合物をランダム化する位置に挿入することによ
り行う。その結果得られるライブラリーはまた、上記方法においてプローブとし
ても用い得る。異なる配列を識別するため、たとえば、ランダム化した位置での
所定の部位に位置する所定のホスホジエステル結合にて特異的な結合の開裂を行
わなければならない。
【００３８】 本発明の方法の他の好ましい態様では、プローブは、プローブの開裂を可能に
する少なくとも１つの修飾をランダム化されるヌクレオチドとは離れた所定の部
位に有する。 特に好ましい態様では、この修飾はホスホロチオエート基および／またはＲＮ
Ａ塩基および／またはホスホジエステル結合の導入である。
【００３９】 プローブが３つのランダム化された位置を含む場合、少なくとも２つのそのよ
うな結合開裂が必要とされる(図１０)。ついで、それぞれ１つのランダム化され
た位置を含む３つの断片が得られ、これらはそれゆえ、他の仕方で知られている
質量組成に基づき、変異塩基に関する直接的な結論を得ることを可能にする。記
載の結合の開裂は不完全な仕方であってもよい。これにより、より大きい断片を
統合して配列情報を確保することが可能になり、またはあいまいな部分について
は配列情報を具体化することが可能になる。ランダム化位置における特異的な結
合の開裂は、ライブラリーの合成時にすでに導入したホスホロチオエート基を挿
入することにより達成される。これらはまずハロゲン化ヒドロキシアルキルによ
りヒドロキシアルキル化され、ついでアルカリ条件下で選択的に切断され得る。
別法として、ランダム化された位置の隣にウラシルが挿入されるように試料を構
築することもできる。ついで、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼとそれに続くアル
カリ処理により、この位置で骨格を切断することができる。
【００４０】 通常、マトリックスは、高い吸光係数並びに選択したレーザー波長での電荷生
成の良好な支持を示すような仕方で選択する。本発明の方法の他の好ましい態様
において、レーザー光によるプローブの脱着を支持するマトリックスは、アセト
ン中のα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸の１：９ないし９：１の比、好ましく
は１：１の比の溶液、またはα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸メチルエステル
とα−シアノ−４−メトキシ桂皮酸またはシナピン酸またはそのメチル誘導体と
の１：９ないし９：１の比、好ましくは１：１の比の混合物であるからなる。
【００４１】 本発明の方法の他の好ましい態様において、マトリックスは、α−シアノ−４
−ヒドロキシ桂皮酸、またはα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸メチルエステル
とα−シアノ−４−メトキシ桂皮酸またはシナピン酸またはそのメチル誘導体と
の１：９９ないし９９：１の比、好ましくは１：１の比の混合物からなり、これ
はＭＡＬＤＩプローブ支持体にアセトン、イソプロパノール、アセトニトリル、
エタノール、メタノールまたは水またはこれら溶媒の２またはそれ以上の混合物
中の溶液として適用する。
【００４２】 所定の位置でのある構築ブロックへの質量タグの上記原理は種々の部分ライブ
ラリーのために用いることができ、ついでそれらを合わせてより大きなライブラ
リーとすることができる。 それゆえ、別の好ましい態様では、プローブは異なる質量および／または電荷
タグを持つ部分ライブラリーとして製造される。特異的に分析した質量から特定
の部分ライブラリーに関する結論を得ることができるように、部分ライブラリー
