KR100473903B1 - 리간드쌍의결합을검출하는방법 - Google Patents

리간드쌍의결합을검출하는방법 Download PDF

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Abstract

리간드 쌍의 표지된 제1 구성원 세트를 당해 제1 구성원이 제2 구성원에 결합될 수 있는 충분한 시간 동안 일정 조건하에서 하나 이상의 제2 구성원을 함유하는 생물학적 샘플과 결합(여기서, 태그는 특정한 제1 구성원과 상관 관계를 가지고, 비형광 분광분석 또는 전위차 측정으로 검출가능하다)시키는 단계(a), 결합된 제1 구성원과 제2 구성원을 결합되지 않은 구성원으로부터 분리시키는 단계(b), 태그를 표지된 제1 구성원으로부터 절단하는 단계(c) 및 당해 태그를 비형광 분광분석 또는 전위차 측정으로 검출하고, 이로부터 제1 구성원의 제2 구성원으로의 결합을 검출하는 단계(d)를 포함하여, 리간드 쌍의 제1 구성원의 제2 구성원으로의 결합을 검출하는 방법이 제공된다.

Description

리간드 쌍의 결합을 검출하는 방법
본 발명은 일반적으로 핵산 분자를 분석하는 방법과 분석용 조성물에 관한 것으로, 특히 본 발명은 각종 생물학적 분석물의 분석 감도를 향상시키는 데 이용되는 특정한 태그 및 링커의 용도에 관한 것이다.
핵산 분자의 검출과 분석은 생물학에서 가장 중요한 기술 중의 하나로서, 분자 생물학의 핵심이고 생물학의 다른 분야에서 그 역할이 급속히 확대되고 있다.
일반적으로, 실질적으로 모든 생화학적 반응에 계속하여, 분석은 몇 가지 형태의 검출 단계를 수반한다. 특히 관심의 대상은 핵산 하이브리드화와 항원 항체 결합의 검출이다. 이상적으로, 검출은 감도가 좋아야 하고 복수의 샘플을 처리할 수 있어야 한다. 그러나, 현재의 검출 기술은 이들 특성에 있어서 다소 한계가 있다.
일반적으로, 핵산 분자의 하이브리드화는 하이브리드화 프로브가 방사성 표지를 함유하는 경우 자동방사그래프 또는 인광 이미지 분석으로 검출하거나, 하이브리드화 프로브가 바이오틴 또는 디곡신 등의 표지를 함유(이는 효소 결합한 항체나 리간드에 의해 인식된다)하는 경우 덴시토미터로 검출한다. 방사성 표지된 프로브를 이용하는 경우, 자동방사그래프에 의한 검출은 상반성 불일치 및 비선형성 등의 제한이 있다. 이와 같은 필름의 제한은 인광 이미지 분석에 의하여 표지를 검출하는 것으로 극복이 가능하다. 그러나, 방사성 표지를 안전성이 요구되고, 자원 이용을 증가시키므로 특정한 장치 및 개인의 훈련을 필요로 한다. 이러한 이유로, 비방사성 표지를 사용하는 것이 광범위하게 증대되고 있다. 이와 같은 시스템에서, 뉴클레오티드는 바이오틴 또는 디곡신 등의 표지(이는 항체 또는 색원체 기질에 반응하는 효소로 표지된 항체나 기타 분자에 의해 검출된다)를 함유한다. 또는, 형광 표지를 사용한다. 이들 시스템은 상기와 같은 안전성과는 관련이 없지만, 불안정하고 비특이적 반응을 일으킴으로써 높은 백그라운드(즉, 낮은 시그날 대 노이즈 비)를 나타내는 성분을 사용한다.
항원 항체 반응은 몇 가지 방법 중의 한가지를 이용하여 검출한다. 핵산 하이브리드화의 경우, 방사성 또는 비방사성 표지는 전형적으로 항체에 결합한다. 표지의 종류는 비슷하다: 색원체 기질과 반응하는 효소, 형광체, 리간드 또는 그 밖의 항체에 의해 검출되는 헵탄 등. 핵산 하이브리드화의 검출시와 동일한 제한이 이들 검출법에도 나타난다.
따라서, 본 발명은 여러 가지 핵산 또는 단백질(예: 항체)을 기본으로 하는 방법에 이용될 수 있는 신규한 조성물을 제공하고, 또한 다른 관련된 이점을 제공한다.
발명의 요약
간단히 말하면, 본 발명은 광범위한 기재 분석물에 있어서 감도와 샘플의 처리수를 증가시키기 위한 조성물과 방법을 제공한다. 특히, 본 명세서에 기재되어 있는 본 발명에 기초하여, 이제까지 완결하는 데 장시간을 요하는 많은 분석을 10배 내지 100배 신속하게 처리할 수 있게 된다. 따라서, 본 명세서에 기재되어 있는 방법은 이전에 사용되었던 분석법을 능가하는 매우 혁신적이고 중요한 개선책을 제시하고 있다.
예를 들면, 본 발명의 한 측면은 리간드 쌍의 표지된 제1 구성원 세트를 당해 제1 구성원의 제2 구성원에 결합될 수 있는 충분한 시간동안 일정 조건하에 하나 이상의 제2 구성원을 함유하는 생물학적 샘플과 결합시키는 단계(여기서, 태그는 특정한 제1 구성원과 상관 관계를 가지고, 비형광 분광분석 또는 전위차 측정으로 검출가능하다)(a), 결합된 제1 구성원과 제2 구성원을 결합되지 않은 구성원으로부터 분리하는 단계(b), 태그를 표지된 제1 구성원으로부터 절단하는 단계(c) 및 당해 태그를 비형광 분광분석 또는 전위차 측정으로 검출하고, 이로부터 제1 구성원의 제2 구성원으로의 결합을 검출하는 단계(d)를 포함하여, 리간드 쌍의 제1 구성원의 제2 구성원으로의 결합을 검출하는 방법을 제공한다.
다양한 제1 및 제2 구성원 쌍은 본 발명의 범위 내에서 이용할 수 있고, 예를 들면, 핵산 분자(예: DNA, RNA, PNA 등의 핵산 동족체, 또는 이들의 조합물), 단백질 또는 폴리펩티드[예: 항체 또는 항원 단편(예: 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 또는 CDR 등의 결합 파트너)], 올리고당, 호르몬, 유기 분자 및 기타 기질(예: 글루쿠로니다제-약 분자 등의 생체이물), 또는 다른 리간드 쌍을 포함한다. 본 발명의 여러 가지 실시양태에서, 제1 구성원과 제2 구성원은 분자의 형태가 서로 같거나 다를 수 있다. 예를 들면, 대표적인 제1 구성원 리간드와 제2 구성원 리간드 쌍에는 핵산 분자/핵산 분자; 항체/핵산 분자; 항체/호르몬; 항체/생체이물 및 항체/단백질이 포함된다.
바람직하게는, 제1 구성원은 선택된 제2 구성원을 특이적으로 (즉, 다른 관련 분자는 배제하고) 인식하거나, 관련된 제2 구성원 분자의 한 부류(예: 관련 수용체의 한 부류)를 인식한다. 바람직하게는, 제1 구성원은 적어도 약 10-5/M 이상, 바람직하게는 10-6/M, 10-7/M, 10-8/M, 10-9/M, 또는 10-12/M 이상의 친화성으로 제2 구성원에 결합된다. 제2 구성원에 대한 제1 구성원의 친화성은 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다[참조: Scatchard, Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660-672, 1949].
본 발명의 다른 측면에서, 핵산을 생물학적 샘플로부터 노출시키는 단계(a), 노출된 핵산을 표지된 핵산 프로브가 핵산에 하이브리드화되기에 충분한 시간 동안 일정 조건하에 하나 이상의 선택된 표지된 핵산 프로브와 결합(여기서, 태그는 특정한 핵산 프로브와 상관 관계를 가지고, 비형광 분광분석 또는 전위차 측정으로 검출가능하다)시키는 단계(b), 하이브리드화된 프로브를 하이브리드화되지 않은 프로부로부터 분리하는 단계(c), 당해 태그를 표지된 단편으로부터 절단하는 단계(d) 및 당해 태그를 비형광 분석 또는 전위차 측정으로 검출하고, 이로부터 생물학적 샘플의 유전자 발현 패턴을 결정하는 단계(e)를 포함하여, 소정의 생물학적 샘플로부터의 유전자 발현 패턴을 분석하는 방법을 제공한다. 하나의 실시양태에서, 상기 생물학적 샘플은 핵산을 노출시키는 단계 이전에 선택된 분자로 자극할 수 있다. 대표적인 "활성제(자극물)"로는 핵산 분자, 재조합 유전자 운반 비히클, 유기 분자, 호르몬, 단백질, 염증성 인자, 사이토킨, 약물, 약물 후보, 파라분비 및 자기분비 인자 등이 있다.
본 발명에서 "생물학적 샘플"은 생존 생물(예: 포유동물, 어류, 박테리아, 기생충, 바이러스, 균류 등) 또는 환경(예: 공기, 물 또는 고체 샘플)로부터 수득되는 샘플만을 포함하지 않고, 인공적 또는 합성적으로 생산된 생물학적 물질(예: 파아지 라이브러리, 유기 분자 라이브러리, 유전자 클론 풀 등)도 포함한다. 생물학적 샘플의 대표적인 예로서는, 생물학적 유체(예: 혈액, 정액, 뇌척수액, 뇨), 생물학적 세포(예: 줄기 세포, B 또는 T 세포, 간세포, 섬유아세포 등) 및 생물학적 조직이 있다.
상기에서 설명한 방법의 각종 실시양태에서, 본 발명에 따르는 핵산 프로브와 분자는, 예를 들면, 연결, 분해 또는 신장(예: PCR) 반응에 의해 생성된다. 다른 측면에 따르면, 핵산 프로브 또는 분자의 5' 말단에 표지되고, 이렇게 표지된 분자는 올리고뉴클레오티드 프라이머 또는 디데옥시뉴클레오티드 터미네이터로서 기능한다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 250, 300, 350, 400, 450개 또는 500개 이상의 상이한 독자 표지된 분자가 소정의 반응에서 동시에 사용될 수 있다. 여기서, 각 태그는 선택된 핵산 단편, 프로브 또는 제1 구성원 또는 제2 구성원에 대해 독자적이고, 따라서 개별적으로 동정될 수 있다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 태그(들)는 형광분석, 질량 분광분석, 적외선 분광분석, 자외선 분광분석, 또는 정전위 전류 측정(예: 전량 측정 검출기 또는 전류 측정 검출기 이용)을 통하여 검출할 수 있다. 적당한 분광분석 기술의 대표적인 예로서는 비행시간형 질량 분광분석, 4중극형 질량 분광분석, 자기 섹터 질량 분광분석, 전기 섹터 질량 분광분석이 있다. 이와 같은 기술의 특정한 실시형태로서는 이온 포획 질량 분광분석, 전기분무 이온화 질량 분광분석, 이온 분무 질량 분광분석, 액체 이온화 질량 분광분석, 대기압 이온화 질량 분광분석, 전자 이온화 질량 분광분석, 고속 원자 충격 이온화 질량 분광분석, MALDI 질량 분광분석, 광 이온화 비행시간형 질량 분광분석, 레이저 액적 질량 분광분석, MALDI-TOF 질량 분광분석, APCI 질량 분광분석, 나노-분무 질량 분광분석, 분무 이온화 질량 분광분석, 화학 이온화 질량 분광분석, 공명 이온화 질량 분광분석, 2차 이온화 질량 분광분석, 열분무 질량 분광분석이 포함된다.
본 발명의 또다른 실시양태에서, 결합된 제1 구성원과 제2 구성원 또는 노출된 핵산은 결합되지 않은 구성원 또는 분자로부터 겔 전기영동, 모세관 전기영동, 미소채널 전기영동, HPLC, 크기 배제 크로마토그래피, 여과, 폴리아크릴아미드겔 전기영동, 액체 크로마토그래피, 역크기 배제 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 역상 액체 크로마토그래피, 펄스필드 전기영동, 필드 반전 전기영동, 투석 및 형광 활성화 액체 액적 선별 등을 포함하는 방법을 이용하여 분리시킬 수 있다. 또는, 제1 구성원 또는 제2 구성원 또는 노출된 핵산은 고형 지지체[예: 중공 섬유{매사추세츠주 댄버스 소재의 아미코 코포레이션(Amicor Corporation)}, 비이드{펜실베니아주 워링톤 소재의 폴리사이언시스(Polysciences)}, 자기 비이드{캘리포니아주 마운틴 뷰 소재의 로빈 사이언티픽(Robbin Scientific)}, 플레이트, 접시 및 플라스크{뉴욕주 코닝 소재의 코닝 글래스 웍스(Corning Glass Works)}, 메쉬{캘리포니아주 마운틴 뷰 소재의 벡톤 딕킨슨(Becton Dickinson)}, 스크린 및 고체 섬유{에델만 등(Edelman et al.)의 미국 특허 제3,843,324호 및 구로다 등(Kuroda et al.)의 미국 특허 제4,416,777호}, 막{매사추세츠주 베드포드 소재의 밀리포어 코포레이션(Millipore Corp.)}, 및 침지스틱)에 결합된다. 제1 구성원 또는 제2 구성원 또는 노출된 핵산이 고형 지지체에 결합되면, 본 발명의 실시양태에서 본 명세서에 기재되어 있는 방법은 고체 지지체의 결합되지 않은 물질을 세척하여 제거하는 단계를 추가로 포함한다.
다른 실시양태에서, 표지된 제1 구성원은 화학 반응, 산화, 환원, 산 불안정화, 염기 불안정화, 효소적, 전기화학적, 가열 및 광 불안정화 반응을 통하여 절단한다. 또다른 실시양태에서, 분리, 절단 및 검출 단계는 연속적 방식(예: 연속 흐름)으로 자동화된 단일 장치 내에서 수행할 수 있다.
본 발명의 이들 측면과 그밖의 다른 측면들은 이하의 상세한 설명과 첨부된 도면을 참조하여 보다 분명히 이해될 것이다. 또한, 특정한 과정 또는 조성물(예: 플라스미드 등)을 상세히 설명하는 여러 가지 참조 문헌을 이하에 제시하고 있으며, 이들은 전체가 본 명세서 중에 참고로서 활용된다.
도 1은 화학적으로 절단가능한 질량 분광분석 태그의 펜타플루오로페닐 에스테르를 합성하기 위해 카복실 아미드 말단을 갖는 태그를 유리시키는 과정을 도시한 흐름도이다.
도 2은 화학적으로 절단가능한 질량 분광분석 태그의 펜타플루오로페닐 에스테르를 합성하기 위해 카복실산 말단을 갖는 태그를 유리시키는 과정을 도시한 흐름도이다.
도 3 내지 도 6 및 도 8은 광화학적으로 절단가능한 36개의 질량 분광분석 태그의 테트라플루오로페닐 에스테르를 합성하는 과정을 도시한 흐름도이다.
도 7은 아민 말단을 갖는 광화학적으로 절단가능한 36개의 질량 분광분석 태그를 합성하는 과정을 도시한 흐름도이다.
도 9는 광화학적으로 절단가능한 질량 분광 태그 산의 36개의 테트라플루오로페닐 에스테르의 대응하는 세트로부터 제조한 광화학적으로 절단가능한 36개의 질량 분광분석 표지된 올리고뉴클레오티드를 합성하는 과정을 도시한 흐름도이다.
도 10은 36개의 아민 말단을 갖는 광화학적으로 절단가능한 질량 분광분석 태그 산의 대응하는 세트로부터 제조한 광화학적으로 절단가능한 36개의 질량 분광 분석 표지된 올리고뉴클레오티드를 합성하는 과정을 도시한 흐름도이다.
도 11은 질량 분광분석법을 이용한 복수 태그의 동시 검출을 나타낸다.
도 12는 α-시아노 매트릭스 단독의 질량분광사진이다.
도 13은 모듈로 구성되는 표지된 핵산 단편을 도시한 것이다.
위에 언급한 바와 같이, 본 발명은 광범위한 여러 가지 생물학적 분석물에서 분석 감도와 샘플 수를 증대시키기 위하여 이용되는 태그 및 링커를 제공한다. 아래에는 사용되는 대표적인 태그 및 링커, 태그가 이용되는 각종 방법 및 태그 검출법을 자세히 설명한다.
간단히 말하면, 본 발명의 한 측면에 따르면, 목적 분자 또는 이의 전구체가 불안정한 결합(들)에 의해 태그에 연결되어 있는 화합물을 제공한다. 따라서, 본 발명의 화합물은 화학식 T-L-X[여기서, T는 태그 성분이고, L은 불안정한 결합이거나 불안정한 결합을 포함하는 링커 성분이고, X는 목적 분자(MOI) 성분, 또는 MOI가 T-L에 결합되도록 하는 관능기 성분(Lh)의 분자중의 어느 하나이다)를 갖는 것으로 볼 수 있다.
따라서, 본 발명의 화합물은 보다 상세하게는 화학식 T-L-MOI 및 T-L-Lh로 나타낼 수 있다.
아래에 상세히 기재되는 이유 때문에, T-L-MOI 화합물 세트를 불안정한 결합(들)이 파괴되는 조건에 의도적으로 적용시켜 태그 잔기를 화합물의 나머지 부분으로부터 방출시킨다. 태그 잔기는 특징적인 한가지 이상의 분석 방법을 이용하여 태그 잔기의 구조에 대한 직접적인 정보 및, 보다 중요하게는, 대응하는 MOI의 동정에 대한 간접 정보를 제공한다.
L이 직접 결합인 본 발명에 따르는 화합물의 간단한 예는 화학식 1을 참고로 한다:
[화학식 1]
화학식 1에서,
T는 카보닐 그룹에 결합된 질소 함유 폴리사이클릭 방향족 잔기이고,
X는 MOI(특히, 말단이 아민 그룹인 핵산 단편)이고, L은 아미드 그룹을 형성하는 결합이다.
종래의 기술에서 알 수 있듯이, 태그 성분 내의 아미드 결합을 변화시키지 않는 산성 또는 염기성 조건하에 아미드 결합이 화학적으로 절단(파괴)되기 때문에 아미드 결합은 T의 결합에 비하여 불안정하다. 따라서, 태그 잔기(즉, T를 포함하는 절단 생성물)이 반응식 1과 같이 방출된다:
[반응식 1]
그러나, 링커 L은 다음의 예시적인 실시양태에서 알 수 있는 바와 같이 단순한 직접 결합 이상일 수 있으며, 화학식 2의 본 발명의 다른 대표적인 화합물을 참고로 한다.
[화학식 2]
오르토-니트로벤질아민 잔기(화학식 2에서 네모 안의 원자 참조)를 갖는 화합물은 광에 불안정하여, 이러한 화합물의 특정 파장의 화학선 조사에의 노출은 벤질아민 결합(화학식 2에서 굵은 선으로 나타낸 결합 참조)을 선택적으로 절단시키는 것으로 공지되어 있다. 따라서, 화학식 2는 화학식 1과 같은 T와 MOI 그룹을 갖지만, 링커 그룹은 복수의 원자 및 결합을 포함하며, 그 중에는 특히 불안정한 결합이 존재한다. 따라서, 화학식 2의 광분해는 아래에 제시하는 바와 같이 태그 잔기(T 함유 잔기)가 화합물의 나머지 부분으로부터 분리된다.
[반응식 2]
따라서, 본 발명은 적당한 절단 조건에 노출되었을 때 절단 반응을 하여 이에 의해 태그 잔기가 화합물의 나머지 부분으로부터 방출되는 화합물을 제공한다.본 발명의 화합물은 태그 잔기, MOI(또는 이의 전구체, Lh) 및 2개의 그룹을 함께 결합시키는 불안정한 결합(들)으로 기재할 수 있다. 또는, 본 발명의 화합물은 형성되는 성분으로 기재할 수 있다. 따라서, 화합물은 다음과 같이 태그 반응체, 링커 반응체 및 MOI 반응체의 반응 생성물로 기재할 수 있다.
태그 반응체는 화학적 핸들(Th) 및 가변 성분(Tvc)으로 구성되어 Tvc-Th의 일반 구조를 갖는 것으로 이해된다. 이 명명법을 예시하기 위하여, 화학식 2의 화합물을 제조하기 위해 사용되는 태그 반응체를 나타내는 화학식 3을 참조한다. 화학식 3의 태그 반응체는 아래와 같이 태그 가변 성분과 표지 핸들을 함유한다:
[화학식 3]
화학식 3에서, 태그 핸들(-C(=0)-A)은 T-L 부분을 형성하기 위해 태그 반응체가 링커 반응체와 반응하는 수단을 단순히 제공한다. 화학식 3에서 "A" 그룹은 카복실 그룹이 화학적으로 활성인 상태이므로 다른 핸들과 결합하기 쉬운 것을 나타낸다. "A"는, 예를 들면, 하이드록실 그룹 또는 펜타플루오로페녹시이다. 본 발명은 아래에 상세히 논의되는 바와 같이 태그 가변 성분과 결합할 수 있는 복수의 태그 핸들을 제공한다. 따라서, 태그 가변 성분은 화학식 T-L-X에서 "T" 부분에 해당하고, 또한 L을 절단하는 반응으로부터 형성된 태그 잔기의 부분이 된다.
또한, 아래에 상세히 논의되는 바와 같이, 태그 가변 성분은 본 발명에 따르는 화합물 세트를 제조하는 데에 있어서 각각의 구성원이 분석 기술을 통하여 다른구성원으로부터 구별될 수 있도록 각각의 구성원들이 독특한 가변 성분들을 갖는 것이 바람직하다. 하나의 예로서, 화학식 3의 태그 가변 성분은 UV나 질량 스펙트럼으로 구별할 수 있는 화학식
의 세트의 하나의 구성원이 될 수 있다.
마찬가지로, 링커 반응체는 링커 불안정한 성분에 인접하는 화학적 핸들(각각 Lh로 나타낼 수 있으며, 적어도 2개 이상이 필요하다)로 기재할 수 있다. 여기서, 링커 불안정한 성분은, 필요한 불안정 부분(L2) 및 임의의 불안정한 부분(Ll 및 L3)으로 구성되고, 여기서 임의의 불안정한 부분은 핸들 Lh로부터 L2를 분리시키는 데에 효과적으로 사용되고, 필요한 불안정한 부분은 링커 불안정한 성분 내에 불안정한 결합을 제공하는 데에 효과적으로 사용된다. 따라서, 링커 반응체는 화학식 Lh-L1-L2-L3-Lh으로 이해될 수 있다.
링커 반응체를 설명하기 위해 사용된 명명법은, 화학식 2의 화합물로부터 또한 유도된 화학식 4로서 설명할 수 있다:
[화학식 4]
화학식 4에서 나타낸 바와 같이, 원자들은 한가지 이상의 기능적 역할을 수행한다. 따라서, 화학식 4에서 벤질 질소는 링커 반응체를 아미드 형성 반응을 통하여 태그 반응체에 결합시키는 화학적 핸들로서 작용하고, 이어서 벤질 탄소-질소결합이 특히 광분해 절단되기 쉽다는 점에 있어서 감수성인 불안정한 부분 L2 구조의 필요한 부분으로서도 작용한다. 또한, 화학식 4를 보면, 링커 반응체는 L1 그룹을 갖지 않지만 L3 그룹(메틸렌 그룹)을 갖는 것을 알 수 있다. 마찬가지로, 링커반응체는 L3 그룹을 갖지 않고 L1 그룹만을 갖거나, L1 그룹 및 L3 그룹을 모두 갖거나, L1 그룹 또는 L3 그룹을 모두 갖지 않는다. 화학식 4에서, 카보닐 그룹에 인접하는 "P" 그룹의 존재는 카보닐 그룹이 반응으로부터 보호된다는 것을 나타낸다. 이 구성에서, 태그 반응체(화학식 3) 활성화 카복실 그룹은 링커 반응체(화학식 4)의 아민 그룹과 반응하여 아미드 결합을 형성하고, 화학식 T-L-Lh의 화합물을 제공한다.
MOI 반응체는 목적 분자의 적합한 반응성 형태이다. 목적 분자가 핵산 단편인 경우, 적당한 MOI 반응체는 5' 하이드록실 그룹을 통하여 포스포디에스테르 그룹과 결합하고, 이어서 말단이 아미노 그룹인 알킬렌 쇄와 결합하고 있는 핵산 단편이다. 이 아미노 그룹은 화학식 4의 카보닐 그룹과 반응(카보닐 그룹을 탈보호시킨 후, 바람직하게는 카보닐 그룹의 아민 그룹과의 반응의 활성화 후)하여 MOI를 링커와 결합시킨다.
시간순으로 보면, 본 발명은 태그 반응체(화학적 태그 핸들과 태그 가변 성분을 갖는다), 링커 반응체(2개의 화학적 링커 핸들, 필요한 불안정한 부분 및, 0-2개의 임의의 불안정한 부분을 갖는다) 및 MOI 반응체(목적 성분의 분자 및 목적 핸들의 화학적 분자를 갖는다)를 이용하여 화학식 T-L-MOI를 형성하는 것으로 이해된다. 따라서, 화학식 T-L-MOI를 형성하기 위하여, 태그 반응체와 링커 반응체를 반응시켜 최초에 화학식 T-L-Lh를 제공한 다음, MOI 반응체를 화학식 T-L-Lh과 반응시켜 화학식 T-L-MOI를 형성하거나, 또는 (보다 바람직하지는 않지만) 링커 반응체 및 MOI 반응체를 반응시켜 최초에 화학식 Lh-L-MOI를 제공한 후에 화학식 Lh-L-MOI를 태그 반응체와 반응시켜 화학식 T-L-MOI를 형성시킨다. 보다 간편하게는, 화학식 T-L-MOI의 화합물은 이러한 화합물을 형성하기 위해 사용되는 태그 반응체, 링커 반응체 및 MOI 반응체에 의해 설명된다. 물론, 화학식 T-L-MOI의 동일한 화합물을 다른 (일반적으로는 보다 많은 노력을 들이는) 방법을 통하여 제조할 수 있으며, 본 발명의 화학식 T-L-MOI의 화합물의 범위에 포함된다.
어떠한 경우에도, 본 발명은, 태그 잔기가 화합물의 나머지 부분으로부터 방출되도록 절단 조건하에 적용시켜 화학식 T-L-MOI의 화합물을 제공한다. 태그 잔기는 적어도 태그 가변 성분을 포함하고, 대표적으로는 태그 반응체를 링커 반응체와 결합시키는 데에 사용된 태그 핸들로부터의 원자 일부 또는 전부, 링커 핸들로부터의 원자 일부 또는 전부, 당해 그룹이 화학식 T-L-MOI에 존재할 경우 임의의 불안정한 부분 L1을 추가로 포함하고, L2의 정밀 구조 및 절단 화학의 성질에 따라 필요한 불안정한 부분 L2의 일부분을 포함한다. 간단히 하면, 태그 잔기는 T가 대표적으로는 태그 잔기의 주요 부분(질량면에서)을 구성하므로 T 함유 잔기로 부를 수 있다.
본 발명의 한 가지 측면에서, 여러 가지 성분(T, L, X)을 상세히 설명하기로 한다. 이를 설명하기 전에, 먼저 T, L 및 X를 설명하기 위해 본원에서 사용되는 용어들을 정의하기로 한다.
본원에서 사용되는 경우, "핵산 단편"이란 선택적 표적 핵산 분자에 상보적인(즉, 전부 또는 일부에 상보적인) 분자를 의미하는 것으로, 천연물에서 추출하거나 합성 또는 재조합에 의해 생성(천연에 존재하지 않는 분자를 포함)되고, 적절한 경우 이본쇄 또는 일본쇄 형태이며, 올리고뉴클레오티드(예: DNA 또는 RNA), 프라이머, 프로브, 핵산 동족체(예: PNA), 폴리머라제에 의해 5'에서 3' 방향으로 신장된 올리고뉴클레오티드, 화학 또는 효소 처리하여 절단된 핵산, 디디옥시 터미네이터를 갖거나 5' 또는 3' 말단에의 중합이 방지된 화합물로 3' 또는 5' 말단에서 캡핑된 핵산 및 이들의 조합물을 포함한다. 선택된 표적 핵산 분자에 대한 핵산 단편의 상보성은 일반적으로 단편 전체 길이에 대하여 특이적 염기쌍이 적어도 약 70% 이상인 것을 의미한다. 바람직하게는, 핵산 단편은 적어도 약 80%의 특이적 염기쌍을 나타내고; 가장 바람직하게는 적어도 약 90% 이상을 나타낸다. 미스매치 비율(따라서, 특이적 염기쌍 형성의 비율)을 결정하기 위한 분석 방법은 해당 분야에 공지된 것으로서, 전체 염기쌍 형성된 대조군을 참조로 하는 경우 Tm의 함수로서 미스매치 비율을 기초로 한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "알킬"이라 함은 단독 또는 조합하여 1개 내지 10개, 바람직하게는 1개 내지 6개, 보다 바람직하게는 1개 내지 4개의 탄소원자 를 포함하는 포화된 직쇄 또는 측쇄의 탄화수소 라디칼을 말한다. 이와 같은 라디칼의 예로는, 이로써 제한되지는 않으나, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, 펜틸, 이소아밀, 헥실, 데실 등이 있다. "알킬렌"이라 함은, 1개 내지 10개, 바람직하게는 1개 내지 6개, 보다 바람직하게는 1개 내지 4개의 탄소원자를 포함하는 포화된 직쇄 또는 측쇄의 탄화수소 디라디칼을 말한다. 이와 같은 디라디칼의 예로는, 이로써 제한되지는 않으나, 메틸렌, 에틸렌(-CH2-CH2-), 프로필렌 등이 있다.
"알케닐"이라 함은 단독 또는 조합하여 2개 내지 10개, 바람직하게는 2개 내지 6개, 보다 바람직하게는 2개 내지 4개의 탄소원자 전체에 있어서 적어도 하나 이상의 탄소원자 이중 결합을 갖는 직쇄 또는 측쇄의 탄화수소 라디칼을 말한다. 이와 같은 라디칼의 예로는, 이로써 제한되지는 않으나, 에테닐, E- 및 Z-프로페닐, 이소프로페닐, E- 및 Z-부테닐, E- 및 Z-이소부테닐, E- 및 Z-펜테닐, 데세닐 등이 있다. "알케닐렌"이라 함은 2개 내지 10개, 바람직하게는 2개 내지 6개, 보다 바람직하게는 2개 내지 4개의 탄소원자 전체에 있어서 적어도 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 직쇄 또는 측쇄의 탄화수소 디라디칼을 말한다. 이와 같은 디라디칼의 예로는, 이로써 제한되지는 않으나, 메틸리덴(=CH2), 에틸리덴 (-CH=CH-), 프로필리덴(-CH2-CH=CH-) 등이 있다.
"알키닐"이라 함은 단독 또는 조합하여 2개 내지 10개, 바람직하게는 2개 내지 6개, 보다 바람직하게는 2개 내지 4개의 탄소원자 전체에 있어서 적어도 하나 이상의 탄소-탄소 삼중 결합을 갖는 직쇄 또는 측쇄의 탄화수소 라디칼을 말한다.이와 같은 라디칼의 예로는, 이로써 제한되지는 않으나, 에틸(아세틸레닐), 프로피닐(프로파길), 부티닐, 헥시닐, 데시닐 등이 있다. "알키닐렌"이라 함은 단독 또는 조합하여 2개 내지 10개, 바람직하게는 2개 내지 6개, 보다 바람직하게는 2개 내지 4개의 탄소원자 전체에 있어서 적어도 하나 이상의 탄소-탄소 삼중 결합을 갖는 직쇄 또는 측쇄의 탄화수소 디라디칼을 말한다. 이와 같은 디라디칼의 예로는,이로써 제한되지는 않으나, 에티닐렌(-C≡ C-), 프로피닐렌(-CH2-C≡ C-) 등이 있다.
"사이클로알킬"이라 함은 단독 또는 조합하여 3개 내지 8개, 바람직하게는 3개 내지 6개의 탄소원자의 포화된 사이클릭 배열을 말한다. 이와 같은 사이클로알킬의 예로는, 이로써 제한되지는 않으나, 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실 등이 있다. "사이클로알킬렌"은 사이클로알킬의 디라디칼 형태를 말한다.
"사이클로알케닐"이라 함은 단독으로 또는 조합하여 4개 내지 8개, 바람직하게는 5개 또는 6개의 탄소원자를 포함하고 하나 이상의 이중 결합을 갖는 사이클릭카보사이클을 말한다. 이와 같은 사이클로알케닐의 예로는, 이로써 제한되지는 않으나, 사이클로펜테닐, 사이클로헥세닐, 사이클로펜타디에닐 등이 있다. "사이클로알케닐렌"은 사이클로알케닐의 디라디칼 형태를 말한다.
"아릴"은 페닐, 나프틸, 인데닐, 인다닐, 아줄레닐, 플루오레닐 및 안트라세닐로 이루어진 그룹으로부터 선택된 카보사이클릭(전체적으로 탄소와 수소로 이루어진) 방향족 그룹; 또는 푸릴, 티에닐, 피리딜, 피롤릴, 옥사졸릴, 티아졸릴, 이미다졸릴, 피라졸릴, 2-피라졸리닐, 피라졸리디닐, 이소옥사졸릴, 이소티아졸릴, 1,2,3-옥사디아졸릴, 1,2,3-트리아졸릴, 1,3,4-티아디아졸릴, 피리다지닐, 피리미디닐, 피라지닐, 1,3,5-트리아지닐, 1,3,5-트리티아닐, 인돌리지닐, 인돌릴, 이소인돌릴, 3H-인돌릴, 인돌릴, 벤조[b]푸라닐, 2,3-디하이드록벤조푸라닐, 벤조[b]티 오페닐, 1H-인다졸릴, 벤즈이미다졸릴, 벤즈티아졸릴, 푸리닐, 4H-퀴놀리지닐, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 신놀리닐, 프탈라지닐, 퀴나졸리닐, 퀴녹살리닐, 1,8-나프티리디닐, 테리디닐, 카바졸릴, 아크리디닐, 페나지닐, 페노티아지닐 및 페노옥사지닐로 이루어진 그룹으로부터 선택된 헤테로사이클릭 방향족 그룹을 말한다.
본 명세서에서 정의되는 "아릴" 그룹은 수소, 할로겐, 하이드록시, 아미노,니트로, 트리플루오로메틸, 트리플루오로메톡시, 알킬, 알케닐, 알키닐, 시아노, 카복시, 카보알콕시, 1,2-디옥시에틸렌, 알콕시, 알케녹시 또는 알키녹시, 알킬아미노, 알케닐아미노, 알키닐아미노, 지방족 또는 방향족 아실, 알콕시-카보닐아미노, 알킬설포닐아미노, 모르폴리노카보닐아미노, 티오모르폴리노카보닐아미노, N-알킬구아니디노, 아르알킬아미노설포닐; 아르알콕시알킬; N-아르알콕시우레아; N-하이드록실우레아; N-알케닐우레아; N,N-(알킬,하이드록실)우레아; 헤테로사이클릴; 티오아릴옥시-치환 아릴; N,N-(아릴,알킬)하이드라지노, Ar'-치환 설포닐헤테로사이클릴; 아르알킬-치환 헤테로사이클릴; 사이클로알킬 및 사이클로알케닐-치환 헤테로사이클릴; 사이클로알킬-융합 아릴; 아릴옥시-치환 알킬; 헤테로사이클릴아미노; 지방족 또는 방향족 아실아미노카보닐; 지방족 또는 방향족 아실-치환 알케닐; Ar'-치환 아미노카보닐옥시; Ar',Ar'-이치환 아릴; 지방족 또는 방향족 아실-치환 아실; 사이클로알킬카보닐알킬; 사이클로알킬-치환 아미노; 아릴옥시카보닐알킬; 포스포로디아미딜 산 또는 에스테르로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택된 1개 내지 4개의 치환체를 갖는다.
"Ar'"은 상기에서 정의한 바와 같이 수소, 할로겐, 하이드록실, 아미노, 니트로, 트리플루오로메틸, 트리플루오로메톡시, 알킬, 알케닐, 알키닐, 1,2-디옥시메틸렌, 1,2-디옥시에틸렌, 알콕시, 알케녹시, 알키녹시, 알킬아미노, 알케닐아미노 또는 알키닐아미노, 알킬카보닐옥시, 지방족 아실 또는 방향족 아실, 알킬카보닐아미노, 알콕시카보닐아미노, 알킬설포닐아미노, N-알킬 또는 N,N-디알킬 우레아로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1개 내지 3개의 치환체를 갖는 카보사이클릭 또는 헤테로사이클릭 아릴 그룹이다.
"알콕시"라 함은 단독으로 또는 조합하여 알킬 에테르 라디칼을 말하고, 여기에서 "알킬"은 상기에서 정의한 바와 같다. 적당한 알킬 에테르 라디칼의 예에는, 이로써 제한되지는 않으나, 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소-프로폭시, n-부톡시, 이소-부톡시, sec-부톡시, tert-부톡시 등이 있다.
"알케녹시"라 함은 단독으로 또는 조합하여 화학식 알케닐-0-의 라디칼을 말하는 것으로서, 여기서 "알케닐"은 상기에서 정의한 것과 같고, 단 당해 라디칼은에놀 에테르가 아니다. 적당한 알케녹시 라디칼의 예로는, 이로써 제한되지는 않으나, 알릴옥시, E- 및 Z-3-메틸-2-프로페녹시 등이 있다.
"알키닐옥시"라 함은 단독으로 또는 조합하여 화학식 알키닐-0-의 라디칼을말하는 것으로서, 여기서 "알키닐"은 상기에서 정의한 바와 같고, 단 당해 라디칼은 이놀 에테르가 아니다. 적당한 알키녹시 라디칼의 예로는, 이로써 제한되지는 않으나, 프로파길옥시, 2-부티닐옥시 등이 있다.
"티오알콕시"라 함은 화학식 알킬-S-의 티오에테르 라디칼을 말하는 것으로,여기서 "알킬"은 상기에서 정의한 바와 같다.
"알킬아미노"는 단독으로 또는 조합하여 모노-또는 디-알킬-치환 아미노 라디칼(즉, 화학식 알킬-NH-또는 (알킬)2-N-의 라디칼)을 말하는 것으로, 여기서 "알킬"이라 함은 상기에서 정의한 바와 같다. 적당한 알킬아미노 라디칼로는, 이로써제한되지는 않으나, 메틸아미노, 에틸아미노, 프로필아미노, 이소프로필아미노, t-부틸아미노, N,N-디에틸아미노 라디칼 등이 있다.
"알케닐아미노"는 단독으로 또는 조합하여 화학식 알케닐-NH- 또는 (알케닐)2-N-의 라디칼을 말하는 것으로, 여기서 "알케닐"이라 함은 상기에서 정의한 바와 같고, 단 당해 라디칼은 엔아민이 아니다. 적당한 알케닐아미노 라디칼에는, 이로써 제한되지는 않으나, 아릴아미노 라디칼이 있다.
"알키닐아미노"라 함은 단독으로 또는 조합하여 화학식 알키닐-NH 또는 (알키닐)2N-의 라디칼을 의미하며, 여기에서 "알키닐"은 상기에서 정의한 바와 같고, 단 당해 라디칼은 인아민이 아니다. 이러한 알키닐아미노 라디칼의 예로는 프로파길 아미노 라디칼이 있다.
"아미드"는 -N(R1)-C(=0)- 또는 -C(=O)-N(R1)-을 말하는 것으로, 여기서 R1은 본 명세서에서 다른 그룹 뿐만 아니라 수소를 포함하는 것으로 정의된다. "치환 아미드"란 R1이 수소가 아닌 것을 말하고, "비치환 아미드"는 R1이 수소인 것을 말한다.
"아릴옥시"는 단독으로 또는 조합하여 화학식 아릴-0-의 라디칼을 말하는 것으로, 여기서 아릴은 상기에서 정의한 바와 같다. 아릴옥시 라디칼의 예로는, 이로써 제한되지는 않으나, 페녹시, 나프톡시, 피리딜옥시 등이 있다.
"아릴아미노"는 단독으로 또는 조합하여 화학식 아릴-NH-의 라디칼을 의미하고, 여기서 아릴은 위에서 정의한 바와 같다. 아릴아미노 라디칼의 예로는, 이로써 제한되지는 않으나, 페닐아미노(아닐리도), 나프틸아미노, 2-, 3- 및 4-피리딜아미노 등이 있다.
"아릴-융합 사이클로알킬"은 단독으로 또는 조합하여 아릴 라디칼과 인접한 2개의 원자를 공유하는 사이클로알킬 라디칼을 말하는 것으로, 여기서 "사이클로알킬"과 "아릴"은 상기에서 정의한 바와 같다. 아릴-융합 사이클로알킬 라디칼의 예로는, 이로써 제한되지는 않으나, 벤조융합 사이클로부틸 라디칼이 있다.
"알킬카보닐아미노"는 단독으로 또는 조합하여 화학식 알킬-CONH-의 라디칼을 말하는 것으로, 여기서 "알킬"이라 함은 상기에서 정의한 바와 같다.