をその合成に際して質量タグを付加する必要がある。このことは、固相合成でＰ
ＮＡライブラリーに容易に結合させることができる天然アミノ酸により意図的に
行われる。種々の部分ライブラリーを質量タグで標識することにより、全体のラ
イブラリーの分析に自由に用いることができる質量の範囲が有意に増大される。
【００４３】 さらに、本発明は、場合により核酸分子が結合した、プローブおよび／または
プローブ支持体を含むキットに関する。タンパク質支持体は、上記のように、そ
の表面を前処理してあり、それゆえ核酸の結合が可能である。好ましくは、前処
理は化学的な方法により行われる。 本明細書中に言及した多数の刊行物は、参照のため本明細書中に引用する。
【００４４】 実施例により本発明を説明する。実施例１： 本発明による全体的な方法の記載 化学的に修飾したＰＣＲ生成物の固定化を可能とする物質でＭＡＬＤＩ標的を
コーティングする（たとえば、ＮＨ2官能化表面）。標的ＤＮＡのアレイを該表 面上に移し、結合させる。このアレイは、記載した仕方で調製したプローブのラ
イブラリーとハイブリダイズする。プローブライブラリーの相補的成分は、対応
標的ＤＮＡに結合する。ついで、結合しなかったプローブを除去するため、充分
に洗浄する。マトリックスを適用し、ＭＡＬＤＩ標的を質量分光分析計に移す。
標的−ＤＮＡが見出される各点にレーザーを狙いをつけ、これら標的−ＤＮＡが
結合したプローブの質量分析を行う。
【００４５】実施例２： 電荷タグを有するＰＮＡ−ライブラリーの分析 ＰＮＡのライブラリーは、本明細書に記載した合成において電荷タグで標識す
る。ＰＮＡのライブラリーを５０％アセトニトリル中に溶解し、希釈する。ＭＡ
ＬＤＩマトリックス（この場合には、アセトン中のα−シアノ−４−メトキシ桂
皮酸とα−シアノ−４−ヒドロキシル桂皮酸メチルエステルとの１：１混合物）
をＭＡＬＤＩ標的に適用する。溶媒を直ちに蒸発させる。ついで、０.５ｍｌの ＣＴ−ＰＮＡ溶液を乾燥マトリックスに加える。溶媒を蒸発させた後、ＭＡＬＤ
Ｉ標的を質量分光分析計に移し、プローブを分析する。その結果を図５に示す。
【００４６】実施例３： ＣＴ−ＰＮＡによる標的ＤＮＡのアレイの分析 記載の仕方でコンビナトリアル製造したＣＴ−ＰＮＡのライブラリーを、ＭＡ
ＬＤＩ標的上に固定化した標的ＤＮＡのアレイとハイブリダイズさせる。標的Ｄ
ＮＡ中に相補的配列を見出したプローブは結合する。ついで、ライブラリーの残
留成分を除去するため、ＭＡＬＤＩ標的を洗浄する。マトリックスをＭＡＬＤＩ
標的に加え、標的を分析のため質量分光分析計に移す（図１）。未知の標的ＤＮ
Ａをハイブリダイズしたプローブにより特徴付ける。種々の標的ＤＮＡの類似性
は、同じプローブに結合するという事実により特徴付けられる。
【００４７】実施例４： プローブによる標的ＤＮＡのアレイの分析 プローブを個々に調製し、ついで合わせてライブラリーとする。重要なことは
、２つの異なるプローブによって質量が占領されないことである。このプローブ
のライブラリーを用いて、固定化した標的ＤＮＡのアレイへハイブリダイゼーシ
ョンさせる。結合しなかったプローブを洗い落とす。マトリックスを適用し、結
合したプローブを質量分光分析計で分析する。
【００４８】実施例５： 部分ライブラリーの製造およびＭＡＬＤＩ−分析 配列に対する質量の明らかな関係を有するＰＮＡ−ライブラリーのための好ま
しい例を図８および表１に示す。他のランダムなＰＮＡにおいては、コンビナト
リアル固相合成において３つの位置を変化させなければならない。これは、４つ
の異なる塩基により６４の可能な化合物に対応する。本実施例では、表１に示し
た構成要素を用いて２つの別個の合成を行う。合成２では２つのバリン単位の導
入によりさらに質量タグで標識してある。各部分合成から、すべてその質量によ
り区別できる３２の化合物が得られる。両部分ライブラリーを合わせて、それぞ
れ特異的な質量を有する６４の異なる配列のライブラリーとすることができる。
このライブラリーについて計算したＭＡＬＤＩ−質量スペクトルを図８に示す。
６４のピークは重複しない；各ピークは、３つのランダム化した位置（それぞれ
４塩基）でのＰＮＡライブラリーからの特異的配列に対応する。
【００４９】 実施例６：ＭＡＬＤＩプローブ支持体の表面処理 本発明の方法の好ましい態様において、ＭＡＬＤＩプローブ支持体の表面をま
ずシリケートでコーティングし、ついでシラン化によりエポキシ官能化する。別
法として、エポキシ官能化アクリルポリマーを金属表面に適用することもできる
。標的ＤＮＡはエポキシ官能基により表面に共有結合される。特に好ましい態様
において、固定化すべきＤＮＡにまず第一級アミノ官能基を付与する。ついで、
反応しなかったエポキシ官能基を過剰のアミンで不活化し、ついで実施例４に従
って方法を続ける。
【００５０】実施例７： ４４８プローブのプローブライブラリーの構築 最後の実施例に記載した方法に従って７の合成を行い、ついで質量／電荷タグ
をカップリングする。 質量範囲 １．６４プローブ：電荷タグ−TCP1GAP2GAP3G 2600-2800Da ２．６４プローブ：電荷タグ＋200Da質量タグ−TCP1AGP2GAP3G 2800-3000Da ３．６４プローブ：電荷タグ＋400Da質量タグ−TCP1AGP2AGP3G 3000-3200Da ４．６４プローブ：電荷タグ＋600Da質量タグ−TCP1AAP2AGP3G 3200-3400Da ５．６４プローブ：電荷タグ＋800Da質量タグ−TCP1AAP2GAP3G 3400-3600Da ６．６４プローブ：電荷タグ＋1000Da質量タグ−TCP1GAP2GAP3G 3600-3800Da ７．６４プローブ：電荷タグ＋1200Da質量タグ−TCP1GAP2AGP3G 3800-4000Da 上記一連の合成において、第６の合成は内部対照として働くものである。別法
として、以下の合成を行うこともできる： ６．６４プローブ：電荷タグ＋1000Da質量タグ−TCP1GGP2GAP3G 3600-3800Da
【００５１】実施例８： 金属表面への標的ＤＮＡの共有結合固定化 １．金属表面のシリケートおよびシランコーティング： 態様Ａ： ５０ｍｇの三珪酸ナトリウム（Aldrich）を加熱および攪拌下に６００μｌの 水中に溶解し、１００μｌのメタノールを滴下する。静置すると、溶液は１５分
以内に濁ってはならない。この溶液の均等なコーティングを、前以て清浄にした
プレートに柔らかな布で適用し、室温にて乾燥させる。プレートをさらに５０℃
にて１５分間乾燥させ、メタノールで洗浄する。ついで、５０℃で再度加熱し、
重合しなかったシリケートを水で洗い落とす。「ガラス様の」金属プレートを３
−（アミノプロピル）トリエトキシシランの溶液（アセトン：水／９５：５中に
２％）で２０分間処理し、メタノールで洗浄し、５０℃で乾燥させる。
【００５２】 態様Ｂ（好ましい態様）： （Ａ）に記載したように、５％の３−（アミノプロピル）トリエトキシシラン
をシリケート溶液に加え、その均等な層を柔らかな布で金属プレートに適用する
。室温で乾燥させた後、表面を濃塩酸の蒸気に３０秒間晒すと曇って不透明にな
る。プレートを５０℃にて１５分間乾燥させ、メタノールおよび水で洗浄し、つ
いで再び乾燥させる。
【００５３】 態様Ｃ： 前以て清浄にしたプレートを３−（アミノプロピル）トリエトキシシランの溶