"알콕시카보닐아미노"는 단독으로 또는 조합하여 화학식 알킬-OCONH-의 라디칼을 말하는 것으로, 여기서 "알킬"이라 함은 상기에서 정의한 바와 같다.
"알킬설포닐아미노"는 단독으로 또는 조합하여 화학식 알킬-SO2NH-의 라디칼을 말하는 것으로, 여기서 "알킬"이라 함은 상기에서 정의한 바와 같다.
"아릴설포닐아미노"는 단독으로 또는 조합하여 화학식 아릴-SO2NH-의 라디칼을 말하는 것으로, 여기서 "아릴"이라 함은 상기에서 정의한 바와 같다.
"N-알킬우레아"는 단독으로 또는 조합하여 화학식 알킬-NH-CO-NH-의 라디칼을 말하는 것으로, 여기서 "알킬"이라 함은 상기에서 정의한 바와 같다.
"N-아릴우레아"는 단독으로 또는 조합하여 화학식 아릴-NH-CO-NH-의 라디칼을 말하는 것으로, 여기서 "아릴"이라 함은 상기에서 정의한 바와 같다.
"할로겐"은 불소, 염소, 브롬 및 요오드를 말한다.
"탄화수소 라디칼"은 하나의 단일 수소원자만이 독립적인 안정한 분자를 만드는 데에 필요한 탄소와 수소원자의 배열을 말한다. 따라서, 탄화수소 라디칼은탄소원자 위에 하나의 공 전자배위를 갖고, 이를 통하여 탄화수소 라디칼이 다른 원자(들)에 결합된다. 탄화수소 라디칼에는 알킬, 아케닐, 알키닐, 사이클로알킬등이 있다.
"탄화수소 디라디칼"은 2개의 수소원자가 독립적인 안정한 분자를 만드는 데에 필요한 탄소와 수소원자의 배열을 말한다. 따라서, 탄화수소 라디칼은 탄소원자 위에 2개의 공 전자배위를 갖고, 이를 통하여 탄화수소 라디칼이 다른 원자(들)에 결합된다. 탄화수소 디라디칼의 예에는 알킬렌, 알케닐렌, 알키닐렌, 사이클로 알킬렌 등이 있다.
"하이드로카빌"은 탄소와 수소의 전체가 단일 원자가 부위를 갖고, 이를 통하여 별개의 부분에 결합되는 임의의 안정한 배열을 말하는 것이다. 따라서, 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 아릴(아릴 환 안에 헤테로원자가 없다), 아릴알킬, 알킬아릴 등을 포함한다. 탄화수소 라디칼은 하이드로카빌의 다른 명칭이다.
"하이드로카빌렌"은 탄소와 수소의 전체가 2개의 원자가 부위를 갖고, 이를 통하여 다른 부분에 결합되는 임의의 안정한 배열을 말하는 것이다. 따라서, 알킬렌, 알케닐렌, 알키닐렌, 사이클로알킬렌, 사이클로알케닐렌, 아릴렌(아릴렌 환 안에 헤테로원자가 없다), 아릴알킬렌, 알킬아릴렌 등을 포함한다. 탄화수소 디라디칼은 하이드로카빌렌의 다른 명칭이다.
"하이드로카빌-0-하이드로카빌렌"은 산소원자에 결합된 하이드로카빌 그룹을 말하는 것으로, 여기서 산소원자는 하이드로카빌렌 그룹이 다른 부분에 결합되는 2개의 원자가 부위 중의 한 군데에서 하이드로카빌렌 그룹에 결합되어 있다. "하이 드로카빌-S-하이드로카빌렌", "하이드로카빌-NH-하이드로카빌렌" 및 "하이드로카빌-아미드-하이드로카빌렌"도 등가의 의미를 가지며, 여기서 산소는 황 또는 -NH-,아미드 그룹으로 각각 치환될 수 있다.
"N-(하이드로카빌)하이드로카빌렌"은 하이드로카빌렌 그룹을 말하며, 여기서 2개의 원자가 부위 중 하나는 질소원자와 결합하고 질소원자는 동시에 수소와 하이드로카빌 그룹에 결합되어 있다. "N,N-디(하이드로카빌)하이드로카빌렌"은 하이드로카빌렌 그룹을 말하며, 여기서 2개의 원자가 부위 중 하나는 질소원자와 결합하고 질소 원자는 동시에 2개의 하이드로카빌 그룹에 결합되어 있다.
"하이드로카빌아실-하이드로카빌렌"은 하이드로카빌렌 그룹의 2개의 원자가부위 중 한 개에 아실 (-C(=O)-) 그룹을 통하여 결합된 하이드로카빌 그룹을 말한다.
"헤테로사이클릴하이드로카빌"과 "헤테로실릴"은 탄소원자와, 산소, 질소, 인, 황으로부터 선택된 4개 이하의 원자("헤테로원자"라 함)를 포함하는, 안정한 원자의 사이클릭 배열을 말한다. 사이클릭 배열은 3 내지 7개의 원자로 이루어진 모노사이클릭 형태이거나 8 내지 11개의 원자로 이루어진 바이사이클릭 형태이다. 환은 포화되거나 불포화(방향족 환 포함)된 것으로서, 임의로 벤조융합된다. 환내에서 질소와 황 원자는 질소의 4급화 형태를 포함하는 임의의 산화 상태로 존재한다. 헤테로사이클릴하이드로카빌은 엔도사이클릭 탄소 또는 헤테로원자에 부착되어 안정한 구조를 형성한다. 바람직한 헤테로사이클릴하이드로카빌에는 1개 또는 2개의 질소 헤테로원자를 갖는 5 내지 7원의 모노사이클릭 헤테로사이클을 포함한다.
"치환된 헤테로사이클릴하이드로카빌"이라 함은 상기에서 정의한 바와 같은 헤테로사이클릴하이드로카빌을 말하는 것으로, 여기서 적어도 하나의 환 원자가 환밖으로 신장하는 특정 치환체에 결합한다.
하이드로카빌 그룹 및 하이드로카빌렌 그룹에 있어서, "하나 이상의 수소가동수의 불소로 치환된 상기 유도체"라 함은 탄소, 수소 및 불소만을 포함하고 그 밖의 원자를 포함하지 않는 분자를 말한다.
"활성 에스테르"라 함은 친핵성 시약(예: 아민 및 알콜 또는 티올 친핵성 시약)으로 용이하게 치환되는 "이탈 그룹"을 갖는 에스테르를 말한다. 이탈 그룹에는, 이로써 제한되지는 않으나, N-하이드록시석신이미드, N-하이드록시벤조트리아졸, 할로겐(할라이드), 테트라플루오로페놀레이트를 포함하는 알콕시, 티오알콕시 등이 있다. "보호 에스테르"라 함은 마스크되었거나 비반응성 상태가 된 에스테르 그룹을 말한다[참조: Greene, "Protecting Groups In Organic Solutions"].
상기 정의를 고려하여, 본 명세서 전체에 사용되는 다른 화학적 용어는 당업자에게 쉽게 이해될 것이다. 용어는 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 바람직한 및 보다 바람직한 라디칼의 쇄 길이는 이러한 모든 조합에 적용된다.
A. 표지된 핵산 단편의 제조
상기에 언급한 바와 같이, 본 발명의 한 가지 측면은 각 레인에서 16개 이상의 태그를 사용할 수 있도록 하는, DNA 서열화의 일반적인 도식을 제공한다. 여기서, 연속적인 검출을 통하여, 종래의 형광을 기본으로 하는 서열화와 마찬가지로 태그를 검출할 수 있고, 서열은 크기 분리가 발생함에 따라 판독된다. 이와 같은 도식은 표지된 분자들의 크기 분리에 기초한 임의의 DNA 서열화 기술에도 적용된다. 본 발명에서 사용되는 적당한 태그 및 링커, 및 핵산 서열화 방법은 다음에 보다 상세히 설명하기로 한다.
1. 태그
여기서, "태그"란 "목적 분자"를 독특하게 동정하는 데 사용되는 화학적 잔기를 말하는 것으로, 보다 자세히는 임의의 태그 반응체, 태그 성분 및 태그 잔기에 있어서 가장 밀접하게 결합되는 태그 가변 성분을 말한다.
본 발명에서 유용한 태그는 몇가지 성질을 갖는다:
1) 다른 모든 태그들과 구별된다. 이와 같은 다른 화학적 잔기와의 구별은 태그(특히 절단 반응 후)의 크로마토그래피 거동, 분광 특성 또는 전위차 특성 또는 이들 모두를 기초로 한 것이다. 태그를 유용하게 구별하기 위해 사용되는 분광분석에는 질량 분광분석(MS), 적외선(IR) 분광분석, 자외선(UV) 분광분석 및 형광분광분석이 포함되고, MS, IR 및 UV가 바람직하며, MS가 가장 바람직한 분광분석법이다. 전위차계 전류측정은 바람직한 전위차법이다.
2) 태그는 10-22 내지 10-6 몰로 존재할 때 검출될 수 있다.
3) 태그는, 태그를 독특하게 동정하기 위한 MOI에 부착될 수 있는 화학적 핸들을 갖는다. 부착은 MOI에 직접적으로 또는 "링커" 그룹을 통하여 간접적으로 형성된다.
4) 태그는, 그것이 제공하는 전체의 조작(MOI로의 부착 및 절단, 및 태그가 부착되는 동안의 MOI의 임의의 조작 포함)에 대해 화학적으로 안정해야 한다.
5) 태그는 태그가 부착되는 동안의 MOI에 대하여 실시되는 조작을 크게 간섭하지 않는다. 예를 들면, 태그가 올리고뉴클레오티드에 부착되는 경우, 태그는 올리고뉴클레오티드에 대하여 수행되는 하이브리드화 또는 효소 반응(예: PCR 서열화 반응)을 크게 방해하지 않아야 한다. 마찬가지로, 태그가 항체에 부착되는 경우, 항체에 의한 항원 인식을 크게 방해하지 않아야 한다.
특정한 분광분석 또는 전위차법으로 검출하고자 하는 태그 잔기는 당해 방법에 의한 검출 감도와 특이성을 증강시키는 특성을 가져야 한다. 대표적으로, 태그 잔기는, 태그 잔기의 주요 부분을 구성하는 태그 가변 성분으로 설계되기 때문에 이러한 성질을 갖는다. 다음에서, "태그"라는 용어의 사용은 태그 잔기(즉, 태그 가변 성분을 함유하는 절단 산물)을 나타내지만, 독특하게 검출가능한 성질을 제공하는 태그 잔기의 일부가 되는 태그 가변 성분 자체를 나타내기도 한다. 화학식 T-L-X의 화합물에서, "T" 부분은 태그 가변 성분을 함유한다. 태그 가변 성분이, 예를 들면, 질량 분광분석법 등에 의해 특성화되도록 설계하는 경우, T-L-X의 "T" 부분을 Tms라고 부른다. 마찬가지로, T를 함유하는 T-L-X의 절단 산물은 Tms 함유 잔기라고 부른다. 이하의 분광 분석법과 전위차법은 Tms 함유 잔기의 특성화에 사용된다.
a. MS 태그의 특성
태그가 질량 분광분석법으로 분석가능한 경우(즉, MS 판독가능한 태그, 또한 본 명세서에서 MS 태그 또는 "Tms 함유 잔기"라고도 한다), 태그의 필수 특성은 이온화될 수 있어야 한다. 따라서, MS 판독가능한 태그의 설계에서, MS의 이온화 조건하에 양전하 또는 음전하를 포함할 수 있는 화학적 관능성을 도입하는 것이 바람직한 요소이다. 이 특징은 특히 전자분무 이온화에서 이온 형성의 효율성과 전체적인 검출 감도를 개선시킨다. 이온화된 전위를 유지하는 화학적 관능기는 Tms나 L 또는 이 2가지 모두에 기인하는 것이다. 질량 분광분석법으로 검출되는 분석물의 상대적인 감도를 증대시키는 요인은 문헌[참조: Sunner, J., et al., Anal. Chem. 60:1300-1307(1988)]에서 논의되어 있다.
음전하의 함유를 용이하게 하는 바람직한 관능기는 페놀성 하이드록실, 카복실산, 포스포네이트, 인산염, 테트라졸, 설포닐우레아, 퍼플루오로 알콜 및 설폰산 등의 유기산이다.
이온화 조건하에 양전하의 함유를 용이하게 하는 바람직한 관능기는 지방족 또는 방향족 아민이다. MS 태그의 검출을 증강시키는 아민 관능기의 예로는 4급 아민(즉, 각각 탄소원자와의 4개의 결합을 갖는 아민; 애버솔드(Aebersold)의 미국 특허 제5,240,859호 참조)와 3급 아민(즉, 각각 탄소원자와의 3개의 결합을 갖는 아민; 이것은 피리딘에 존재하는 것과 같이 C=N-C 그룹을 포함한다; Hess et al., Anal. Biochem. 224:373, 1995; Bures et al., Anal. Biochem. 224:364, 1995 참조)이 있다. 입체 장애된 3급 아민이 특히 바람직하다. 3급 아민과 4급 아민은 알킬 또는 아릴이다. Tms 함유 잔기는 하나 이상의 이온화 가능한 화학종을 포함해야 한다. 바람직한 전하 상태는 하나의 태그당 하나의 이온화된 화학종을 갖는 것이다. 따라서, Tms 함유 잔기(및 각 태그 가변 성분)는 오직 1개의 입체 장애된 아민 그룹 또는 유기산 그룹을 함유하는 것이 바람직하다.
Tms 함유 잔기의 일부를 형성하는 적당한 아민-함유 라디칼은 화학식
을 포함한다.
질량 분광분석법에 의한 태그의 동정은 분자량 대 전하비(m/z)을 기초로 한다. MS 표지의 바람직한 분자량 범위는 약 100 내지 2,000달톤이고, 바람직하게는 Tms 함유 잔기는 적어도 약 250달톤, 보다 바람직하게는 적어도 약 300달톤, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 350달톤의 질량을 갖는다. 일반적으로, 질량 분광분석법을 이용하여 약 200 내지 250달톤 이하(정밀한 장치에 따라 다르지만)의 모이온을 갖는 Tms 함유 잔기들을 구별하는 것은 곤란하기 때문에, 본 발명에서 바람직한 Tms 함유 잔기는 상기 범위를 초과하는 질량을 갖는다.
상기에서 설명한 바와 같이, Tms 함유 잔기는, 태그 가변 성분 이외에, Tms 자체에 존재하지 않는 원자들을 함유한다. 따라서, Tms 함유 잔기가 적어도 약 250달톤의 질량을 갖는 한, Tms 자체의 질량은 약 250달톤 이하일 것이다. 따라서, Tms의 질량 범위는 15(즉, 메틸 라디칼) 내지 약 10,000달톤, 바람직하게는 100 내지 약 5,000달톤, 보다 바람직하게는 약 200 내지 약 1,000달톤이다.
이러한 태그가 한 가지 이상의 동위원소를 유의적인 양으로 포함하는 원자를 도입하는 경우, 태그를 질량 분광분석법으로 구별하는 것은 곤란하다. 따라서, 질량 분광분석용으로 의도되는 바람직한 T 그룹(Tms 그룹)은 탄소; 수소와 불소 중의 하나 이상; 및 산소, 질소, 황, 인 및 요오드로부터 선택된 임의의 원자를 포함한다. 다른 원자도 Tms에 존재할 수 있지만, 이의 존재는 질량 스펙트럼 데이터의 분석을 보다 어렵게 할 수 있다. Tms 그룹는 수소 및/또는 불소원자 이외에 탄소, 질소 및 산소 원자만을 갖는 것이 바람직하다.
불소는 Tms 그룹에 존재하는 바람직한 임의의 원자이다. 수소에 비하여, 불소는 훨씬 무겁다. 따라서, 불소원자의 존재는 수소원자보다 높은 Tms 그룹의 질량을 도입시킬 수 있으므로 Tms 그룹은 상기 설명한 바와 같이 바람직하지 않은 250달톤의 질량에 도달하고 이를 초과할 수 있다. 또한, 수소를 불소로 치환하면, Tms 함유 잔기에 휘발성이 높아지고, 분석물의 휘발성이 증가하여 질량 분광분석법이 검출 방법으로 사용되는 경우 감도를 증강시킨다.
Tms의 분자식은 C1-500N0-100O0-100S0-10P0-10HαFβIδ인데, 여기서, α, β 및 δ의 합은 C, N, O, S 및 P 원자의 채워지지 않은 원자가를 만족시키기에 충분한 값을 갖는다. 표지 분자식 C1-500N0-100O0-100S0-10P0-10HαFβIδ은 Tms가 적어도 1개를 함유하면서, 1개 내지 500개의 탄소원자를 함유할 수 있으며, 또한 임의로 100개 이하의 질소원자("N0-"은 Tms가 질소원자를 1개도 함유할 필요가 없음을 의미한다) 및 100개의 산소원자, 10개 이하의 황 원자와 10개 이하의 인 원자를 함유할 수 있음을 의미한다. 부호 α, β 및 δ는 Tms에서 각각 수소, 불소 및 요오드 원자의 수를 나타내고, 이들 수 중에서 임의의 2개는 영이 될 수 있고, 이들 수의 합은 채워지지 않은 C, N, O, S 및 P 원자의 원자가가 총합과 같다. Tms는 C1-50N0-10O0-10HαFβ(여기서, α와 β의 합은 Tms 함유 잔기에 존재하는 수소와 불소 원자의 총수와 같다)인 분자식을 갖는 것이 바람직하다.
b. IR 태그의 특성
유기 화학 그룹의 IR 검출에는 라만 산란 IR과 흡수 IR의 2가지 형태가 있다. 라만 산란 IR 스펙트럼과 흡수 IR 스펙트럼을 상보적인 분광학적 방법이다. 일반적으로, 라만 여기는 결합 극성의 변화에 의존하는 데에 반하여, IR흡수는 쌍극자 모멘트의 변화에 의존한다. 약한 IR 흡수선은 강한 라만선이 되고, 그 역도성립한다. 파장수는 IR 스펙트럼의 특징적인 단위이다. IR 태그에는 별개의 적용을 갖는 3가지 스펙트럼 영역이 있다: l2500 내지 400cm-1에서 근 IR 영역, 4000 내지 600cm-1에서 중간 IR 영역, 600 내지 30cm-1에서 원 IR 영역. 화합물이 MOI,프로브 또는 프라이머를 동정하기 위한 태그로서 기능하는, 본 명세서에 기재되어 있는 사용되는 영역으로는 중간 스펙트럼 영역이 바람직하다. 예를 들면, 카보닐스트레치(1850 내지 l750cm-1)는 카복실 그룹, 카복실 에스테르 및 아미드, 및 알킬및 아릴 카보네이트, 카바메이트 및 케톤에서 측정된다. N-H 변각(1750 내지 l60cm-1)은 아민, 암모늄 이온 및 아미드를 동정하는 데에 이용된다. 1400 내지 l250cm-1에서는 아미드에서 C-N 스트레치 뿐만 아니라 R-OH 변각도 검출된다. 방향족 치환 패턴은 900 내지 690cm-1(ArNH2의 C-H 변각, N-H 변각)에서 검출된다. 포화 C-H, 올레핀, 방향족 환, 이중결합, 삼중결합, 에스테르, 아세탈, 케탈, 암모늄염; 옥심, 니트로, N-옥사이드 및 질산과 같은 N-0 화합물; 아조, 하이드라존, 퀴논, 카복실산, 아미드, 락탐은 모두 진동 적외선 상관 데이터를 나타낸다[참조: Pretsch et al., Spectral Data for Structure Determination of Organic Compounds, Springer-Verlag, New York, 1989]. 바람직한 화합물은 2230 내지 2210cm-l에서 매우 강한 니트릴 스트레칭 진동을 나타내는 방향족 니트릴을 포함한다. 다른 종류의 유용한 화합물은, 2140cm-1와 2100cm-1 사이에서 날카로운 흡수 밴드를 발생하는 강한 스트레칭 진동을 갖는 방향족 알킨이다. 세 번째 유형의 화합물은 2160 내지 2120cm-1 영역에서 강한 흡수 밴드를 나타내는 방향족 아지드이다.티오시아네이트는 2275 내지 2263cm-1에서 강한 흡수를 나타내는 대표적인 화합물이다.
c. UV 태그의 특성
유기 발색단의 종류와 각각의 UV 가시 성질이 문헌[참조: Scott(Interpretation of the UV Spectra of Natural Products, Permagon Press, New Yrok, 1962]에 제시되어 있다. 발색단은 특정한 광을 흡수하는 원자 또는 원자단 또는 전자단이다. 공액계에서 π→π * 극대값에는 경험칙이 존재한다[참조: Pretsch et al., Spectral Data for Structure Determination of Organic Compounds, p. B65 and B70, Springer-Verlag, New York, 1989]. 바람직한 화합물(공액계를 갖는)은 n→π * 및 π→π*의 전이를 한다. 이와 같은 화합물은, 예를 들면, 엑시드 바이올렛 7, 아크리딘 오렌지, 아크리딘 옐로우 G, 밝은 블루 G, 콩고 레드, 크리스탈 바이올렛, 말라키트 그린 옥살레이트, 메타닐 옐로우, 메틸렌 블루, 메틸렌 오렌지, 메틸 바이올렛 B, 나플로 그린 B, 오일 블루 N, 오일 레드 0, 4-페닐아조페놀, 샤프라니 0, 솔벤트 그린 3 및 수단 오렌지 G가 있으며, 이들 화합물 모두는 시판되고 있다(Aldrich, Milwaukee, WI). 다른 적당한 화합물은 문헌[참조. Jane, I., et al., J. Chrom. 323:191-225(1985)]에 기재되어 있다.
d. 형광 태그의 특성
형광 프로브는 흡수 및 형광 방출 파장과 강도로부터 대부분 직접 동정하고 정량할 수 있다. 방출 스펙트럼(형광 및 인광)은 흡수 스펙트럼보다 훨씬 감도가 높고 특이적인 특정을 가능케 한다. 여기 상태 수명 및 형광 이방성과 같은 다른 광물리적 특성은 덜 광범위하게 사용된다. 가장 일반적으로 이용되는 강도 파라미터는 흡수시 몰 흡광 계수(ε)와 형광시 양자 수량(QY)이다. ε값은 단일 파장(통상 프로브의 극대 흡수 파장)에서 명시되는 반면에, QY는 전체 형광 스펙트럼 프로파일에 대한 광자 방출 총량을 측정한 값이다. 좁은 최적 밴드 폭(<20nm)이 통상형광 여기(흡수를 통한)에 이용되지만, 형광 검출 밴드 폭은 보다 가변적이고, 최대 감소의 완전 스펙트럼으로부터 최대 해상도의 좁은 밴드(∼20nm)에 이른다. 프로브 분자당 형광 강도는 ε와 QY 곱에 비례한다. 현재 실용적인 측면에서 중요한 형광단 가운데 이들 파라미터의 범위는 ε가 대략 10,000 내지 100,000cm-1M-1이고 QY가 0.1 내지 1.0이다. 형광 태그로 사용가능한 화합물은 다음과 같다: 플루오레세인, 로다민, 람다 블루 470, 람다 그린, 람다 레드 664, 람다 레드 665, 아크리딘 오렌지, 요오드화 프로피듐. 이들 화합물은 모두 펜실베니아주 플레전트 갭소재의 람다 플루오레센스 캄파니(Lambda Fluorescence Co.)로부터 시판되고 있다. 나일 레드, 텍사스 레드, 리사마인TM, BODIPYTM과 같은 형광 화합물은 오레곤주 유진소재의 몰큘라 프로브[Molecular Probes]에서 시판되고 있다.
e. 전위차 태그의 특성
전기화학 검출(ECD) 원리는, 특정의 전압을 인가한 전위에 있어서 전자를 공여하거나 수용하여 측정가능한 전류를 생산하는 화합물의 산화 또는 환원을 기본으로 한다. 특정한 화합물이 전위차에 제공된 경우, 분자는 작용 공간의 표면에서 전자의 상실(산화) 또는 수득(환원)에 의해 분자 재배열을 한다. 이와 같은 화합물을 전기적이라 하고, 전기화학 반응을 한다. EC 검출기는, 그 위에 HPLC 용출액이 흐르는 전극 표면에 전압을 가한다. 칼럼으로부터 용출되는 전기 활성 화합물은 전자를 공여(산화)하거나 수득(환원)하여 즉시 전류 피크를 발생시킨다. 중요한 것은, 발생 전류량이 분석물의 농도와 인가 전압 모두에 의존하고, 각 화합물은 산화 또는 환원이 시작되는 특정한 전압을 갖는다는 사실이다. 현재 가장 많이 이용되고 있는 전기화학 검출기는, 전위를 일정하게 유지한 다음에 전기화학 반응으로부터 생성된 전류를 측정하는 전류 측정 검출기이다. 이와 같은 종류의 분광 분석법을 "정전위 전류측정"이라고 한다. 시판되는 전류 측정기는 매사추세츠 켈름포드 소재의 이에스에이, 인코포레이티드(ESA, Inc.)에서 입수할 수 있다.
검출 효율이 100%인 특수화된 검출기는 "전량적"이라 한다. 전량 검출기는 고감도이고, 선택성과 감도에 있어서 많은 장점을 가지므로, 이러한 종류의 검출기는 어레이에 유용하다. 전량 검출기에 있어서, 분석물의 소정 농도에서 시그날 전류는 작용 전극에 인가한 전위(전압)의 함수로서 플롯팅된다. 그 결과로 수득되는 S자형 그래프는 전류-전압 곡선 또는 유체역학적 전압전류곡선(HDV)이라고 한다. HDV는, 활성 전극에 인가한 전위의 최량의 선택을 가능하게 하고, 이것은 관찰되는 시그날을 최대화시킬 수 있다. ECD의 주요 장점은 팸토몰 이하에서 전류 검출 수준을 갖는 이의 고유한 감도이다.
많은 생화학약품, 약제, 살충제를 포함하여 다양한 화학물질 및 화합물이 전기화학적으로 활성을 갖는다. 크로마토그래피에서 공용출되는 화합물은 반파 전위(최대 시그날 값의 절반인 전위)가 30 내지 60mV로 상이한 경우에도 효과적으로 해석할 수 있다.
최근 개발된 전량 센서는 액체 크로마토그래피에 기초한 분리에서 검출기로사용하는 경우 공용출되는 화합물의 선택성, 동정 및 해석을 제공한다. 따라서, 이들 정렬 검출기는 자체에서 달성된 다른 세트의 분리를 추가시킬 수 있다. 현재의 계기는, 원칙적으로 데이터를 수득하는 속도에 의해서만 제한되는 16개의 채널을 갖는다. EC 어레이로 해석할 수 있는 화합물의 수는 크로마토그래피에 의해 제한된다(즉, 제한된 총 플레이트 수). 그러나, 크로마토그래피에서 공용출되는 2가지 이상의 화합물이 반파 전위에서 30 내지 60mV의 상위를 갖는 경우, 어레이는 화합물을 구별할 수 있다. 전기화학적 활성이 있는 화합물의 능력은 EC 활성 그룹(즉, -OH, -0, -N, -S)의 유무에 따른다.
전량 검출기를 이용하여 검출되는 화합물에는 5-하이드록시트립타민, 3-메톡시-4-하이드록시페닐-글리콜, 헤모겐티딘산, 도파민, 메탄프린, 3-하이드록시키누레닌, 아세토미노펜, 3-하이드록시트립토플, 5-하이드록시인돌 아세테이트, 옥탄설폰산, 페놀, o-크레졸, 피로개롤, 2-니트로페놀, 4-니트로페놀, 2,4-디니트로페놀, 4,6-디니트로크레졸, 3-메틸-2-니트로페놀, 2,4-디클로로페놀, 2,4-디니트로페놀, 4,6-디니트로크레졸, 3-메틸-니트로페놀, 2,4-디클로로페놀, 2,6-디클로로페놀, 2,4,5-트리클로로페놀, 4-클로로-3-메틸페닐, 5-메틸페닐, 4-메틸-2-니트로페놀, 2-하이드록시아닐린, 4-하이드록시아닐린, 1,2-페닐렌디아민, 벤조카테킨, 부투론,클로톨루론, 디우론, 이소프로투론, 리뉴론, 메토브로무론, 메톡수론, 모노리뉴론,모뉴론, 메티오닌, 트립토판, 티로신, 4-아미노벤조산, 4-하이드록시벤조산, 4-하이드록시쿠말린산, 7-메톡시쿠마린, 아피게닌 바이칼레인, 카페인산, 카테킨, 센타우레인, 클로로겐산, 다이드제인, 다티스세틴, 디오스메틴, 에피카테킨 겔레이트,에피겔로 카테킨, 에피켈로 카테킨 겔레이트, 유게놀, 유파토린, 페룰린산, 피세틴, 갈란긴, 몰식자산, 가데닌, 제니스테인, 겐티신산, 헤스페리딘, 이리게닌, 캠페롤, 류코야니딘, 루테올린, 망고스틴, 모린, 미리세틴, 나린긴, 나리루틴, 펠라르곤딘, 페오니딘, 플로레틴, 프라텐세인, 프로토카테킨산, 람네틴, 퀘르세틴, 사쿠라네틴, 스큐텔라레인, 스코폴레틴, 낙산알데히드, 낙산, 탕게리틴, 트로세루틴, 움벨리페론, 바닐산, 1,3-디메틸 테트라하이드로이소퀴놀린, 6-하이드록시도파민, r-살솔리놀, N-메틸-r-살솔리놀, 테트라하이드로이소퀴놀린, 아미트립틸린, 아포몰핀, 캡사이신, 클로디아제폭사이드, 클로프로마진, 다우노루비신, 데시프라민, 도세핀, 플루오세틴, 프룰라제팜, 이미프라민, 이소프로테레놀, 메톡사민, 몰핀, 몰핀-3-글루쿠로나이드, 노르트립틸린, 옥사제팜, 페닐에프린, 트리미프라민, 아스코르빈산, N-아세틸 세로토닌, 3,4-디하이드록시벤질아민, 3,4-디하이드록시만델산(DOMA), 3,4-디하이드록시페닐아세트산(DOPAC), 3,4-디하이드록시페닐알라닌(L-DOPA), 3,4-디하이드록시페닐글리콜(DHPG), 3-하이드록시안트라닐산, 2-하이드록시페닐아세트산(2HPAC), 4-하이드록시벤조산(4HBAC), 5-하이드록시인돌-3-아세트산(5HIAA), 3-하이드록시키누레닌, 3-하이드록시만델산, 3-하이드록시-4-메톡시페닐에틸아민, 4-하이드록시페닐아세트산(4HPAC), 4-하이드록시페닐락트산(4HPLA), 5-하이드록시트립토판(5HTP), 5-하이드록시트립토폴(5HTOL), 5-하이드록시트립타민(5HT), 5-하이드록시트립타민 설페이트, 3-메톡시-4-하이드록시페닐글리콜(MHPG), 5-메톡시트립타민, 5-메톡시트립토판, 5-메톡시트립토폴, 3-메톡시티라민(3MT), 3-메톡시티로신(3-OM-DOPA), 5-메틸시스테인, 3-메틸구아닌, 부포테닌, 도파민, 도파민-3-글루쿠로나이드, 도파민-3-설페이트, 도파민-4-설페이트, 에피네프린, 에피닌, 엽산, 글루타티온(환원), 구아닌, 구아노신, 헤모겐티신산(HGA), 호모발린산(HVA), 호모바닐릴 알콜(HVOL), 호모베라틴산, hva 설페이트, 히포크산틴, 인돌, 인돌-3-아세트산, 인돌-3-락트산, 키누레닌, 멜라토닌, 메탄프린, N-메틸트립타민, N-메틸티라민, N,N-디메틸트립타민, N,N-디메틸티라민, 노르에피네프린, 노르메타네프린, 옥토파민, 피리독살, 피리독살 포스페이트, 피리독사민, 시네프린, 트립토폴, 트립타민, 티라민, 요산, 바닐릴만델산(vma), 크산틴 및 크산토신이 있다. 기타 적당한 화합물은 문헌[참조: Jane, I., et al. J. Chrom. 323:191-225(1985)와 Musch, G., et al., J. Chrom. 348:97-110(1985)]에 기재되어 있다. 이들 화합물은 당해 분야에 공지된 방법으로 화학식 T-L-X의 화합물에 도입된다. 예를 들면,카복실산 그룹을 갖는 화합물은 아민, 하이드록실 등과 반응시켜 T와 L 사이에 아미드, 에스테르 및 다른 결합을 형성시킨다.
상기 성질과 더불어, 및 의도된 검출 방법과 무관하게, 태그는 모듈러 화학구조를 갖는 것이 바람직하다. 이는 조합 화학 기술을 이용하는 다수의 구조적으로 연관된 표지의 구성을 보조할 수 있다. 예를 들면, Tms 그룹은 여러 가지 성질을 갖는다. 그 중의 하나는, Tms 함유 잔기가 질량 분광분석에 제공된 경우에 단일이온화 전하 상태를 유지하는 관능기(간단히 "질량 분광 감도 증강" 그룹 또는 MSSE라 한다)를 포함하는 것이 바람직하다. 또한, Tms 함유 잔기 계열에서 하나의 구성원으로 작용하는 것이 바람직하고, 계열의 구성원은 상이한 질량/전하 비를 가지지만 질량 분광분석기에서 모두 동일한 감도를 갖는다. 따라서, Tms 함유 잔기 계열의 구성원은 동일한 MSSE를 갖는 것이 바람직하다. 화합물계를 제조하기 위해서는 모듈러 합성 방법을 통하여 태그 반응부를 생성시키는 것이 편리한 것으로 밝혀졌으며, 그 결과 태그 성분 자신은 모듈을 함유하는 것으로 관찰될 수 있다.
Tms 그룹의 구조에 대한 바람직한 모듈식 방법에서, Tms는 화학식 T2-(J-T3)n-(여기서, T2는 탄소와 하나 이상의 수소, 불소, 요오드, 산소, 질소, 황 및 인으로부터 형성되고 질량이 15 내지 500달톤인 유기 잔기이고, T3는 탄소와 하나 이상의 수소, 불소, 요오드, 산소, 질소, 황 및 인으로부터 형성되고 질량이 50내지 1000달톤인 유기 잔기이며, J는 직접 결합이거나, 아미드, 에스테르, 아민, 설파이드, 에테르, 티오에스테르, 디설파이드, 티오에테르, 우레아, 티오우레아, 카바메이트, 티오카바메이트, 쉬프 염기, 환원형 쉬프 염기, 이민, 옥심, 하이드라존, 포스메이트, 포스포네이트, 포스포르아미드, 포스폰아미드, 설포네이트, 설폰아미드 또는 탄소-탄소 결합과 같은 관능기이고, n은 1 내지 50의 정수이고, n이 1보다 큰 경우, T3와 J는 각각 독립적으로 선택된다)을 갖는다.
분자식 T2-(J-T3)n-은 T-L-X 화합물 계열의 편리한 입구를 제공한다. 여기서, 화합물 계열의 각 구성원은 서로 상이한 T 그룹을 갖는다. 예를 들면, T가 Tms이고 각각의 계열 구성원이 동일한 MSSE를 갖는 경우, T3 그룹 중의 하나는 MSSE 구조를 제공한다. Tms의 질량에 관하여 계열의 구성원들간의 변동성을 제공하기 위하여, T2 그룹은 계열 구성원들마다 변동시킬 수 있다. 예를 들어, 하나의 구성원은T2가 메틸이고, 다른 구성원은 T2가 에틸이고, 또다른 구성원은 T2가 프로필 등일 수 있다.
질량에서 "전체(gross)" 비약 또는 큰 비약을 제공하기 위하여, T3 그룹은 화학식 T-L-X에 유의적인(예: 백배 또는 수백배의) 질량 단위를 부가하도록 설계할 수 있다. 이와 같은 T3 그룹은 분자량 범위 조정 그룹("WRA)"이라고 한다. WRA는 한계 범위 이상의 질량을 갖는 한 세트의 T2 그룹과 함께 작용하는 경우 매우 유용하다. 한 세트의 T2 그룹은 하나 이상의 WRA T3 그룹을 Tms에 간단히 혼입시킴으로써 넓은 질량 범위를 갖는 Tms 그룹을 제조하기 위해 이용된다. 따라서, 단순한 예를 사용하면, 한 세트의 T2 그룹이 Tms에 250 내지 340달톤 범위의 질량을 제공하는 경우, 예시적인 수인 100달톤을 T3 그룹으로서 갖는 단일 WRA의 첨가는 동일한 세트의 T2 그룹을 사용하면서 350내지 440달톤의 질량으로의 접근을 제공한다. 마찬가지로, 2개의 100달톤 MWA 그룹(각각 T3 그룹으로서)의 첨가는 450 내지 540달톤의 질량으로의 접근을 제공할 수 있고, WRA 그룹의 부가적인 첨가는 계속하여 Tms 그룹의 질량을 매우 크게 증가시킬 수 있다. 화학식 T2-(J-T3-)n-L-X의 바람직한 화합물은 화학식 Rvwc-(RWRA)w-RMSSE-L-X(여기서, VWC는 "T2" 그룹이고, WRA 및 MSSE 그룹은 각각 "T3" 그룹이다)로 나타낼 수 있다. 이 구조는 도 12에 도시되어 있으며, Tms를 제조하기 위한 모듈러 방법을 나타낸다.
화학식 T2-(J-T3)n-에서, T2 및 T3는 하이드로카빌; 하이드로카빌-0-하이드로카빌렌; 하이드로카빌-S-하이드로카빌렌; 하이드로카빌-NH-하이드로카빌렌: 하이드로카빌-아미드-하이드로카빌렌; N-(하이드로카빌)하이드로카빌렌; N,N-디(하이드로카빌)하이드로카빌렌; 하이드로카빌아실-하이드로카빌렌; 헤테로원자(들)이 산소,질소, 황 및 인으로부터 선택된 헤테로사이클릴하이드로카빌, 헤테로원자(들)이 산소, 질소, 황 및 인으로부터 선택되고 치환체가 하이드로카빌, 하이드로카빌-0-하이드로카빌렌, 하이드로카빌-NH-하이드로카빌렌, 하이드로카빌-S-하이드로카빌렌, N-(하이드로카빌)하이드로카빌렌, N,N-디(하이드로카빌)하이드로카빌렌 및 하이드로카빌아실-하이드로카빌렌인 치환된 헤테로사이클릴하이드로카빌이다. 또한, T2 및/또는 T3는 하나 이상의 수소가 불소로 치환되는, 앞서 설명한 임의의 잠재적 T2/T3 그룹의 유도체일 수 있다.
또한, 화학식 T2-(J-T3)n-에서, T3는 화학식 -G(R2)-(여기서, G는 하나의 R2 치환기를 갖는 C1-6 알킬렌 쇄이다)를 갖는 것이 바람직하다. 따라서, G가 에틸렌(-CH2-CH2-)인 경우, 1개 또는 2개의 에틸렌 탄소는 R2 치환체를 가지고, R2는 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 아릴-융합 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 아릴, 아르알킬, 아릴-치환 알케닐 또는 알키닐, 사이클로알킬-치환 알킬, 사이클로알케닐-치환 사이클로알킬, 바이아릴, 알콕시, 알케녹시, 알키녹시, 아르알콕시, 아릴-치환 알케녹시 또는 알키녹시, 알킬아미노, 알케닐아미노 또는 알키닐아미노, 아릴-치환 알킬아미노, 아릴-치환 알케닐아미노 또는 알키닐아미노, 아릴옥시, 아릴아미노, N-알킬우레아-치환 알킬, N-아릴우레아-치환 알킬, 알킬카보닐아미노-치환 알킬, 아미노카보닐-치환 알킬, 혜테로사이클릴, 헤테로사이클릴-치환 알킬, 헤테로사이클릴-치환 아미노, 카복시알킬 치환 아르알킬, 옥소카보사이클릴-융합 아릴및 헤테로사이클릴알킬; 사이클로알케닐, 아릴-치환 알킬 및, 아르알킬, 하이드록시-치환 알킬, 알콕시-치환 알킬, 아르알콕시-치환 알킬, 알콕시-치환 알킬, 아르알콕시-치환 알킬, 아미노-치환 알킬, (아릴-치환 알킬옥시카보닐아미노)-치환 알킬, 티올-치환 알킬, 알킬설포닐-치환 알킬, (하이드록시-치환 알킬티오)-치환 알킬, 티오알콕시-치환 알킬, 하이드로카빌아실아미노-치환 알킬, 헤테로사이클릴아실아미노-치환 알킬, 하이드로카빌-치환-헤테로사이클릴아실아미노-치환 알킬, 알킬설포닐아미노-치환 알킬, 아릴설포닐아미노-치환 알킬, 모르폴리노-알킬, 티오모르폴리노-알킬, 모르폴리노 카보닐-치환 알킬, 티오모르폴리노카보닐-치환 알킬, [N-(알킬, 알케닐 또는 알키닐)- 또는 N,N-[디알킬, 디알케닐, 디알키닐 또는 (알킬, 알케닐)-아미노]카보닐-치환 알킬, 헤테로사이클릴아미노카보닐, 헤테로사이클릴알킬렌아미노카보닐, 헤테로사이클릴아미노카보닐-치환 알킬, 헤테로사이클릴알킬렌아미노카보닐-치환 알킬, N,N-[디알킬]알킬렌아미노카보닐, N,N-[디알킬]알킬렌아미노카보닐-치환 알킬, 알킬-치환 헤테로사이클릴카보닐, 알킬-치환 헤테로사이클릴카보닐-알킬, 카복실-치환 알킬, 디알킬아미노-치환 아실아미노알킬, 및 아르기닌, 아스파라긴, 글루타민, S-메틸 시스테인, 메티오닌 및 이들의 상응하는 설폭사이드 및 설폰 유도체, 글리신, 로이신, 이소로이신, 알로-이소로이신, t-로이신, 노르로이신, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 프롤린, 알라닌, 오르니틴, 히스티딘, 글루타민, 발린, 트레오닌, 세린, 아스파르트산, 베타-시아노알라닌, 및 알로트레오닌으로부터 선택된 아미노산 측쇄; 알리닐과 헤테로사이클릴카보닐, 아미노카보닐, 아미도, 모노- 또는 디알킬아미노카보닐, 모노 또는 디아릴아미노카보닐, 알킬아릴아미노카보닐, 디아릴아미노카보닐, 모노 또는 디아실아미노카보닐, 방향족 또는 지방족 아실, 및 아미노, 카복시, 하이드록시, 머캅토, 모노- 또는 디알킬아미노, 모노- 또는 디아릴아미노, 알킬아릴아미노, 디아릴아미노, 모노- 또는디아실아미노, 알콕시, 알케녹시, 아릴옥시, 티오알콕시, 티오알케녹시, 티오알키녹시, 티오아릴옥시 및 헤테로사이클릴로부터 선택된 치환체로 선택적으로 치환된알킬로부터 선택된다.