液（アセトン：水／９５：５中に２％）で３０分間シラン化する。プレートを乾
燥させ、メタノールで洗浄し、５０℃に１５分間加熱し、水洗する。 態様Ｄ： 態様Ａ、ＢおよびＣと同様にして、３−（メルカプトプロピル）トリエトキシ
シランを用いてチオールで官能化することも可能である。
【００５４】 ２．エポキシシランによる金属担体の前処理： 金属プローブ支持体を上記と同様にしてシリケートでコーティングする。その
表面を、２回蒸留した水で数回洗浄する。乾燥したプローブ支持体を、３−グリ
シジルオキシプロピルトリメトキシシランとトリメトキシ［２−（７−オキサビ
シクロ［４.１.０］ヘプト−３−イル）エチル］シランとの１：１混合物（０. ５μｌ／ｍｍ2）でコーティングし、加熱プレート上で４０分間インキュベート する。プレートをアセトンで充分に洗浄し、５５℃で１５分間乾燥させ、真空で
貯蔵する。
【００５５】 ３．リンカーによるＤＮＡの官能化： 態様Ａ： ホスホロチオエート架橋を用いて合成したＤＮＡを、ＤＭＦ中の過剰のＳＩＡ
Ｂ（４−（ヨードアセトアミド）安息香酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエス
テル、Pierce Chemical、ロックフォード、イリノイ、米国）で官能化する。溶 媒を真空蒸発させ、得られた黄色の残渣を酢酸エチルで数回洗浄し、ついで乾燥
させる。これら条件下では、もっぱらヨードアセトアミド官能基が反応する。Ｎ
−ヒドロキシスクシンイミドエステルは、固定化に際してアミノ官能基とのその
後の反応に利用できる。
【００５６】 態様Ｂ： アミノ官能化オリゴヌクレオチドを無水ＤＭＳＯ中の過剰のＳＩＡＢと室温で
反応させる。精製を（Ａ）と同様にして行う。これら条件下、ＳＩＡＢはそのヨ
ードアセトアミド官能基で約５０％反応し、そのＮ−ヒドロキシスクシンイミド
エステル官能基で約５０％反応する。ついで、固定化を、１Ｄに従って処理した
金属プレートと逆に行うことができる。 態様Ｃ： 態様（Ａ）および（Ｂ）はまた、ハロゲンアルキルカルボン酸−ＮＨＳ−エス
テルを用いて同様に行うことができる。しかしながら、長い反応時間とより高い
温度が必要である。
【００５７】 ４．前以て処理した金属プレート上へのＤＮＡの結合： 態様Ａ： 官能化したＤＮＡを無水ＤＭＳＯ中の酢酸ナトリウムの飽和溶液に溶解し、コ
ーティング金属プレートに適用する。３０分の反応時間の後、残留する溶媒を除
去し、隣接するスポット間の相互混入を避けうるような仕方で金属プレートをま
ず１Ｍ塩化アンモニウム溶液で、ついで２回蒸留水で洗浄する。この手順を３回
繰り返す。ついで、大量の２回蒸留水を用いて再度漱ぎ、その後にハイブリダイ
ゼーションを行うまで金属プレートを真空貯蔵する。 態様Ｂ： （Ａ）と同様にして、非修飾ＤＮＡを用いた非共有結合固定化もまた可能であ
る。この場合は、洗浄手順を１Ｍ塩化アンモニウム溶液なしで行う。
【００５８】 態様Ｃ： ＭＡＬＤＩ標的への標的ＤＮＡの固定化はまた、以下のようにしても行うこと
ができる。アミノ官能化ＤＮＡ（１.５ナノモル）を固定化緩衝液（１Ｍ Ｋ2Ｈ ＰＯ4／ＫＨ2ＰＯ4 ｐＨ７.５）に加える。シラン化により官能化した表面をこ の溶液でコーティングし、室温にて１６〜２０時間静置する。その後、プレート
をハイブリダイゼーション緩衝液で数回洗浄し、乾燥させる。
【００５９】 態様Ｄ： エポキシ官能化固相上への標的ＤＮＡの固定化は以下のようにして行うことが
できる。１０ｍｇの支持体（Eupergit C250L、Roehm Pharma Plymere）を１ｍｌ
の固定化緩衝液（１Ｍ Ｋ2ＨＰＯ4／ＫＨ2ＰＯ4 ｐＨ７.５）中に懸濁する。１.