바람직한 화학식 T2-(J-T3-)n-L-X의 화합물은 화학식 5의 화합물이다.
[화학식 5]
위의 화학식 5에서,
G는 (CH2)1-6(여기서, "G"로 나타내는 하나의 CH2 그룹 또는 CH2 그룹 중의 하나의 그룹에서의 수소는 -(CH2)c-아미드-T4로 대체된다)이고,
T2 및 T4는 화학식 Cl-25N0-9Oo-9HαFβ의 유기 잔기(여기서, α와 β의 합은 C, N 및 0원자의 채워지지 않은 원자가를 만족시키기에 충분한 값이다)이고,
아미드는 화학식 이고,
R1은 수소 또는 Cl-10의 알킬이고,
c는 0 내지 4의 정수이고,
n은 1 내지 50의 정수이고, n이 1보다 큰 경우 G, c, 아미드, R1 및 T4는 서로 독립적으로 선택된다.
다른 바람직한 실시양태에서, 화학식 T2-(J-T3-)n-L-X의 화합물은 화학식 6의화합물이다.
[화학식 6]
위의 화학식 6에서,
T5는 화학식 C1-25N0-9O0-9HαFβ의 유기 잔기(여기서, α와 β의 합은 C, N 및 O 원자의 채워지지 않은 원자가를 만족시키기에 충분한 값이다)이고,
T5는 3급 또는 4급 아민 또는 유기산을 포함하고,
m은 0 내지 49의 정수이고,
T2, T4, R1, L 및 X는 위에서 정의한 바와 같다.
또다른 바람직한 실시양태에서, 화학식 T2-(J-T3-)n-L-X의 화합물은 화학식 7의 화합물이다.
[화학식 7]
위의 화학식 7에서,
T5는 화학식 C1-25N0-9O0-9HαFβ의 유기 잔기(여기서, α와 β의 합은 C, N 및 0원자의 채워지지 않은 원자가를 만족시키기에 충분한 값이다)이고,
T5는 3급 또는 4급 아민 또는 유기산을 포함하고,
m은 0 내지 49의 정수이고, T2, T4, c, R1, "아미드", L 및 X는 위에서 정의한 바와 같다.
T5 그룹을 갖는 화학식에서, -아미드-T5는 화학식
중의 하나인 것이 바람직하고, 이것은 유기산을 "G"로부터 신장시키는 유리 아미노그룹과 반응시켜 편리하게 제조한다.
상기 화합물이 T5 그룹을 갖고 "G"그룹이 유리 카복실 그룹(또는 이의 반응성 등가체)인 경우, -아미드-T5 그룹은 화학식
의 물질이 바람직하고, 이는 적당한 유기 아민을 "G"그룹으로부터 신장시키는 유리카복실 그룹과 반응시켜 편리하게 제조한다.
본 발명의 제3 실시양태에서, 화학식 T-L-MOI는 화학식
또는
[여기서, T2와 T4는 화학식 Cl-25N0-9O0-9S0-3HαFβIδ의 유기 잔기(여기서, α, β 및 δ의 합은 C, N, O, S 및 P 원자의 채워지지 않은 원자가를 만족시키기에 충분한 값이다)이고, G는 (CH2)1-6(여기서, 하나의 CH2 그룹 또는 CH2 그룹 중의 하나의 CH2 그룹에서의 수소는 -(CH2)c-아미드-T4로 대체된다)이고, 아미드는 화학식
이고,
R1은 수소 또는 Cl-10의 알킬이고, c는 0 내지 4의 정수이고, "C2-C10"은 2개 내지 10개의 탄소원자를 갖는 하이드로카빌렌 그룹을 나타내고, "ODN-3'-OH"는 말단의 3' 하이드록실 그룹을 갖는 핵산 단편(즉, 핵산 단편의 3' 말단 이외에 있어서 (C1-C10)에 결합된 핵산 단편)이고, n은 1 내지 50의 정수이고, n이 1보다 큰 경우 G, c, 아미드, R1, T4는 각각 독립적으로 선택되며, 단일 탄소원자에 3개의 헤테로원자가 결합되지 않는 것이 바람직하다]의 구조이다.
위에서 기재된 화학식 T2-C(=0)-N(R1)-그룹을 함유하는 화학식에서, 당해 그룹은 HN(R1)-의 아민을 다음 중에서 선택되는 유기산(이는 단순히 예시적인 것이며,잠재적인 유기산의 모든 목록을 구성하는 것은 아니다)과 반응시켜 형성된다: 포름산, 아세트산, 프로피올산, 프로피온산, 플루오로아세트산, 2-부틴산, 사이클로프로판카복실산, 부티르산, 메톡시아세트산, 디플루오로아세트산, 4-펜틴산, 사이클로부탄카복실산, 3,3-디메틸아크릴산, 발레르산, N,N-디메틸글리신, N-포밀-Gly-OH, 에톡시아세트산, (메틸티오)아세트산, 피롤-2-카복실산, 3-푸로산, 이소옥사졸-5-카복실산, 트랜스-3-헥센산, 트리플루오로아세트산, 헥산산, Ac-Gly-OH, 2-하이드록시-2-메틸부티르산, 벤조산, 니코틴산, 2-피라진카복실산, 1-메틸-2-피롤카복실산, 2-사이클로펜텐-1-아세트산, 사이클로펜틸아세트산, (S)-(-)-2-피롤리돈-5-카복실산, N-메틸-L-프롤린, 헵탄산, Ac-b-Ala-OH, 2-에틸-2-하이드록시부티르산, 2-(2-메톡시에톡시)아세트산, p-톨루산, 6-메틸니코틴산, 5-메틸-2-피라진카복실산, 2,5-디메틸피롤-3-카복실산, 4-플루오로벤조산, 3,5-디메틸이소옥사졸-4-카복실산, 3-사이클로펜틸프로피온산, 옥탄산, N,N-디메틸석신남산, 페닐프로피올산, 신남산, 4-에틸벤조산, p-아니스산, 1,2,5-트리메틸피롤-3-카복실산, 3-플루오로-4-메틸벤조산, Ac-DL-프로파길글리신, 3-(트리플루오로메틸)부티르산, 1-피페리딘프로피온산, N-아세틸프롤린, 3,5-디플루오로벤조산, Ac-L-Val-OH, 인돌-2-카복실산, 2-벤조푸란카복실산, 벤조트리아졸-5-카복실산, 4-n-프로필벤조산, 3-디메틸아미노벤조산, 4-에톡시벤조산, 4-(메틸티오)벤조산, N-(2-푸로일)글리신, 2-(메틸티오)니코틴산, 3-플루오로-4-메톡시벤조산, Tfa-Gly-OH, 2-나프트산, 퀴날드산, Ac-L-Ile-OH, 3-메틸인덴-2-카복실산, 2-퀴녹살린카복실산, 1-메틸인돌-2-카복실산, 2,3,6-트리플루오로벤조산, N-포밀-L-Met-OH, 2-[2-(2-메톡시에톡시)에톡시]아세트산, 4-n-부틸벤조산, N-벤조일글리신, 5-플루오로인돌-2-카복실산, 4-n-프로폭시벤조산, 4-아세틸-3,5-피롤카복실산, 3,5-디메톡시벤조산, 2,6-디메톡시니코틴산, 사이클로헥산펜탄산, 2-나프틸아세트산, 4-(1H-피롤-1-일)벤조산, 인돌-3-프로피온산, m-트리플루오로메틸벤조산, 5-메톡시인돌-2-카복실산, 4-펜틸벤조산, Bz-b-Ala-OH, 4-디에틸아미노벤조산, 4-n-부톡시벤조산, 3-메틸-5-CF3-이소옥사졸-4-카복실산, (3,4-디메톡시페닐)아세트산, 4-비페닐카복실산, 피발로일-Pro-OH, 옥타노일-Gly-OH, (2-나프톡시)아세트산, 인돌-3-부티르산, 4-(트리플루오로메틸)페닐아세트산, 5-메톡시인돌-3-아세트산, 4-(트리플루오로메톡시)벤조산, Ac-L-Phe-OH, 4-펜틸옥시벤조산, Z-Gly-OH, 4-카복시-N-(푸르-2-일메틸)피롤리딘-2-온, 3,4-디에톡시벤조산, 2,4-디메틸-5-CO2Et-피롤-3-카복실산, N-(2-플루오로페닐)석신남산, 3,4,5-트리메톡시벤조산, N-페닐안트라닐산, 3-페녹시벤조산, 노나노일-Gly-OH, 2-페녹시피리딘-3-카복실산, 2,5-디메틸-1-페닐피롤-3-카복실산, 트랜스-4-(트리플루오로메틸)신남산, (5-메틸-2-페닐옥사졸-4-일)아세트산, 4-(2-사이클로헥세닐옥시)벤조산, 5-메톡시-2-메틸인돌-3-아세트산, 트랜스-4-코티닌카복실산, Bz-5-아미노발레르산, 4-헥실옥시벤조산, N-(3-메톡시페닐)석신남산, Z-Sar-OH, 4-(3,4-디메톡시페닐)부티르산, Ac-o-플루오로-DL-Phe-OH, N-(4-플루오로페닐)글루타람산, 4'-에틸-4-비페닐카복실산, 1,2,3,4-테트라하이드로아크리딘카복실산, 3-페녹시페닐아세트산, N-(2,4-디플루오로페닐)석신남산, N-데카노일-Gly-OH, (+)-6-메톡시-a-메틸-2-나프탈렌아세트산, 3-(트리플루오로메톡시)신남산, N-포밀-DL-Trp-OH, (R)-(+)-a-메톡시-a-(트리플루오로메틸)페닐아세트산, Bz-DL-Leu-OH, 4-(트리플루오로메톡시)페녹시아세트산, 4-헵틸옥시벤조산, 2,3,4-트리메톡시신남산, 2,6-디메톡시벤조일-Gly-OH, 3-(3,4,5-트리메톡시페닐)프로피온산, 2,3,4,5,6-펜타플루오로페녹시아세트산, N-(2,4-디플루오로페닐)글루타람산, N-운데카노일-Gly-OH, 2-(4-플루오로벤조일)벤조산, 5-트리플루오로메톡시인돌-2-카복실산, N-(2,4-디플루오로페닐)디글리콜람산, Ac-L-Trp-OH, Tfa-L-페닐글리신-OH, 3-요오도벤조산, 3-(4-n-펜틸벤조일)프로피온산, 2-페닐-4-퀴놀린카복실산, 4-옥틸옥시벤조산, Bz-L-Met-OH, 3,4,5-트리에톡시벤조산, N-라우로일-Gly-OH, 3,5-비스(트리플루오로메틸)벤조산, Ac-5-메틸-DL-Trp-OH, 2-요오도페닐아세트산, 3-요오도-4-메틸벤조산, 3-(4-n-헥실벤조일)프로피온산, N-헥사노일-L-Phe-OH, 4-노닐옥시벤조산, 4'-(트리플루오로메틸)-2-비페닐카복실산, Bz-L-Phe-OH, N-트리데카노일-Gly-OH, 3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐아세트산, 3-(4-n-헵틸벤조일)프로피온산, N-헵타노일-L-Phe-OH, 4-데실옥시벤조산, N-(α,α,α -트리플루오로-m-톨릴)안트라닐산, 나플룸산, 4-(2-하이드록시헥사플루오로이소프로필)벤조산, N-미리스토일-Gly-OH, 3-(4-n-옥틸벤조일)프로피온산, N-옥타노일-L-Phe-OH, 4-운데실옥시벤조산, 3-(3,4,5-트리메톡시페닐)프로피오닐-Gly-OH, 8-요오도나프토산, N-펜타데카노일-Gly-OH, 4-도데실옥시벤조산, N-팔미토일-Gly-OH 및 N-스테아로일-Gly-OH. 이들 유기산은 하나 이상의 다음 회사[참조: Advanced ChemTech, Louisville, KY; Bachem Bioscience Inc., Torrance, CA; Calbiochem-Novabiochem Corp., San Diego, CA; Farchan Laboratories Inc., Gainesville FL; Lancaster Synthesis, Windham NH; 및 MayBridge Chemical Company(c/o Ryan Scientific), Columbia, SC]로부터 구입한다. 이들 회사의 카다로그에는 산을 동정하기 위해 상기에 사용되는 생략형을 기재하고 있다.
f. 태그 제조 수단으로서의 조합 화학
조합 화학은 대규모 화학 라이브러리를 생산하는 일종의 합성 전략이다(PCT 출원 공개공보 제WO 94/08051호 참조). 이들 조합 라이브러리는 목적 분자(MOI)를 동경하기 위한 태그로 사용될 수 있다. 조합 화학은 각종 실재 분자의 거대한 배열을 생성하기 때문에, 변화하는 구조의 한 쌍의 상이한 "구성 블럭(building blocks)"을 서로 체계적이고 반복적인 공유 결합으로서 정의할 수 있다. 구성 블럭은 친핵체, 친전자체, 디엔, 알킬화제 또는 아실화제, 디아민, 뉴클레오티드, 아미노산, 당, 지질, 유기 단량체, 신톤 및 이들의 조합물과 같이 다수의 천연에 존재하는 형태 및 합성 형태를 취할 수 있다. 구성 블럭들을 연결시키는 데에 이용되는 화학 반응에는 알킬화, 아실화, 산화, 환원, 가수분해, 치환, 탈리, 첨가, 환화, 축합 등이 있다. 이 과정은, 올리고머, 비올리고머, 또는 이들의 조합인 화합물의 라이브러리를 생산할 수 있다. 올리고머인 경우, 화합물은 분지가 있거나, 분지 없거나 환상이다. 조합 방법에 의해 제조될 수 있는 올리고머 구조의 예에는 올리고펩티드, 올리고뉴클레오티드, 올리고당, 폴리리피드, 폴리에스테르, 폴리아미드, 폴리우레탄, 폴리우레아, 폴리에테르, 폴리(인 유도체)(예: 포스페이트, 포스포네이트, 포스포르아미드, 포스폰아미드, 아인산염, 포스핀아미드 등), 및 폴리(황 유도체)(예: 설폰, 설포네이트, 설파이트, 설폰아미드, 설펜아미드 등)이 포함된다.
한가지 공통 형태의 올리고 조합 라이브러리는 펩티드 조합 라이브러리이다. 펩티드 화학과 분자 생물학의 최근 기술 혁신에 의하여 수천만 내지 수억개의 상이한 펩티드 서열로 이루어진 라이브러리를 제조하여 이용할 수 있게 되었다. 이와 같은 라이브러리는 3가지의 광범위한 카테고리로 분류된다. 라이브러리의 첫 번째카테고리는 가용성이고 지지체와 결합되지 않은 펩티드 라이브러리의 화학 합성과 연관이 있다[참조: Houghten et al., Nature 354:84, 1991]. 두 번째 카테고리는 플라스틱 핀, 수지 비이드, 또는 솜과 같은 고형 지지체 위에 제시되고 지지체와 결합된 펩티드 라이브러리의 화학 합성과 연관된다[참조: Geysen et al., Mol. Immunol. 23:709, 1986; Lam et al., Nature 354:82, 1991; Eichler and Houghten, Biochemistry 32:11035, 1993]. 이들 최초 2가지 카테고리에서, 구성 블럭들은 일반적으로 L-아미노산, D-아미노산, 비천연 아미노산, 또는 이들의 일부 혼합물 또는 조합물이다. 세 번째 카테고리는, 분자 생물학적 접근을 이용하여 사상 파아지입자 또는 플라스미드의 표면 위에 펩티드 또는 단백질을 제조하는 것이다[참조: Scott and Craig. Curr. Opinion Biotech. 5:40, 1994]. 가용성이고 지지체와 결합되지 않은 펩티드 라이브러리는 태그로서의 사용을 포함하여 여러가지 적용에 적당하다. 펩티드 라이브러리에서 화학 다양성의 이용가능한 레퍼터리는 과메틸화와 같은 단계를 통하여 확장할 수 있다[참조: Ostresh et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 91:11138, 1994].
펩티드 조합 라이브러리의 다수의 변이체는 펩티드 골격이 변형되는 경우 및/또는 아미드 결합이 모방 그룹으로 치환되는 경우에 가능하다. 사용가능한 아미드 모방 그룹에는 우레아, 우레탄 및 카보닐메틸렌 그룹이 포함된다. 측쇄가 알파 탄소가 아닌 각 아미노산의 아미드 질소로부터 생성되도록 골격을 재구성하는 것은 펩토이드로 알려진 화합물의 라이브러리를 제공할 수 있다[참조: Simon et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 89:9367, 1992].
다른 공통 형태의 올리고머 조합 라이브러리는, 여러가지 유기 및 무기 원자 그룹이 인산 결합 대신에 치환되는 경우 및 질소나 황이 에테르 결합에서 산소 대신에 치환되는 경우를 포함하여, 구성 블럭이 천연 또는 비천연 뉴클레오티드 또는 다당 유도체의 형태인 올리고뉴클레오티드 조합 라이브러리이다[참조: Schneider et al., Biochem. 34:9599, 1995; Freier et al., J. Med. Chem. 38:344, 1995; Frank, J. Biotechnology 41:259, 1995; Schneider et al., Published PCT WO 942052; Ecker et al., Nucleic Acids Res. 21:1853, 1993].
보다 최근에는, 비올리고머 소분자 화합물 집합체의 조합 생성이 소개되었다[참조: DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:690, 1993; Bunin et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 91:4708, 1994]. 소분자 라이브러리에의 사용에 적당한 구조는 헤테로사이클릭, 방향족, 지환족, 지방족, 스테로이드, 항생물질, 효소 억제제, 리간드, 호르몬, 약물, 알칼로이드, 오피오이드, 테르펜, 포르피린, 독소, 촉매 및 이들의 조합물과 같은 각종 유기 분자를 포함한다.
g. 태그의 조합 합성을 위한 특이적 방법
다양한 세트의 아민-함유 MS 태그를 제조하고 이용하기 위한 2가지 방법이 다음에 설명된다. 이들 2가지 방법에서, 조합 화학 기술을 이용하여 다수의 표지된 링커를 동시에 병행하여 합성할 수 있도록 고상 합성법이 사용된다. 첫번째 방법에서, 올리고뉴클레오티드로부터 태그를 최종적으로 절단하여 카복실 아미드를 유리시킨다. 두 번째 방법에서, 태그의 절단은 카복실산을 생성한다. 이들 방법에 사용되는 화학 성분 및 링커 요소들은 아래와 같이 약기된다:
R = 수지
FMOC = 플루오레닐메톡시카보닐 보호 그룹
All = 알릴 보호 그룹
CO2H = 카복실산 그룹
CONH2 = 카복실 아미드 그룹
NH2 = 아미노 그룹
OH = 하이드록실 그룹
CONH = 아미드 결합
COO = 에스테르 결합
NH2-Rink-CO2H = 4-[(α-아미노)-2,4-디메톡시벤질]-페녹시부티르산
(Rink 링커)
OH-1MeO-CO2H = (4-하이드록시메틸)페녹시부티르산
OH-2MeO-CO2H = (4-하이드록시메틸-3-메톡시)페녹시아세트산
NH2-A-CO2H = 측쇄에 지방족 또는 방향족 아민 관능기를 갖는 아미
노산
X1...Xn-CO2H = 독특한 분자량을 갖는 n종의 카복실산 세트
올리고1...올리고(n) = n개의 올리고뉴클레오티드 세트
HBTU = O-벤조트리아졸-1-일-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사
플루오로인산염
방법 1의 과정은 다음과 같다:
OH-2MeO-CONH-R
↓ FMOC-NH-Rink-CO2H; 커플링(예: HBTU)
FMOC-NH-Rink-COO-2MeO-CONH-R
↓ 피페리딘(FMOC 제거)
NH2-Rink-COO-2MeO-CONH-R
↓ FMOC-NH-A-CO2H; 커플링(예: HBTU)
FMOC-NH-A-CONH-Rink-COO-2MeO-CONH-R
↓ 피페리딘(FMOC 제거)
NH2-A-CONH-Rink-COO-2MeO-CONH-R
↓ n개의 분획으로 분할.
↓↓↓↓↓ n개의 상이한 산 X1... Xn-COOH와 커플링.
X1...Xn-CONH-A-CONH-Rink-COO-2MeO-CONH-R
↓↓↓↓↓ 1% TFA를 이용하여 수지로부터 표지된 링커를 절단.
X1...Xn-CONH-A-CONH-Rink-CO2H
↓↓↓↓↓ n개의 올리고(올리고1...올리고(n))과 커플링.
(예: Pfp 에스테르를 통하여)
X1...Xn-CONH-A-CONH-Rink-CONH-올리고1...올리고(n)
↓ 표지된 올리고를 채움.
↓ 서열화 반응 수행.
↓ 서열화 반응으로부터 상이한 길이의 단편을 분리.
(예: HPLC 또는 CE를 통하여)
↓ 25-100% TFA를 이용하여 링커로부터 태그를 절단.
X1...Xn-CONH-A-CONH
↓
질량 분광분석법으로 분석한다.
방법 2의 과정은 다음과 같다:
OH-1MeO-CO2-All
↓ FMOC-NH-A-CO2H; 커플링(예: HBTU)
FMOC-NH-A-COO-1MeO-CO2-ALL
↓ 팔라듐(아릴 제거)
FMOC-NH-A-COO-1MeO-CO2H
↓ OH-2MeO-CONH-R; 커플링(예: HBTU)
FMOC-NH-A-COO-1MeO-COO-2MeO-CONH-R
↓ 피페리딘(FMOC 제거)
NH2-A-COO-1MeO-COO-2MeO-CONH-R
↓ n개의 분획으로 분할.
↓↓↓↓↓ n개의 상이한 산 X1... Xn-COOH과 커플링.
X1...Xn-CONH-A-COO-1MeO-COO-2MeO-CONH-R
↓↓↓↓↓ 1% TFA를 이용하여 수지로부터 표지된 링커를 절단.
X1...Xn-CONH-A-COO-1MeO-CO2H
↓↓↓↓↓ n개의 올리고(올리고1...올리고(n))과 커플링.
(예: Pfp 에스테르를 통하여)
X1...Xn-CONH-A-COO-1MeO-CONH-올리고1...올리고(n)
↓ 표지된 올리고를 채움.
↓ 서열화 반응 수행.
↓ 서열화 반응으로부터 상이한 길이의 단편을 분리.
(예: HPLC 또는 CE를 통하여)
↓ 25-100% TFA를 이용하여 링커로부터 태그를 절단.
X1...Xn-CONH-A-CO2H
↓
질량 분광분석법으로 분석한다.
2. 링커
본원에서 사용되는 "링커" 성분(또는 L)은 "태그"(또는 T)를 "목적 분자"(또는 MOI)에 화학적 공유 결합을 통하여 연결시키는 데 사용되는 직접 공유 결합 또는 유기 화학 그룹을 말한다. 또한, 직접 결합 자체 또는 링커 성분 내의 하나 이상의 결합은 T가 T-L-X 화합물(이는 MOI 성분을 포함한다)의 나머지로부터 유리되는(달리 말하면, 절단되는) 조건하에 절단된다. T 안에 존재하는 태그 가변 성분는 절단 조건에서도 안정해야 한다. 바람직하게는, 절단은 수분 이내, 보다 바람직하게는 15초 이하 내에 신속하게 이루어져야 한다.
일반적으로, 링커는 태그의 거대한 세트 각각을 MOI의 유사하게 큰 세트 각각에 연결시키는 데에 사용된다. 대표적으로, 단일 태그-링커 조합은 각 MOI에 부착되어 각종 T-L-MOI를 제공하지만, 어떤 경우에는 하나 이상의 태그-링커 조합은 각각의 MOI에 부착되어 각각의 (T-L)n-MOI를 제공한다. 본 발명의 다른 실시양태에서, 2개 이상의 태그가 링커 위의 복수의 독립적인 부위를 매개로 단일 링커에 결합된 후, 이와 같은 복수의 태그-링커 조합은 각각의 MOI에 결합되어 각종의 (T)n-L-MOI를 제공한다.
표지된 MOI의 세트를 다양하게 조작한 후, 특정의 화학적 및/또는 물리적 조건을 이용하여 링커 안의 하나 이상의 공유 결합을 절단시킴으로써 MOI로부터 태그를 유리시킨다. 절단가능한 결합(들)은, 태그, 링커 및 MOI가 함께 연결되는 경우, 형성되는 동일한 결합의 일부이거나 아니다. 링커의 디자인은 대부분 절단이 이루어지는 조건을 결정한다. 따라서, 링커는 특히 영향을 받는 절단 조건에 의해 동정될 수 있다. 링커가 광에 불안정(즉, 화학적 방사선에 노출되었을 때 절단되는 경향이 있다)한 경우, 링커는 Lhy로 명명된다. 마찬가지로, 명명 Lacid, L base, L[O], L[R], Lenz, Lelc, LΔ, LSS는 산, 염기, 화학적 산화, 화학적 환원, 효소의 촉매 활성(보다 간단히 말하면 "효소"), 전기화학적 산화 또는 환원, 고온("열적") 및 티올 교환의 각각에 특히 영향을 받는 링커를 나타내기 위해 사용된다.
특정한 형태의 링커는 단일형의 절단 조건에만 불안정한 반면에, 다른 형태의 링커는 몇가지 절단 조건에서 불안정하다. 또한, 복수의 태그를 결합시켜 (T)n-L-MOI형 구조를 제공할 수 있는 링커에서, 태그 결합 부위 각각은 상이한 절단 조건에서 불안정하다. 예를 들면, 2개의 태그가 결합되어 있는 링커에서, 태그 중의 하나는 염기에 대해서만 불안정하고, 다른 태그는 광분해에 대해서만 불안정하다.
본 발명에 유용한 링커는 다음과 같은 몇가지 속성을 갖는다:
1) 링커는 화학적 핸들(Lh)을 갖고, 링커는 화학적 핸들을 통하여 MOI에 부착된다.
2) 링커는 제2의 다른 화학적 핸들(Lh)을 갖고, 이 화학적 핸들을 통하여 태그는 링커에 부착된다. 복수의 태그가 단일 링커에 부착[(T)n-L-MOI형 구조]되면, 별개의 핸들이 각 태그에 대하여 존재한다.
3) 링커는, T 함유 잔기가 화합물의 나머지 부분(이것은 MOI를 함유한다)으로부터 유리되도록 절단시키는 조건을 제외하고는 제공된 모든 조작에 대하여 안정하다. 따라서, 링커는 태그가 링커에 부착되거나 링커가 MOI에 부착되는 동안 및 태그 및 링커(T-L)가 MOI에 부착되는 동안에 MOI의 임의의 조작에도 안정하다.
4) 링커는 T-L이 MOI에 부착되는 동안 MOI에 대해 수행되는 조작을 유의적으로 간섭하지 않는다. 예를 들면, T-L이 올리고뉴클레오티드에 결합하는 경우, T-L은 올리고뉴클레오티드에 대해 수행되는 전체의 하이브리드화 또는 효소 반응(예: PCR)을 유의적으로 간섭하지 않아야 한다. 마찬가지로, T-L이 항체에 결합하는 경우, T-L은 항체에 의한 항원 인식을 유의적으로 간섭하지 않아야 한다.
5) 태그의 검출 가능성에 악영향을 미치지 않는 물리적 또는 화학적 과정을 이용하여 화합물의 나머지로부터 태그의 절단은 고도로 제어된 방식으로 생성된다.
임의의 소정의 링커에 있어서, 링커가 광범위한 각종 MOI에 부착되어, 광범위한 각종 태그가 링커에 부착되는 것이 바람직하다. 이와 같은 유동성은, 일단 제조되면, 여러가지 상이한 세트의 MOI와 함께 사용되는 T-L 접합체의 라이브러리를 가능하게 하는 장점이 있다.
상기에 설명한 바와 같이, 바람직한 링커는 화학식 Lh-L1-L2-L3-Lh(여기서, 각 Lh는 링커를 태그 반응체와 목적 분자 반응체에 연결시키기 위해 사용될 수 있는 반응성 핸들이고, L2는 링커에 불안정성을 부여하므로 L2는 링커의 불가결한 부분이며, L1과 L3는 핸들 Lh로부터 L2를 분리시키기 위해 효과적으로 사용되는 임의의 그룹이다)로 나타낼 수 있다.
L1(이는 L3에 비하여 T에 보다 근접한 것으로 정의된다)는 필요한 불안정 부분 L2으로부터 T를 분리시키는 역할을 한다. 이와 같은 분리는 절단 반응이 T 함유 잔기의 구조에서 무작위로 변화시키는 특정한 반응성 종(예: 유리 라디칼)을 생성하는 경우에 유용하다. 절단 부위가 T 함유 잔기로부터 추가로 분리되는 경우, 절단 부위에서 형성된 반응성 종이 T 함유 잔기의 구조를 파괴할 가능성이 감소한다. 또한, L1에서의 원자들은, 전형적으로 T 함유 잔기에 존재하는 경우, L1의 원자들은 T 함유 잔기에 목적하는 성질을 부여한다. 예를 들면, T 함유 잔기가 Tms 함유 잔기이고, 입체 장애된 아민이 Tms 함유 잔기의 구조 일부로서(예를 들면, MSSE로서 작용한다) 바람직하게 존재하는 경우, 입체 장애된 아민은 L1 불안정 부분에 존재한다.
다른 예를 들자면, L1 및/또는 L3는 단순히 링커 성분에 존재한다. 즉, 링커의 상업적 공급업자는 이러한 L1 및/또는 L3 그룹을 갖는 형태로 판매하기로 선택하기 때문이다. 이와 같은 경우, L1 및/또는 L3 그룹은 이들이 결합되는 화합물에 특별한 성능 잇점을 부여하지 않지만, L1 및/또는 L3 그룹을 갖는 링커를 사용하는 것이 해롭지는 않다(이러한 그룹이 절단 반응을 억제하지 않는다). 따라서, 본 발명에서 L1 및/또는 L3 그룹은 링커 성분 내에 존재할 수 있다.
L1 및/또는 L3 그룹은 직접 결합(이 경우에 당해 그룹은 실제로는 존재하지 않는다), 하이드로카빌렌 그룹(예: 알킬렌, 아릴렌, 사이클로알킬렌 등), -O-하이드로카빌렌(예: -O-CH2-, O-CH2CH(CH3)- 등), 또는 하이드로카빌렌-(O-하이드로카빌렌)w-(여기서, w는 1 내지 약 10의 정수이다)(예: -CH2-O-Ar, -CH2CH2)4- 등)이다.
고상 합성법의 등장과 더불어, 특정 반응 조건에 불안정한 링커에 대한 다수의 문헌이 보고되었다. 대표적인 고상 합성법에서, 고형 지지체는 반응 부위에 불안정한 링커를 통하여 결합시키고, 합성되는 분자를 반응 부위에서 생성시킨다. 분자가 완전히 합성되는 경우, 고상 지지체-링커-분자 구성물은 고상 지지체로부터 분자를 유리시키는 절단 조건에 제공한다. 여기에 사용하기 위해 개발된 불안정한 링커(또는 이러한 상황에 사용된다)는 또한 본 발명의 링커 반응체로서도 용이하게 사용된다.
문헌[참조: Lloyd-Williams, P., et al., "Convergent Solid-Phase Peptide Synthesis", Tetrahedron Report No. 347, 49(48):11065-11133(1993)]에는 화학적 방사선 뿐만 아니라 산, 염기 및 기타 절단 조건에 불안정한 링커에 대하여 광범위하게 논의되고 있다. 불안정한 링커에 대한 부가적인 정보의 공급원은 이미 공지된 것이다.
상기에 설명한 바와 같이, 상이한 링커 설계는 상이한 특정 물리적 또는 화학적 조건하에 절단가능성("불안정성")을 제공한다. 각종 링커를 절단시키는 조건의 예에는 산, 염기, 산화, 환원, 불소, 티올 교환, 광분해 및 효소 조건이 있다.
상기의 링커에 있어서 일반 기준을 만족시키는 절단가능한 링커는 당업자에게 공지된 것이며, 일리노이주 록포드 소재의 피어스(Pierce)에서 발간한 카다로그에 나와 있다. 그 예를 들면 다음을 포함한다:
· 에틸렌 글리코비스(석신이미딜석신산)(EGS), 및 하이드록실아민(1M, 37 ℃, 3-6시간)에 의해 절단되는 아민 반응성 가교제;
· 0.0015M 과요오드산나트륨에 의해 절단되는 아민 반응성 가교제인 디석신이미딜 타르타르산(DST)과 설포-DST;
· 염기(pH 11.6)에 의해 절단되는 아민 반응성 가교제인 비스[2-(석신이미딜옥시카보닐옥시)에틸]설폰(BSOCOES)과 설포-BSOCOES;
· 1,4-디-[3'-(2'-피리딜디티오(프로피온아미도)]부탄(DPDPB), 티올 교환 또는 환원에 의해 절단되는 피리딜디티올 가교제;
· N-[4-(p-아지도살리실아미도)-부틸]-3'-(2'-피리딜디티오)프로피온아미드(APDP), 티올 교환 또는 환원에 의해 절단되는 피리딜디티올 가교제;
· 비스-[베타-4-(아지도살리실아미도)에틸]-디설파이드, 티올 교환 또는 환원에 의해 절단되는 광반응성 가교제;
· N-석신이미딜-(4-아지도페닐)-1,3'-디티오프로피온산(SADP), 티올 교환 또는 환원에 의해 절단되는 광반응성 가교제;
· 설포석신이미딜-2-(7-아지도-4-메틸쿠마린-3-아세트아미드)에틸-1,3'-디티오프로피오네이트(SAED), 티올 교환 또는 환원에 의해 절단되는 광반응성 가교제;
· 설포석신이미딜-2-(m-아지도-o-니트로벤즈아미도)에틸-1,3'-디티오프로피오네이트(SAND), 티올 교환 또는 환원에 의해 절단되는 광반응성 가교제.
태그 방출에 사용되는 절단가능한 링커 및 절단 조건의 다른 예는 아래와 같다. 실릴 연결 그룹은 불소에 의하거나 또는 산성 조건하에 절단된다. 3-, 4-, 5- 또는 6-치환-2-니트로벤질옥시 또는 2-, 3-, 5- 또는 6-치환-4-니트로벤질옥시 연결 그룹은 광자원(광분해 작용)에 의해 절단된다. 3-, 4-, 5- 또는 6-치환-2-알콕시페녹시 또는 2-, 3-, 5- 또는 6-치환-4-알콕시페녹시 연결 그룹은 Ce(NH4)2(NO3)6 (산화)에 의해 절단된다. NCO2(우레탄) 링커는 수산화물(염기), 산 또는 LiAlH4(환원)에 의해 절단된다. 3-펜테닐, 2-부테닐 또는 1-부테닐 연결 그룹은 O3, OSO4/IO4- 또는 KMnO4(산화)에 의해 절단된다. 2-[3-, 4-, 또는 5-치환-푸릴]옥시 연결 그룹은 O2, Br2, MeOH 또는 산에 의해 절단된다.
다른 불안정한 연결 그룹을 절단시키는 조건은 다음과 같다: t-알킬옥시 연결 그룹은 산에 의해 절단되고; 메틸(디알킬)메톡시 또는 4-치환-2-알킬-1,3-디옥솔란-2-일 연결 그룹은 H3O+에 의해 절단되고; 2-실릴에톡시 연결 그룹은 불소 또는 산에 의해 절단되고; 2-(X)-에톡시(여기서, X는 케토, 에스테르, 아미드, 시아노, NO2, 설파이드, 설폭사이드, 설폰이다) 연결 그룹은 알칼리 조건하에 절단되고; 2-, 3-, 4-, 5-, 또는 6-치환-벤질옥시 연결 그룹은 산 또는 환원 조건하에 절단되고; 2-부틸옥시 연결 그룹은(Ph3P)3RhC1(H)에 의해 절단되고; 3-, 4-, 5- 또는 6-치환-브로모페녹시 연결 그룹은 Li, Mg 또는 BuLi에 의해 절단되고; 메틸티오메톡시 연결그룹은 Mg2+에 의해 절단되고; 2-(X)-에틸옥시(여기서, X=할로겐) 연결 그룹은 Zn 또는 Mg에 의해 절단되고; 2-하이드록시에틸옥시 연결 그룹은 산화(예: Pb(OAc)4)에 의해 절단된다.
링커는 산 또는 광분해에 의해 절단되는 것이 바람직하다. 고상 펩티드 합성법을 위해 개발되어 있는 몇가지의 산 불안정화 링커는 태그를 MOI에 연결시키는 데에 유용하다. 이들 링커 중의 일부는 문헌[참조: Lloyd-Williams et al., (Tetrahedron 49:11065-11133, 1993)]에 따르는 최근의 총설에 기재되어 있다. 특히 유용한 링커는 p-알콕시벤질 알콜을 기본으로 하는 것으로서, 그 안에는 4-하이드록시메틸페녹시아세트산과 4-(4-하이드록시메틸-3-메톡시페녹시)부티르산의 2가지가 있다[켄터키주 루이즈빌 소재의 어드밴스트 켐텍(Advanced ChemTech) 공급]. 이 2가지 링커 모두가 벤질알콜과의 에스테르 결합을 통하여 태그에 부착되고, 카복실산과의 아미드 결합을 통하여 아민-함유 MOI에 부착된다. 이들 분자에 의해 연결된 태그는 다양한 농도의 트리플루오로아세트산을 이용하여 MOI로부터 유리된다. 이들 분자의 절단은 태그 상에 카복실산의 유리를 발생시킨다. 어드밴스트 켐텍 사에서 FMOC가 보호된 형태로 공급되는 2,4-디메톡시-4'-(카복시메틸옥시)-벤즈하이드릴아민과 같이 관련 링커를 통하여 부착된 태그의 산 절단은 유리된 태그 위에 카복실 아미드의 유리를 발생시킨다.
본원에서 유용한 광불안정화 링커도 고상 펩티드 합성법을 위하여 최근에 개발되었다(Lloyd-Williams 총설 참조). 이들 링커는 통상 2-니트로벤질에스테르 또는 2-니트로벤질아미드를 기본으로 한다. 문헌에 최근 보고된 광불안정화 링커의 예로는, 4-(4-(1-Fmoc-아미노)에틸)2-메톡시-5-니트로페녹시)부탄산[참조: Holmes and Jones, J. Org. Chem. 60:2318-2319, 1995)과 3-(Fmoc-아미노)-3-(2-니트로페닐)프로피온산[참조: Brown et al., Molecular Diversity 1:4-12, 1995]이 있다. 이 2가지 링커는 모두 MOI 상에서 카복실산을 통하여 아민과 결합한다. 링커에 대한 태그의 부착은 태그 위의 카복실산과 링커 위의 아민 사이에서 아미드를 형성시킴으로써 제조된다. 광불안정화 링커의 절단은 통상 공지된 강도와 시간의 조건에서 350nm의 파장을 갖는 UV 광선에 의해 수행된다. 링커의 절단은 태그 위의 1급 아미드의 유리를 발생시킨다. 감광성 링커의 예로는 니트로페닐 글리신 에스테르, 엑소- 및 엔도-2-벤조노르보네일 클로라이드와 메탄 설포네이트 및 3-아미노-3(2-니트로페닐)프로피온산이 있다. 효소적 절단의 예로는 에스테르 결합을 절단하는 에스테라제, 포스포디에스테르 결합을 절단하는 뉴클레아제, 펩티드 결합을 절단하는 프로테아제 등이 있다.
바람직한 링커 성분은 화학식 8의 오르토-니트로벤질 구조를 갖는다.
[화학식 8]
위의 화학식 8에서,
a, b, c, d, 또는 e 위치에서 하나의 탄소원자는 -L3-X로 치환되고, L1(직접 결합인 것이 바람직하다)은 N(R1)의 좌측에 존재한다.
이와 같은 링커 성분은 "a"로 표시된 탄소와 N(R1) 사이의 결합의 선택적인 광유도 절단에 감수성이다. R1의 동일성은 절단 반응에서 전형적으로 중요한 것은 아니지만, R1은 수소와 하이드로카빌로부터 선택되는 것이 바람직하다. 본 발명에 의하면, 화학식 8에서 -N(R1)-이 -O-로 치환될 수 있다. 또한, 화학식 8에서 b, c, d 또는 e 위치 중의 하나 이상이 필요에 따라 알킬, 알콕시, 불소, 염소, 하이드록실, 카복실레이트 또는 아미드로 치환될 수 있고, 이들 치환체는 각각의 경우에서 독립적으로 선택된다.
본 발명에서 화학적 핸들 Lh을 갖는 바람직한 링커 성분은 화학식 9이다.
[화학식 9]
위의 화학식 9에서,
b, c, d 또는 e 위치 중의 하나 이상은 수소, 알킬, 알콕시, 불소, 염소, 하이드록실, 카복실레이트 또는 아미드로 치환될 수 있고,
R1은 수소 또는 하이드로카빌이고,
R2는 -OH 또는, 다른 부분과 커플링하기 위한 카복실산을 보호하거나 활성화시키는 그룹이다.
플루오로카본 및 하이드로플루오로카본 그룹은 다른 부분과의 커플링에 대해 카복실산을 활성화시키는 데에 적당하다.
3. 목적 분자(MOI)
MOI에는 핵산 또는 핵산 동족체(예: PNA), 핵산의 단편(즉, 핵산 단편), 합성 핵산 또는 단편, 올리고뉴클레오티드(예: DNA 또는 RNA), 단백질, 펩티드, 항체 또는 항원 단편, 수용체, 수용체 리간드, 리간드 쌍의 구성원, 사이토킨, 호르몬, 올리고당, 합성 유기분자, 약물 및 이들의 조합물이 포함된다.
본 발명에서 MOI의 예로는 핵산 단편이 바람직하다. 핵산 단편은, 벡터가 염기 서열화에 이용되는 경우, 벡터에 존재하는 서열에 대하여 상보적인 프라이머 서열인 것이 바람직하다. 바람직하게는, 핵산 단편은 단편의 3' 말단 이외에, 가장 바람직하게는 단편의 5' 말단에서 태그에 직간접적으로 부착된다. 핵산 단편은 유전자 데이터베이스[참조: Dib et al., Nature 380:152-154, 1996; CEPH Genotype Database, http:/www.cephb.fr]를 통하여 제조하거나 상업적 판매회사(예: 와이오밍주 매디슨 소재의 프로메가(Promega)로부터 구입할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, MOI에는 MOI를 T-L-Lh 화합물을 결합시키는 데 유용한 관능기를 갖는 유도체가 포함된다. 예를 들면, 포스포디에스테르가 알킬렌아민에 결합되는 경우, 5' 말단에 포스포디에스테를 갖는 핵산 단편은 MOI이다. 이와 같은 MOI는, 예를 들면, 본 발명의 참고 자료인 미국 특허 제4,762,779호에 기재되어 있다. 내부가 변형된 핵산 단편도 또한 MOI이다. 핵산 단편의 예시적인 내부 변형으로는 염기(예: 아데닌, 구아닌, 시토신, 티미딘, 우라실)가 반응성 관능기를 부가함으로써 변형된 경우가 있다. 이와 같이 내부적으로 변형된 핵산 단편은 버지니아주 헌든 소재의 글렌 리써치(Glen Research)에서 시판한다. 핵산 단편의 별도의 예시적인 내부 변형은 핵산 단편의 당과 포스페이트 그룹 사이에 삽입되는 변형 포스포디에스테르를 합성하기 위해 염기성 포스포르아미데이트를 사용하는 것이다. 염기성 포스포르아미데이트는 포스포르아미데이트로부터 유도한 부분을 포함하는 핵산 단편을 다른 부분(예: T-L-Lh 화합물)에 결합하도록 하는 반응성 그룹을 포함한다. 이와 같은 염기성 포스포르아미데이트는 캘리포니아주 팔로 알토 소재의 클로네테크 라보라토리즈, 인코포레이티드(Clonetech Laboratories, Inc.)로부터 시판되고 있다.
4. 화학적 핸들(Lh)
화학적 핸들은 안정하지만 제1 분자의 부분으로서 존재하는 반응성 원자 배열로서, 핸들은 제2 분자의 부분으로서 존재하는 상보적인 화학적 핸들과 2개의 분자 사이에서 공유 결합을 형성하기 위해 화학 반응을 일으킨다. 예를 들면, 이러한 2개의 핸들 사이의 반응이 2개의 분자를 결합시켜 공유 결합(특히 에스테르 그룹)을 형성할 때 화학적 핸들은 하이드록실 그룹이고, 이와 상보적인 화학적 핸들은 카복실산 그룹(또는 하이드로플루오로아릴 에스테르와 같은 활성화 유도체)이다.
화학적 핸들은 태그를 링커에 부착시키고 링커를 MOI에 부착시키기에 적당한 많은 공유 결합 반응에 사용된다. 이와 같은 반응에는 알킬화(예: 에테르, 티올에테르 형성), 아실화(예: 에스테르, 아미드, 카바메이트, 우레아, 티오우레아), 포스포릴화(예: 포스페이트, 포스포네이트, 포스포르아미드, 포스폰아미드 형성), 설포닐화(예: 설포네이트, 설폰아미드 형성), 축합(예: 이민, 옥심, 하이드라존 형성), 실릴화, 디설파이드 형성, 및 니트렌 또는 카벤과 같은 광분해 반응에 의한 반응성 중간체의 생성이 있다. 일반적으로, 태그를 링커에 부착시키기에 적당한 핸들과 결합 형성 반응은 링커를 MOI에 부착시키는 데 적당하고, 그 역도 동일하다. 몇몇 경우에 있어서, MOI는 사전 변형 또는 유도화를 받게 되어 링커를 부착시키는 데에 필요한 핸들을 제공한다.
링커를 MOI에 부착시키는 데에 특히 유용한 결합의 한가지 형태는 디설파이드 결합이다. 이 결합의 형성은 링커 위의 티올 그룹("핸들")와 MOI 위의 별도의 티올 그룹이 존재해야 한다. 따라서, 온화한 산화 조건은 2개의 티올을 디설파이드로서 결합시키기에 충분하다. 디설파이드 형성은 과량의 적당한 디설파이드 교환제(예: 피리딜 디설파이드)를 사용함으로써 유도된다. 디설파이드 형성은 용이하게 가역되므로 디설파이드는 원하는 경우 태그를 유리시키기 위한 절단가능한 결합으로서도 사용된다. 이는, 전형적으로 과량의 적당한 티올 교환제(예: 디티올트레이톨)을 사용하여 동일한 온화한 조건에서 달성된다.
아미드 결합의 형성은 태그(또는 링커를 갖는 태그)를 올리고뉴클레오티드에 연결시키기 위해 특히 중요하다. 1급 지방족 아민 핸들은 6-모노메톡시트리틸헥실시아노에틸-N,N'-디이소프로필 포스포르아미다이트[글렌 리서치(Glenn Research, Sterling, VA)에서 시판]과 같은 포스포르아미다이트를 갖는 합성 올리고뉴클레오티드에 용이하게 도입된다. 도입된 1급 아민과 비교하는 경우, 아데노신 및 구아노신과 같은 천연 뉴클레오티드에 존재하는 아민은 실제로 비반응성이다. 이와 같은 반응성의 차이는 뉴클레오티드 아민이 아닌 도입된 1급 아민 및 아미드를 갖는 관련 결합 그룹(예: 우레아, 티오우레아, 설폰아미드)를 선택적으로 형성할 수 있는 능력의 기초를 형성한다.
분자 프로브 카타로그(몰큘라 프로브)에 기재되어 있는 바와 같이, 아민-반응성 관능기에는 활성화 카복실산 에스테르, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 설포닐 할라이드 및 디클로로트리아젠이 부분적으로 포함된다. 활성 에스테르는 형성되는 아미드 생성물이 매우 안정하므로 아민 변형에는 우수한 시약이다. 또한, 이들 시약은 지방족 아민과의 반응성이 양호하고 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 아민과는 반응성이 낮다. 활성 에스테르의 예에는 N-하이드록시석신이미드 에스테르, 펜타플루오로페닐 에스테르, 테트라플루오로페닐 에스테르 및 p-니크로페닐 에스테르가 있다. 활성 에스테르는 실제로는 카복실산을 함유하는 임의의 분자로부터 제조할 수 있으므로 활성 에스테르는 유용하다. 활성 에스테르를 제조하는 방법은 문헌[참조: Bodansky, Principles of Peptide Chemistry(2d ed.), Springer Verlag, London, 1993]에 기재되어 있다.
5. 링커 부착
전형적으로, 단일 형태의 링커가 특정 세트 또는 계열의 태그를 특정 세트 또는 계열의 MOI에 연결시키는 데에 사용된다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 단일의 동일한 방법이 다양한 T-L-MOI 구조를 제조하기 위해 수반될 수 있다. T-L-MOI 구조 세트가 큰 경우, 이는 조합 화학 또는 다른 병행 처리 기술의 방법을 이용하여 제조할 수 있으므로 특히 유리하다. 유사한 방법에 있어서, 단일 형태의 링커의 사용은 단일의 다양한 T-L-MOI 구조를 절단하기 위해 사용될 수 있다. 다시 말하면, 이것은 큰 세트의 T-L-MOI 구조에 있어서 병행, 반복 및/또는 자동화 방법으로 처리할 수 있으므로 유리하다.
그러나, 본 발명의 다른 실시양태에서는 링커의 2가지 이상이 서로 상이한 서브세트의 태그를 이에 대응하는 서브세트의 MOI와 연결시키기 위해 사용된다. 이 경우, 선택적인 절단 조건이, 각 링커를 독립적으로, 다른 서브세트의 MOI 위에 존재하는 링커를 절단하지 않으면서 절단하기 위해 사용된다.
많은 공우 결합 형성 반응은 태그를 링커에 부착시키고, 링커를 MOI에 부착시키는 데 사용할 수 있다. 이와 같은 반응에는 알킬화(예: 에테르, 티오에테르 형성), 아실화(예: 에스테르, 아미드, 카바메이트, 우레아, 티오우레아), 인산화(예: 포스페이트, 포스포네이트, 포스포르아미드, 포스폰아미드 형성), 설포닐화(예: 설포네이트, 설폰아미드 형성), 축합(예: 이민, 옥심, 하이드라존 형성), 실릴화, 설파이드 형성, 및 니트렌 또는 카벤과 같은 광분해 반응에 의한 반응성 중간체의 생성이 있다. 일반적으로, 태그를 링커에 부착시키기에 적당한 핸들과 결합 형성 반응은 링커를 MOI에 부착시키는 데 적당하고, 그 역도 성립한다. 몇몇 경우에 있어서, MOI의 사전 변형 또는 유도화를 받게 되어 링커를 부착시키는 데에 필요한 핸들을 제공한다.
링커를 MOI에 부착시키는 데에 특히 유용한 결합의 한가지 형태는 디설파이드 결합이다. 이 결합의 형성은 링커 위의 티올 그룹("핸들")과 MOI 위의 다른 티올 그룹이 존재해야 한다. 여기에 온화한 산화 조건은 2개의 티올을 디설파이드로서 결합시키기에 충분하다. 디설파이드 형성은 과량의 적당한 디설파이드 교환제(예: 피리딜 디설파이드)를 사용함으로써 유도된다. 디설파이드 형성은 용이하게 가역되므로 디설파이드는 원하는 경우 태그를 유리시키기 위한 절단가능한 결합으로서도 사용된다. 이는, 전형적으로 과량의 적당한 티올 교환제(예: 디티올트레이톨)을 사용하여 동일한 온화한 조건에서 달성된다.
아미드 결합의 형성은 태그를 올리고뉴클레오티드에 연결시키기 위해 특히 중요하다. 1급 지방족 아민 핸들은 6-모노메톡시트리틸헥실시아노에틸-N,N-디이소프로필 포스포르아미다이트(글렌 리서치에서 시판)과 같은 포스포르아미다이트를 사용하여 합성 올리고 뉴클레오티드에 용이하게 도입된다. 도입된 1급 아민과 비교하는 경우, 아데노신 및 구아노신과 같은 천연 뉴클레오티드에 존재하는 아민은 실제로 비반응성이다. 이와 같은 반응성의 차이는 뉴클레오티드 아미드 및 도입된 1급 아민(뉴클레오티드 아민에는 없다)을 갖는 관련 결합 그룹(예: 우레아, 티오우레아, 설폰아미드)를 선택적으로 형성할 수 있는 능력의 기초를 형성한다.
분자 프로브 카타로그(몰큘라 프로브)에 기재되어 있는 바와 같이, 아민-반응성 관능기에는 활성화 카르복실산 에스테르, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 설포닐 할라이드, 및 디클로로트리아젠이 부분적으로 포함된다. 활성 에스테르는 형성되는 아미드 생성물이 매우 안정하므로 아민 변형에 우수한 시약이다. 또한, 이들 시약은 지방족 아민과의 반응성이 양호하고 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 아민과는 반응성이 낮다. 활성 에스테르의 예에는 N-하이드록시석신이미드 에스테르, 펜타플루오로페닐 에스테르, 테트라플루오로페닐 에스테르, 및 p-니트로페닐 에스테르가 있다. 활성 에스테르는 실제로는 카복실산을 함유하는 임의의 분자로부터 제조할 수 있으므로 유용하다. 활성 에스테르를 제조하는 방법은 문헌[참조: Bodansky, Principles of Peptide Chemistry(2d ed.), Springer Verlag, London, 1993)]에 기재되어 있다.
링커로서 기능을 하는 많은 시판되는 가교제가 있다[예: Pierce Cross-linkers(피어스 케미칼 캄파니) 참조]. 이들 가운데에는 호모이관능성을 갖는 이미도에스테르와 n-하이드록시석신이미딜(NHS) 에스테르와 같이 호모이관능성을 갖는 아민-반응성 가교제가 있다. 연속적인 반응을 가능하게 하는 2개 이상의 상이한 반응성 그룹을 갖는 헤테로이관능성 가교제가 존재한다. 이미도에스테르는 알칼리성 pH에서 아민과 급속히 반응한다. NHS-에스테르는 1급 또는 2급 아민과 반응시키는 경우, 안정한 생성물을 제공한다. 말레이미드, 알킬 및 아릴 할라이드, 알파-할로아실 및 피리딜 디설파이드는 티올과 반응한다. 말레이미드는 pH 6.5 내지 7.5 범위에서 티올(설프하이드릴) 그룹에 특이적으로 반응하고, 알카리성 pH에서는 아민과 반응한다. 티올에테르 결합은 생리적 조건에서 안정하다. 알파-할로아세틸 가교제는 요오드아세틸 그룹을 함유하고, 설프하이드릴과 반응한다. 이미다졸은 요오드아세틸 부분과 반응하지만, 그 반응은 매우 느리다. 피리딜 디설파이드는 티올 그룹과 반응하여 디설파이드 결합을 형성한다. 카보디이미드는 카복실을 하이드라지드의 1급 아민과 커플링시켜 아실-하이드라진 결합을 형성한다. 아릴아지드는 UV 또는 가시광에 노출될 때까지 화학적으로 불활성인 광친화성 시약이다. 이들 화합물이 250-460nm의 파장에서 광분해되는 경우, 반응성 아릴 니트렌이 형성된다. 반응성 아릴 니트렌은 상대적으로 비특이적이다. 글리옥살은 아르기닌의 구아니디닐 부분에 대하여 반응성이다.
본 발명의 하나의 대표적인 실시양태에서, 태그를 먼저 링커에 결합시킨 후에 태그와 링커의 조합을 MOI에 결합시켜 T-L-MOI 구조를 형성한다. 또는, 링커를 MOI에 먼저 결합시킨 후에 링커와 MOI와의 조합을 태그에 결합시켜 동일한 구조를 형성할 수 있다. 예를 들면, MOI가 DNA 프라이머 또는 올리고뉴클레오티드인 경우가 있다. 이 경우에 있어서, 태그는 전형적으로 먼저 링커에 결합시킨 후에 T-L을 DNA 프라이머 또는 올리고뉴클레오티드에 결합시킨다. 이어서, 예를 들면, 서열화 반응에서 사용한다.
표지가 가역적으로 MOI에 결합되는 한가지 유용한 형태(예: 올리고뉴클레오티드 또는 DNA 서열화 프라이머)는 화학적으로 불안정한 링커를 이용하는 것이다. 링커에 대한 한가지 바람직한 설계에 의해, 링커를 트리플루오로아세트산(TFA)과 같은 휘발성 유기산에 노출시킨 경우 절단시킬 수 있다. 특히 TFA는 전기분무를 포함하여 다수의 MS 이온화 방법에 적합성이다.
변이 분석을 위한 본 발명의 조성물. 변이 분석에 유용한 조성물은 화학식 TMS-L-MOI의 한 쌍의 화합물[여기서, Tms는 탄소; 수소와 불소 중의 하나 이상; 및 산소, 질소, 황, 인, 요오드로부터 선택된 원자를 포함하는, 질량 분광분석으로 검출가능한 유기 그룹이고, L은 Tms 함유 잔기를 화합물의 나머지 부분으로부터 절단시키는 유기 그룹이며, Tms 함유 잔기는 화합물이 질량 분광분석에 제공되는 경우 단일 이온화 전하 상태를 유지하고 3급 아민, 4급 아민 및 유기산으로부터 선택된 관능기를 포함하고, MOI는 핵산 단편이고, L은 MOI의 3' 말단 이외의 위치에서 MOI와 접합되어 있다]를 포함한다.
조성물은, 한 쌍의 구성원이 동일하지 않은 Tms 그룹을 가지고, 염기가 동일하지 않은 하나의 염기 위치를 제외하고는 동일한 서열을 갖는 화합물 쌍을 포함한다. 본 발명의 조성물의 다른 실시양태에서, 화합물 쌍의 구성원은 동일하지 않은 Tms 그룹을 가지고, 염기가 동일하지 않은 하나의 염기 위치를 제외하고는 동일한 서열을 가진다. 이어서, 이들 조성물을 지지체가 결합된 핵산 서열 이것은 각 쌍의 구성원의 하나의 서열과 동일하다)에 첨가한다. 그래서, 본 발명의 조성물은 상기에 설명한 화합물 복수 쌍을 포함하고, 고형 지지체에 고정된 등량의 복수의 핵산을 추가로 포함한다. 여기서, 복수의 핵산의 각 구성원은 각 쌍의 다른 구성원과 정확히 상보적인 염기 서열을 갖는다.
또한, 본 발명은 복수개의 용기를 포함하는 변이 분석을 위한 키트를 제공한다. 각 용기는 화학식 Tms-L-MOI의 화합물(여기서, Tms는 탄소; 수소와 불소 중의 하나 이상; 및 산소, 질소, 황, 인, 요오드로부터 선택한 임의의 원자들을 포함하는, 질량 분광분석으로 검출가능한 유기 그룹이고, L은 Tms-함유 부분을 화합물의 나머지 부분으로부터 절단시키는 유기 그룹이며, Tms-함유 부분은 화합물이 질량 분광분석에 제공되는 경우 단일 이온화 전하 상태를 유지하고 3급 아민, 4급 아민, 유기산으로부터 선택된 관능기를 포함하고, MOI는 핵산 단편이고, L은 MOI의 3' 말단 이외의 위치에서 MOI와 접합되어 있다) 한쌍을 포함한다.
상기 키트에서, 각 쌍의 화합물은 동일하지 않은 Tms 그룹을 가지고, 염기가 동일하지 않은 하나 또는 2개의 염기 위치를 제외하고는 동일한 서열을 가진다. 바람직한 키트에서 용기 수는 3개 이상이고, 더욱 바람직하게는 5개 이상이다.
B. 분석
상기에서 언급한 바와 같이, 본 발명은 본 명세서에서 제공되는 태그 및 검출 방법을 사용하여 분석 감도 및 처리량을 향상시킬 수 있는 광범위한 각종 분석 방법을 제공한다. 한가지 측면에 따르면, 이와 같은 방법을 이용하여, 리간드 쌍의 표지된 제1 구성원을 리간드 쌍의 제1 구성원이 제2 구성원에 결합될 수 있는 충분한 시간 동안 일정 조건하에 하나 이상의 제2 구성원을 함유하는 생물학적 샘플과 결합(여기서, 태그는 특정한 제1 구성원과 상관 관계를 가지고, 비형광 분광분석 또는 전위차 측정으로 검출가능하다)시키는 단계(a), 결합된 제1 구성원과 제2 구성원을 결합되지 않은 구성원으로부터 분리시키는 단계(b), 태그를 표지된 제1 구성원으로부터 절단하는 단계(c) 및 당해 태그를 비형광 분광분석 또는 전위차 측정으로 검출하여 리간드 쌍의 제1 구성원의 제2 구성원으로의 결합을 검출하는 단계(d)를 포함하는, 리간드 쌍의 제1 구성원의 제2 구성원으로의 결합을 검출할 수 있다.
광범위한 각종 제1 구성원과 제2 구성원 쌍은 본 발명의 상황 내에서 이용될 수 있고, 예를 들면, 핵산 분자(예: DNA, RNA, PNA와 같은 핵산 동족체, 또는 이들의 임의의 조합물), 단백질 또는 폴리펩티드(예: 항체 또는 항원 단편(예: 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 또는 CDR과 같은 결합 파트너), 올리고당, 호르몬, 유기 분자 및 기타 기질(예: 글루쿠로니다제-약물분자와 같은 생체이물), 또는 리간드 쌍의 임의의 다른 리간드를 포함한다. 본 발명의 각종 실시양태에서, 제1 및 제2 구성원은 동일한 형태 또는 상이한 형태의 분자일 수 있다. 예를 들면, 대표적인 제1 및 제2 구성원 리간드 쌍에는 핵산 분자/핵산 분자; 항체/핵산 분자; 항체/호르몬; 항체/생체이물; 및 항체/단백질이 포함된다.
본원에 제공된 기재가 있지만, 분석 방법을 보다 잘 이해하기 위해서, 특히 바람직한 분석 방법을 다음에 간단히 설명하기로 한다.
1. 핵산 분석
a. 도입
상기에 언급한 바와 같이, 본 발명은 절단가능한 태그 및/또는 링커가 동시에 분석되는 샘플의 특이성, 감도, 또는 수를 향상시키기 위하여 소정의 방법 내에서 종래의 표지(예: 방사성 표지, 형광 표지, 또는 효소 표지) 대신에 사용될 수 있는 다양한 방법을 제공한다. 증강되는 이와 같은 대표적인 방법의 예로는 표준 핵산 하이브리드화 반응[참조: Sambrook et al., 상기 참조], 순환 프로브 기술(CPT)(미국 특허 제4,876,187호 및 제5,001,769호 참조), 또는 올리고뉴클레오티드-결합 분석(OLA)[참조: Burket et al., Science 196:180, 1987] 등의 진단 반응이 있다. 이들 외에 다른 기술 방법은 이하에 보다 상세히 설명하기로 한다.
b. 하이브리드화 기술
유전자의 성공적인 클로닝 및 서열화는 관련되지 않은 DNA 또는 RNA 분자의 대규모 풀에서 유전자 또는 이의 mRNA를 검출함으로써 그 구조와 발현을 연구할 수 있다. 조직 내의 특정한 단백질을 암호화하는 mRNA의 양은, 유전자의 활성에 중요한 파라미터이고 기능 시스템의 활성에도 크게 관련되어 있다. 이의 조절은 유전자(시스-작용 성분)와, 조직-특이적으로 또는 호르몬과 2차 전달 시스템에 의해 활성화되는 서열-특이적 DNA 결합 단백질(트랜스-작용 인자)의 서열간의 상호작용에 의존한다.
몇가지 기술이 특정 유전자, 이의 조절 서열, 특이적 mRNA 및 이의 발현 조절의 분석에 이용될 수 있다. 여기에서 서던/노던 블롯 분석, 리보뉴클레아제(RNase) 보호 분석 및 인 시투 하이브리드화 방법이 포함된다.
특정 유전자의 뉴클레오티드 조성의 변이는 큰 병리학적 및 생리학적 연관성이 있다. 조성의 변이가 비암호화 영역(5',3'-플랭킹 영역과 인트론)에 국재하면, 이는 유전자 발현의 조절에 영향을 미쳐서 비정상적인 활성화 또는 억제 반응을 일으킨다. 유전자의 암호 영역(엑손)에 국재하는 경우, 이는 단백질 기능의 변화 또는 기능 이상 단백질을 생성한다.
따라서, 유전자 내의 특정 서열은, 특정한 질병과 관련되어 질환의 마커로서 유용하게 이용된다. 따라서, 의약 분야에서 연구의 제1 목적은 진단 수단으로서 이러한 유전자 변이를 검출하고 병리학적 및 생리학적 현상의 이해를 위한 중요한 정보를 수득하는 것이다.
특정 유전자 내의 변이와 관련되는 집단 분석의 기본적인 방법은 서던 블롯 방법을 이용하는 DNA 분석이다. 간단히 말하면, 제조한 게놈 DNA를 제한 효소(RE)로 절단하여, 게놈 상의 RE의 특이적인 인식 부위의 존재로 결정되는, 각종 길이의 다수의 DNA 단편을 생성한다. 이 제한 부위 내부에 변이를 갖는 특정 유전자의 대립유전자는 상이한 수와 길이의 단편으로 절단한다. 이는 제한 단편 길이 다형(RFLP)이라고 하며, 많은 적용을 갖는 중요한 진단 마커로 이용된다.
분석되는 단편은 DNA 단편의 풀로부터 분리하고, 특이적 프로브를 사용하여 다른 DNA 종과 구별하여야 한다. DNA는 아가로즈 겔을 사용하여 전기영동 분획에 제공하고, 계속하여 나일론 또는 니트로셀룰로즈 막으로의 전이 및 고정화에 제공한다. 고정화된 일본쇄 DNA는 검출되는 DNA에 상보적인 표지된 DNA와 하이브리드화한다. 비특이적인 하이브리드화를 제거한 후, 목적 DNA 단편을 다음에 자세히 기재되는 MALDI-MS로 가시화한다.
생리학적 파라미터에 의한 특이한 유전자 전사 및 이의 조절의 존재와 정량은 노던 블롯 분석과 RNase 보호 분석을 통하여 분석할 수 있다.
이들 방법 원리는 기초는 전체 세포 RNA의 풀을 특이적 프로브와 하이브리드화하는 것이다. 노던 블롯 기법에서, 조직의 전체 RNA가 아가로즈 겔을 이용하여 전기영동법으로 분리되고, 전이시키며, RNA에 상보적인 표지된 안티센스 RNA(cRNA)에 고정시켜 검출한다. 이어서, 이 cRNA 프로브는 본원에 기재된 바와 같이 표지된다. 엄격한 세척 조건을 적용함으로써, 비특이적으로 결합된 분자는 제거된다. 특이적으로 결합된 분자들은 그 후 MALD1-MS에 의해 검출된다. 또한,특이성은 검출된 mRNA의 크기를 목적 mRNA의 예상 길이와 비교하여 조절할 수 있다.
보다 신속하지만 특이적이지는 않은 도트 블롯 방법은, RNA가 전술한 분획을 수반하지 않는 막 위에 직접 적하되는 것을 제외하고는 노던 블롯 기법과 동일하게 수행된다. RNA는 도트 블롯에 비특이적으로 고정된다.
mRNA 종의 검출에 가장 특이적인 방법은 RNase 보호 분석이다. 간단히 말하면, 조직 또는 세포 배양물로부터의 전체 RNA를 완전한 상동성의 표지된 특이적 cRNA와 하이브리드화한다. 특이성은 이후의 RNase 소화를 통하여 달성할 수 있다. 하이브리드화되지 않은 일본쇄 RNA와, 적은 미스매치를 갖는 비특이적으로 하이브리드화된 단편은 인식되어 절단되지만, 완전한 상동성의 이본쇄 RNA는 효소에 대한 접근가능성이 없고 보호된다. 프로테이나제 K 소화 및 페놀 추출에 의해 RNase를 제거한 다음, 특이적으로 보호된 단편을 통상은 변성 폴리아크릴아미드 겔 위에서 분해 산물로부터 분리하고, 예상 크기는 HPLC로 체크한다. 위에 기재된 모든 분석물은 비형광 분석 또는 전위차 측정으로 정량할 수 있다.
조직 내의 세포의 특정한 집단에 있어서 소정의 mRNA의 정확한 위치는 인 시투 하이브리드화 방법을 통하여 결정할 수 있다. 이 방법은 면역세포화학 방법과 유사하고, 실제로, 예를 들면, 어떤 단백질이 국부적으로 합성되고 다른 공급원으로부터 실제로 도입되었는지를 알기 위해 동일한 절편에 대하여 면역세포화학 방법에서 동시에 수행된다. 특정 mRNA를 발현하는 세포 종류를 확인할 가능성은 별도로 하고, 하이브리드화 방법은 상기에 설명한 기술을 이용하는 전체 조직 RNA 제조물의 분석보다 더 감수성이다. 이 경우는, mRNA가 조직 내에 매우 상이한 영역 또는 종류의 세포에서 고농도로 발현되고 전체 조직의 균질화로 희석되는 경우이다. 따라서, 하이브리드화에 의한 유전자 발현의 분석은 뇌와 같은 불균질한 조직의 분석에 있어서 특히 중요하다. 하이브리드화에 있어서, 조직은 동결 또는 관류 고정되어 조직화학 프로토콜에 따라 절단되어야 한다. 조직 절편 및 사용되는 표지된 프로브의 하이브리드화 프로토콜은 상기에서 설명한 다른 하이브리드화 방법과 유사하다. 반정량적 분석도 가능하다.
c. mRNA 대표적인 집단으로서의 cDNA와 프로브로의 사용
대부분의 mRNA는 단일 카피 서열로부터 전사된다. cDNA의 또다른 특성은, 대부분의 유전자에 염색체형으로 존재하는 인트론 때문에 게놈의 보다 긴 영역을 대표하는 것이다. 대표는 하나의 유전자로부터 또다른 유전자로 변화하지만 많은 유전자가 단일 cDNA에 나타나는 게놈 DNA에서 100 kb 이상을 커버하기 때문에 매우 중요하다. 분자 하이브리드화의 한가지 가능한 사용은 다른 종으로부터 제조되는 클론을 발견하기 위해 하나의 종으로부터의 프로브를 이용하는 것이다. 마우스와 사람의 mRNA 서열 차이는 긴 서열의 특이적 교차 재결합을 가능케하고, 최고도로 보전된 영역을 제외하고는 PCR 프라이머의 교차 하이브리드화를 방지한다.
단일 세포로부터 제조된 cRNA 프로브를 이용하는 신경계와 같은 복잡한 생물학적 샘플에서 차등 스크리닝은 PCR 기본 및 cRNA 기본 증폭 기술의 개발에 의해 현재 가능하게 되었다. 몇몇 그룹은 10 내지 50개의 세포로부터 제조한 소량의 폴리 (A)+RNA(1ng 이하)로부터 cDNA 라이브러리의 생성을 이미 보고한 바 있다[참조: Belyav et al., Nuc. Acids Res. 17:2919, 1989]. 라이브러리는 mRNA 복잡도를 충분히 대표하지만, 이들 라이브러리의 평균 cRNA 삽입 크기는 매우 작다(<2kb).
보다 최근에는, 방법론이 단일 세포로부터 RCR 기본 프로브[참조: Lambolez et al., Neuron 9:247, 1992]와 cRNA 기본 프로브[참조: Van Gelder et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1663, 1990]을 모두 생성하기 위해 조합되었다. 전기 기록 후, 단일 세포의 세포질 함량을 인 시투 cDNA의 합성과 증폭을 위하여 피치-클램프 미소 전극으로 흡입한다. PCR을 사용하여, 단일 푸르킨예 세포로부터의 선택적인 글루타민산 수용체 mRNA 및 기관형 소뇌 배양물 중의 단일 글리아로부터의 GFAP mRNA의 cDNA를 증폭시킨다[참조: Lambolez et al., Neuron 9:247, 1992]. cRNA 증폭의 경우, 전자 프로모터 서열을 cDNA 합성을 위한 프라이머에 설계하고, 복잡한 안티센스 cRNA 박테리오파아지 RNA 폴리머라제를 이용한 시험관내 전사로 생성한다.
따라서, 본 발명의 한가지 실시양태에서, 표지된 cRNA는 cDNA 라이브러리를 무작위로 스크리닝하기 위한 표지된 프로브로서 사용할 수 있고, 목적 cDNA 단편(수용체, 성장 인자, 이온 채널 등)을 포함하는 서던 블롯을 스크리닝하기 위한 "발현 프로파일링" 실험에 사용할 수 있다. RCR 기본 방법에서 종종 당면하는 증폭 선형성의 결여는 cRNA 기본 방법으로 최소화할 수 있다.
d. 올리고뉴클레오티드 결합 분석
올리고뉴클레오티드 결합 분석은 표적 서열을 함유하는 PCR 산물을 검출하기 위해 ELISA 분석[참조: OLA, Nickerson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8923, 1990]을 이용하는 PCR 기본 스크리닝법의 연장이다. 따라서, 겔 전기영동법과 콜로니 하이브리드화 방법이 모두 배제될 수 있다. 간단히 말하면, OLA는 2개의 인접한 올리고뉴클레오티드: "수용체" 프로브(5' 말단에 표지함)와 5'-인산화/3'-바이오티닐화 "앵커" 프로브를 이용한다. PCR 프라이머의 내부 서열에 상보적인 2개의 올리고뉴클레오티드는 표적 DNA에 어닐링시키고, 완전히 상보적인 경우, 2개의 프로브를 T4 DNA 리가제로 연결시킨다. 고정된 스트렙트아비딘 상에 바이오티닐화 앵커 프로브를 포집하고 공유결합시킨 리포터 프로브에 있어서 분석은 PCR 산물 중의 표적 서열의 존재 또는 부재에 대해 시험한다.
e. 하이브리드화 방법의 적용
ⅰ. 법의학
DNA 서열 변이 수준에서 기체 동정은 지문, 혈액형, 또는 신체적 특성과 같은 종래의 기준보다 다수의 실제적인 이점을 제공한다. 대부분의 표현성 마커와는 대조적으로, DNA 분석을 친부확인 시험에 요구되는 개체간의 관련성을 추론할 수 있다. 유전자 분석은, 밀접하게 관련되는 공여자와 수용체 세포간의 구별을 요구하는 경우, 골수 이식에서 매우 유용한 것으로 증명되어 있다. DNA 블롯에 의한 DNA 지문에는 현재 2종류의 프로브가 사용되고 있다. 다형의 미소 DNA 프로브는 상이한 개체에서 다양한 형태로 각각 존재하는 복수의 DNA 서열을 동정하고, 복잡하고 개체간의 매우 다양한 패턴을 형성한다. VNTR 프로브는 게놈의 단일 서열을 동정하지만, 이러한 서열은 동정된 단편의 크기에 따라 구별되는 사람 집단 중의 30 종류까지 상이한 형태로 존재한다. 근친이 아닌 개체가 복수의 VNTR 또는 미소 프로브에 있어서 동일한 하이브리드화 패턴을 가질 확률은 매우 낮다. DNA 블롯에 필요한 것보다 매우 적은 조직은, 1개의 머리카락만으로도 유전자 마커의 PCR 기본분석에 충분한 DNA를 제공한다. 또한, 극히 적은 DNA 단편만이 필요하므로, 부분적으로 분해된 조직도 분석에 사용할 수 있다. 법의학 DNA 분석은 OLA와 같은 단순 자동화 분석 시스템으로 연구되는 다형 DNA 서열을 가지고 DNA 분석으로 최종적으로 실시될 수 있다. 예를 들면, 22개의 별개의 유전자 서열의 분석은, 집단에 2개의 서로 다른 형태로 각각 존재하고 1010개의 상이한 결과를 발생시켜 사람 개체 의 독특한 동정을 가능케 한다.
ⅱ. 종양 진단
바이러스 또는 세포성 암유전자 검출은 핵산 진단 적용의 별개의 중요한 분야이다. 바이러스 암유전자(v-암유전자)는 레트로바이러스에 의해 전염되지만, 세포 암유전자(c-암유전자)는 이미 정상 세포에 존재한다. 그러나, 세포성 암유전자는 점변이(방광암에 있어서 및 직장 결장 종양에 있어서 c-k-ras 암유전자에서와 같이), 프로모터 유도, 유전자 증폭(신경아종의 경우의 N-myc 암유전자에서와 같이) 또는 염색체의 재배열(만성 골수성 백혈병의 경우 제9 염색체 내지 제22 염색체의 c-abl 암유전자의 전위에서와 같이)과 같은 특이적인 변형에 의해서 활성화된다. 이와 같은 활성화 과정은 각각 추가의 변성 과정과 함께 증대되고 제어할 수 없는 세포 증식을 유도한다. (망막아종(Rb) 유전자 및 골육아종에서와 같이) 종양의 형성을 위해 불활성화되어야 하는 소위 "열성 암유전자"가 DNA 프로브의 도움으로 검출될 수 있다. 면역글로블린 유전자와 T-세포 수용체 유전자에 대응하는 프로브를 이용하여 B-세포 림프종과 림프구 백혈병을 검출할 수 있다.
ⅲ. 이식 검정
이식된 조직의 거부반응은 조직 적합성 항원(HLA)의 특이적 부류에 의해 결정적으로 제어된다. 이들의 항원 제시 혈액 세포(예: 매크로파지)의 표면에서 발현된다. HLA와 외래 항원의 복합체는 세포 표면의 상응하는 T-세포 수용체를 통하여 T-헬퍼 세포에 의해 인식된다. HLA 항원과 T-세포 수용체간의 상호작용은 인체에 캐스캐이드 유사 면역 반응을 유도하는 복합 방어 반응을 유발한다.
상이한 외래 항원의 인식은, 항체 반응과 마찬가지로, T-세포 수용체의 가변성 항원-특이적인 영역에 의해 매개된다. 이식 거부에 있어서, 외래 항원에 적합한 특이적 T-세포 수용체를 발현하는 T-세포는 T-세포 풀로부터 제거할 수 있다. 이와 같은 분석은, PCR로 증폭시켜 항원-특이적인 가변성 DNA 서열을 동정함으로써 선택적으로 증가된다. 특이적 증폭 반응은 특이적 T-세포 수용체의 단일 세포 특이적 동정을 가능하게 한다.
유사한 검정이 연소성 당뇨병, 동맥 경화증, 다발성 경화증, 류머티즘성 관절염, 또는 뇌척수염과 같은 자가면역성 질병을 동정하기 위하여 현재 실시되고 있다.
ⅳ. 게놈 진단
전체 신생아의 4퍼센트가 유전자 결손을 지니고 태어난다. 단일 유전자만의 변형에 의해 발생되는 3,500가지의 유전병 중에서, 1차적 분자 결손은 약 400개에 대해서 알려져 있다.
유전병은 오래전에 표현형 분석(혈액결핍증과 같은 빈혈증: 탈라세미아), 염색체 분석(몽고증과 같은 핵형병: 트리소미-21), 또는 유전자 생성물 분석(페닐케톤증과 같은 변형된 단백질: 페닐피루브산을 증가시키는 페닐알라닌 하이드록실라제 효소의 결핍)으로 진단된다. 핵산 검출법의 추가의 사용은 게놈 진단 범위를 확장시킬 수 있다.
특정한 유전병의 경우, 2가지 대립유전자 중의 하나만의 변형은 질병에 충분하다(우성 유전된 단일 유전자 결손). 많은 경우, 2가지 대립유전자는 변형되어야 한다(열성 유전된 단일 유전자 결손). 세 번째 형태의 유전자 결손에서, 질병의 발생은 유전자 변형에 의해서만 결정되는 것이 아니고 식습관(당뇨병 또는 동맥경화증의 경우) 또는 생활양식(암의 경우)과 같은 인자에 의해서도 결정된다. 매우 빈번하게는, 이들 질병은 고령의 사람들에게 발생한다. 정신 분열증, 신경성 우울증 또는 간질과 같은 질병이 이러한 상황에 해당한다. 이 경우, 질병의 발생이 환경 인자 이외에 상이한 염색체 위치에서 유전자 변형에 의존하는 경우, 이는 연구 중이다.
직간접적인 DNA 분석을 사용하여, 겸상 적혈구성 빈혈증, 탈라세미아, al-항트립신 결핍증, 레슈-니한 증후군, 포낭성 섬유증/뮤코비시도시스, 듀첸/벡커 근육 위축증, 알츠하이머병, X염색체 의존성 정신 박약증, 헌팅턴 무도병 등 일련의 유전병을 진단할 수 있다.