５ナノモル固定化すべき標的ＤＮＡに加え、穏やかに攪拌しながら室温で２４時
間インキュベートする。過剰分を除去し、反応しなかったエポキシ官能基を１Ｍ
グリシン溶液で処理して不活化する。残渣を除去し、支持体を数回洗浄する。そ
のようにして、固定化ＤＮＡを−２０℃にて一層長期間貯蔵できる。
【００６０】 ５．ハイブリダイゼーションおよび試料の調製： 固定化標的ＤＮＡへのＰＮＡプローブ（または核酸プローブ）のハイブリダイ
ゼーションは、各プローブに対応して調節した温度にてＰＢＳ緩衝液中で起こる
。標的をまずＰＢＳ緩衝液で洗浄し、ついで２回蒸留水で再び洗浄する。金属プ
レートを真空乾燥させ、ついでＭＡＬＤＩマトリックス（α−シアノ−４−ヒド
ロキシ桂皮酸、アセトン中に１％；または電荷タグＰＮＡ／核酸の方法について
は対応メチルエステルと同様に；または好ましい態様として、電荷タグ標識ＰＮ
Ａのためのα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸メチルエステルとα−シアノ−４
−メトキシ桂皮酸との１：１混合物）で各スポットを別々にコーティングする。
別法として、マトリックススプレーを用いたフラットコーティングを行うことも
できる。速やかな乾燥プロセスにより、アレイ内の拡散が防がれる。
【００６１】 ５．好ましい態様： 好ましい態様において、２．Ａ．に従ってホスホロチオエート架橋で合成しＳ
ＩＡＢで官能化したＤＮＡの、１．Ｂ．に従って製造した表面上への結合を、室
温での無水ＤＭＳＯ中での反応により金属プレート上で行う（３０分間）。電荷
タグ標識プローブＰＮＡ／ＤＮＡによるハイブリダイゼーションの後、ＭＡＬＤ
Ｉ標的を２回蒸留水で洗浄し、乾燥させ、分離した各スポットについてα−シア
ノ−４−ヒドロキシ桂皮酸メチルエステルとα−シアノ−４−メトキシ桂皮酸と
の混合物でフラットコーティングする（４．と同様にして）。
【００６２】 ６．タンパク質コーティング： 他の態様は、ＭＡＬＤＩ標的の金属表面のタンパク質でのコーティングである
。これには、遺伝子３２、配列非特異的な仕方で単一のＤＮＡに結合するタンパ
ク質が適している。このタンパク質で標的をコーティングした後、標的ＤＮＡの
アレイをこれに適用できる。標的ＤＮＡがｃＤＮＡであるなら、これらはＰＣＲ
においてオリゴ−ｄＴ（たとえば、ｄＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ）でプライミ
ングした。オリゴ−ｄＴは、遺伝子３２と強く相互作用する。遺伝子３２へのオ
リゴ−ｄＴの共有結合は、短いＵＶ光を用いた光架橋により達成できる。36,37 ＭＡＬＤＩ標的の固定化後、記載した仕方でプローブのライブラリーを用いて標
的ＤＮＡのアレイを分析できる。配列特異的なタンパク質／ＤＮＡ相互作用、た
とえばＧＣＮ４／ＡＰ１もまた適している。
【００６３】 他の態様は、ストレプトアビジンをコーティングしたマグネチックビーズへの
ビオチン化標的ＤＮＡの結合である。この標的ＤＮＡをプローブライブラリーで
分析し、ついでマグネチック粒子をＭＡＬＤＩ標的に移し、そこでプローブをマ
トリックスおよびわずかな加熱によりマトリックスへ移す。
【００６４】
【表１】 表１：明らかな質量／配列関係を有する質量タグ標識ライブラリーを製造するた
めにＰＮＡサブユニットに適用される置換基。＊：２つのバリン単位で質量タグ
標識した第二の合成。対応する合成成分は図９に示してある。
【００６５】
【表２】
【表３】
【表４】
【図面の簡単な説明】
【図１】 質量分光分析走査によるフィンガープリンティングの模式図。 （１）コンビナトリアルにより製造した質量の区別できるプローブのライブラリ
ー。 （２）このライブラリーを、ＭＡＬＤＩ標的に固定化されている標的ＤＮＡとハ
イブリダイズさせる。該標的ＤＮＡ中の配列に相補的な配列を有するプローブの
みが該標的ＤＮＡに堅固に固定化されうる。充分な洗浄の後、ＭＡＬＤＩ−マト
リックスを適用する。 （３）ハイブリダイズしたプローブを質量分析により同定する。
【図２】 ＭＡＬＤＩ標的のコーティングおよび標的ＤＮＡのアレイの固定
化の模式図。非共有結合固定化では二官能性リンカーは省いてある。