ⅴ. 감염병
감염병의 진단에 있어서 재조합 DNA법의 적용은, 현재의 진단법이 성가시고 결과에 지연되는 경우, 바이러스 감염에 대해 가장 광범위하게 탐구되고 있다. 조직 또는 배양 세포의 하이브리드화는 급성 및 만성 감염의 진단을 가능하게 하였다. 신성한 및 포르말린 고정된 조직은 침투성 경부 암에서 파필로마바이러스 검출에 적당한 것으로 보고되어 있지만, 배양 세포는 사이토메갈로 바이러스와 엡스테인-바르 바이러스의 검출에 사용된다. 재조합 DNA 기술의 세균성 질병의 진단에의 적용은, 비용 효율성, 속도 및 정밀도 등이 부합되는 경우, 현재의 세균 증식 방법을 대체할 수 있다. 재조합 DNA 절차가 적용되기 시작하는 임상적 상황에는, 트랜스포손의 존재, 편호성 증식 클라미디아, 식물 중의 미생물 및 집단에 의한 감염 확산을 수반하는 단순한 수단에 의해 페니실린 내성 네이시리아(Neisseria) 임균의 동정이 포함된다. 레이슈마니아 및 플라스모디아와 같은 기생충을 포함하는 질병의 세계적인 역병학적 도전은 이미 재조합 방법에 의해 부합되고 있다.
2. 단백질 분석
a. 도입
상기에서 언급한 바와 같이, 광범위한 각종 단백질 분석 방법은 본 명세서에서 기재되어 있는 태그로 증강시킬 수 있다[참조: Antibodies: A laboratory Manual, Harlow and Lane(eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988 참조]. 대표적인 예로는 향류 면역 전기영동법(CIEP), 효소-결합 면역 흡착 분석(ELISA), 억제 또는 경쟁 분석 및 샌드위치 분석과 같은 항원-항체 분석, 동시 면역분석 및 면역여과 분석을 포함한다. 그러나, 이와 마찬가지로 리간드-수용체 분석 등을 포함하는 광범위한 각종 분석 방법도 증강될 수 있다.
b. 면역검정
인슐린과 티로신에 대한 RIA가 개발된 이래, 방사성 동위원소로 표지된 항원을 포함하는 방법은 호르몬 및 약물과 같은 헵텐 분자의 측정에 적용된다. 이들 방법은 표지된 항원과 한정량의 항체에 대하여 표지되지 않은 항원간의 경쟁에 기초한 것이다. 이들 방법은 또한 검정에 사용되는 항체의 양이 한정되므로 "한정 시약" 방법으로도 기재된다.
표지된 항체는 1941년 이래 면역형광법에 사용되었으나, IRMA에 방사성 동위원소로 표지된 항원이 도입되기 전까지는 정량적 방법에서 널리 적용되지 않았다. IRMA, 추가로 다른 고상 기본의 이중항체 또는 "샌드위치" 분석(ELISA, IFMA, 면역형광 염색 분석)은 항원에 대하여 과량의 항체를 사용하므로, "과량 시약" 방법이라고 불린다. 원칙적으로, 과량의 시약을 사용하는 것은 배양 시간을 단축시키고 감도를 잠재적으로 증가시킬 수 있다. 고체상은 분리를 용이하게 하고, 시그날은 경쟁 분석에 있어서 침입 관계에 대립되는 항원의 양에 정비례한다.
아비딘-바이오틴 기술은 생화학, 분자생물학 및 의학 등의 많은 분야에서 중요하고, 여기에는 비방사성 면역분석, 세포화학 염색, 세포 분리 및 핵산의 분리에 의한 단백질의 검출 및 하이브리드화에 의한 특이적 DNA/RNA 서열의 검출이 포함된다. 이 기술은 아비딘-바이오틴간의 상호작용(연합 상수 1015M-1)이 매우 높은 친화성, 항체, 핵산, 지질과 같은 광범위한 표적 생분자를 바이오틸화하는 능력으로부터의 유용성을 유도한다. 표적 분자를 분리하기 위한 첫 번째 단계는 목적 분자의 바이오틸화 또는 최종적으로 표적 분자(예: 항체 또는 표적 복합체를 형성하는하이브리드화 프로브)와 결합하는 생분자의 바이오틸화 단계이다. 이어서, 바이오틸화 분자 또는 표적 복합체는 아비딘-바이오틴 상호작용에 기초하는 친화 매질을 이용함으로써 불균일한 혼합물 중의 다른 분자로부터 분리된다.
따라서, 본 발명의 한가지 실시양태에서 표준 면역분석은 전형적인 동위원소로 표지된 시약 대신에 이용된 표지된 시약을 완성한다. 이러한 방법은, 매우 증가된 감도, 및 다수의 샘플을 동시에 분석하는 능력을 나타낸다.
3. 유전자 발현 분석
본 명세서에 기재되어 있는 발명의 하나는 단일 측정으로 다수의 유전자 (1-2000개)의 발현을 측정하기 위한 고처리량 방법을 제공한다. 이 방법은 또한 하나의 과정당 100개 이상의 샘플을 병행 처리하는 능력이 있으며, 약물 스크리닝,발생 생물학, 분자 의학 연구 등에 적용할 수 있다. 본 발명의 한가지 측면에 따르면, (a) 생물학적 샘플로부터 핵산을 노출시키는 단계; (b) 표지된 핵산 프로브가 핵산에 하이브리드화될 수 있는 충분한 조건 및 시간 동안에, 노출된 핵산을 하나 이상의 표지된 핵산 프로브와 결합시키는 단계(여기서, 태그는 특정한 핵산 프로브와 상관 관계를 가지고, 비형광 분광분석 또는 전위차 측정으로 검출가능하다); (c) 하이브리드화된 프로브를 하이브리드화되지 않은 프로브로부터 분리하는 단계; (d) 태그를 표지된 단편으로부터 절단하는 단계 및 (e) 비형광 분광분석 또는 전위차 측정으로 태그를 검출하고, 이로부터 생물학적 샘플 중의 유전자 발현 패턴을 결정하는 단계를 포함하는, 선택된 생물학적 샘플로부터 유전자 발현 패턴을 결정하는 방법을 제공한다.
본 발명의 특히 바람직한 실시양태에서, 다음과 같이 분석 또는 방법이 제공된다: 표적 공급원으로부터의 RNA를, 특이적 하이브리드화 단계(즉, 고정시킨 올리고(dT) 포획 프로브에 의한 폴리 (A) mRNA의 포획)를 통하여 고형 지지체에 결합시킨다. 이어서, 고형 지지체를 세척하고, cDNA를 표준 방법(즉, 역전사 효소)을 이용하여 고형 지지체 위에서 합성한다. 이어서, RNA 쇄를 가수분해로 제거하여, cDNA가 합성되는 RNA의 다양성, 풍부성 및 복잡성을 반영하는 고형 지지체에 공유결합으로 고정된 DNA 집단을 생성한다. 이어서, 고형 지지체를 목적 유전자 서열에 상보적인 1개 내지 수천개의 프로브를 이용하여 하이브리드화한다. 각각의 프로브를 절단가능한 질량 분광분석 태그 또는 다른 형태의 절단가능한 태그로 표지한다. 하이브리드화 단계 이후, 과량 또는 하이브리드화되지 않은 프로브를 세정하고, 고형 지지체를 미세적정 플레이트의 웰에 위치시키고, 질량 스펙트럼 태그를 고형 지지체로부터 절단한다. 고형 지지체를 샘플 용기의 웰로부터 제거하고, 월의 내용물을 질량 분광분석계로 측정한다. 특정한 질량 분광분석계 태그의 출현은 샘플에 RNA의 존재를 나타내고, 특이적 유전자가 소정의 생물학적 샘플에서 발현됨을 증명하는 것이다. 이 방법은 정량 가능하다.
절단가능한 태그를 이용하여 유전자 발현을 신속하게 측정하기 위한 조성물과 방법은 다음에 상세히 기재된다. 간단히 말하면, 조직(간장, 근육 등)과 초대 또는 형질전환 세포주, 분리하거나 정제한 세포형 또는 유전자 발현의 결정에 유용한 다른 생물질 재료 등의 임의의 공급원은 RNA의 공급원으로 사용할 수 있다. 바람직한 방법에서, 생물학적 공급원 물질을, 뉴클레아제와 프로테아제를 억제하고 고형 지지체에 대한 표적 핵산의 하이브리드화를 지지하기 위해 카오트로프 존재하에 용해시킨다. 조직, 세포 및 생물학적 공급원을 1 내지 6몰의 카오트로프염(구 아니딘 하이드로클로라이드, 구아니딘 티오시아네이트, 과염소산나트륨 등)에 효율적으로 용해시킬 수 있다. 공급원인 생물학적 샘플이 용해된 다음, 용액을 고형 지지체와 혼합하여 용해 산물에 존재하는 표적 핵산을 포획한다. 이 방법의 한가지 변형에서는, RNA를 고정시킨 올리고(dT) 포획 프로브를 이용하여 포획한다. 고형 지지체에는 나일론 비이드, 폴리스티렌 마이크로비이드, 유리 비이드 및 유리 표면, 또는 올리고뉴클레오티드가 공유 결합으로 부착될 수 있는 다른 형태의 고형지지체가 포함된다. 고형 지지체를, 폴리에틸렌(이민), 아크릴아민, 아민=덴드리머 등과 같은 아민 중합체로 우선적으로 피복한다. 중합체 상의 아민을, 올리고뉴클레오티드를 고유 결합으로 고정시키기 위해 사용한다. 올리고뉴클레오티드는 5'-아민(일반적으로, 6개의 탄소 스페이서-암 및 원위의 아민을 포함하는 핵실아민이다)을 우선적으로 합성한다. 올리고뉴클레오티드는 15 내지 50개 길이의 뉴클레오티드로 구성된다. 올리고뉴클레오티드는 염화시아누르산과 같은 호모-이관능성또는 헤테로-이관능성 가교제에 의해 활성화된다. 활성 올리고뉴클레오티드를 배제 크로마토그래피에 의해 과량의 가교제(즉, 염화시아누르산)로부터 정제한다. 이어서, 활성 올리고뉴클레오티드는 고형 지지체와 혼합하여 공유 부착을 유도한다. 올리고뉴클레오티드가 공유 부착되면, 고형 지지체의 반응하지 않은 아민을 고형 지지체의 고형 지지체의 양전하를 배제하기 위해 캡핑(즉, 석신산 무수물)한다.
고형 지지체를 병행하게 사용할 수 있고, 95웰 또는 384웰의 포맷으로 우선적으로 구성할 수 있다. 고형 지지체를 96웰 또는 384웰 장치의 페그, 축 또는 로드에 부착한다. 고체 지지체는 분리가능한 또는 특정의 배치에 필수적이다. 고형 지지체의 특정한 배치는 분석의 기능성에 결정적 중요성은 없지만, 분석의 자동화능력에 영향을 준다.
고형 지지체를 15분 내지 수시간 동안 용해물과 혼합하고, 표적 핵산을 고형 지지체에 포획한다. 일반적으로, 표적 핵산의 "포획"은 표적 RNA 및 고형 지지체 위에 고정된 포획 프로브의 상보적인 염기쌍을 통하여 이루어진다. 다른 실시양태에서, 고형 지지체 상의 고정된 올리고(dT)에 하이브리드화하기 위해 대부분의 진핵세포 메신저 RNA에서 발견되는 3' 폴리 (A) 스트레치를 이용한다. 또다른 실시양태에서, 소정의 서열을 갖는 RNA를 포획하기 위해 특이적인 올리고뉴클레오티드또는 (50개 이상의 염기를 갖는) 긴 프로브를 사용할 수 있다. 또한, 다른 가능성은 표적 RNA 집단에서 다수의 관련 서열들을 포획하기 위한 축중 프라이머(올리고 뉴클레오티드)를 사용할 수도 있다. 하이브리드화 시간은 RNA 집단의 서열 복잡도와 사용되는 포획 프로브의 종류에 따라 좌우된다. 하이브리드화 온도는 사용되는 카오트로프의 종류와 카오트로프의 최종 농도에 따라 지시된다[참조. Van Ness and Chen, Nuc, Acids Res.]. 용해물은 우선적으로 표적 RNA를 확산시키기 위해 고형 지지체와 함께 계속 교반시킨다. 표적 핵산을 포획하는 단계가 완료되면, 용해물을 고형 지지체로부터 세척하여 모든 카오트로프 또는 하이브리드화 용액을 제거한다. 고형 지지체는 이온 또는 비이온성 세정제, 완충제 및 염을 포함하는 용액으로 우선적으로 세척하는 것이 적당한다. 다음 단계는 포획된 RNA에 상보적인 DNA의 합성 단계이다. 이 단계에서는 고정시킨 포획 올리고뉴클레오티드를 역전사를 위한 신장 프라이머로 사용한다. 반응은 일반적으로 25 내지 37℃에서 이루어지며, 중합 반응시에는 교반하는 것이 바람직하다. cDNA가 합성된 후, 포획된 올리고뉴클레오티드가 신장 프라이머로 사용되므로 cDNA는 고형 지지체에 공유 결합된다. 이어서, RNA를 cDNA/RNA 이중쇄로부터 가수분해한다. 이 단계는 이본쇄를 변성시키는 가열 또는 RNA를 화학적으로 가수분해시키기 위한 염기(즉, 0.1N NaOH)를 사용하여 실시할 수 있다. 이 단계에서 중요한 결과는 cDNA를 후속 단계에서 소정의 프로브와의 하이브리드화에 이용할 수 있다는 사실이다. 고형 지지체 또는 고형 지지체의 세트를 추가로 세정하고, RNA 또는 RNA 단편을 제거한다. 이 시점에서, 고체 지지체는 서열의 풍부성, 복잡성, 다양성에 의해 RNA 집단을 나타내는 cDNA 분자의 대표적 집단을 포함한다.
다음 단계는 존재 또는 부재 및 비교적 풍부한 특이적 cDNA서열을 동정하기위해 선택된 프로브를 고형 지지체와 하이브리드화시키는 것이다. 프로브는 우선적으로는 15 내지 50개 길이의 뉴클레오티드로 구성된다. 프로브의 서열은 분석의 최종 사용자가 기재한다. 예를 들면, 프로브이 최종 사용자가 조직의 염증 반응에서 유전자 발현을 연구하고자 한다면, 프로브는 다수의 사이토킨 mRNA, 지질을 조절하는 효소를 암호화하는 RNA, 염증 반응에 관여하는 세포를 조절하는 인자를 암호화하는 RNA 등에 상보적이 되도록 선택할 것이다. 일단, 한 세트의 소정의 서열이 연구를 위해 규정되면, 각 서열을 올리고뉴클레오티드 프로브로 제조하고, 각 프로브를 특이적인 절단가능한 태그에 할당한다. 태그(들)를 각 올리고뉴클레오티드(들)에 부착시킨다. 이어서, 올리고뉴클레오티드(들)를 적당한 하이브리드화 조건하에 고형 지지체 위의 cDNA와 하이브리드화한다. 하이브리드화 단계를 완료한후, 고형 지지체를 세척하여 하이브리드화되지 않은 프로브를 제거한다. 이어서, 고형 지지체 또는 지지체의 어레이를 질량 분광분석 태그를 절단시키는 용액에 배치한다. 질량 분광분석 태그를, 질량 분광분석기에 의해 측정하고 각 태그가 존재하는 질량을 동정하고 발현된 mRNA의 존재(및 풍부) 또는 부재를 결정한다.
4. 미생물, 특이적 유전자 발현, 또는 핵산의 특이적 서열의 검출
DNA 프로브의 절단가능한 태그와의 사용은 임의 형태의 샘플 또는 표본에 존재하는 미생물의 존재 또는 부재를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 일반적으로, 샘플은 이온성 세정제 또는 카오트로프를 이용하는 용해 단계를 거치고, 핵산을 고형 지지체 위에 특이적으로 또는 비특이적으로 고정시키고 표지된 DNA프로브로 탐지한다. 세정 단계에서 하이브리드화되지 않은 프로브를 제거하고, 태그를 각각의 프로브로부터 절단하여 측정한다.
검출가능한 핵산으로는, mRNA, 게놈 DNA, 플라스미드 DNA 또는 RNA, rRNA, 바이러스 DNA 또는 RNA가 있다. 표적 핵산을 검출하기 위해, 본 명세서에 기재되어 있는 분석이 균일하게 이루어지지 않으므로 표적은 일정한 형태의 고정을 필요로 한다: 특이적 또는 비특이적인 2가지 형태의 고정이 가능하다. 비특이적인 고정의 경우, 핵산을 핵산에 대하여 친화성을 갖는 고형 지지체 또는 기질에 고정시킨다. 이 때, 핵산을 정제하거나 비특이적으로 고정되기 전에 정제하지 않을 수 있다. 고형 지지체에는 나일론 막, 니트로셀룰로오스로 구성되는 막 등이 있다. 고형 지지체를 예비-결정된 서열의 표지된 올리고뉴클레오티드로 탐지하여 표적 핵산을 동정할 수 있다. 세정 단계에서 하이브리드화되지 않은 프로브를 제거하고,태그를 각각의 프로브로부터 절단한 다음 측정한다.
특정한 유전자 또는 DNA 서열의 존재에 관한 집단을 분석하기 위한 고도의 특이성을 발생시키는 다른 방법은 서던 블롯(Southern blot) 방법이다. 제조한 DNA를 제한 효소(RE)로 절단하고, 게놈 위의 제한 효소의 특이적 인식 부위의 존재에 의해 결정되는 각종 길이의 다수의 DNA 단편을 수득한다. 이러한 제한 부위 내측에 변이를 갖는 유전자의 대립유전자를 각종 수 및 길이의 단편들로 절단한다. 수득되는 제한 단편 길이 다형(RFLP)은 단편이 특이적으로 동정되는 경우 미생물 진단에 중요하다.
분석되는 단편을 DNA 단편 풀로부터 분리하고, 특이적 프로브를 사용하여 다른 DNA 종과 구별한다. 따라서, DNA를 일정한 형태의 겔 또는 크로마토그래피를 이용하여 전기영동 분획에 제공한 다음 나일론 또는 니트로셀룰로오스 막에 옮겨 고정시킨다. 고정된 일본쇄 DNA를 검출될 DNA에 상보적인 표지된 올리고뉴클레오티드와 하이브리드화한다. 비특이적 하이브리드화를 제거한 후, 하이르리화된 프로브로부터 태그(들)를 절단함으로써 표적 DNA 단편을 동정한다. 본원에 기재된 기술에서, 100개 이상의 프로브를 동시에 사용할 수 있다.
특이적 유전자 전사체의 존재 및 정량을 노던 블롯(Northern blot) 분석과 RNase 보호 분석으로 분석할 수 있다. 이들 방법의 기본 원리는 전체 세포 RNA의 풀을 특이적 표지된 프로브 또는 이들의 세트와 하이브리드화시키는 것이다. 노던 블롯 방법에서, 조직의 전체 RNA를 아가로즈 겔을 이용하여 전기영동으로 분별하고, 고형 지지체(나일론, 니트로셀룰로오스 등)에 옳겨 고정한다. RNA는 검출되는 RNA에 상보적인 표지된 올리고뉴클레오티드와 하이브리드화한다. 비특이적 하이브리드화를 제거한 후, 하이브리드화된 프로브로부터 태그(들)를 절단함으로써 목적 RNA 단편을 동정한다. 엄격한 세정 조건에 적용함으로써, 특이적으로 결합된 분자들에 비하여 하이브리드화가 약하므로 비특이적으로 결합된 분자를 배제한다. 도트 블럿 방법은 신속하지만 특이적이지 않으며, 이것은 RNA가 미리 분획되지 않고 막 위에 직접 적가되는 것을 제외하고는 노던 블롯 방법과 같이 수행된다.
mRNA 종의 검출을 위한 특이적인 방법은 RNase 보호 분석법이다. 조직 또는 세포 배양물로부터의 전체 RNA를 리보뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드의 표지된 프로브와 하이브리드화시킨다. 특이성은 순차적인 RNase 절단으로 달성된다. 하이브리드화되지 않은 일본쇄 RNA와 적은 미스매치를 갖는 비특이적으로 하이브리드화된 단편은 인식되어 절단되는 반면에, 이본쇄 RNA 또는 상동성 DNA/RNA 이중쇄는 효소에 접근가능하지 않고 보호된다. 특이적으로 보호된 단편을 분해 산물로부터 분리하고, 태그(들)를 각 프로브로부터 절단한 후, 측정한다.
조직 내의 세포의 특이적 집단에서 소정의 mRNA(또는 임의의 핵산 서열)의 정확한 위치를 하이브리드화를 통하여 결정할 수 있다. 하이브리드화 방법은 상기 에서 설명한 기술을 이용하는 전체 조직 RNA 제조물의 분석보다 민감하다. 이것은 mRNA가 조직의 매우 분리된 영역 또는 세포 형태에서 고농도로 발현되어 전체 조직의 균질화를 통하여 희석시키는 경우가 있다. 인 시투 하이브리드화에 있어서, 조직은 조직 화학 프로토콜에 따라 동결 또는 관류고정시키고 절편화해야 한다. 조직 절편과 사용되는 표지된 프로브에 대한 하이브리드화 프로토콜은 상기에서 설명한 다른 하이브리드화 방법과 동일하다. 정량 분석도 가능하다.
5. 변이 검출 방법
질병의 검출은 질병의 예방과 치료에 있어서 점차로 중요해지고 있다. 다인 자 질병은 유전자 시험을 고안하기가 곤란한 반면에, 200가지 이상의 질병은 단일유전자의 결손, 때로는 단일 아미노산 잔기의 변화에 의해 유발된다[참조: Olsen, Biotechnology: An industry comes of age, National Academic Press, 1986]. 이들 변이 중 대부분은 질병 상태를 초래하는 변형된 아미노산을 발생시킨다.
민감함 변이 검출 기술은 변이 스크리닝을 위한 특별한 가능성을 제공한다. 예를 들면, 수정란은 착상 전에도 분석이 가능하다[참조: Holding and Monk, Lancet 3:532, 1989]. 효율적인 유전자 시험은 점차, 건강 검진과 관련한 기관지 또는 방광으로부터 박탈된 세포에서 암유전자 변이를 스크리닝할 수 있다[참조: Sidransky et al., Science 252:706, 1991]. 또한, 미지의 유전자가 유전병을 초래한 경우, DNA 서열 변이체를 모니터하는 방법은 유전자 연쇄 분석을 통한 질병의 유전을 연구하기 위해 유용할 수 있다. 그러나, 개별 유전자에서 변이를 검출하고 진단하는 것은 기술적 및 경제적 과제를 제기한다. 몇가지 상이한 접근이 추구되었으나, 진정의 광범위한 적용에 충분한 효율성 및 비용 모두를 충족시키는 것은 없었다.
단일 뉴클레오티드를 포함하는 변이는 물리적, 화학적 또는 효소적 수단에 의해 샘플에서 동정할 수 있다. 일반적으로, 변이 검출 방법은 이전에 미지의 변이를 동정하는 데에 적합한 스크리닝 방법 및 공지의 서열 변이체를 검출하고 구별하고 또는 정량하기 위해 설계되는 방법으로 나누어진다.
변이 검출을 위한 몇가지 스크리닝 기술은 야생형 및 변이체 서열에서 유래하는, 특히 변성된 경우, 비정상적인 행동을 나타내는 미스매치된 상보적 DNA 쇄의 헤테로이중쇄에서 개발되었다. 이 현상을 변성 및 온도 구배 겔 전기영동법(각각DGGE 및 TGGE)에서 이용된다. 추가로 변성되는 구배 겔에서 전기영동시킨 경우, 단일 뉴클레오티드 위치에서만 미스매치된 이중쇄는 부분적으로 변성되어 이동을 지연시킨다[참조. Myers et al., Nature 313:495, 1985; Abrams et al., Genomics 7:463, 1990; Henco et al., Nucl. Acids Res. 18:6733, 1990]. 변이가 검출되어 도, 변이의 정확한 위치에 관한 정보는 수득되지 않는다. 변이체 형태는 더 단리하여 DNA 서열 분석에 제공된다.
또한, RNA 프로브와 표적 쇄의 헤테로이중쇄는 2개의 쇄가 적당하게 쌍을 이루지 않는 위치에서 RNase A로 절단된다. 절단 부위는 변성된 프로브의 전기영동을 통하여 결정된다. 그러나 몇가지 변이는 모든 미스매치가 RNase A에 의해 효율적으로 절단되는 것은 아니기 때문에 검출을 피할 수 있다.
이중쇄의 미스매치 염기들도 화학적인 변형을 받을 수 있다. 이와 같은 변형은 쇄가 미스매치 부위에서 절단되기 쉽고 폴리머라제를 후속되는 신장 반응에서정지시킨다. 화학적인 절단 기술은 2Kb까지의 표적 서열에서 변이의 동정을 가능하게 하고 미스매치 뉴클레오티드(들)의 대략적인 부위에 관한 정보를 제공한다[참조: Cotton et al., PNAS USA 85:4397, 1988; Ganguly et al., Nucl. Acids Res. 18:3933, 1991]. 그러나, 이 기술은 작업이 까다롭고 변이의 정확한 위치를 동정할 수 없는 단점이 있다.
DNA 쇄에서 변이를 검출하기 위한 대체 방법은, 정상 뉴클레오티드 중의 하나를 변형시킨 뉴클레오티드와 (합성시에) 치환하여, 생성물의 분자량 또는 다른 물리적인 파라미터를 변경시키는 것이다. 야생형 서열에 비하여 이와 같이 변형된 뉴클레오티드의 수가 증가하거나 감소한 쇄는 변경된 전기영동 이동성을 나타낸다 [참조: Naylor et al., Lancet 337:635, 1991]. 이 기술은 변이의 존재를 검출할 수 있지만, 변이 위치를 제공하지는 않는다.
다른 2가지 방법은 변경된 겔 이동에 의해 DNA 단편의 변이를 가시화할 수 있다. 일본쇄 입체형 다형 기법(SSCP)에서는 변이가 변성된 쇄를 상이한 구조로 하여 천연 겔 전기영동시에 이동성에 영향을 미친다. 내부 미스매치를 포함하는 헤테로이중쇄 DNA 분자도 전기영동에 의해 정확하게 매치된 분자로부터 분리된다 [참조: Orita, Genomics 5:874, 1989; Keen, Trends Genet. 7:5, 1991]. 앞서 논의한 기술과 마찬가지로, 변이의 존재는 결정되지만 위치는 결정되지 않는다. 또한, 이들 기술의 다수는 단일 변이와 다중 변이를 구별하지 못한다.
상기에 언급한 기술들은 모두 DNA의 제한된 단편에의 변이 존재를 나타내고,이중 일부는 절편 내의 대략적인 국재를 가능하게 한다. 그러나, 서열 분석은 절편의 암호 가능성에 대한 변이의 영향을 해명하기 위해 여전히 요구된다. 서열 분석은 매우 강력하여, 예를 들면, 발병된 가족의 다른 개체의 동일한 변이를 스크리닝하고 악성 질병의 경우에 질병의 진행을 모니터할 수 있으며, 자가 이식 이전에 골수에 잔존하는 악성 세포를 검출할 수 있다. 이와 같은 장점들에도 불구하고, 비용이 많이 들기 때문에, 이 방법은 보통의 진단법으로 채택될 것 같지는 않다.
다수의 다른 방법들이 고지의 서열 변이체를 분석하기 위해 개발되었다. 자동화와 절약은 개체와 일반 집단을 스크리닝하기 위해 적용되는 이러한 형태의 분석에 있어서 중요하게 고려해야 한다. 다음에 기재되는 기술들은 모두 절약 및 자동화를 요구되는 특이성과 조합시키지 않는다.
변이는 짧은 올리고뉴클레오티드 프로브의 표적 서열에 대한 하이브리드화에미치는 탈안정화 효과를 통하여 동정된다[참조: Wetmur, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol., 26:227, 1991]. 일반적으로, 이 기술의 대립유전자 특이적 올리고뉴클레오티드 하이브리드화 방법은 표적 서열의 증폭과 짧은 올리고뉴클레오티드 프로브와의 후속 하이브리드화를 포함한다. 증폭된 산물은, 고정시킨 올리고뉴클레오티드 프로브의 어레이에 대한 하이브리드화 패턴을 결정함으로써 많은 서열 변이체에 대하여 스캐닝할 수 있다.
그러나, 뉴클레오티드 서열 차이에 있어서 많은 다른 방법들을 구분하는 조건을 확립하는 것은 모두 서열 차이를 결정하기 위한 효소에 의존한다[참조: Saiki, PNAS USA 86:6230, 1989; Zhang, Nucl. Acids Res. 19:3929, 1991].
예를 들어, 제한 효소는 약 4-8개의 뉴클레오티드의 서열을 인식하다. 평균G+C 함량에 기초하여, DNA 절편에서 뉴클레오티드 위치의 약 절반이 100개의 제한효소의 패널로 모니터된다. 또는, 인공적 제한 효소 인식 서열은 부분적으로 미스매치된 프라이머를 사용함으로써 가변 위치 주위에서 생성된다. 이 기술을 이용하여, 변이체 또는 야생형 서열만이 증폭한 후 제한 효소로 인식되어 절단된다[참조: Chen et al., Anal. Biochem. 195:51, 1991; Levi et al., Caner Res 51:3497, 1991].
다른 방법은, 3' 방향의 두 번째 위치에서 표적 서열에 미스매치된 올리고뉴클레오티드 프라이머가 PCR에서 프라이머로서 작용하는 감소된 능력을 나타내는 성질을 이용한다. 그러나, 일부 3' 미스매치, 명확하게는 G-T는 이의 유용성을 제한하는 다른 것보다 덜 억제된다. 이 기술을 개선하기 위한 방책으로, 추가의 미스 매치가 3' 말단의 세 번째 위치에서 프라이머에 도입된다. 이는, 하나의 대립유전 자 변이체와 하이브리드화되는 프라이머의 3개의 3' 뉴클레오티드에 2개의 미스매치된 위치를 발생시키고, 프라이머가 다른 대립유전자 변이체와 하이브리드화되는경우에 3' 말단으로부터 세 번째 위치에서 하나의 미스매치된 위치를 발생시킨다 [참조: Newton et al., Nucl. Acids Res. 17:2503, 1989]. 1bp 미스매치의 증폭을위한 바람직한 증폭 조건을 정의하는 것이 필요하다.
DNA 폴리머라제는 어떤 뉴클레오티드가 표적 쇄의 가변 위치의 바로 상부의 올리고뉴클레오티드 프라이머에 첨가되는지를 결정함으로써 대립유전자 서열 변이 체를 구별하는 데에 사용된다.
연결 분석법도 개발되었다. 이 방법에서는 표적 쇄 위에 직접 병렬 위치에서 하이브리드화되는 2개의 올리고뉴클레오티드 프로브가 DNA 리가제에 의해 연결된다. 2개의 올리고뉴클레오티드 프로브가 서로 인접하는 미스매치가 있는 경우 연결이 억제된다.
a 변이 검출 검정
변이는 게놈 DNA에서 단일 염기쌍 변화이다. 본 발명의 상황에서, 이와 같은 변화 대부분은 문제되고 있는 서열과 상보적인 올리고뉴클레오티드와 하이브리드화하여 용이하게 검출할 수 있다. 본원에 기재되어 있는 시스템에서는 2개의 올리고뉴클레오티드가 변이를 검출하기 위해 사용된다. 한 개의 올리고뉴클레오티드는 야생형 서열을 가지며, 다른 올리고뉴클레오티드는 변이 서열을 갖는다. 2개의 올리고뉴클레오티드가 야생형 표적 게놈 서열 상의 프로브로서 사용되는 경우, 야생형 올리고뉴클레오티드는 완전한 염기쌍 구조를 형성하고, 변이 올리고뉴클레오티드 서열은 단일 염기쌍 미스매치를 갖는 이중쇄를 형성한다.
상기에서 논의한 바와 같이, 야생형 대 미스매치된 이중쇄의 Tm에서 6 내지 7℃의 차이는 두 종류의 이중쇄의 용이한 동정 또는 구별을 가능하게 한다. 이러한 구별을 위하여, 각각의 하이보트로프 용액에서 미스매치된 이중쇄의 Tm에서 하이브리드화를 수행한다. 이어서, 하이브리드화 정도를 올리고뉴클레오티드 프로브의 세트에 대하여 측정한다. 미스매치된 프로브에 대한 야생형 프로브의 하이브리드화 범위의 비를 측정하는 경우, 10/1 내지 20/1 이상의 값이 수득된다. 이와 같은 형태의 결과는 변이 검출에 대한 강력한 분석법의 개발을 가능하게 한다.
예시적인 목적을 위해, 하나의 변이 검출 검정 형식은 표적 핵산(예: 게놈DNA)와 목적 영역을 확장시키는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용한다. 올리고뉴클레오티드 프로브는 길이가 24nt 이상(최대로 약 36nt)이고, 올리고뉴클레오티드프로브의 3' 또는 5' 말단에 형광색소로 표지된다. 각각의 하이브리드화 용액에 조직 배양 세포, 조직, 장기 등을 용해시켜 목적 핵산을 수득한다. 이어서, 용해 용액을 표적 핵산을 변성키시는 온도(표적 핵산 이중쇄의 Tm보다 15-20℃ 높음)로 가열한다. 올리고뉴클레오티드 프로브를 변성 온도에서 가하고, 미스매치된 이중 쇄의 Tm에서 0.5 내지 24시간 동안 하이브리드화를 수행한다. 이어서, GF/C(GF/B등) 유리 섬유 필터를 통과시켜 게놈 DNA를 수집한다. 필터를 하이브리드화 용액으로 세척하여 하이브리드화되지 않은 올리고뉴클레오티드 프로브(RNA, 짧은 올리고와 핵산은 이 조건에서 유리 섬유 필터에 결합하지 않는다)를 제거한다. 이어서, 하이브리드화 올리고 프로브는 표적 DNA로부터 열적으로 용출되고 (형광에 의해) 측정된다. 고도의 감도를 요구하는 분석에는 프로브를 농축하여 측정한다.
매우 민감한 다른 프로토콜을 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 방법은 세포, 샘플 등에 존재할 것으로 의심되는 변이는 포함하는 핵산(즉, 표적 핵산)을 용이하게 분석할 수 있다. "표적 핵산"은, 이의 존재가 목적으로 되고 이의 존재 또는 부재가 하이브리드화 분석으로 검출될 수 있는 DNA 또는 RNA의 뉴클레오티드 서열을 함유한다. 본 발명에 따른 하이브리드화 방법은 또한 핵산의 복잡한 생물학적 혼합물(RNA 및/또는 DNA)에도 적용된다. 이와 같은 복잡한 생물학적 혼합물에는 프로토플라스트를 포함하는 광범위한 진핵세포와 원핵세포 및/또는 폴리뉴클레오티드 핵산을 갖는 다른 생물학적 물질들이 포함된다. 이 방법은 조직 배양 세포, 동물 세포, 동물 조직, 혈액 세포(예; 망상적혈구, 림프구), 식물 세포, 박테리아, 효모, 바이러스, 마이코플라즈마, 원생동물, 균류 등에도 적용된다. 공지 공급원의 핵산 프로브들 사이의 특이적 하이브리드화를 검출함으로써, 표적 핵산의 특이적 존재가 확립될 수 있다.
핵산의 복합 집단에서 표적 핵산을 검출학 위한 대표적인 하이브리드화 분석 프로토콜은 다음과 같이 기재할 수 있다: 표적 핵산을 겔 매트릭스 상에서 크기별로 분리하고(전기영동), 클로닝하고 분리한 다음에 풀로 세분화하건, 복합 집단으로 방치한다. 표적 핵산을 옮기고 스폿트하고 나일론 막 또는 니트로셀룰로오스 막과 같은 고형 지지체에 고정시킨다(여기서, "고정"은 "정렬"로 달리 표현할 수 있다). 이어서, 고정시킨 핵산을 가열 처리하거나 UV 조사하여 핵산을 비가역적으로 고정시킨다. 이어서, 막을 덴하르트 시약[참조: Dendhart, Biochem. Biophys. Res. Comm. 23:641, 1966], 혜파린[참조: Singh and Jones, Nucleic Acids Res. 12:5627, 1984], 및 무지방 건조유[참조: Jones et al., Gene Anal. Tech 1:3, 1984]를 포함하는 "차단제(blocking agent)"에 침지시킨다. 차단제는, 니트로셀룰로오스가 사용되는 경우, 일반적으로 예비하이브리드화 단계와 하이브리드화 단계모두에 포함된다. 이어서, 하이보트로프 용액에서 상기에 설명한 조건하에 표적 핵산을 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브로 탐지한다. 이어서, 결합하지 않은 효소를 세척하고 막을 기질 용액에 첨지한다. 이어서, 실질적으로 상기에 설명한 바 와 같이 시그날을 MALDI-MS로 검출한다.
b. 하이브리드화에 의한 서열화
종래에는 프라이머를 표적 DNA와 하이브리드화하고 폴리머라제를 사용하여 쇄를 신장시킴으로써 통상 DNA 서열 분석을 수행하였다. 디데옥시뉴클레오티드를포함시킴으로써 특이적 중단이 제어된다. 어닐링 완충제에 하이보트로프를 포함시키고 및/또는 프라이머에 무염기성 잔기를 도입하고 분별 온도에서 어닐링함으로써 이와 같은 형태의 분석에서 프라이밍의 특이성을 향상시킬 수 있다.
다른 서열 분석법은 무작위의 짧은 올리고뉴클레오티드와 표적의 하이브리드 화를 포함한다. 중복 하이브리드화 분석법으로 서열을 구성한다. 이 기술에서는 정확한 하이브리드화가 필수적이다. 하이보트로프 또는 무염기성 잔기의 사용 및 분별 온도에서의 어닐링은 미스매치된 하이브리드화를 감소시키거나 방지하기 위해 이러한 기술에 유용하다. 이 목적은 올리고뉴클레오티드 프로브의 대형 어레이 또는 핵산 샘플의 대형 어레이를 탐지하기 위해 자동화 하이브리드화 방법을 개발하는 것이다. 이와 같은 기술의 응용은 유전자 지도 작성, 클론 특성화, 의학 유전학, 유전자 발견, 하이브리드화에 의한 DNA 서열 분석, 및 마지막으로 서열화 증명 을 포함한다.
다수의 파라미터는 올리고뉴클레오티드 프로브를 자동화하고 또는 다중화하기 위해 조절되어야 한다. 각 프로브의 안정성은 유사해야 하고, 표적 핵산과의 미스매치 정도, 온도, 이온 강도, 프로브(또는 표적)의 A+T 함량 뿐만 아니라 프로브가 짧을 경우(즉, 6 내지 50개의 뉴클레오티드)의 다른 파라미터는 유사해야 한다. 통상, 실험 조건과 프로브의 서열은 완전한 염기쌍을 갖는 프로브의 형성이 미스매치를 포함하는 임의의 이중쇄보다도 열적으로 바람직할 때까지 조절된다. 하이브리드화에 의한 서열화(SBH), 외포성 섬유증 막관통 단백질 유전자 좌 등과 같은 고도의 다형 유전자 좌를 시험하는 것과 같은 프로브의 대규모 적용은 다중화 프로브 조절의 보다 엄격한 수준을 필요로 한다.
6. 어레이
정렬된 DNA 샘플에의 핵산 하이브리드화는 기초적인 생물학 연구에서 광범위한 적용에 장기간 이용되어 왔고, 현재에는 의학 진단, 법정, 농업에 사용되기 시작하고 있다. 다음에 보다 상세히 기재하는 바와 같이, 핵산 분자 또는 단백질은 어레이를 형성하기 위해 고형 지지체에 부착되고, 본 발명에 따른 표지된 분자로 시험된다.
예를 들면, 본 발명의 한가지 실시양태에서, 정렬된 DNA 샘플은 개별 클론의 동정에 사용된다. 간단히 말하면, 공지의 DNA 분자들을 표지하여 표지된 프로브를 제조하고, 미지의 클론의 어레이에 대하여 하이브리드화를 수행함으로써 시험한다.이어서, 프로브에 대해 특이적인 하이브리드화를 나타내는 클론을 분리한다. 이와같은 분석은 클론의 무순위 어레이를 이용하여 달성된다[참조: Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor, N.Y., 1989]. 또는, 공지의 각개의 동일성(대표적으로는 미지 서열이지만)을 갖는 클론의 조절된 스페이스의 어레이를 포함하는 막도 구입할 수 있다[예: Research Genetics, BAC clone arrays, Huntsville, AL).
다른 실시양태에서, 어레이는 많은 유전자의 전사 수준을 동시에 측정하기 위해 사용된다[참조: Gess et al , mammalian Genome 3:609-619, 1992]. 간단히 말하자면, c-DNA 풀에 표지시켜 특이적 조직에서 풍부하게 발현된 유전자를 동정하기 위해 cDNA 클론의 어레이에서 프로브로 사용한다. 또한, 각각의 cDNA 클론의 미소 어레이를 이용하여 2개의 상이한 RNA 샘플에서 각 유전자의 상대적 발현을 정량적으로 측정한다[참조: Schena et al., Science, 270:467-470, 1995]. 이를 보다 자세히 설명하면, 로봇을 이용하여 개별 클론으로부터의 PCR 산물의 미소 어레이를 생성한다. 어레이의 각 구성원은 단일 cDNA 클론에 대응된다. 어레이의 프로브는 태그를 갖는 각 조직 샘플로부터의 제1 쇄 cDNA를 표지함으로써 제조한다. 2개의 조직 샘플에서 유전자 발현을 비교하기 위하여, 각각으로부터의 cDNA를 다른 태그로 표지한다. 2개의 샘플을 풀링하고, 함께 어레이와 하이브리드화시킨다. 프로 브를 어레이와 하이브리드화시킨 후, 태그를 절단하고, 어레이 중의 각 샘플에 하이브리드화된 각 태그에 대해서 본 발명에서 설명한 바와 같이 분석한다. 소정의유전자에 있어서, 각 표지된 복합 cDNA 샘플에 대한 하이브리드화 비는 2개의 조직샘플에서 상대적인 유전자 발현을 측정한 것이다. 내부 대조군과 2개(또는 잠재적으로 4개까지)의 상이한 태그의 사용은 이 적용에 있어서 중요하다.
이하에 기재된 다른 적용의 대부분은 정렬된 DNA의 각종 공급원 및 프로브 DNA의 각종 공급원을 이용하는 기본 실험에 있어서 변화되지만, 각 적용은 하이브리드화 혼합물에 4 내지 6개 보다 적은 구별가능한 프로브로 종래의 검출 방법의 사용에 의해 한정된다.
원칙적으로 증명되어 매우 광범위한 적용가능성을 갖는 DNA 어레이에 대한 하이브리드화의 다른 적용은 하이브리드화에 의한 서열화(SBH)이다. SBH의 개념은 모든 가능한 n-뉴클레오티드 올리고머(n-mers)의 어레이를 사용하여 미지의 DNA 서열에 존재하는 n-mers를 동정하는 것이다. 이어서, 컴퓨터 방법을 이용하여 완전한 서열을 조립한다[참조: Drmanac et al., Science 260:1649-1652, 1993]. SBH의 적용은 중복 DNA 클론의 물리적인 지도 작성(차례로), 서열 검사, 정상 유전자와 발병 유전자를 비교하는 DNA 지문, 및 상보적 DNA와 게놈 라이브러리 중의 특이적 서열을 가진 DNA 단편의 동정 등이다.
또한, DNA 어레이는 유전자 변화와 다형의 검출에 있어서 광범위하게 적용된다. 공지의 서열 변이체를 고정시키고 환자 또는 병원체로부터의 표지된 PCR 산물로 탐지하여 단일 염기쌍 변화, 결실, 삽입, 변이 및 다형을 검출할 수 있다[참조: Guo et al, Nucleic Acids Res, 22:5456-5465, 1994]. 마찬가지로, 올리고뉴클레오티드의 어레이를 이용하여, HIV의 약물 내성 및 약물 감수성 변이체를 검출하는 것을 포함하여 유전자 변이를 측정할 수 있다[참조: Lipshutz et al., Biotechniques 19:442-447, 1995].
DNA 어레이는 2개 이상의 상이한 기술을 이용하여 생산된다: 개별적으로 생산한 샘플의 합성과 침착(액적에 의해). 인 시투 DNA 샘플을 생성하는 가장 현저한 방법은 올리고뉴클레오티드의 광지향성 합성이다[참조: Pease et al., P.N.A.S. USA 91:5022-6, 1994]. 간단히 말하면, 규정된 DNA 서열의 어레이를, 현대의 사진 식각법을 이용하여 어레이 중의 직접적 올리고뉴클레오티드 합성을 유도하는 광불안정화 보호 그룹을 이용함으로써 생성한다. 마스크를 제조하여 다음 합성 단계에서 특정 염기를 필요로 하는 각 어레이 구성물과 같은 마스크를 제조하고, 광에 노출시킨다. 단일 뉴클레오티드 잔기를 마스크에 의해 노출된 각 쇄에 첨가하고, 합성 주기를 종결한 다음, 다른 마스크와 다른 올리고뉴클레오티드 잔기를 이용하여 다음 합성 주기를 개시한다. 이러한 프로토콜의 연속적 적용은 매우 큰 올리고뉴클레오티드 어레이를 신속하게 구성하는 데에 사용된다. 로봇 침착의 한 유형은 전사 분석에 어레이를 이용한다[참조: Schena et al., 1995].
본 발명의 한가지 실시양태에서, 제2 구성원은 실리카, 석영 또는 유리와 같은 고체 지지체 위에 정렬된다. 이 어레이를 처리하여 비특이적 하이브리드화를 차단하고, 계속하여 고체 지지체 위에서 프로브를 표지한 제1 구성원을 배양한다.바람직한 실시양태에서, 비특이적으로 하이브리드화된 핵산을 제거하기 위해 어레이를 일정한 용액으로 (규정된 엄격함으로) 세척하고, 분광분석 또는 전위차분석 (예: 매트릭스 보조 레이저 해리 및 이온화 질량 분광분석)에 적합한 매트릭스 물질을 포함하는 용액으로 세정한 다음, 건조시켜 적당한 매트릭스를 형성하고, 광에 노출시켜 핵산 프로브로부터 태그를 절단한다. 이어서, 절단된 태그를 스펙트럼 분석 또는 전위차분석(예: MALDI-MS)으로 분석한다.
한가지 실시양태에서, 절단 및 레이저 해리는 한 단계로 일어난다. 다른 변형예에서는, 레이저 해리 및 이온화가 매트릭스를 사용하지 않고 수행된다. 어떤 실험예에서는, 참조 표지된 올리고뉴클레오티드 또는 다른 표지된 화합물을 매트릭스 용액에 첨가하여 광절단, 레이저 해리 및 MS 검출 효율에 있어서의 변동을 조절 한다. 시험 태그와 일련의 참조 태그간의 풍부함 비를 측정하여 MALDI-MS 데이터로부터 정량적 정보를 추출한다.
다른 실시양태에 따르면, 어레이는 길이로 5Obp 이하인 올리고뉴클레오티드를 포함하다. 이것을 이용하여 유전자 지도 작성을 위한 다형(예: 단일 염기쌍 변화)를 검출하거나, 클론, 친부확인 시험, 법의학, 유전자 지도 작성을 분석 또는 분류하고 샘플 내의 특정 DNA의 존재 또는 부재를 검출한다. 마찬가지로, 어레이는 단백질로 구성된다.
C. 핵산 단편의 분리
분리를 필요로 하는 샘플은 복합 매트릭스에 많은 성분들로 이루어진 혼합물이다. 미지의 화합물을 함유하는 샘플의 경우, 성분들을 각각 분리하여 각 성분을 다른 분리 방법으로 동정한다. 혼합물에서 성분의 분리 특성은 일정한 조건하에 일정하게 유지되므로, 일단 결정되면 이것은 성분 각각을 동정하고 정량하는 데에 이용할 수 있다. 이와 같은 방법은 크로마토그래피와 전기영동을 이용한 분리 분석에서 보편적이다.
1. 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)
고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)는 용액에 용해되어 있는 화합물들을 분리하기 위한 크로마토그래피 분리 기술이다. HPLC 기기는 이동상 수용체, 펌프, 주입 기, 분리 컬럼 및 검출기로 구성된다. 화합물은 일정 분량의 샘플 혼합물을 컬럼에 주입하여 분리한다. 혼합물에 존재하는 다른 성분은 이동상과 정지상 사이에서 분배 거동의 차이 때문에 상이한 속도로 컬럼을 통과한다.
최근에는, 화학 결합된 알킬 쇄를 갖는 비다공성 PS/DVB 입자의 IP-RO-HPLC가 일본쇄 및 이본쇄의 핵산 분석에서 유사한 정도의 분해능을 제공하는 모세관 전기영동법을 급속히 대체하고 있다[참조. Huber et al., 1993, Anal. Biochem., 212, p35l, Huber et al., 1993, Nuc. Acids Res., 21, pIO6l; Huber et al., 1993, Biotechniques, 16. p898]. 이본쇄 DNA를 쇄 길이의 함수로서 항상 유지시키지 않는 (AT 염기쌍은 양전하로 하전된 정지상과 GC 염기쌍보다 더 강하게 상호작용하므로) 이온 교환 크로마토그래피와 대조적으로, IP-IR-HPLC는 엄밀한 크기 의존성 분리가 가능하다.
IOOmM의 트리에틸암모늄 아세테이트를 이온쌍 시약으로 사용하는 방법이 개발되어, 포스포디에스테르 올리고뉴클레오티드를 고성능 액체 크로마토그래피로 알 킬화 비다공성 2.3o M 폴리(스티렌-디비닐벤젠) 입자 상에서 성공적으로 분리할 수있다[참조: Oefner et al., 1994, Anal. Biochem., 223, p39]. 이 기술은 50 내지 200 뉴클레오티드 크기 범위 내에서 4개 내지 8개의 염기쌍만이 상이한 PCR 생성물을 분리할 수 있다.
2. 전기영동법
전기영동법은 전기장에서 이온(또는 본 명세서에 기재되어 있는 바와 같은DNA)의 이동도를 기초로 하는 분리 방법이다. 음전하로 하전된 DNA는 양극으로 이동하고, 양전하로 하전된 이온은 음극으로 이동한다. 안전성을 위해서, 한 쪽의 전극은 접지시키고 다른 전극은 양성 또는 음성으로 바이어스시킨다. 전하를 띠는 화학종은 전체 전하, 크기 및 형태에 따라 이동 속도가 다르므로 분리할 수 있다. 전극 장치는 고전압 전원, 전극, 완충제 및 플리아크릴아미드 겔과 같은 완충제 지지체, 또는 모세관으로 구성된다. 개방 모세관을 많은 종류의 샘플에 사용하고, 다른 겔 지지체는 통상 단백질 혼합물 또는 DNA단편에 대한 생물학적 샘플에 사용된다.
3. 모세관 전기영동법(CE)
이의 각종 출현(유리 용액, 등속전기영동법, 등정점전기 영동, 폴리아크릴아미드 겔, 미세 전기운동 "크로마토그래피")에서의 모세관 전기영동법(CE)은 극소량의 복잡한 샘플 혼합물을 매우 높은 분해능으로 신속하게 분리하는 방법이다. MS와함께 사용하는 CE-MS는 생체분석에 매우 강력한 기술이다. 본 발명에서, 이들 두 방법을 연계함으로써 전류 속도가 비슷한 DNA 서열화를 효과적으로 할 수 있다.
CE와 전기분무 이온화법(ESI)은 유속이 비슷하고 용액 내의 이온성 화학종 분리에 용이하다는 사실로 인하여 함께 복합적으로 사용된다. ESl에 기초하여, 4중 극형 질량 분광분석계에 의한 모세관 영역 전기영동법(CZE)과 모세관 등속전기영동법을 복합적으로 사용할 수 있다[참조: Olivares et al., Anal. Chem. 59:1230, 1987; Smith et al., Anal. chem. 60:436, 1988; Loo et al., Anal. Chem. 179:404, 1989; Edmonds et al., J. Chroma. 474:21, 1989; Loo et al., J. Microcolumn Sep. 1:223, 1989; Lee et al., J. Am. Chromatog. 458:313, 1988; Smith et al., J. Chromatog. 480:211, 1989; Grese et al., J. Am. Chem. Soc. 111:2835, 1989]. 작은 펩티드는 펨타몰 수준에서 고감도로 CZE 분석으로 분석될 할 수 있다.
DNA 단편의 가장 강력한 분리 방법은 슬랩 겔 형의 폴리아크릴아미드 겔 전 기영동법(PAGE)이다. 그러나, 현재 기술의 주된 한계점은 서열화 반응에서 생성된 DNA 단편을 겔 전기영동법으로 분리하는 데에 비교적 오랜 시간이 소요된다는 것이다. 증대된 규모(10배)는 초박막 겔을 이용하는 모세관 전기영동법으로 달성할 수 있다. 제1의 유사치에 대응하는 유리 용액에서, 모든 DNA는 염기의 첨가가 질량과 전하를 보충하기 때문에 동일한 이동도를 갖는다. 폴리아크릴아미드 겔에서, DNA 단편들은 길이를 함수로 하여 이동하고, 따라서 이러한 방법은 이를 CE에 적용시킬 수 있다. 현재 가교 폴리아크릴아미드(미터당 10+7개의 플레이트)를 사용하여 1미터당 플레이트 수를 크게 증가시킬 수 있다[참조: Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 85:9660, 1988]. 이와 같은 CE 컬럼은 DNA서열화에 이용할 수 있다. 원칙적으로, CE 방법은 표준 서열화기에서 슬랩 겔 전기영동법보다 속도가 25배 빠르다. 예를 들면, 1시간당 약 300개의 염기를 해독할 수 있다. 분해 속도는 슬랩 겔 전기영동법에서 과도한 가열 생성물을 수반하지 않고 겔에 적용되는 전기장의 규모에 의해 한계가 있다. 따라서, 전기장 강도를 증가시켜(슬랩 겔 전기영동법에서 IOV/cm에 대하여 CE는 3OOV/cm) CE의 분리 속도를 증가시킬 수 있다. 모세관 형은 암페어수를 감소시켜 전원 및 생성되는 열생성을 감소시킨다.
처리 능력을 증대시키기 위해 다수의 모세관을 평행으로 이용하는 방법이 개발되었다[참조: Smith et al., Nuc. Acids. Res. 18:4417, 1990]. 마찬가지로, 분리를 모세관 평행한 어레이 위에서 실시하여 높은 서열화 처리 능력을 나타내는 모세관 전기영동법이 도입되었다[참조: Mathies and Huang, Nature. 359:167, 1992; Huang et al,, Anal. Chem. 64:967, 1992; Huang et al., Anal. Chem. 64:2149, 1992]. 모세관 전기영동법의 주요 단점은 모세관 위에 한정된 양의 샘플을 적재하여 사용할 수 있다는 점이다. 분리하기 전에, 모세관의 처음 부분에 다량의 샘플을 농축함으로써 부하능력을 증가시키고 검출 수준을 저하시킬 수 있다. CE에서 사전 농축 방법으로 가장 많이 사용되는 방법은 샘플 적층이다. 샘플의 적층은 최근 문헌[참조: Chien and Burgi, Anal. Chem. 64:489A, 1992]에 총설되어 있다. 샘플 적층은 샘플 완충제와 모세관 완충제의 매트릭스의 차이(pH, 이온 강도)에 의존하므로, 샘플 영역을 횡단하는 전기장은 모세관 영역보다는 크게 된다. 샘플 적층시, 저농도의 완충제에 용해된 다량의 샘플은 모세관 컬럼의 상부에 미리 농축시킨다.모세관은 동일 성분이지만 고농도의 완충제로 충전된다. 샘플 이온이 모세관 완충제 및 보다 낮은 전기장에 도달하는 경우, 이것은 농축 영역에 적층된다. 샘플 적층은 검출성을 1내지 3배 가량 증가시킨다.
예비농축의 다른 방법은, 분석물의 유리 영역 CE분리법을 수행하기 전에 등 속전기영동법(ITP)을 이용하는 것이다. ITP는 CE와 전형적으로 관련되는 낮은 nL 주입 용량과는 대조적으로, 마이크로리터 부피의 샘플을 모세관에 충진시키는 전기영동법이다. 이 방법에서는 분석물보다 이동도가 각각 크거나 작은 2개의 완충제(리딩 및 트레일링 전해액) 사이에 샘플을 삽입하는 것에 의존한다. 이 기술은 본래 분석물을 동일한 이동 속도로 순수 영역으로 집중시키는 농축 방법이다. 리딩 및 트레일링 전해액의 몇가지 선택의 필요성 및 분리 과정에서 양이온 또는 음이온의 화학종만을 분리하는 능력 때문에 이 기술은 현재 적층 기술보다 맡이 사용되지 않는다.
DNA 서열화 과정의 핵심은 DNA 또는 올리고뉴클레오티드 단편의 전기영동법에 의한 선택적인 분리이다. 이것은 각 단편들을 분리하고 뉴클레오티드에 따라 상이하므로 매우 뛰어난 기술이다. 1000개의 단편(1000bp)까지 분리할 수 있다. 절단가능한 태그를 사용하여 서열화하는 이점은 다음과 같다. 절단가능한 태그를 사용하면, DNA 단편을 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법에 의해 분리시키는 경우, 슬랩겔 형을 이용할 필요가 없다. 4 내지 2000개까지의 많은 샘플을 한꺼번에 처리하므로 현재의 염색-프라이머 또는 염색-터미네이터 방법(즉, ABIl373 서열화기)에서와 같이 샘플을 병행하게 작동하여 처리하지 않아도 된다. 평행한 레인을 작동할 이유가 없으므로 슬랩 겔을 사용할 이유가 없다. 따라서, 전기영동법에 의한 분리를 수행할 때 슬랩 겔 형 대신에 튜브 겔 형을 사용한다. 문헌[참조. Grossman et al., Genet. Anal. Tech. APPI. 9:9, 1992]은 슬랩 겔 형에 비하여 튜브 겔 형을 사용하는 경우 상당한 잇점이 수득됨을 기재한다. 이것은 슬랩 겔에 비하여 튜브 겔 형에 있어서 주울 열을 크게 분산시키기 때문에 이 능력은 운전 시간이 보다 빠르고(50%) 고분자량 DNA 단편(1000nt 이상)의 분해능을 높일 수 있다. 긴 해독은 게놈 서열화에 중요하다. 따라서, 절단가능한 태그를 서열화에 사용함으로써 사용 자가 최고의 분해능을 갖는 가장 효율적이고 민감한 DNA 분리법을 사용할 수 있다는 잇점이 있다.
4. 대량 생산 장치
모세관 전기영동법(CE)은 DNA 서열화, 법의학적 분석, PCR 산물 분석 및 제 한 단편 크기 조정에 이용되는 매우 강력한 기술이다. CE는 모세관 겔을 이용하여 훨씬 큰 전기장을 적용하므로 종래의 슬랩 PAGE보다 훨씬 신속하다. 그러나, CE는 겔 하나에 오직 한 개의 샘플만을 처리할 수 있다는 단점이 있다. 이 방법은 CE의 신속한 분리 시간과 복수의 샘플을 동시에 분석할 수 있는 능력을 조합한다. 대량 생산 장치 사용의 기본 개념은 레인 치수를 약 100 마이크로미터로 소형화함으로써 전기영동법의 정보 밀도를 증가시키는 능력이다. 전자 산업에서는 1마이크론 이하의 크기를 갖는 회로의 제조에 대량 생산을 통상 적용하고 있다. 모세관 어레이의 전류 밀도는 모세관의 경외에 의해 제한된다. 채널의 대량 생산은 어레이의 밀도를 보다 증가시킨다. 또한, 대량 생산은 유리 섬유를 사용할 수 없는 물리적 조립을 가능하게 하고, 채널을 한 개의 칩 위에서 다른 장치에 직접 연결시킨다. 소수의 장치가 분리 기술용으로 마이크로칩 위에 구성되어 있다. 기체 크로마토그래피[참조: Terry et al., IEEE Trans. Electron Device, ED-26:1880, 1979)와 액체 크로마토그래피(Manz et al., Sens. Actuators Bl:249, 1990]가 실리콘칩 위에서 제조되고 있으나, 이들 장치는 널리 사용되지 않고 있다. 몇몇 그룹은 대량 생산 장치 위에서 형광 색소와 아미노산을 분리시키는 방안에 대하여 보고한 바 있다[참조: Manz et al., J. Chromatography 593:253, 1992, Effenhauser et al., Anal. Chem. 65:2637, 1993]. 최근에는, 사진식각법과 화학식각법을 사용하여 유리 기판 위에 다량의 분리 채널을 제조하는 기술이 개발되었다[참조: Wooley and Mathies, Proc. Natl. Acad. Sci. 91:1l348, 1994]. 분리 채널은 하이드록시에틸 셀룰로오스(HEC) 분리 매트릭스로 충전된다. 이것은 DNA 제한 단편들을 2분 이내에 분리할 수 있는 것으로 밝혀졌다.
D. 태그의 절단
상기에 설명한 바와 같이, 상이한 링커의 설계는 다양한 특정 물리적 또는 화학적 조건하에 절단가능성("불안정성")을 나타낸다. 다양한 링커를 분해시키는 조건의 예에는 산, 염기, 산화, 환원, 불소, 티올 교환, 광분해 및 효소 조건이 있다.
상기에 열거한 링커로서의 일반 기준을 충족시키는 절단가능한 링커는 공지된 것이며, 피어스[Pierce(Rockford, IL)]에서 발간한 카다로그에 제시된 절단가능한 링커를 포함한다. 그 예를 들면 다음을 포함한다:
· 에틸렌 글리코비스(석신이미딜석시네이트)(EGS), 하이드록실아민(1 M, 37 ℃, 3-6시간)에 의해 절단되는 아민 반응성 가교제;
· 0.0015 M 과요오드산나트륨에 의해 절단되는 아민 반응성 가교제인 디석신이미딜 타르트레이트(DST)과 설포-DST;
· 염기(pH 11.6)에 의해 절단되는 아민 반응성 가교제인 비스[2-(석신이미딜옥시카보닐옥시)에틸]설폰(BSOCOES)과 설포-BSOCOES;
· 1,4-디-[3'-(2'-피리딜디티오(프로피온아미도)]부탄(DPDPB), 티올 교환 또는 환원에 의해 절단되는 피리딜디티올 가교제;
· N-[4-(p-아지도살리실아미도)-부틸]-3'-(2'-피리딜디티오)프로피온아미드(APDP), 티올 교환 또는 환원에 의해 절단되는 피리딜디티올 가교제;
· 비스-[베타-4-(아지도살리실아미도)에틸]-디설파이드, 티올 교환 또는 환원에 의해 절단되는 광반응성 가교제;
· N-석신이미딜-(4-아지도페닐)-1,3'-디티오프로피오네이트(SADP), 티올 교환 또는 환원에 의해 절단되는 광반응성 가교제;
· 설포석신이미딜-2-(7-아지도-4-메틸쿠마린-3-아세트아미드)에틸-1,3'-디티오프로피오네이트(SAED), 티올 교환 또는 환원에 의해 절단되는 광반응성 가교제;
· 설포석신이미딜-2-(m-아지도-o-니트로벤즈아미도)에틸-1,3'-디티오프로피오네이트(SAND)과, 티올 교환 또는 환원에 의해 절단되는 광반응성 가교제.
태그 방출에 사용되는 절단가능한 링커와 절단 조건의 다른 예는 아래와 같다. 실릴 연결 그룹은 불소에 의하거나 산성 조건하에 절단된다. 3-, 4-, 5- 또는 6-치환-2-니트로벤질옥시 또는 2-, 3-, 5-, 또는 6-치환-4-니트로벤질옥시 연결 그룹은 광자 공급원(광분해 작용)에 의해 절단된다. 3-, 4-, 5- 또는 6-치환-2-알콕시페녹시 또는 2-, 3-, 5- 또는 6-치환-4-알콕시페녹시 연결 그룹은 Ce(NH4)2(NO3)6(산화)에 의해 절단된다. NCO2(우레탄) 링커는 수산화물(염기), 산, 또는 LiAlH4(환원)에 의해 절단된다. 3-펜테닐, 2-부테닐, 또는 1-부테닐 연결 그룹은 O3, OSO4/IO4-, 또는 KMnO4(산화)에 의해 절단된다. 2-[3-, 4- 또는 5-치환-퓨릴]옥시 연결기는 O2, Br2, MeOH 또는 산에 의해 절단된다.
다른 연결 그룹은 절단시키는 조건은 다음과 같다: t-알킬옥시 연결 그룹은 산에 의해 절단되고; 메틸(디알킬)메톡시 또는 4-치환-2-알킬-1,3-디옥솔란-2-일 연결 그룹은 H3O+에 의해 절단되고; 2-실릴에톡시 연결 그룹은 불소 또는 산에 의해 절단되고; 2-(X)-에톡시(여기서, X는 케토, 에스테르 아미드, 시아노, NO2, 설파이드, 설폭사이드, 설폰이다) 연결 그룹은 산 또는 환원 조건하에 절단되고; 2-, 3-, 4-, 5- 또는 6-치환-벤질옥시 연결 그룹은 산 또는 환원 조건하에 절단되고; 2-부테닐옥시 연결 그룹은 (Ph3P3)RhCl(H)에 의해 절단되고; 3-, 4-, 5- 또는 6-치환-벤질옥시 연결 그룹은 Li, Mg, 또는 BuLi에 의해 절단되고; 메틸티오메톡시 연결 그룹은 Hg2 +에 의해 절단되고; 2-(X)-에틸옥시(여기서, X는 할로겐이다) 연결 그룹은 Zn 또는 Mg에 의해 절단되고; 2-하이드록시에틸옥시 연결 그룹은 산화(예: Pb(OAc)4)에 의해 절단된다.
연결 그룹은 산 또는 광분안정성에 의해 절단되는 것이 바람직하다. 고상 펩티드 합성법을 위한 몇가지의 산불안정화 링커가 태그를 MOI에 연결시키는 데에 유용하다. 이들 링커 중의 일부는 문헌[참조: Lloyd-Williams et al., Tetrahedron 49:11065-11133, 1993]에 기재되어 있다. 특히 유용한 형태의 링커는 p-알콕시벤질 알콜을 기본으로 하는 것으로서, 4-하이드록시메틸페녹시아세트산과 4-(4-하이드록시메틸-3-메톡시페녹시)부티르산의 2가지가 있다[어드밴스트 켐테크(Advanced ChemTech, Louisville, KY) 공급]. 이 2가지 링커 모두가 벤질알콜과 결합하는 에스테르 결합을 통하여 태그에 부착되고, 카복실산과 결합하는 아미드 결합을 통하여 아민-함유 MOI에 부착된다. 이들 분자에 의해 연결된 태그는 다양한 농도의 트리플루오로아세트산을 이용하여 MOI로부터 방출된다. 이들 링커가 절단되면, 태그 상에 카복실산이 유리된다. 어드밴스트 켐테크에서 FMOC가 보호된 형태로 공급되는 2,4-디메톡시-4'-(카복시메틸옥시)-벤즈하이드릴아민과 같이 관련 링커를 통하여 부착된 태그를 산으로 절단하면 방출된 태그 위에 카복실 아미드가 유리된다.
이 응용에서 유용한 광불안정화 링커도 대부분 고상 펩티드 합성법을 위하여 개발되었다(Lloyd-Williams 논문 참조). 이들 링커는 2-니트로벤틸에스테르 또는 2-니트로벤질아미드를 기본 물질로 한다. 최근 문헌에 보고된 광불안정화 링커의 예를 들면, 4-(4-(1-Fmoc-아미노)에틸)2-메톡시-5-니트로페녹시)부탄산[참조: Holmes and Jones, J. Org. Chem. 60:2313-2319, 1995]와 3-(Fmoc-아미노)-3-(2-니트로페닐)프로피온산[참조: Brown et al., Molecular Diversity 1:4-12, 1995]가 있다. 이 2가지 링커는 모두 카복실산을 통하여 MOI 상의 아민과 결합한다. 태그 위의 카복실산과 링커 위의 아민 사이에 아미드를 형성함으로써 태그가 링커에 부착된다. 광불안정화 링커는 공지된 강도와 시간의 조건에서 350 nm의 파장을 갖는 UV 광선에 의해 절단된다. 광화학 절단을 위한 상용 장치는 아우라 인더스트리즈 인코포레이티드(Aura Industries Inc., Staten Island, NY)와 아그레네틱스(Agreneics, Wilmington, MA)가 시판중이다. 링커가 절단되면 태그 상에 1급 아민이 유리된다. 광불안정화 링커에는 니트로페닐 글리신 에스테르, 엑소- 및 엔도-2-벤조노르보르네일 클로라이드 및 메탄 설페이트, 및 3-아미노-3(2-니트로페닐)프로피온산이 있다. 효소 절단의 경우는 에스테르 결합을 절단하는 에스테르제, 포스포디에스테르 결합을 절단하는 뉴클레아제 및 펩티드 결합을 절단하는 펩티다제 등이 있다.
E. 태그의 검출
일반적으로 검출 방법은 몇몇 형태의 스펙트럼 영역에서 흡수와 발광에 의존한다. 원자 또는 분자가 광을 흡수하는 경우, 입사 에너지가 양자화된 구조를 높은 에너지 수준으로 여기시킨다. 여기 형태는 광의 파장에 따라 다르다. 전자는 자외선 또는 가시 광선에 의해 높은 궤도로 황성화하고, 분자 진동이 적외선에 의해 여기되고, 회전이 마이크로파에 의해 여기한다. 흡수 스펙트럼은 파장의 함수로서 광의 흡수이다. 원자 또는 분자의 스펙트럼은 그 에너지 수준 구조에 의존한다. 흡수 스펙트럼은 화합물의 동정에 유용하다. 특정한 흡수 분광법에는 원자 흡수 분광법(AA), 적외선 분광법(IR) 및 UV-vis 분광법(uv-vis)이 포함된다.
높은 에너지 수준으로 여기되는 원자 또는 분자는 방선 반사에 의해 낮은 에너지 수준으로 떨어진다. 이 발광은 전이가 동일한 스핀의 상태 사이에서 일어나면 형광이라고 하고, 전이가 상이한 스핀 상태 사이에서 일어나면 인광이라고 한다. 분석물의 발광 강도는 농도(낮은 농도에서)에 선형으로 비례하고, 발광 화학종을 정량하는 데에 유용하다. 발광 분광법에는 원자 발광 분광법(AES), 원자 형광 분광법(AFS), 분자 레이저-유도 형광(LIF) 및 X선 형광(XRE)이 포함된다.
전자파가 물질을 통과하면, 광선의 대부분이 원래의 방향대로 진행하지만, 일부는 다른 방향으로 산란된다. 입자광으로서 동일한 파장에서 산란되는 광을 레이라이(Rayleigh) 산란이라 한다. 진동(광자)에 의해 투명한 고체에서 산란되는 광을 브릴로우인(Brillouin) 산란이라 한다. 브릴로우인 산란은 전형적으로 입사광으로부터 0.1 내지 1 파수만큼 이동한다. 분자 중의 진동 또는 불투명한 고체에서 광학적 포논에 의해 산란되는 광을 라만 산란이라 한다. 라만 산란은 입사광으로부터 4000 파수만큼 이동한다. 특정 산란 분광법에는 라만 분광분석이 포함된다.
IR 분광분석은 샘플에 의한 중간 적외선 흡수 파장과 강도를 측정하는 것이다. 중간 적외선 광(2.5 내지 50μm, 4000 내지 200cm-1)은 분자 진동을 높은 에너지 수준으로 여기시킬만큼 에너지가 충분히 크다. IR 흡수 대역의 파장은 화학 결합의 종류에 따라 다르고, IR 분광분석은 유기 및 유기 금속 분자의 동정에 가장 유용하다.
근적외선 흡수 분광분석(NIR)은 샘플에 의한 근적외선 흡수 파장과 강도를 측정하는 것이다. 근적외선의 광의 범위는 800nm 내지 2.5μm(12,500 내지 4,000cm-1)이고, 분자 진동의 배음과 조합에 의해 높은 에너지 수준으로 여기시킬만큼 에너지가 충분히 크다. NIR 분광분석은 전형적으로 유기 관능기, 특히 O-H, N-H, C=O의 정량적 측정에 이용된다. NIR 기계류의 성분과 구성은 uv-vis 흡수 분광계와 유사하다. 광원은 통상 텅스텐 램프이고, 검출기는 PbS 고상 검출기이다. 샘플 홀더는 유리 또는 석영이고 용매는 전형적으로 CCl4와 CS2이다. NIR 분광 분석의 이용은 온라인 연구와 과정 제어에 적합하다.
자외선과 가시광선 흡수 분광분석(uv-vis)은 샘플에 의한 근자외선 및 가시광선 흡수 파장과 강도를 측정하는 것이다. 진공 UV 흡수는 100-200 nm(105 내지 50,000cm-1)에서 발생하고, 석영 UV 흡수는 200 내지 350nm(50,000 내지 28,570cm-1)에서, 가시 광선 흡수는 350 내지 800nm(28,570 내지 12,500cm-1)에서 발생한다. 이는 비어-램버트-브라우그에트(Beer-Lambert-Brouguet) 법칙으로 설명된다. 자외선과 가시광선은 외각 전자를 높은 에너지 수준으로 촉진시킬만큼의 에너지를 갖는다. UV-vis 분광분석은 통상 용액에서의 분자의 무기 이온 또는 착체에 적용된다. UV-vis 스펙트럼은 스펙트럼이 넓은 한계가 있다. 광원은 통상 자외선 측정의 경우에 수소 또는 중수소 램프이고, 가시광선 측정인 경우에는 텅스텐 램프이다. 이들 연속 광원의 파장은 프리즘 또는 격자 회절기와 같은 파장 분리기를 사용하여 선택된다. 파장 분리기를 주사하여 스펙트럼을 수득하고 정량적인 측정을 스펙트럼으로부터 단일 파장에 대하여 실시한다.
질량 분광분석기는 이온화된 원자 또는 분자의 질량 대 전하 비(m/z)의 차이를 이용하여 이들을 서로 분리하는 것이다. 질량 분광분석법은 원자 또는 분자의 정량에 이용되고, 분자에 대한 화학적 및 구조적인 정보를 결정하는 데 유용하다. 분자는 화합물을 동정하기 위한 구조 정보를 제공하는 특유한 분할 패턴을 갖는다. 질량 분광분석기의 일반적인 조적은 다음과 같다. 기체 상태의 이온을 제조하고 이온을 질량 대 전하 비(m/z)에 따라 시간 또는 공간적으로 분리한다. 이어서, 질량 대 시간 비에서 이온의 양을 측정한다. 질량 분광분석기의 이온 분리력은 분해능으로 설명할 수 있으며, 이것은 R = m/Δ m으로 정의된다(여기서, m은 이온 질량이고 Δ m은 질량 스펙트럼에서 2개의 분리가능한 피크간의 질량 차이이다. 예를 들면, 분해능이 1000인 질량 분광분석기는 m/z이 100.0인 이온을 m/z이 100.1인 이온으로부터 분리할 수 있다.
일반적으로, 질량 분광분석기(MS)는 이온 공급원, 질량 선택적 분석기 및 이온 검출기로 구성된다. 자기 섹터 MS형, 4중극형 MS 및 비행시간형 MS도 이온광을 추출하고 가속하여 이온을 공급원 영역으로부터 질량 분광분석기로 전달한다. 몇가지 질량 분광분석기(자기 섹터 MS, 4중극형 MS, 또는 비행시간형 MS에 대하여)의 설계에 대한 상세한 설명이 아래에 설명된다. 자기 섹터 MS의 단일 집속형 분석기는 180°, 90°, 60°의 입자 빔 경로를 이용한다. 입자에 영향을 미치는 다양한 힘은 상이한 질량 대 전하 비를 갖는 이온을 분리한다. 이중 집속형 분석기의 경우, 정전기적 분석기를 이러한 장치에 추가하여 입자를 동력학적 에너지의 차이에 따라 분리한다.
4중극형 MS의 4중극형 질량 필터는 병렬로 배열된 4개의 금속 막대로 구성된다. 전압을 인가하면, 이온이 4개의 금속 막대 사이에 집중되는 비행 경로로 진행한다. 소정의 DC 및 AC 전압에서, 특정한 질량 대 전하 비를 갖는 이온만이 4중극형 필터를 통과하고 나머지 이온들은 원래의 경로로 진행한다. 질량 스펙트럼은 금속 막대에 인가하는 전압을 변화시키면서 4중극형 필터를 통과하는 이온을 모니터하여 수득한다.
비행시간형 MS는 "표류 영역"을 통과하는 이동 시간의 차이를 이용하여 이온을 질량에 따라 분리한다. 펄스 방식으로 가동하므로 이온을 펄스 형태로 생성시키고 및/또는 추출해야 한다. 펄스 전기장은 qV의 동력학적 에너지로 모든 이온을 전기장이 없는 표류 영역으로 향하게 가속시킨다(여기서, q는 이온 전하이고, V는 인가 전압이다). 이온의 동력학적 에너지가 0.5 mV2이면, 가벼운 이온은 무거운 이온보다 큰 속도를 가지고, 먼저 표류 영역의 말단의 검출기에 도달한다. 이온 검출기의 출력을 시간 함수로 오실로스코프에 표시하여 질량 스펙트럼을 수득한다.
이온 형성 방법은 질량 분광분석의 시작이다. 화학 이온화는 분석 분자(태그)와 반응하여 광자 또는 수소 이온 이동에 의해 이온을 형성하는 시약 이온을 사용하는 방법이다. 시약 이온은 과량(태그에 대하여)의 메탄을 전자 충격(EI) 이온 공급원에 주입하여 생성시킨다. 이온들이 충돌하여 CH4 +와 CH3 +를 생성하고, 이 이온들은 메탄과 반응하여 CH5 +와 C2H5 +를 형성한다. 태그를 이온화시키는 다른 방법은 플라즈마와 섬광 방전물을 이용하는 것이다. 플라즈마는 효과적으로 원자들을 여기하고 이온화시키는, 고온의 부분적으로 이온화된 기체이다. 섬광 방전은 2개의 전극 사이에 유지되는 저압의 플라즈마이다. 전자 충격 이온화는 텅스텐 필라멘트에서 통상 발생하는 전자 빔을 이용하여 기체 상태의 원자 또는 분자를 이온화시킨다. 전자 빔에서 나온 전자는 전자를 분석물의 원자 또는 분자로부터 전자를 탈락시켜 이온을 생성한다. 전기분무 이온화는 매우 미세한 침과 일련의 스키머를 사용한다. 샘플 용액을 공급원 챔버에 분무하여 액적을 형성한다. 이렇게 해서 형성된 샘플 액적이 전하를 포함하고, 모세관 입구의 용매에 의해 증발되어 소실되면 높은 전하를 갖는 분석물 분자만 남는다. ESI는 증발 또는 이온화가 곤란한 거대 생분자에 특히 유용하다. 고속 원자 충격(FAB)은 탈리 및 이온화를 유발하는 고체 샘플에 충돌하는 Xe 또는 Ar과 같은 중성 원자의 고에너지 빔을 이용한다. 기체 상태로 되기가 어려운 거대 생분자에 유용하다. FAB는 모두 분할을 일으키지 않고, 따라서 거대 분자 이온 피크만을 나타내므로 분자량 결정에 유용하다. 전하 교환 셀을 통하여 이온 공급원으로부터 이온을 가속시킴으로써 원자 빔이 생성된다. 이온은 중성 원자와 충돌할 때 원자를 포획하여 고에너지의 원자 빔을 형성한다. 레이저 이온화(LIMS)는 레이저 펄스가 샘플의 표면으로부터 물질을 제거하여 샘플 성분의 일부를 이온화시키는 마이크로플라즈마를 생성하는 방법이다. 매트릭스-보조 레이저 탈리 이온화(MALDI)는 단백질 또는 DNA 단편과 같은 거대 생분자를 증발시키고 이온화시키는 LIMS법이다. 생분자를 니코티산과 같은 고형 매트릭스에 분산시킨다. UV 레이저 펄스는 거대 분자를 이온 형태의 기체상으로 운반하는 매트릭스를 제거하여 질량 분광분석기로 추출된다. 플라즈마-탈리 이온화(PD)는 서로 반대 방향으로 이동하는 2개의 분열 단편을 생성하는 252Cf의 파괴를 이용한 것이다. 한 개의 분열 단편은 샘플과 충돌하여 1-10개의 분석물 이온을 생성한다. 다른 분열 단편은 검출기와 충돌하여 데이터 측정을 유발한다. 이 이온화법은 거대 생분자에 유용하다. 공명 이온화(RIMS)는 한 개 이상의 레이저 빔을 공명으로 동조시켜 기체상의 원자 또는 분자의 전이를 단계별로 이온화 전위 이상으로 증가시켜 이온을 생성하는 방법이다. 2차 이온화(SIMS)는 3He+, 16O-, 또는 40Ar+과 같은 이온 빔을 샘플의 표면으로 집속시켜 표면 물질을 기체 상태로 스퍼터링하는 방법이다. 스파크 공급원은 전류를 2개의 전극에 횡단으로 펄스함으로써 고체 샘플에 있는 분석물을 이온화하는 방법이다.