【図３】 Ｎ−末端質量／電荷タグ。 核酸または修飾形態の核酸の５'側またはＰＮＡのＮ末端に電荷タグ標識を導入 することができる。この電荷タグは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル官
能基および第四級アンモニウム基を有する。これら２つの官能基は、基Ｒ1によ り隔てられている。Ｒ1は電荷タグの質量変数として働く（電荷タグのカップリ ングは、氷上、水溶液中、弱塩基性（ｐＨ８.５）にて行う。反応は３０分で完 了する）。
【図４】 非修飾ＰＮＡと電荷タグ標識ＰＮＡとの１：１混合物。 電荷タグおよび非修飾ＰＮＡを、１：１混合にてα−シアノ−４−ヒドロキシル
桂皮酸メチルエステルマトリックスを用いて分析した。異なる感度が明白である
。１塩基短くなり電荷タグ標識した誤り配列（１９８３Ｄａ）では、非修飾の配
列（２０７４Ｄａ）に比べて有意に強いシグナルを生じる。
【図５】 １０量体ＰＮＡライブラリーの質量分布。 配列中の２つの位置を、変性塩基（ＴＣＧＡ）を用いて合成する。配列はＮＴＴ
ＧＴＴＴＴＣＮである。その結果、質量によって区別しうる９のＰＮＡが生じる
。ＰＮＡライブラリーにおいて、ＣＣ＝２８１０Ｄａ、ＣＴ＝ＴＣ＝２８２５Ｄ
ａ、ＣＡ＝ＡＣ＝２８３４Ｄａ、ＴＴ＝２８４０Ｄａ、ＴＡ＝ＡＴ＝２８４９Ｄ
ａは、ＣＧ＝ＧＣ＝２８５０Ｄａ、ＡＡ＝２８５８Ｄａ、ＴＧ＝ＧＴ＝２８６５
Ｄａ、ＡＧ＝ＧＡ＝２８７４ＤａおよびＧＧ＝２８９０Ｄａと区別できない。常
に、同位体溶液を観察する。全ＰＮＡライブラリーには、「ホットポット反応」
において電荷タグが付与された。ＭＡＬＤＩ分析を、α−シアノ−４−メトキシ
桂皮酸とα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸メチルエステルとの１：１マトリッ
クス混合物中で行った。
【図６】 質量／電荷タグ。 ２つの変性して合成した位置を有する１０量体ＰＮＡライブラリーを質量／電荷
で標識した。配列はＮＴＴＧＴＴＴＴＣＮである。α−シアノ−４−ヒドロキシ
桂皮酸マトリックス中の出発物質と標識ＰＮＡライブラリーとの混合物を示す。
ライブラリーに固定電荷担体を適用する利点が明らかである。電荷タグ標識した
ライブラリーからのシグナルは、等濃度で検出されるが、非修飾ＰＮＡでは検出
されない。１塩基短い誤配列は検出できる。
【図７】 平行して行う質量タグ合成並びに質量タグ構築ブロックＬ（ラン
ダムな位置）を用いることによるＰＮＡライブラリーの合成の原理。このランダ
ムな位置において、ＰＮＡ骨格上に各異なる置換基を有する種々の塩基を（質量
タグとして）用いる。対応ＰＮＡ分子の質量は、その配列に明らかに割り当てら
れる。
【図８】 ＰＮＡライブラリーの計算したＭＡＬＤＩ質量スペクトル。 ３２ずつの異なる配列を用いた２つの異なる固相合成（そのうちの一方は質量タ
グ標識してある）から６４の異なる質量ピークが生じ、これらはそれぞれ、４つ
の塩基（それぞれ、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔを挿入）で３の可変位置にてＰＮＡライブラ
リーからの特異的な配列に割り当てられる。計算は、表１に示す置換基に基づく
。計算のため、コンピュータープログラムＭＡＳＰ（著作権Christoph Steinbec
k博士）を用いた。
【図９】 質量の区別しうるＰＮＡライブラリーの合成のために用いる、コ
ンビナトリアルＢｏｃ固相合成に使用可能なＰＮＡ合成構築ブロック。表１に示
す質量タグ標識した構築ブロックを説明する。
【図１０】 特異的な結合切断によるプローブの配列分析。 ＤＮＡプローブのライブラリーの種々の配列はまた、ランダムな位置（Ｎ＝Ａ、
Ｇ、ＣまたはＴ）での特異的な結合切断によっても質量スペクトルで同定できる
。すでに固相合成の間にこれらの位置にホスホロチオエート官能基が導入してあ
り、この部位でＤＮＡを特異的に開裂することができる（たとえば、ヨードエタ
ノールで）。このことは、断片の正確な化学的性質を考慮することなく図式的に
表してある。断片の質量は、配列の大部分がわかっていることから、完全なシー
クエンシングを行うことなく全配列の明白な決定を可能とする。置換基Ｒ1は任 意のさらなるＤＮＡ配列を示し、Ｒ2はさらなる任意の配列またはＨを示す。Ｒ3 は−ＯＨ（ホスホジエステル）またはアルキル−（アルキルホスホネート）を示