태그는 분자로부터 절단되기 전, 절단되는 동안 또는 절단된 후에 하전된다. 이온 "탈리"에 따른 이온화 방법과 고체 또는 액체 표면으로부터 이온의 직접적인 형성 또는 발광은 비휘발성의 열적으로 불안정한 화합물의 분석에 유용하다. 이들 방법은 이온화 이전에 중성 분자를 증발시키는 필요성을 생략하고 일반적으로 분자의 열분해를 최소화한다. 이와 같은 방법에는 전계탈리[참조: Becky, Principles of Field Ionization and Field Desorption Mass Spectrometry, Pergamon, Oxford, 1977], 플라즈마 탈리[참조: Sundqvist and Macfarlane, Mass Spectrom. Rev. 4:421, 1985], 레이저 탈리[참조: Karas and Hillenkamp, Anal. Chem. 60:2299, 1988; Karas et al., Angew. Chem. 101:805, 1989], 고속 입자 충격(예: 고속 원자 충격(FAB), 2차 이온 질량 분광분석법(SIMS); Barber et al., Anal. Chem. 54:645A, 1982), 열분무(TS) 이온화[참조: Vestal, Mass Spectrom. Rev. 2:447, 1983]이 포함된다. 열분무 이온화는 액체 크로마토그래피와 함께 온라인으로 폭넓게 사용된다. 연속 흐름 FAB법[참조: Caprioli et al., Anal. Chem. 58:2949, 1986]도 현저한 가능성을 나타낸다. 그 밖의 이온화/질량 분광분석법에는 이온-트랩 질량 분광분석법, 전기분무 이온화 질량 분광분석법, 이온 분무 질량 분관분석법, 액체 이온화 질량 분광분석법, 대기압 이온화 질량 분광분석법, 전자 이온화 질량 분광분석법, 준안정 원자 폭발 이온화 질량 분광분석법, 고속 원자 폭발 이온화 질량 분광분석법, MALDI 질량 분광분석법, 광이온화 비행시간형 질량 분광분석법, 레이저 액적 질량 분광분석법, MALDI-TOF 질량 분광분석법, APCI 질량 분광분석법, 나노분무 질량 분광분석법, 분무 이온화 질량 분광분석법, 화학 이온화 질량 분광분석법, 공명 이온화 질량 분광분석법, 2차 이온화 질량 분광분석법 및 열분무 질량 분광분석법이 있다.
비휘발성 생물학적 화합물을 분석하는 이온화 방법은 적용 범위가 중복된다. 이온화 효율은 매트릭스 성분과 화합물의 형태에 따라 크게 달라진다. 현제 이용할 수 있는 결과는 TS의 상한 분자량이 약 8000 달톤[참조: Jones and Krolik, Rapid Comm. Mass Spectrom. 1:67, 1987]이다. TS가 주로 4중극형 질량 분광기에 사용되므로 감도는 전형적으로 보다 높은 질량 대 전하 비(m/z)에 비부분적으로 영향을 받는다. TOF 질량 분광분석기는 시판되고 있으며, m/z 범위가 검출기 효율에 의해서만 제한되는 장점이 있다. 최근에는 2가지 또다른 이온화 방법이 도입되었다. 이들 방법은 매트릭스-보조 레이저 탈리(MALDI)[참조: Karas and Hillenkamp, Anal. Chem. 60:2299, 1988; Karas et al., Angew. Chem. 101:805, 1989]와 전기분무 이온화(ESI)이다. 이 2가지 방법은 이온화 효율이 매우 높다(즉, [생성된 분자 이온수]/[소비된 분자수]가 매우 높다). 기술의 최종 가능성을 규종하는 감도는 샘플의 크기, 이온량, 유속, 검출 효율 및 실제 이온화 효율에 따라 달라진다.
전기분무-MS는 1960년대에 최초로 제안되었다[참조: Dole et al., J. Chem. Phys. 49:2240, 1968]. 전기분무 이온화(ESI)는 질량 분광분석법에 의한 분석을 위하여 하전된 분자를 생성하는 수단이다. 간단히 말하면, 전기분무 이온화는 강한 정전기장에 액체를 분무시켜 고도로 하전된 액적을 생산하는 것이다. 대기압의 건조한 기체 안에서 일반적으로 형성되는 고도로 하전된 액적은 전하 반발력이 접착력보다 커서 "쿨롱 충격"을 일으킬 때까지 중성 용매의 증발에 의해 수축된다. 이온화 과정은 정확한 기작은 논쟁의 여지가 많으나, 몇몇 그룹은 가설을 제시하였다 [참조: Blades et al., Anal. Chem. 68:2199-14, 1991; Kebarle et al., Anal. Chem. 65:A972-86, 1993; Fenn, J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 4:524-35, 1993]. 이온 형성의 최종적인 과정에는 상관없이, ESI는 온화한 조건하에 용액으로부터 하전된 분자를 생성한다.
소량의 유기 분자로부터 유용한 질량 스펙트럼 데이터를 수득하기 위해서는 이온 생산이 효율적이어야 한다. ESI의 이온화 효율은 분자의 양전하 정도와 관련된다. 이온화를 실험적으로 개선하기 위하여 통상 산성 조건을 이용한다. 이온화 개선을 위한 다른 방법으로는 가능한 경우 4차 아민을 이용하는 방법이 있다[참조: Aebersold et al., Protein Science, 1:494-503, 1992; Smith et al., Anal. Chem. 60:436-41, 1988].
전자문무 이온화는 다음과 같이 보다 상세히 설명된다. 전기분무 이온 생성에는 두 단계가 필요하다: 대기압 근처에서 고도로 하전된 액적의 분산과 증발 유도 조건. 분석물의 분자 용액을 고전위를 유지하는 침을 통과시킨다. 침의 말단에서 용액은 분산된 분석물 분자를 함유하고, 고도로 하전된 액적으로 연무된다. 액적은 신속하게 증발되고 전계탈리 또는 잔여 증발의 과정에 의해 양성자화된 단백질 분자가 기체상으로 방출된다. 전기분무는 일반적으로 모세관으로부터 소량의 액체(일반적으로 1-10uL/min) 흐름에 높은 전기장을 적용함으로써 생성된다. 0.2-2 cm 떨어진 배치된 모세 전극과 반대 전극 사이에는 3-6kV의 전위차가 적용된다(여기서, 탈용매화의 정도에 의존하는 이온, 하전된 클러스터 및 하전된 액적은 작은 구멍을 통해서 MS에 의해 샘플링된다). 전기장은 모세관 말단의 액체 표면에 전하의 축적을 생성하므로, 액체의 유속과 저항률, 표면 장력이 액적 생산에 중요한 영향을 미친다. 높은 전기장은 액체 표면을 파괴시켜 고도로 하전된 액적을 형성한다. 양전하 또는 음전하로 하전된 액적은 모세관 바이어스에 따라 생산된다. 음이온성 형태는 전기 방전을 방지하기 위해 산소와 같은 전자 포촉제가 있어야 한다.
광범위한 액체는 진공으로 정전기적으로 분무되거나 분무제의 보조를 받아 분무된다. 분무를 위하여 전기장만을 사용하는 경우, 액체 전도성과 유전률의 범위가 실제적으로 제한된다. 10-4M의 수용성 전해질 용액에 해당하는 액체 유속에서 안정한 전기분무를 위해서는 실온에서 용액 전도도가 10-5ohm 이하이어야 한다. ESI-MS에서 가장 유용한 것으로 밝혀진 형태에서, 유속을 적당히 조절하면 액체가 미세한 안개 입자로 분산된다. 모세관과의 거리가 짧으면, 액적 직경이 1 μm 수준으로 매우 균일해진다. 특히, 액체의 유속이 클수록 전체 전기분무 이온 전류가 약간씩 증가한다는 사실은 중요하다. 가열은 전기분무를 효과적으로 수행하기 위하여 유용하다는 증거가 존재한다. 예를 들면, 약간만 가열을 해도 점성과 표면 장력이 감소하여 수용액이 쉽게 전기분무된다. 가열과 기체 분무를 함께 이용하는 전기분무의 경우, 액체의 유속이 커지지만 액적의 하전 정도가 감소한다. 분자 이온을 형성에는 초기 액적 점적을 증발시키는 조건이 필요하다. 이것은 적당한 온도(60 ℃ 이하)에서 건조한 기체를 유동시키고, 인터페이스를 매개로 이동할 때 가열하여(특히, 이온 포획 방법의 경우에) 비교적 낮은 압력에서 에너지 충돌을 유도함으로써 구압에서 달성된다.
ESI에 대한 보다 상세한 과정은 아직 불확실하지만, ESI에 의해 생성되는 매우 작은 액적은 나머지 용매가 증발된 후에 용액 내의 전체 전하가 기체상으로 이송되는 것을 가능하게 한다. 이어서, 질량 분광분석 검출은, 탈용매화 후에 뿐만 아니라 m/z 범위(4중극형 분석기의 경우 4000달톤 이하)를 갖고 충분한 효율로 생성되어 전도되는 이온을 필요로 한다. 광범위한 용질은 ESI-MS에 적당한 것으로 밝혀졌으며, 분자량에 대한 이온화 효율의 실질적인 상관광계의 결여는 고도로 식별력이 없는 광범위하게 적용가능한 이온화 과정에 시사한다.
전기분무 이온 "공급원"는 대기압 근처에서 기능을 하며, 전기분부 "공급원"은 반대 전극에 대하여 액체 용액을 전기적으로 바이어스하기 위한 방법을 도입하는 금속 또는 유리 모세관이다. 분석물과 아세트산과 같은 다른 첨가물을 포함하는 물-에탄올 혼합물인 용액은 모세관 말단으로 흐른다. 본질적으로 어떠한 용매계에서도 사용할 수 있는 ESI 공급원은 문헌[참조: Smith et al., Anal. Chem. 62:885, 1990]에 기재되어 있다. ESI의 전형적인 유속은 1-10uL/min이다. ESI-MS의 주요 필요조건은 고압 영역으로부터 MS 내부로 이온을 가능한한 효율적으로 이송하는 것이다.
ESI의 효율은 고도로 민감한 측정 원리를 제공한다. 이것은 본 명세서에 기재되어 있는 본 발명에 유용하다. 전류 장치 성능은 1가로 하전된 화학종에 대하여 약 2 x 10-12A 또는 약 107counts/s인 검출기에서 전체 이온 전류를 제공한다. 분석 물이 완전히 이온화된 경우, 하전된 화학종의 농도가 10-10M 또는 10-18mol/s 정도로 낮으면 검출가능한 이온 전류(약 10counts/s)가 발생한다. 예를 들면, 모세관 전기영동과 접한 ESI를 사용하여 4급 암모늄 이온의 저검출 한계값을 수득할 수 있다[참조: Smith et al., Anal. Chem. 59:1230, 1988]. 섹터 장치을 갖는 어레이 검출기를 이용하면 이득을 수득할 수 있어서 스펙트럼 부분들을 동시에 검출할 수 있다. 현재에는 ESI에 의해 형성된 이온의 약 10-5정도만이 검출되므로, 개선된 감도 바이어스에 주목할 필요가 있다. 본 발명에서 이온화 및 검출 방법의 개선책도 제안하고 있음을 이해할 것이다.
분리 기계류(예: 겔)와 검출기(예: 질량 분관분석기) 사이에 인터페이스를 배치하는 것이 바람직하다. 인터페이스는 다음의 특성을 갖아야 한다: (1) 분리된 시간 간격에서 DNA 단편을 수집하는 능력; (2) DNA 단편의 농축; (3) 전기전동 완충제와 환경으로부터 DNA 단편을 회수하는 능력; (4) DNA 단편에서 태그의 절단;(5) DNA 단편에서 태그의 분리 ;(6) DNA 단편의 처분;(7) 휘발성 용액에 태그의 배치 ;(8) 태그의 기화 및 이온화; (9) 태그를 전기분무 장치로 배치하여 질량 분광분석기로의 유입.
또한, 인터페이스는 겔의 저면으로부터 용출되는 DNA 단편을 "휘수"할 수 있다. 겔은 슬랩 겔, 관상 겔, 모세관 겔 등으로 구성된다. DNA 단편은 몇가지 방법을 이용하여 회수한다. 첫번째 방법은 DNA 단편이 전극 위 또는 부근에서 회수되도록 전기장을 사용하는 것이다. 두번째 방법에서는 겔의 저면을 통과하여 액체를 유동시킴으로써 DNA 단편들을 회수한다. 이 2가지 방법을 복합적으로 채택하여 유동된 액체에 DNA 단편들을 이동시킨 후에 액체를 전기장으로 농축시킨다. 그 결과, DNA 단편들이 분리 방법이 실시된 환경으로부터 제거된다. 즉, 전기장을 이용하여 DNA 단편을 한 종류의 용액으로부터 다른 용액으로 "드래그"할 수 있게 된다.
일단 DNA 단편들이 적당한 용액(전기분무와 질량 분관분석에 적합한)에 있게 되면, DNA 단편으로부터 태그를 절단한다. 이어서, 전기장을 이용하여 DNA 단편을 태그로부터 분리한다(태그가 DNA 단편과 반대의 전하인 것이 바람직하다). 전기장 또는 유동 액체를 통하여 태그를 전기분무 장치로 도입시킨다.
형광 태그는 흡수 및 형광 방광 파장과 강도에 의해 직접 동정되고 정량된다.
연속적인 여기 및 방출 파장(lEX, lS1, lS2)을 제공하는 종래의 분광 형광 광도계는 매우 순응성이지만, 유동 사이토미터와 레이저 주사 현미경과 같은 단일의 보다 특수화된 장치는 고정된 단일의 파장에서 여기가능한 프로브를 필요로 한다. 최신의 장치에서는 통상 아르곤 레이저의 488nm 선이다.
1프로브 분자당 형광 강도는 e와 QY의 곱에 비례한다. 현재 실제상 중요한 형광체 중에서 이들 파라미터의 범위는 ε이 대략 10,000 내지 100,000cm-1M-1이고 QY는 0.1 내지 1.0이다. 흡수가 고강도의 조명에 의해 포화되는 경우, 여기에 발형광단의 비가역적인 파괴(포토블리칭)가 형광 검출능을 제한하는 요인가 된다. 포토블리칭의 실제적인 영향은 문제로 되는 형광 검출법에 따라 달라진다.
장치(또는 인터페이스)를 분리 단계와 검출 단계 사이에 배치되어 크기 분리와 태그 검출의 연속적 조작(실시간)을 가능하게 하는 것은 당업자에게 명백한다. 이것은 분리 방법론 및 기계류와 검출 방법론 및 기계류를 일체로 하고, 단일 장치를 형성한다. 예를 들면, 인터페이스는 분리 기술과 질량 분광분석법 또는 정전위 전류 측정에 의한 검출과의 사이에 배치시킨다.
인터페이스의 기능은 주로 분석물로부터 태그를 방출시키는 것이다(예: 질량 분광분석기). 인터페이스에는 몇가지의 대표적인 실행이 존재한다. 인터페이스의 설계는 절단가능한 링커의 선택에 의존한다. 광 또는 광 절단성 링커를 사용하는 경우, 에너지원 또는 광자원이 필요하다. 산-불안정성, 염기-불안정성 또는 디설파이드 링커의 경우, 시약의 첨가가 인터페이스 내부에 필요하다. 효소의 첨가는, 효소 감응성 링커(예: 특이적 프로테아제 및 펩티드 링커, 뉴클레아제 및 DNA 또는 RNA 링커, 글리코실라제, HRP 또는 포스파타제)와 절단 후에 불안정한(예: 화학 발광 기질과 마찬가지로) 링커가 필요하다. 인터페이스의 다른 특성은 밴드 확대가 최소화되고, 질량 분광분석기로 주입되기 전에 DNA를 태그로부터 분리시킬 수 있다는 것이다. 분리법에는 전기전동법, 친화성, 크기 유지(투석), 여과 등을 이용한 방법들이 있다.
또한, 태그(또는 핵산-링커-태그 구성물)을 농축하고, 전기전동법으로 포획하고, 이어서 이것을 선택된 이온화법의 특정한 형태에 적용할 수 있는 대체 시약의 유동에 방출시킬 수 있다. 인터페이스는 미소 비이드 위에 태그(또는 핵산-링커-태그 구성물)을 포획하고, 비이드(들)을 챔버 내부로 사출시키고, 레이저 탈리/증발을 수행한다. 유동에 있어서 대체 완충액 중으로 추출할 수 있다(예를 들면, 모세관 전기영동 완충액으로부터 투과성 막을 가로질러 소수성 완충액으로). 어떤 경우에는 태그를 인터페이스의 기능도 겸하는 질량 분광분석기 내부로 계속적으로 송달하는 것이 바람직하다. 인터페이스의 다른 기능은 각각의 칼럼에 있어서 시간대를 교대하면서 태그를 복수의 칼럼으로부터 질량 분광분석기로 송달하는 것이다. 또한, 태그를 시간으로 분리하여 단이르이 컬럼으로부터 복수의 MS 검출기로 송달하고, 수 밀리초 이내에 태그의 각 세트를 회수한 다음, 질량 분광분석기로 송달할 수 있다.
이하는 본 발명에 사용되는 분리 및 검출 기술의 대표적인 공급 리스트이다: 호에퍼 사이언티픽 인스트루먼트[Hoefer Scientific Instruments(San Francisco, CA) - 서열화 기기의 전기영동 장치(Two StepTM, Pocker FaceTM Ⅱ); 파마시아 바아오테크[Pharmacia Biotech(Piscataway, NJ)] - DNA 분리 및 서열화용 전기전동 장치(PCR-SSCP 분석용 PhastSystem, DNA 서열화용 MacroPhor System); 퍼킨 엘머/어플라이드 바이오시스템스 디비젼[Perkin Elmer/Applied Biosystems Division(ABI, Foster City, CA)] - 형광 염에 기촌한 반자동화 서열화기(ABI373, ABI377); 아날리티칼 스펙트랄 디바이스[Analytical Spectral Devices(Boulder, CO) - UV 분광계; 히다치 인스투루먼츠 [Hitachi Instruments(Tokyo, Japan)] - 원광 흡광 분광계, 형광 분광계, LC 및 GC 질량 분광분석기, NMR 분광계 및 UV-VIS 분광계; 퍼셉티브 바이오시스템스[PerSeptive Biosystems(Framingham, MA)] - 질량 분광분석기(VoyagerTM Elite); 브루커 인스투루먼츠 인코포레이티드[Bruker Instruments Inc.(Manning Park, MA)] - FTIR 분광계(Vector 22), FT-라만 분광계, 비행시간형 MALDI 질량 분광분석기(Reflex IITM), 이온 포확 질량 분광분석기(EsquireTM), MALDI 질량 분광분석기; 어낼러티칼 테클놀로지 인코포레이티드[Analytical Technology Inc.(ATI, Boston, MA)] - 모세관 겔 전기전동 장치, UV 검출기, 다이오드 어레이 검출기; 텔레딘 엘렉트로닉 테크놀로지즈[Teledyne Electronic Technologies(Mountain View, CA)] - 이온 포획 질량 분광분석기(3DQ DiscoveryTM, 3DQ ApogeeTM); 퍼킨 엘머/어플라이드 바이오시스템스 디비젼[Perkin Elmer/Applied Biosystems Division(Foster City, CA)] - 전기분무에 적합한 Sciex 질량 분광분석기(삼중 4중극형 LC/MS/MS, API 100/300); 휴렛 팩커드[Hewlett-Packard(Santa Clara, CA)] - 질량 선택적 검출기(HP 5972A), MALDI-TOF 질량 분광분석기(HP G2025A), 다이오드 어레이 검출기, CE 장치, HPLC 장치(HP 1090), UV 분광계; 및 핀니간 코포레이션[Finnigan Corporation(San Jose, CA) - 질량 분광분석기(자기 섹터(MAT 95 STM), 4중극형 분광계(MAT 95 SQTM), 4가지 상이한 질량 분광분석기); 라인닌[Rainin(Emeryville, CA) - HPLC 측정기.
본 명세서에 기재되어 있는 방법과 조성물은, 특정 샘플 종류와 뉴클레오티드의 동일성에 대한 지도로서 기능하는 절단된 태그를 이용할 수 있다. 각 서열화 방법의 초기 단계에서, 특정(선택된) 프라이머를 특정한 태그에 할당한다. 태그는 샘플의 종류, 디데옥시 터미네이터의 종류(생거 서열화 반응의 경우) 또는 이 2가지 모두에 대한 지도로 이용된다. 특히, 태그는 프라이머 종류를 가리키는 지도가 되고, 프라이머는 벡터 종류를 가리키는 지도이고, 벡터는 샘플 종류의 지도로 작용한다. 또한, 태그는 디데옥시뉴클레오티드 반응에 이용되는 디데옥시 터미네이터 종류(ddTTP, ddCTP, ddGTP, ddATP)의 위치를 찾는 지도로서 작용한다. 서열화 반응이 수행된 다음의 단편들은 크기에 따라 연속적으로 분리된다.
태그는 단편으로부터 임시 단위로 절단되어 측정되며, 임시 단위로 기록된다. 서열은 태그 지도를 임시 단위와 비교하여 구성한다. 즉, 전체의 태그의 동일성이 크기 조정 단계 이후에 기록고, 임시 단위로 서로 관련된다. 크기 조정 단계에서는 한 개의 뉴클레오티드의 증가에 의해 핵산 단편을 분리하고, 관련되는 태그의 동일성은 하나의 뉴클레오티드의 증가에 의해 분리한다. 디데옥시-터미네이터 또는 뉴클레오티드 지도와 샘플 종류를 예지함으로써, 서열을 선형적으로 용이하게 추정할 수 있다.
이하의 실시예는 예증을 위한 것으로서 본 발명의 범위를 한정하기 위한 것은 아니다.
달리 설명하지 않는 한, 실시예에서 사용하고 있는 화학 약품은 알드리히 케미칼 캄파니(Aldrich Chemical Company, Milwaukee, WI)로부터 구입한다. 이하의 약어는 제시된 의미를 가지며, 본 명세서에서 사용된다:
ANP = 3-(Fmoc-아미노)-3-(2-니트로페닐)프로피온산
NBA = 4-(Fmoc-아미노메틸)-3-니트로벤조산
HATU = 0-7-아자벤조트리아졸-1-일-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로인산
DIEA = 디이소프로필에틸아민
MCT = 모노클로로트리아진
NMM = 4-메틸모르폴린
NMP = N-메틸피롤리돈
ACT357 = 어드밴스트 켐테크 인코포레이티드[Advanced ChemTech, Inc., Louisville, KY]가 제조한 ACT357 펩티드 합성기
ACT = 어드밴스트 켐테크 인코포레이티드 제조
NovaBiochem = 칼바이오켐-노바바이오켐 인터내셔날(CalBiochem-NovaBiochem International)(캘리포니아주 샌디에고 소재)
TFA = 트리플루오로아세트산
Tfa = 트리플루오로아세틸
iNIP = N-메틸이소니페코트산
Tfp = 트리플루오로페닐
DIAEA = 2-(디이소프로필아미노)에틸아민
MCT = 모노클로로트라아젠
5'-AH-ODN = 5'-아미노헥실 말단화 올리고데옥시뉴클레오티드
실시예
실시예 1
절단가능한 태그 서열화에 사용되는 산불안정화 링커의 제조
A. 카복실아미드 말단을 갖는 태그를 유리시키는 화학적으로 절단가능한 질량 분광분석 태그의 펜타플루오로페닐 에스테르 합성
도 1은 반응도를 나타낸다.
단계 A. ACT357 펩티드 합성기(ACT)의 회수 용기에서 TentaGel S AC 수지(화합물 Ⅱ; ACT 공급; 1당량)을 DMF에 현탁시킨다. DMF에 녹인 화합물 Ⅰ(3당량), HATU(3 eq.), DIEA(7.5당량)를 첨가하고 회수 용기를 1시간 동안 진탕시킨다. 용매를 제거하고 NMP(2회), MeOH(2회) 및 DMF(2회)로 수지를 세척한다. 화합물 Ⅰ을 수지에 결합시키고 세척 단계를 반복하여 화합물 Ⅲ을 수득한다.
단계 B. 수지(화합물 Ⅲ)을 DMF 중의 25% 피페리딘과 혼합하고, 5분 동안 진탕시킨다. 수지를 여과하고 DMF 중의 25% 피페리딘과 혼합한 다음, 10분간 진탕시킨다. 용매를 제거하고, NMP(2회), MeOH(2회) 및 DMF(2회)를 수지를 세척한 후에 단계 C에 직접 사용한다.
단계 C. 단계 B로부터의 탈보호 수지를 DMF에 현탁시키고, DMF 중의 측쇄에 아민 관능기를 갖는 FMOC-보호 아미노산(화합물 Ⅳ, 예: 알파-N-FMOC-3-(3-피리딜)-알라닌, 공급처:신테테크: 3당량 공급)과 DIEA(7.5당량)을 첨가한다. 용매를 제거하고, NMP(2회), MeOH(2회), DMF(2회)로 수지를 세척한다. 화합물 Ⅳ을 수지에 결합시키고, 세척 단계를 반복하여 화합물 Ⅴ를 수득한다.
단계 D. 수지(화합물 Ⅴ)을 단계 B에서 설명한 바와 같이 피페리딘으로 처리하여 FMOC 그룹을 제거한다. 탈보호된 수지를 회수 용기로부터 ACT357을 이용하여 16개의 반응 용기에 균등하게 분배한다.
단계 E. 단계 D에서 수득한 탈보호된 수지 16개의 분획을 DMF에 현탁시킨다. 각 반응 용기에 DMF 중의 적당한 카복실산 Ⅵ1-16(R1-16CO2H; 3당량)와 HATU(3당량) 및 DIEA(7.5당량)를 첨가한다. 용기를 1시간 동안 진탕시킨다. 용매를 제거하고, NMP(2회), MeOH(2회) 및 DMF(2회)로 수지를 세척한다. 화합물 Ⅵ1-16을 수지에 결합시키고, 세척 단계를 반복하여 화합물 Ⅶ1-16을 수득한다.
단계 F. 수지(화합물 Ⅶ1-16)의 16개 분획을 CH2Cl2(3회)로 세척한다. 각각의 반응 용기에 CH2Cl2 중의 1% TFA를 첨가하고, 용기를 30분 동안 진탕시킨다. 용매를 반응 용기로부터 각 튜브로 여과시킨다. 수지의 16개 분획을 CH2Cl2(2회)와 MeOH(2회)로 세척하고, 여과물을 각 튜브에 결합시킨다. 각 튜브를 증발시켜 화합물 Ⅷ1-16을 수득한다.
단계 G. 유리 카복실산 Ⅷ1-16 각각을 DMF에 용해시킨다. 각 용액에 피리딘(1.05당량)을 첨가하고, 펜타플루오로페닐 트리플루오로아세트산염(1.1당량)을 첨가한다. 혼합물을 45분간 실온에서 교반시킨다. 용액을 EtOAc로 희석시키고, 1M 수용성 시트르산(3회)와 5% 수용성 NaHCO3(3회)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과한 후에 증발시켜 화합물 Ⅸ1-16을 수득한다.
B. 카복실산 말단을 갖는 태그를 유리시키는 화학적으로 절단가능한 질량 분광분석태그의 펜타플루오로페닐 에스테르 합성
도 2는 반응도를 나타낸다.
단계 A. 4-(하이드록시메틸)페녹시부티르산(화합물 Ⅰ; 1당량)을 CHCl3 중의DIEA(2.1 당량)와 알릴 브롬화물(2.1당량)과 결합시키고, 환류로 2시간 동안 가열한다. 혼합물을 EtOAc로 희석하고, 1 N HCl(2회), 카보네이트 완충액(pH 9.5)(2회) 및 염수(1회)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 증발하여 화합물 Ⅰ의 알릴 에스테르를 수득한다.
단계 B. 단계 A(1.75 당량)로부터의 화합물 Ⅰ 알릴 에스테르를 CHCl3에서 측쇄에 아민 관능기를 갖는 FMOC-보호된 아미노산(화합물 Ⅱ, 예: 알파-N-FMOC-3-(3-피리딜)-알라닌, 공급처: 신테테크, 1당량), N-메틸모르폴린(2.5당량) 및 HATU(1.1당량)와 결합시키고, 4시간 동안 실온에서 교반시킨다. 혼합물을 CHCl3로 희석시키고, 1M 수용성 시트르산(2회), 물(1회)와 5% 수용성 NaHCO3(2회)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 증발시킨다. 섬광 크로마토그래피로 화합물 Ⅲ를 분리한다(CHCl3 → EtOAc).
단계 C. 화합물 Ⅲ을 CHCl3에 용해시키고, Pd(PPh3)4(0.07당량)와 N-메틸아닐린(2당량)을 첨가한 다음, 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반시킨다. 혼합물을 CHCl3로 희석하고, 1M 수용성 시트르산(2회) 및 물(1회)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고 진공하에 증발시킨다. 섬광 크로마토그래피로 화합물 Ⅳ를 분리한다(CHCl3 → EtOAc + HOAc).
단계 D. ACT357 펩티드 합성기(ACT)의 회수 용기에서 TentaGel S AC 수지(화합물 Ⅴ; 1당량)을 DMF에 현탁시킨다. DMF 중의 화합물 Ⅳ(3당량), HATU(3당량) 및 DIEA(7.5당량)를 첨가하고, 회수 용기를 1시간 동안 진탕시킨다. 용매를 제거하고, NMP(2회), MeOH(2회) 및 DMF(2회)를 수지를 세척한다. 화합물 Ⅳ을 수지에 결합시키고 세척 단계를 반복하여 화합물 Ⅵ를 수득한다.
단계 E. 수지(화합물 Ⅵ)을 DMF 중의 25% 피페리딘과 혼합하고, 5분 동안 진탕시킨다. 수지를 여과하고 DMF 중의 25% 피페리딘과 혼합한 다음, 10분간 진탕시킨다. 용매를 제거하고 NMP(2회), MeOH(2회) 및 DMF(2회)로 수지를 세척한다. 탈보호된 수지를 ACT357을 이용하여 회수 용기로부터 16개의 반응 용기에 균등하게 분배한다.
단계 F. 단계 E로부터의 탈보호된 16 분획의 수지를 DMF에 현탁시킨다. 각 반응 용기에 DMF 중의 적당한 카복실산 Ⅶ1-16(R1-16CO2H; 3당량), HATU(3당량) 및 DIEA(7.5당량)를 첨가한다. 용기를 1시간 동안 진탕시킨다. 용매를 제거하고, 수지를 NMP(2회), MeOH(2회) 및 DMF(2회)로 세척한다. 화합물 Ⅶ1-16을 수지에 결합시키고, 세척 단계를 반복하여 화합물 Ⅷ1-16를 수득한다.
단계 G. 수지(화합물 Ⅷ1-16) 16개 분획을 CH2Cl2(3회)로 세척한다. 각각의 반응 용기에 CH2Cl2 중의 1% TFA를 첨가하고, 용기를 30분 동안 진탕시킨다. 용매를 반응 용기로부터 각 튜브로 여과시킨다. 수지 16개 분획을 CH2Cl2(2회) 및 MeOH(2회)로 세척하고, 여과물을 각 튜브에 결합시킨다. 각 튜브를 증발시켜 화합물 Ⅸ1-16을 수득한다.
단계 H. 유리 카르복실산 Ⅸ1-16 각각을 DMF에 용해시킨다. 각 용액에 피리딘(1.05당량)을 첨가하고, 펜타플루오로페닐 트리플루오로아세테이트(1.1당량)을 첨가한다. 혼합물을 45분간 실온에서 교반시킨다. 용액을 EtOAc로 희석시키고, 1M 수용성 시트르산(3회)와 5% 수용성 NaHCO3(3회)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과한 후에 증발시켜 화합물 Ⅹ1-16을 수득한다.
실시예 2
T-L-X의 광분행성 절단의 입증
실시예 11에서 제조한 T-L-X 화합물에 실온에서 7분간 근 UV를 조사한다. 350nm에서 방출 피크를 갖는 레이요네트 형광 자외선 램프(Southern New England Ultraviolet Co.)(코넥티컷주 미들타운 소재)를 UV 광 공급원으로 사용한다. 램프를, 샘플을 놓은 페트리 접시로부터 15cm 거리를 두고 배치시킨다. SDS 겔 전기영동은 접합의 85% 이상이 당해 조건에서 절단된 것을 나타낸다.
실시예 3
형광 표지된 프라이머 제조와 발형광단의 절단 입증
올리고뉴클레오티드의 합성과 정제
올리고뉴클레오티드(ODN)은 표준 포스포르아미다이트 화학 또는 H-포스포네이트 화학(Glenn Research Sterling, VA)을 이용하는 자동화 DNA 합성기에서 제조된다. 적당하게 차단된 dA, dG, dC, T 포스포아미다이트는 이러한 형태로 시판되며, 합성 뉴클레오티드는 적당한 형태로 변환된다. 올리고뉴클레오티드는 표준 포스포르아미다이트를 이용하거나 H-포스포네이트 화학을 이용하여 제조한다. 올리고뉴클레오티드는 표준 방법을 적용하여 정제한다. 5'-트리틸 그룹을 갖는 올리고뉴클레오티드는 0.1 N Et3NH+OAc-(pH 7.0) 중의 15% 내지 55% MeCN의 구배를 이용하여 20분 이상 동안 12 ㎛의 300 # 라이닌(캘리포니아주 에머리빌 소재) Dynamax C-8 4.2x250mm 역상 컬럼을 사용하여 HPLC로 크로마토그래피한다. 탈트리틸화가 수행되면, 겔 배제 크로마토그래피를 사용하여 올리고뉴클레오티드를 추가로 정제한다. 알카리 pH에서의 PRP-컬럼[일리노이주 디어필드 소재의 알테크(Alltech)] 및 PAGE로 올리고뉴클레오티드의 질을 분석한다.
2,4,6-트리클로로트리아진에서 유도된 올리고뉴클레오티드의 제조: 5'-말단 아민 연결된 올리고뉴클레오티드 10 내지 1000μg을 알카리성(pH 8.3 내지 8.5) 완충제에서 19℃ 내지 25℃, 30 내지 120분 동안에 10% n-메틸-피롤리돈 중의 과량의 재결정화 염화 시아누르산과 반응시킨다. 최종 반응 조건은 pH 8.3에서 0.15M 붕산 나트륨과, 2mg/ml 재결정 염화 시아누르산, 500μg/ml의 뉴클레오티드이다. 반응하지 않은 염화 시아누르산을 G-50 세파데스[Sephadex(Pharmacia)(뉴저지주 피스캣어웨이 소재)] 컬럼에서 크기 배제 크로마토그래피로 제거한다.
pH 8.3에서 1시간 동안 실온에서 활성화된 정제 누클레오티드를 0.15 M 붕산 나트륨(pH 8.3) 중의 100배의 몰 과량의 시스타민과 반응시킨다. 반응하지 않은 시스타민을 G-50 세파덱스 컬럼에서 크기 배제 크로마토그래피로 제거한다. 유도된 ODN을 아민-반응성 형광체와 반응시킨다. 유도된 ODN 제조물을 3개 부분으로 나누고, 각각을 (a) 20배 몰과량의 텍사스 레드 설포닐 클로라이드(몰큘라 프로브), (b) 20배 몰과량의 리사민 설포닐 클로라이드(몰큘라 프로브), (c) 20배 몰과량의 플루오레세인 이소티오시아네이트와 반응시킨다. 최종 반응 조건은 pH 8.3에서 0.15M 붕산 나트륨과 실온에서 1시간이다. 반응하지 않은 형광체는 G-50 세파덱스 컬럼에서 크기 배제 크로마토그래피로 제거한다.
올리고뉴클레오티드로부터 형광체를 절단하기 위해서는, ODN을 1×10-5 몰 농도로 조정하고, TE(TE는 0.01M 트리스, pH 7.0, 5mM EDTA이다)로 12,3 배로 희석한다. 100μl 부피의 ODN에 대하여 25μl의 0.01M 디티오트레이톨(DTT)를 첨가한다. 형광을 검은색 미세적정 플레이트에서 측정한다. 용액을 인큐베이션관(150㎕)에서 제거하고, 검은 미세적정 플레이트[버지니아주 챈틸리 소재의 다이나텍 라보라토리즈(Dynatek Laboratories)]에 올려놓는다. 이이서, 플레이트를 플루오레세인에 대해서는 591 nm의 여기 파장 및 520nm의 모니터 발광, 텍사스 레드에 대해서는 591nm의 여기 파장 및 612nm의 모니터 발광, 및 리사민에 대해서는 570nm의 여기 파장 및 590nm의 모니터 발광으로 플루오로스칸 II 형광 광도계[버지니아주 맥릭 소재의 플로우 라보라토리즈(Flow Laboratories)]를 사용하여 직접 판독한다.
이 데이터는 형광색소가 ODN으로부터 절단될 때 상대적 형광이 약 200배 증가함을 나타낸다.
실시예 4
표지된 M13 서열 프라이머의 제조와 태그의 절단 입증
2,4,6-트리클로로트리아진에서 유도된 올리고뉴클레오티드의 제조: 5'-말단 아민이 연결된 올리고뉴클레오티드(5'-헥실아민-TGTAAAACGACGGCCAGT-3')(S당량 서열 1) 1000g을 10% n-메틸-피롤리돈의 알카리성(pH 8.3 내지 8.5) 완충제에서 19℃ 내지 25℃에서 30 내지 120분 동안 과량의 재결정화시킨 염화 시아누르산과 반응시킨다. 최종 반응 조건은 pH 8.3에서 0.15M 붕산나트륨, 2mg/ml 재결정 염화 시아누르산 및 500μg/ml의 뉴클레오티드이다. 반응하지 않은 염화 시아누르산을 G-50 세파덱스 컬럼에서 크기 배제 크로마토그래피로 제거한다.
이어서, 활성화된 정제 뉴클레오티드를 0.15M 붕산 나트륨(pH 8.3) 중의 100배 몰 과량의 시스타민과 1시간 동안 실온에서 반응시킨다. 반응하지 않은 시스타민을 G-50 세파덱스 컬럼에서 크기 배제 크로마토그래피로 제거한다. 유도된 ODN을 각종 아미드와 반응시킨다. 유도된 ODN 제조물을 12개 부분으로 분할하고, 각각을(1) 4-메톡시벤조산, (2) 4-플루오로벤조산, (3) 톨루산, (4) 벤조산, (5) 인돌-3-아세트산, (6) 2,6-디플루오로벤조산, (7) 니코틴산 N-옥사이드, (8) 2-니트로벤조산, (9) 5-아세틸살리실산, (10) 4-에톡시벤조산, (11) 신남산, (12) 3-아미노니코틴산의 각각의 펜타플루오로페닐-에스테르와(25몰 과량) 반응시킨다. 반응을 2시간 동안 37℃에서 pH 8.3의 0.2M 붕산나트륨 속에서 수행한다. 유도된 ODN을 G-50 세파덱스 상의 겔 분별 크로마토그래피로 정제한다.
올리고뉴클레오티드로부터 태그를 절단하기 위해서는, ODN을 1×10-5 몰 농도 조정하고, 50% EtOH(V/V)를 포함하는 TE(TE는 0.01M 트리스, pH 7.0), 5mM EDTA이다)에서 12,3배로 희석한다. 100μl 부피의 ODN에 대해 25μl의 0.01 M 디티오트레이톨(DTT)를 첨가한다. 대조군에는 DDT를 첨가하지 않는다. 실온에서 30분간 배양한다. 이어서, NaCl을 0.1M까지 가하고, 2용적의 EtOH를 가하여 ODN을 침전시킨다. ODN을 4℃에서 15분 동안 원심 분리로 용액으로부터 제거한다. 상청액을 분리하여 완전히 건조시킨다. 펠릿을 25μl MeOH에 용해시킨 후, 질량 분광분석기를 이용하여 태그의 존재에 대해 시험한다.
이 연구에 사용되는 질량 분광분석기는 외부 이온 공급원 푸리에-변환 질량 분광계(FTMS)이다. MALDI 분석을 위해 제조한 샘플을 프로브의 선단부에 올려 놓고, 이온 공급원에 삽입한다. 샘플에 레이저 펄스를 조사하는 경우, 이온이 공급원로부터 추출되어 긴 4중주극형 이온 가이드를 통과하여 초전도 자석의 구경 내부로 위치하는 FTMS 분석기 셀로 집속된다.
스펙트럼으로부터 다음의 정보를 수득할 수 있다. 피크는 다음의 분자량에서 25 내지 100의 상대 강도 단위로 변한다:(1) 212.1 amu; 4-메톡시벤조산 유도체, (2) 200.1 amu; 4-플루오로벤조산 유도체, (3) 196.1 amu; 톨루산 유도체, (4) 182.1 amu; 벤조산 유도체, (5) 236.2 amu; 인돌-3-아세트산 유도체, (6) 218.1 amu; 2,6-디플루오로벤조산 유도체, (7) 199.1 amu; 니코틴산 N-옥사이드 유도체, (8) 227.1 amu; 2-니트로벤조산 유도체, (9) 179.18 amu; 5-아세틸살리실산 유도체, (10) 226.1 amu; 4-에톡시벤조산 유도체, (11) 209.1 amu; 신남산 유도체, (12) 198.1 amu; 3-아미노니코틴산 유도체.
그 결과로부터, 태그가 프라이머로부터 절단되고 질량 분광분석기에 의해 검출됨을 알 수 있다.
실시예 5
R1-36(ε-INIP)-ANP-TFP 화합물의 제조
도 3은 36개의 T-L-X 화합물(X=Lh)의 세트의 병행 제조를 나타낸 것이다. 여기서, Lh는 활성화 에스테르(특히, 테트라플루오로페닐 에스테르)이고, L2는 오르토-니트로벤질아민 그룹이고, L3는 Lh와 L2와 결합하는 메틸렌 그룹이고, T는 수지의 카복실산이 L2 벤질아민 그룹의 질소원자와 결합하여 아미드 결합을 형성하고, 가변 중량 성분 R1-36이 수지의 α-아미노 그룹을 통하여 결합(여기서, R 그룹은 T2에 대응되고 특정한 카복실산을 통하여 도입된다)되는 모듈러 구조이고, 질량 분광분석 감도 인핸서 그룹(N-메틸이소니페코트산을 통하여 도입됨)가 수지의 ε-아미노 그룹을 통하여 결합된다.