す。
【図１１】 「電荷タグ」ＰＮＡプローブ混合物ＣＣＸＣＡＧＣＣ（Ｘ＝Ａ
、Ｇ、Ｃ、Ｔ）は、Eupergit上に固定化した標的ＤＮＡにハイブリダイズし、Ｃ
ＣＣＣＡＧＣＣが相補的配列である。より低いスペクトルは出発混合物を示し、
より高いスペクトルは相補的なＣＣＣＣＡＧＣＣ配列の明らかに好ましいハイブ
リダイゼーションを示す。
【図１２】 測定の間にプローブ支持体を動かすことなく４−ヒドロキシ−
α−シアノ桂皮酸マトリックスの適用後に検出される、ＭＡＬＤＩプローブ支持
体に固定化した標的ＤＮＡに相補的な「電荷タグ」ＣＣＴＣＡＧＣＣ。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｆ (71)出願人 Ｂｅｒｌｉｎ，ＢＲＤ (72)発明者 ハンス・レーラッハ ドイツ連邦共和国デー−14195ベルリン、 リュッツェルシュタイナーヴェーク50番 Ｆターム(参考） 2G045 AA35 BB22 BB60 DA12 DA13 DA14 FA11 FA12 FA17 FB02 FB03 FB15 4B024 AA11 AA20 CA01 CA09 HA11 4B063 QA01 QA11 QQ42 QR56 QS34 QS36 QS39 QX01

Claims (23)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 下記工程を含む、核酸分子中のヌクレオチド配列の検出方法
    ： （a）異なるヌクレオチド塩基配列のプローブのセットとの核酸分子のハイブリ ダイゼーションであって、その際、各プローブは他のすべてのプローブとは異な
    る質量を示す； （b）ハイブリダイズしなかったプローブの分離； （c）レーザー光によりプローブの脱着を支援するマトリックスへのハイブリダ イズしたプローブの接触； （d）ハイブリダイズし電導性物質からなるプローブ支持体上のマトリックスに より囲まれたプローブの質量分光分析計での分析；および （e）配列を示す核酸分子の決定、その際、プローブ支持体上のプローブの位置 がそれと結合した核酸分子への割り当てを可能にする。
  2. 【請求項２】 工程(a)の前または後に核酸分子を担体の表面に移す、請求 項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 該担体の表面が、電導性物質からなるプローブ支持体の表面
    である、請求項２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 工程（c）の前に、その表面に核酸分子が適用されハイブリ ダイズしたプローブを有する担体を、電導性物質からなるプローブ支持体に適用
    する、請求項２に記載の方法。
  5. 【請求項５】 工程（c）において、ハイブリダイズしたプローブを、マト リックスとの接触前、接触後または接触中に固定化核酸分子から分離させる、請
    求項２に記載の方法。
  6. 【請求項６】 プローブ支持体が、金属である表面、ガラスをコーティング
    した表面、または化学的に修飾した表面を有する、請求項１ないし５のいずれか
    一つに記載の方法。
  7. 【請求項７】 核酸分子のプローブ支持体への固定が、ＮＨ2−官能基、エ ポキシ−官能基若しくはＳＨ−官能基を介し、シリケートもしくはシランでのプ
    ローブ支持体表面のコーティングによって、タンパク質−基質相互作用、タンパ
    ク質−タンパク質相互作用もしくはタンパク質−核酸相互作用、または２つの疎
    水性成分間の相互作用によって行う、請求項１ないし６のいずれか一つに記載の
    方法。
  8. 【請求項８】 タンパク質−基質相互作用が、ビオチン−ストレプトアビジ
    ン結合または抗体−抗原結合である、請求項７に記載の方法。
  9. 【請求項９】 タンパク質−核酸相互作用が遺伝子３２−核酸結合である、
    請求項７に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 プローブが質量タグを有する核酸である、請求項１ないし
    ９のいずれか一つに記載の方法。
  11. 【請求項１１】 質量タグが電荷タグでもある請求項１０に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 核酸がさらに電荷タグを有する、請求項１０に記載の方法
    。
  13. 【請求項１３】 プローブが修飾した核酸分子である、請求項１ないし１２
    のいずれか一つに記載の方法。
  14. 【請求項１４】 修飾した核酸分子が、ＰＮＡ、アルキル化ホスホロチオエ
    ート核酸またはアルキルホスホネート核酸である、請求項１３に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 プローブがコンビナトリアル固相合成により製造される、
    請求項１ないし１４のいずれか一つに記載の方法。
  16. 【請求項１６】 種々の塩基構築ブロックが、それにより合成された各プロ
    ーブがその質量により質量分光分析計で互いに区別できるような仕方でマーキン
    グされている、請求項１５に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 マーキングが、メチル基、エチル基、プロピル基、分枝鎖
    若しくは直鎖アルキル基、ハロゲン置換された分枝鎖若しくは直鎖アルキル基、
    アルコキシアルキル基、アルキルアリール基、アリールアルキル基、アルコキシ
    アリール基、またはアリールオキシアルキル基、または、その重水素化された変
    異体若しくは他の同位体変異体である、請求項１６に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 プローブが、ランダムなヌクレオチドから離れた定められ
    た位置に少なくとも１つの修飾を有し、それによりプローブの開裂が可能になる
    、請求項１４ないし１７のいずれか一つに記載の方法。
  19. 【請求項１９】 修飾が、ホスホロチオエートおよび／またはＲＮＡ塩基お
    よび／またはホスホトリエステル結合のプローブ内への導入である、請求項１８
    に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 マトリックスが、アセトン中のα−シアノ−４−ヒドロキ
    シ桂皮酸の１：９ないし９：１の比、好ましくは１：１の比の溶液、またはα−
    シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸メチルエステルとα−シアノ−４−メトキシ桂皮
    酸またはシナピン酸またはそのメチル誘導体との１：９ないし９：１の比、好ま
    しくは１：１の比の混合物である、請求項１ないし１９のいずれか一つに記載の
    方法。
  21. 【請求項２１】 マトリックスが、アセトン中のα−シアノ−４−ヒドロキ
    シ桂皮酸の１：９ないし９：１の比、好ましくは１：１の比の溶液、またはα−
    シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸メチルエステルとα−シアノ−４−メトキシ桂皮
    酸またはシナピン酸またはそのメチル誘導体との１：９ないし９：１の比、好ま
    しくは１：１の比の混合物であり、アセトン、イソプロパノール、アセトニトリ
    ル、エタノール、メタノールもしくは水またはこれら溶媒の２またはそれ以上の
    混合物中の溶液としてＭＡＬＤＩプローブ支持体に適用する、請求項１ないし１
    ９のいずれか一つに記載の方法。
  22. 【請求項２２】 プローブが異なる質量および／または電荷タグを有する部
    分ライブラリーとして製造される、請求項１ないし２１のいずれか一つに記載の
    方法。
  23. 【請求項２３】 （a）請求項１１ないし１８のいずれか一つに記載のプロ ーブセット、および／または （b）前処理されており、それゆえ標的ＤＮＡのアレイの結合が可能であるか 、および／またはすでに結合した標的ＤＮＡを含むプローブ支持体 を含むキット。
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