도 3에 대해서 언급한다:
단계 A. NovaSyn HMP 수지(NovaBiochem 제품; 1당량)를 ACT357의 회수 용기에서 DMF에 현탁시킨다. DMF 중의 화합물 Ⅰ(ACT 제품의 ANP; 3당량), HATU(3당량) 및 NMM(7.5당량)를 첨가하고, 회수 용기를 1시간 동안 진탕시킨다. 용매를 제거하고, NMP(2회), MeOH(2회) 및 DMF(2회)로 수지를 세척한다. 화합물 Ⅰ을 수지에 결합시키고, 세척 단계를 반복하여 화합물 Ⅱ를 수득한다.
단계 B. 수지(화합물 Ⅱ)을 DMF 중의 25% 피페리딘과 혼합하고, 5분 동안 진탕시킨다. 수지를 여과하고, DMF 중의 25% 피페리딘과 혼합한 다음, 10분간 진탕시킨다. 용매를 제거하고, NMP(2회), MeOH(2회) 및 DMF(2회)로 수지를 세척한 후에 단계 C에 직접 사용한다.
단계 C. 단계 B로부터의 탈보호된 수지를 DMF에 현탁시키고, DMF 중의 측쇄에 아민 관능기를 갖는 FMOC-보호 아미노산(Fmoc-Lysine(Aloc)-OH, PerSeptive Biosystems 제품; 3당량), HATU(3당량) 및 NMM(7.5당량)을 첨가하고, 용기를 1시간 동안 진탕시킨다. 용매를 제거하고, NMP(2회) 및 MeOH(2회) 및 DMF(2회)로 수지를 세척한다. Fmoc-Lys(Aloc)-OH를 수지에 결합시키고, 세척 단계를 반복하여 화합물 Ⅳ를 수득한다.
단계 D. 수지(화합물 Ⅴ)을 CH2Cl2(2회)로 세척한 다음, CH2Cl2 중의(PPh3)4Pd(0)(0.3당량) 및 PhSiH3(10당량)의 용액에 현탁시킨다. 혼합물을 1시간 동안 진탕시킨다. 용매를 제거하고, 수지를 CH2Cl2(2회)로 세척한다. 팔라듐 단계를 반복한다. 용매를 제거하고, 수지를 CH2Cl2(2회), DMF 중의 N,N-디이소프로필에틸암모늄 디에틸디티오카르바메이트(2회) 및 DMF(2회)로 세척하여 화합물 Ⅴ를 수득한다.
단계 E. 단계 D에서 수득한 탈보호된 수지를 단계 C에서 설명한 바와 같이 N-메틸이소니페코트산과 결합시켜 화합물 Ⅵ을 수득한다.
단계 F. Fmoc 보호 수지 Ⅵ를 ACT357로 회부 용기로부터 36개의 반응 용기에 균등하게 분배하고, 화합물 Ⅵ1-36을 수득한다.
단계 G. 수지(화합물 Ⅵ1-36)을 단계 B에서 설명한 바와 같이 피페리딘으로 처리하여 FMOC기를 제거한다.
단계 H. 단계 G에서 수득한 탈보호된 수지 36개의 분획을 DMF에 현탁시킨다. 각 반응 용기에 DMF 중의 적당한 카복실산(R1-36CO2H; 3당량), HATU(3당량) 및 NMM(7.5당량)를 첨가한다. 용기를 1시간 동안 진탕시킨다. 용매를 제거하고, NMP(2회), MeOH(2회) 및 DMF(2회)를 수지를 세척한다. R1-36CO2H을 수지와 결합시키고, 세척 단계를 반복하여 화합물 Ⅷ1-36을 수득한다.
단계 I. 수지(화합물 Ⅷ1-36)의 36개 분획을 CH2Cl2(3회)로 세척한다. 각각의 반응 용기에 TFA:H2O:CH2Cl2를 90:5:5로 첨가하고 용기를 30분 동안 진탕시킨다. 용매를 반응 용기로부터 각 튜브로 여과시킨다. 수지 16개 분획을 CH2Cl2(2X) 및 MeOH(2X)로 세척하고, 여과물을 각 튜브에 결합시킨다. 각 튜브를 증발시켜 화합물 Ⅸ1-36을 수득한다.
단계 J. 유리 카복실산 Ⅸ1-36 각각을 DMF에 용해시킨다. 각 용액에 피리딘(1.05당량)을 첨가하고, 펜타플루오로페닐 트리플루오로아세테이트(1.1당량)를 첨가한다. 혼합물을 45분간 실온에서 교반시킨다. 용액을 EtOAc로 희석시키고, 5% 수용성 NaHCO3(3X)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과한 후에 증발시켜 화합물 Ⅹ1-36을 수득한다.
실시예 6
R1-36-LYS(ε-INIP)-NBA-TFP 화합물의 제조
도 4는 36개의 T-L-X 화합물(X=Lh)의 세트의 병행 합성을 예시한 것이다. 여기서, Lh는 활성화 에스테르(특히, 테트라플루오로페닐 에스테르)이고, L2는 오르토-니트로벤질아민 그룹이고, L3는 Lh와 L2간의 직접 결합이고, Lh는 L2의 방향족 환에 직접 결합하고, T는 수진의 카복실산이 L2 벤질아민 그룹의 질소원자와 결합하여 아미드 결합을 형성하고, 가변 중량 성분 R1-36이 수진의 α-아미노 그룹을 통하여 결합(여기서, R 그룹은 T2에 대응되고 특정한 카복실산을 통하여 도입된다)되는 모듈러 구조이고, 질량 분광분석 감도 인핸서 그룹(N-메틸이소니페코트산을 통하여 도입됨)이 수지의 ε-아미노 그룹을 통하여 결합된다.
도 4에 대해서 언급한다:
단계 A. 실시예 5의 단계 A의 방법에 따라 NovaSyn HMP 수지가 화합물 Ⅰ[참조: Brown et al., Molecular Diversity, 1, 4(1995)에 따라 제조한 NBA)]와 결합하여 화합물 Ⅱ를 수득한다.
단계 B-J. 수지(화합물 Ⅱ)를 실시예 5의 단계 B-J에서 설명한 바와 같이 처리하여 화합물 Ⅹ1-36을 수득한다.
실시예 7
INIP-LYS(ε-R1-36)-ANP-TFP 화합물의 제조
도 5는 36개의 T-L-X 화합물(X=Lh)의 세트의 병행 합성을 예시낸 것이다. 여기서, Lh는 활성화 에스테르(특히, 테트라플루오로페닐 에스테르)이고, L2는 오르토-니트로벤질아민 그룹이고, L3는 Lh와 L2를 연결하는 메틸렌 그룹이고, T는 수지의 카복실산이 L2 벤질아민 그룹의 질소원자와 결합하여 아미드 결합을 형성하고, 가변 중량 성분 R1-36이 수지의 ε-아미노 그룹을 통하여 결합(여기서, R기가 T2에 대응되고 특정한 카복실산을 통하여 도입된다)되는 모듈러 구조이고, 질량 분광분석 감도 인핸서 그룹(N-메틸이소니페코트산을 통하여 도입됨)이 수지의 α-아미노 그룹을 통하여 결합된다.
도 5에 대해서 언급한다:
단계 A-C. 실시예 5와 동일하다.
단계 D. 실시예 5의 단계 B에서 설명한 바와 같이 수지(화합물 Ⅳ)을 피페리딘으로 처리하여 FMOC 그룹을 제거한다.
단계 E. 실시예 5의 단계 C에서 설명한 바와 같이 단계 D의 수지 상의 탈보호된 α-아미노산을 N-메틸이소니페코트산으로 처리하여 화합물 Ⅴ를 수득한다.
단계 F. 실시예 5와 동일하다.
단계 G. 수지(화합물 Ⅵ1-36)를 실시예 5의 단계 D와 같이 팔라듐으로 처리하여 Aloc 그룹을 제거한다.
단계 H-J. 실시예 5와 같은 방법으로 화합물 Ⅹ1-36를 수득한다.
실시예 8
R1-36-GLU(γ-DIAEA)-ANP-TFP 화합물의 제조
도 6은 36개의 T-L-X 화합물(X=Lh)의 세트의 병행 합성를 예시한 것이다. 여기서, Lh는 활성화 에스테르(특히, 테트라플루오로페닐 에스테르)이고, L2는 오르토-니트로벤질아민 그룹이고, L3는 Lh와 L2를 연결하는 메틸렌 그룹이고, T는 글루탐산의 α-카복실산이 L2벤질아민 그룹의 질소원자와 결합하여 아미드 결합을 형성하고, 가변 중량 성분 R1-36이 글루탐산의 α-아미노 그룹을 통하여 결합(여기서, R 그룹은 T2에 대응되고 특정한 카복실산을 통하여 도입된다)되는 모듈러 구조이고, 질량 분광분석 감도 인핸서 그룹(2-(디이소프로필아미노)에틸아민을 통하여 도입됨)이 글루탐산의 γ-아미노 그룹을 통하여 결합된다.
도 6에 대해서 언급한다:
단계 A-B. 실시예 5와 동일하다.
단계 C. 탈보호된 수지(화합물 Ⅲ)이 실시예 5의 단계 C에서 설명한 결합 방법을 이용하여 FMOC-Glu-(OAl)-OH와 결합하여 화합물 Ⅳ을 생성한다.
단계 D. 수지(화합물 Ⅳ) 상의 알릴 에스테르를 CH2Cl2(2회)로 세척한 다음, CH2Cl2 중의 (PPh3)4Pd(0)(0.3당량)와 N-메틸아닐린(3당량)의 용액과 혼합한다. 혼합물을 1시간 동안 진탕시킨다. 용매를 제거하고, 수지를 CH2Cl2(2회)로 세척한다. 팔라듐 단계를 반복한다. 용매를 제거하고, 수지를 CH2Cl2(2회), DMF 중의 N,N-디이소프로필에틸암모늄 디에틸디티오카르바메이트(2회) 및 DMF(2회)로 세척하여 화합물 Ⅴ를 수득한다.
단계 E. 단계 D로부터의 탈보호된 수지를 DMF에 현탁시키고, HATU(3당량)와 NMM(7.5당량)을 혼합하여 활성화시킨다. 용기를 15분간 진탕시킨다. 용매를 제거하고, 수지를 NMP(1회)로 세척한다. 수지를 2-(디이소프로필아미노)에틸아민(3당량)와 NMM(7.5당량)와 혼합한다. 용기를 1시간 동안 진탕시킨다. 2-(디이소프로필아미노)에틸아민을 수지에 결합시키고, 세척 단계를 반복하여 화합물 Ⅵ를 수득한다.
단계 F-J. 실시예 5와 동일하다.
실시예 9
R1-36-LYS(ε-INIP)-ANP-LYS(ε-NH2)-NH2 화합물의 제조
도 7은 36개의 T-L-X 화합물(X=Lh)의 세트의 병행 합성을 예시한 것이다. 여기서, Lh는 아민(특히, 수도 유도 부분의 ε-아미노 그룹)이고, L2는 오르토-니트로벤질아민 그룹이고, L3는 Lh와 L2를 연결하는 카복스아미도-치환 알킬렌아미노아실알킬렌 그룹이고, T는 수지의 카복실산 그룹이 L2 벤질아민 그룹의 질소원자와 결합하여 아미드 결합을 형성하고, 가변 중량 성분 R1-36이 수지의 α-아미노 그룹을 통하여 결합(여기서, R 그룹은 T2에 대응되고 특정 카복실산을 통하여 도입된다)되는 모듈러 구조이고, 질량 분광분석 감도 인핸서 그룹(N-메틸이소니페토트산을 통하여 도입됨)이 수지의 ε-아미노 그룹을 통하여 결합된다.
도 7에 대해서 언급한다:
단계 A. Fmoc-Lys(Boc)-SRAM 수지(ACT 제품; 화합물 Ⅰ)을 DMF 중의 25% 피페리딘과 혼합하고, 5분 동안 진탕시킨다. 수지를 여과하고, DMF 중의 25% 피페리딘과 혼합한 다음, 10분간 진탕시킨다. 용매를 제거하고 NMP(2회), MeOH(2회) 및 DMF(2회)로 수지를 세척한 후에 단계 B에 직접 사용한다.
단계 B. DMF 중의 수지(화합물 Ⅱ), ANP(ACT 제품; 3당량), HATU(3당량) 및 NMM(7.5당량)를 가하고 회수 용기를 1시간 동안 진탕시킨다. 용매를 제거하고, 수지를 NMP(2회), MeOH(2회) 및 DMF(2회)로 세척한다. 화합물 Ⅰ을 수지에 결합시키고, 세척 단계를 반복하여 화합물 Ⅲ를 수득한다.
단계 C-J. 실시예 5의 단계 B-I와 같은 방법으로 수지(화합물 Ⅲ)을 처리하여 화합물 Ⅹ1-36를 수득한다.
실시예 10
R1-36-LYS(ε-TFA)-LYS(ε-IINP)-ANP-TFP 화합물의 제조
도 8은 36개의 T-L-X 화합물(X=Lh)의 세트의 병행 합성을 예시한 것이다. 여기서, Lh는 활성화 에스테르(특히, 테트라플루오로페닐 에스테르)이고 L2는 오르토-니트로벤질아민 그룹이고, L3는 Lh와 L2를 연결하는 메틸렌 그룹이고, T는 제1 수지의 카복실산 그룹이 L2 벤질아민 그룹의 질소원자와 결합하여 아미드 결합을 형성하고, 질량 분광분석 감도 인핸서 그룹(N-메틸이소니페토트산을 통하여 도입됨)이 제1 수지의 ε-아미노 그룹을 통하여 결합되고, 제2 수지 분자가 제1 수지의 α-아미노 그룹을 통하여 제1 수지과 결합하고, 분자량 조정 그룹(트리플루오로아세틸 구조를 갖는)가 제2 수지의 ε-아미노 그룹을 통하여 결합되고, 가변 중량 성분 R1-36이 제2 수지의 α-아미노 그룹을 통하여 결합(여기서, R 그룹은 T2에 대응되고 특정 카복실산을 통하여 도입된다)는 모듈러 구조이다.
도 8에 대해서 언급한다:
단계 A-E. 실시예 5의 단계 A-E와 동일하다.
단계 F. 실시예 5의 단계 B에서 설명한 바와 같이 수지(화합물 Ⅵ)을 피페리딘으로 처리하여 FMOC 그룹을 제거한다.
단계 G. 탈보호된 수지(화합물 Ⅶ)가 실시예 5의 단계 C에서 설명한 결합 방법을 이용하여 Fmoc-Lys(Tfa)-OH와 결합하여 화합물 Ⅷ을 수득한다.
단계 H-K. 실시예 5의 단계 F-J와 같은 방법으로 수지(화합물 Ⅷ)을 처리하여 화합물 XI1-36를 수득한다.
실시예 11
R1-36-LYS(ε-INIP)-ANP-5'-AH-ODN 화합물의 제조
도 9는 실시예 5(X가 활성화 에스테르인 다른 T-L-X 화합물에 대해서 동일한 방법을 사용한다)의 에스테르로부터 유도된 36개의 T-L-X 화합물(X=MOI, MOI는 핵산 단편, ODN이다)의 세트의 병행 합성을 예시한 것이다. MOI는 포스포디에스테르-알킬렌아민 그룹을 통하여 MOI의 5' 말단에 T-L과 접합되어 있다.
도 9에 대해서 언급한다:
단계 A. 화합물 XII1-36을 문헌[참조: Van Ness et al., Nucleic Acids Res., 19, 3345(1991)]에 기재되어 있는 변형된 바이오티닐화 반응에 따라 제조한다. 200mM 붕산나트륨(pH 8.3, 250 mL) 중의 5'-아미노헥실 올리고뉴클레오티드(화합물 XII1-36, 1 mg)의 용액에 테트라플루오로페닐 에스테르(실시예 5의 화합물 Ⅹ1-36, 250mL의 NMP에서 100배 몰 과량으로 존재)을 첨가한다. 반응하지 않고 가수분해된 테트라플루오로페닐 에스테르를 세파덱스 G-50 크로마토그래피를 이용하여 XII1-36로부터 제거한다.
실시예 12
R1-36-LYS(ε-INIP)-ANP-LYS(ε-(MCT-5'-AH-ODN)-NH2 화합물의 제조
도 10은 실시예 9(X가 아민인 다른 화학식 T-L-X의 화합물에 대해서 동일한 방법을 사용한다)의 아민으로부터 유도된 36개의 화학식 T-L-X 화합물(X=MOI, MOI는 핵산 단편, ODN이다)의 세트의 병행 합성을 나타낸 것이다. MOI는 포스포디에스테르-알킬렌아민 그룹을 통하여 MOI의 5' 말단에 T-L과 접합되어 있다.
도 10에 대해서 언급한다:
단계 A. 5'-[6-(4,6-디클로로-1,3,5-트리아진-2-일아미노)헥실]올리고뉴클레오티드 XII1-36을 문헌[참조: Van Ness et al., Nucleic Acids Res., 19, 3345(1991)]에 기재되어 있는 바와 같이 제조한다.
단계 B. 100mM 붕산나트륨(pH 8.3) 중의 1mg/ml의 농도인 5'-[6-(4,6-디클로로-1,3,5-트리아진-2-일아미노)헥실]올리고뉴클레오티드 중의 하나의 용액에 R1-36-LYS(ε-INIP)-ANP-LYS(ε-NH2)-NH2(실시예 11의 화합물 Ⅹ1-36) 중에서 선택한 100배 몰 과량의 1급 아민을 첨가한다. 용액을 밤새도록 주위 온도에 방치한다. 반응하지 않은 아민은 3000MW 절단 막(Amicon; MA)을 통하여 세척액(3X)으로 물을 사용하여 한외여과로 제거한다. 용적을 100 mL로 감소시켜 화합물 ⅩⅢ1-36을 분리한다.
실시예 13
질량 분석법에 의한 복수 태그의 동시 검출 입증
이 실시예에서는 질량 분광분석기를 통하여 복수 화합물(태그)를 동시에 검출하는 능력을 설명한다. 특히, 이 실시예에서 31가지의 화합물을 매트릭스와 혼합하고 고형 지지체 위에 침착후 건조시키고, 레이저를 조사한다. 생성되는 이온을 질량 분광분석기에 도입한다.
다음 화합물(알드리히 제품)을 동일한 몰로 서로 혼합하여 최종 생성물이 0.002M(화합물 당)되도록 한다: 벤즈아미드(121.14), 니코틴아미드(122.13), 피라진아미드(123.12), 3-아미노-4-피페라졸카르복실산(127.10), 2-티오펜카르복사미드(127.17), 4-아미노벤즈아미드(135.15), 톨루마이드(135.17), 6-메틸니코틴아미드(136.15), 3-아미노니코틴아미드(137.14), 니코틴아미드 N-옥사이드(138.12), 3-하이드로피콜린아미드(138.13), 4-플루오로벤즈아미드(139.13), 신남아미드(147.18), 4-메톡시벤즈아미드(151.17), 2,6-디플루오로벤즈아미드(157.12), 4-아미노-5-이미다졸-카복시아미드(162.58), 3,4-피리딘-디플루오르벤즈아미드(165.16), 4-에톡시벤즈아미드(165.19), 2,3-피라진디카복스아미드(166.14), 2-니트로벤즈아미드(166.14), 3-플루오로-4-메톡시벤조산(170.4), 인돌-3-아세트아미드(174.2), 5-아세틸살리실아미드(179.18), 3,5-디아미노-2-피라진카복스아미드(187.59), 4-트리플루오로메틸-벤즈아미드(189.00), 5-아미노-5-페닐-4-피라졸-카복스아미드(202.22), 1-메틸-2-벤질-말로나메이트(207.33), 4-아미노-2,3,5,6-테트라플루오로벤즈아미드(208.11), 2,3-나프트렌디카복실산(212.22). 화합물들을 상기 농도로 DMSO에 올려놓는다. 물질 1㎕를 알파-시아노-4-하이드록시 신남산 매트릭스(1:10000 희석후)와 혼합하고 고체 스테인리스 강철 지지체 위에 침착시킨다.
물질에 단백질 TOF 질량 분광분석기(Bruker)을 이용하여 레이저를 조사하고, 생성되는 이온을 선형 모드와 회절 모드에서 측정한다. 다음 m/z 값을 관찰한다(도 11):
121.1 …→ 벤즈아미드(121.14)
121.1 …→ 니코틴아미드(122.13)
121.1 …→ 피라진아미드(123.12)
124.1
125.2
127.3 …→ 3-아미노-4-피페라졸카복실산(127.10)
127.2 …→ 2-티오펜카복스미드(127.17)
135.1 …→ 4-아미노벤즈아미드(135.15)
135.1 …→ 톨루마이드(135.17)
136.2 …→ 6-메틸니코틴아미드(136.15)
137.1 …→ 3-아미노니코틴아미드(137.14)
138.2 …→ 니코틴아미드 N-옥사이드(138.12)
138.2 …→ 3-히드로피콜린아미드(138.13)
139.2 …→ 4-플루오로벤즈아미드(139.13),
140.2
147.3 …→ 신남아미드(147.18)
148.2
149.2
4-메톡시벤즈아미드(151.17)
152.2
2,6-디플루오로벤즈아미드(157.12)
158.3
4-아미노-5-이미다졸-카복아미드(162.58)
163.3
165.2 …→ 3,4-피리딘-디플루오르벤즈아미드(165.16),
165.2 …→ 4-에톡시벤즈아미드(165.19)
166.2 …→ 2,3-피라진디카복스아미드(166.14)
166.2 …→ 2-니트로벤즈아미드(166.14)
3-플루오로-4-메톡시벤조산(170.4)
171.1
172.2
173.4
인돌-3-아세트아미드(174.2)
178.3
179.3 …→ 5-아세틸살리실아미드(179.18)
181.2 …→ 3,5-디아미노-2-피라진카복시아미드(181.19)
182.2 …→
1-나프탈렌아세트아미드(185.23)
188.2
8-클로로-3,5-디아미노-2-피라진카복시아미드(187.59)
189.2 …→ 4-트리플루오로메틸-벤즈아미드(189.00)
190.2
191.2
192.3
5-아미노-5-페닐-4-피라졸-카복사미드(202.22)
203.2
203.4
1-메틸-2-벤질-말로나메이트(207.33)
4-아미노-2,3,5,6-테트라플루오로벤즈아미드(208.11)
182.2 …→ 2,3-나프트렌디카복실산(212.22)
219.3
221.2
228.2
234.2
237.4
241.4
이 데이터는 31개 화합물 중의 22개가 예상 질량에서 스펙트럼에 나타났고, 9개 화합물이 예상 질량에 대하여 n + H 질량에서 스펙트럼이 나타낸 것을 보여준다. 후자의 현상은 화합물내 아민의 양성자화 때문이다. 31개 화합물 모두 MALDI 질량 분광분석기로 검출된다. 특히 중요한 것은, 이 실시예에서 분광법을 이용하여 복수 태그들을 동시에 검출할 수 있다는 사실을 증명한 것이다.
알파-시아노 매트릭스만(도 11)이 146.2, 164.1, 172.1, 173.1, 189.1, 190.1, 191.1, 192.1, 212.1, 224.1, 228.0, 234.3에서 피크가 나타난다. 스펙트럼에서 다른 동정 질량은 구입 화합물을 추가로 정제하지 않았으므로 오염물에 기인한 것이다.
실시예 14
복수 프로브를 이용한 유전자 발현 분석
붕산과 수산화나트륨으로부터 붕산나트륨 완충액(SBB)을 제조한다. APB 완충제는 0.18M NaCl, 0.05M 트리스(pH 7.6), 5mM EDTA, 및 0.5% 트윈 20R이다. TMNZ 완충제는 0.05M 트리스(pH 9.5), 1mM MgCl2, 0.5 mM ZnCl2이다. FW(필터 세척)은 0.09M NaCl, 50mM 트리스(pH 7.6), 25mM EDTA로 한다. SDS/FW는 0.1% 도데실설페이트(SDS)를 갖는 FW이다. 하이브리드화 용액은 3M 구아니디움 티오시아네이트, 2% N-라우로일사르코신(사르코실), 50mM 트리스(pH 7.6), 25mM EDTA이다. CAP 완충제는 0.1M 시트르산나트륨과 0.2M 인산나트륨(pH 6.5)이다. HRP 기질 용액은 0.1M 시트르산나트륨(pH 6.5), 0.2M 인산나트륨, 2.87mM 4-메톡시-1-나프톨, 0.093mM 3-APXLF-2-벤조티아졸리논 하이드라존 하이드로클로라이드, 및 4mM 과산화수소이다. AP(알카리 포스파타제) 기질 용액은 1M 5-브로모-4-클로린도일-3-포스페이트, 1mM 니트로블루 테트라졸륨, 0.01% 트윈 20(TMNZ에서)이다. 알카리 포스파타제의 형광 기질은 0.5mM 4-메틸-움벨리페론 포스페이트, 0.05M 트리스(pH 9.5), 1mM MgCl2, 0.5mM ZnCl2이다. 폴리(에틸렌이민)은 폴리사이언스에서 구하고, 나일론 비이드는 후버 그룹(Hoover Group)(마이애미주 솔트 세인트 마리 소재)에서 구입한다. 트레에틸옥소늄 테트라플루오로보레이트, 석산산 무수물, 1-메틸-2-피롤리돈은 피어스에서 구입한다. 구아닌 티오시아네이트(GuSCN)은 코닥(Kodak)(뉴욕주 로체스터 소재)에서 구한다. 시아누르 클로라이드는 알드리히의 것을 구입하고 톨루엔으로부터 재결정한다.
A. ODN 합성
포르피로모나스 길기발리스(Pg)의 16S 리보솜 RNA(rRNA)의 보전 또는 과변이 영역에 상보적(5'-CCTTAGGACAGTCTTCTTCAGCG)인 ODN을 ABI 380B나 MilliGen 7500 자동화 DNA 합성기에서 표준 시아노에틸-N,N-디이소프로필아미노-포스포르아미다이트(CED-포스포르아미다이트) 화학을 이용하여 합성한다. 상용의 N-모노메톡시트리틸아미노이헥스-6-일옥시-CED-포스포르아미다이트를 사용하여 5' 말단에 아민 테일을 도입시킨다. 5'-모노메톡시트리트릴 그룹을 갖는 ODN를 0.1M Et3NH+OAc-, pH 7.5, 20분간 5% 내지 45% CH3CN 구배의 해밀톤 PRP-1(7.0 x 305 mm) 가역상 컬럼을 이용하여 HPLC로 분석한다. 3M 아세트산나트륨과 1-부탄올을 가하여 ODN을 침전시킨다. Toso-Haas DEAE-NPR 컬럼을 사용하는 이온 교환 HPLC 및 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법(PAGE)으로 ODN의 질을 분석한다.
B. 폴리머 피복 나일론 비이드의 제조
무수 1-메틸-2-피롤리돈(1800 mL)에서 연마하지 않은 나일론 비이드(25,000, 직경 3/32 인치)를 5분간 주위 온도에서 교반시킨다. 트리에틸옥소늄 테트라플루오로보레이트(200mL, 1M 디클로로메탄)을 첨가하고, 30분간 주위 온도에서 교반한다. 액체를 건조시키고 비이드를 1-메틸-2-피롤리돈(4 x 500 mL)로 신속히 세척한다. 비드를 12 내지 24시간 동안 1-메틸-2-피롤리돈(폴리(에틸렌이민)의 30% 수용액으로부터 제조)에서 70,000 MW 폴리(에틸렌이민)의 3%(w/v) 용액으로 교반한다. 폴리(비이드를 1-메틸-2-피롤리돈(2 x 1L), SDS/FW(2 x 1L), H2O(10 x 2L)로 세척하고, 마지막으로 95% 에탄올(1 x 500mL)로 세척한다. 비이드를 고진공 상태에서 4 내지 5 시간 동안 건조시키고, 피크릴설폰산과 반응시켜 비이드의 아민 함유량을 결정한다.
C. 5'-[6-(4,5-디클로로-1,3,5-트리아진-2-일아미노)-헥실]-ODN의 제조
새롭게 제조한 0.1M SBB(pH 8.3, 3.2mL)와 H2O(1.8mL) 중의 5'-아미노헥실 ODN(1mL, 10mg/mL)의 용액에 재결정한 시아누르산 클로라이드(1mL, 50mg/mL)의 아세토니크릴 용액을 첨가한다. 용액을 주위 온도에서 30 내지 120 분간 혼합한다. 반응하지 않은 사아누르산 클로라이드를 3000MW 절단 막(Amicon; MA)과 세척액으로서 0.1M SBB n(pH 9.3, 4 x 10mL)로 여과하여 제거한다. 5'-[6-(4,5-디클로로-1,3,5-트리아진-2-일아미노)-헥실]-ODN은 0.1M SBB(pH 8.3)에서 4 ℃ 온도로 1주일 방치하여도 분해하지 않고 안정하다.
D. 나일론 비이드에 대한 ODN 부착
상기에 설명한 PEI-피복된 나일론 비이드(500개)를 새롭게 제조한 0.1M SBB(pH 9.3) 안에 놓고 30분 동안 격렬히 진탕시킨다. 보레이트 용액을 경사분리하고 비이드를 0.1M SBB(pH 8.3)으로 세척한 후에 동량의 0.1M SBB를 첨가한다. 이 비이드에 5'-[6-(4,5-디클로로-1,3,5-트리아진-2-일아미노)-헥실]-ODN의 보레이트 용액(1mL, 500mg/mL)을 첨가한다. 혼합물을 주위 온도에서 60분간 격렬히 교반한다. 용액을 경사분리하고 비이드를 0.1 MSBB(pH 8.3, 2 x 500mL)로 세척한다. 비이드를 메틸-2-피롤리돈:1.0M SBB(pH 8.3)을 9:1의 비율로 하여 석신산 무수물(10mg/mL)로 3회 처리한다. 반응 혼합물을 1시간 동안 주위 온도에서 교반시킨 후, 1-메틸-2-피롤리돈(2 x 250mL), dH2O(2 x 1L), SDS/FW(5 x 250mL), dH2O(4 x 1L)로 세척한다. 이 비이드를 25mM EDTA에 넣어 보관한다.
E. 프로브의 설계 및 표지화
실시예 5에서, 자극 대 비자극 Jurkat 사람 T 세포 림파종(JRT 3.5)에서 차동 mRNA 발현이 가능하도록 프로브를 설계한다.
5' 말단의 아민 결합된 올리고뉴클레오티드 100μg을 각각 19℃에서 30 내지 120분 동안 10% n-메틸-피롤리돈 알칼리성(pH 8.3 내지 8.5) 완충제에서 과량의 재결정 시아누르산 클로라이드화 반응시킨다. 최종 반응 조건은 pH 8.3, 2mg/mL 재결정 시아누르산 클로라이드와 500μg/mL 올리고뉴클레오티드이다. 반응하지 않은 시스타민을 G-50 세파덱스 컬럼에서 크기 배제 크로마토그래피로 제거한다. 유도된 ODN을 아민-반응성 형광체와 반응시킨다. 유도 ODN 제조물을 3개의 분획으로 분할하여 각각을 (a) 20배 몰과량의 텍사스 레드 설포닐 클로라이드(몰큘라 프로브), (b) 20배 몰과량의 리사민 설포닐 클로라이드(몰큘라 프로브) 또는 (c) 20배 몰과량의 플루오레세인 이소티오시아네이트와 반응시킨다. 최종 반응 조건은 pH 8.3에서 0.15M 붕산 나트륨과 실온에서 1시간이다. 반응하지 않은 형광체는 G-50 세파덱스 컬럼 상의 크기 배제 크로마토그래피로 제거한다. IL-2, IFN-g, GM-CSF들을 텍사스 레드로 표지하고, c-fos IL-4D와 PKC-g는 리사민으로 표지하고, CTLA4/CD28과 GMP 키나제는 플루오레세인으로 표지한다. IL-2, c-fos, CTLA4 프로브를 풀링한다. IFN-g, IL-4, GMP 키나아제 프로브와, GM-CSF, PKC-g도 풀링한다.
F. 유전자 발현 분석을 위한 고형 지지체 cDNA 합성
올리고 DMO 596 5'-ACTACTGATCAGGCGCGCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'
스페이서 AscⅠ (poly dT)20
G. 자극 및 RNA 제조
Jurkat 세포주 JRT 3.5를 1 x 10-6 세포/ml의 세포 밀도로 혈청 비함유 RPMI 매질[라이프 테크놀로지즈(Life Technologies)]에서 10ng/ml의 포르볼-12-미리스테이트-13 아세테이트[칼바이오켐(Calbiochem)]와 100ng/ml 이오노마이신의 존재하에 6시간 동안 자극한다.
세포를 펠렛화하고, 1 x PBS(라이프 테크놀로지즈)에서 세척하고, 재펠렛화하고, 10-6 세포당 0.5ml의 4M 구아니딘 이소티오시아네이트/1% N-라우릴 사크로신/25mM 시트르산나트륨 pH 7.1[피셔 사이언티픽(Fisher Scientific)]를 함유하는 완충액에 용해시킨다. 2M 아세트산나트륨(피셔 사이언티픽) (pH 4.2)의 10분의 1 용적을 첨가하고, 물로 포화된 페놀[암레스코(Amresco)]를 첨가한다. 혼합한 후에, 클로로포름:이소아밀알콜(29:1)(피셔 사이언티픽)의 4분의 1 용적을 첨가하고, 혼합물을 격렬하게 혼합한 다음에 10분간 아이스에서 배양한다. 수층을 제거하고, 동량의 클로로포름:이소아밀알콜로 추출한다. RNA를 2용적우의 EtOH[콴텀 케이칼 코포레이션(Quantum Chemical Corp.)]로 침전시키고, 원심 분리한 다음에 EtOH를 경사분리하고, RNA를 공기 건조시켜 RNase 비함유 물로 다시 현탁시켜 농도가 1mg과 5mg/ml가 되도록 한다.
H. 포획된 제1 쇄 합성
공유결합으로 5'-ACTACTGATCAGGCGCGCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'의 올리고뉴클레오티드(GenSet, La Jolla, CA)에 결합된 한 개의 나일론 비이드를 1.5 ml의 멸균된 마이크로퓨즈 관(피셔 사이언티픽)에서 충분한 RNase 비함유 물에 희석시킨 10 ㎍의 세포 RNA에 첨가한다. 50mM 트리스(pH 7.5), 1M NaCl(Fisher Scientific), 20 ㎍의 아세틸화 BSA[뉴 잉글랜드 바이오랩(New England Biolabs)]를 함유하는 동량의 2X mRNA 하이브리드화 완충제를 각 튜브에 첨가하고, 튜브를 2시간 동안 실온에서 온화하게 진탕시킨다. 상청액을 제거하고, 비이드를 1X mRNA 하이브리드화 완충액으로 3회 세척한다. 마지막으로 세척한 후에, 1X MMLV-가역 전사 완충제, 1mM dNTP 혼합물, 2mM DTT(라이프 테크놀로지즈), 20 유니트 Rnasin(프로메가(Promega)] 및 10μg/ml 아세탈화 BS(뉴 잉글랜드 바이오랩)로 이루어진 가역 전사 혼합물을 각 튜브에 첨가한 후, 600단위의 MMLV-가역 전사 효소(라이프 테크놀로지즈)를 첨가한다. 이 반응물을 2시간 동안 42 ℃에서 온화하게 진탕시킨다. 1단위 RNase H[베링거-만하임(Boehringer-Mannheim)을 첨가하고, 0.5 시간 더 반응을 지속한다. 상청액을 다시 제거하고, 각 비이드를 10mM 트리스(pH 8.0), 1mM EDTA pH 8(피셔 사이언티픽)에서 3회 세척한다. 비이드를 0.01% SDS(피셔 사이언티픽)으로 TE에서 비등시켜 나머지 RNA 주쇄를 제거한다.
나일론 고형 지지체를 다음의 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브 100 나노그램/ml와 하이브리드화시킨다:
(5'-GAACTCAAACCTCTGGAGGAAGTG-3', IL-2,
5'-CAGTGCAGAGGCTCGCGAGCTATA-3', IFN-γ,
5'-CTTGACCATGATGGCCAGCCACTA-3', GM-CSF,
5'-CATTCCCACGGTCACTGCCATCTC-3', c-fos,
5'-GCGACTGTGCTCCGGCAGTTCTAC-3', IL-4,
5'-GAGGTTCATCGACGATGCCACGAA-3', PKC-γ,
5'-GAGCTCATGTACCCACCTCCGTAC-3', CTLA4/CD28,
5'-ATCTTCGTGCAGCCGCCCTCACTG-3', GMP 키나제)
(모든 올리고는 소 서열에 기초한 GMP 키나제를 제외하고는 사람의 상동체이다). 3M GuSCN에서 8시간 동안 37℃에서 하이브리드화시킨다. 하이브리드화 반응 중에는 반응 혼합물을 천천히 혼합하여 프로브가 고형 지지체에 확산되도록 한다. 8시간의 배양 후에, 고형 지지체를 3M GuSCN으로 3회 세척하고, 0.1 x SSC로 5회 세척하고, 0.01M 디티오레이톨에 넣어 올리고뉴클레오티드로부터 형광체가 절단되도록 한다. 혼합물을 실온에서 15분 동안 배양한다. 형광을 검은색 미세적정 플레이트(다이나텍 라보라토리즈)에서 측정한다. 이어서, 플레이트를 591nm의 여기 파장을 이용하는 Fluoroskan II 형광계(플로우 라보라토리즈)로 직접 판독하고, 495nm의 여기 파장을 이용하여 플루오레세인에 대해 520nm에서의 발광을 모니터하고, 텍사스 레드에 대해 612nm에서의 발광을 모니터한다. 이어서, 리사민에 대해 590nm에서의 발광을 모니터한다. 결과는 다음과 같다:
실시예 15
고체상에서 단일의 염기쌍 미스매치 검출
이 실시예에서는 상보적인 형광 표지된 올리고뉴클레오티드를 이용하여 고정된 프로브에서 단일의 염기쌍 미스매치를 검출하는 것을 설명하고자 한다. 프로브 뉴클레오티드 세트는 염기쌍을 이루는 한 개의 프로브와 하이브리드화되는 경우 미스매치를 갖는 한 개의 뉴클레오티드로 이루어진다. 2개의 올리고뉴클레오티드를 서로 다른 형광체로 표지한 다음, 하이브리드화가 미스매치의 Tm에서 발생하도록 하고, 하이브리드화된 형광체의 비를 결정한다.
"표적" 올리고뉴클레오티드(DMO501: 5'-TTGATTCCCAATTATGCGAAGGAG-3')를 고형 지지체 세트에 고정시킨다. ODN-비이드(직경 32분의 3인치)를 앞서 설명한 바와 같이 제조[참조: Van Ness et al., Nucl. Acids Res. 19:3345, 1991]한다. ODN-비이드는 0.01 내지 1.2mg/비이드의 고정 ODN을 포함한다. DMO508은 DMO501에 대하여 상보적이다. DMO1969는 DMO501에서 위치 11의 G를 T로 치환한 것이고, DMO1971은 DMO501에서 위치 12의 A를 T로 치환한 것이다. 각 프로브 올리고뉴클레오티드를 BIODIPY 또는 TAMRA, 텍사스 레드로 표지한다. 하이브리드화 반응은 50ng/mL의 각 프로브에 대하여 3M GuSCN, 0.01M 트리스(pH 7.6), 5mM EDTA를 사용하여 유도한다. 같은 몰비의 프로브를 사용하여 튜브당 3개의 고형 지지체에서 하이브리드화시킨다. 하이브리드화는 계속 교반시킨 상태에서 30분 동안 42 ℃에서 이루어진다. 비이드를 3M GuSCN으로 42 ℃에서 3회 세척하고 SDS/FW로 5회 세척한다.
프로브 올리고뉴클레오티드를 변성시키기 위하여, 고형 지지체를 200μl의 TE(TE는 0.01M 트리스(pH 7.0), 5mM EDTA이다)에 둔다. 혼합물을 10분간 100℃에서 배양하고, 형광을 검은색 미세적정 플레이트에서 측정한다. 용액을 배양관(200㎕)에서 제거하고, 검은색 미세적정 플레이트(다이나텍 라보라토리즈)에 둔다. 이어서, 플레이트를 495nm의 여기 파장을 이용하는 Fluoroskan II 형광계(플로우 라보라토리즈)로 직접 판독하고, 플루오레세인에 대해 520nm에서의 방사를 모니터하고, 텍사스 레드에 대해 612nm에서의 방사를 모티터한다. 리사민 또는 TAMRA에 대해 590nm애서의 방사를 모티터한다. 결과는 다음과 같다:
이 결과로부터, 태그의 비율이 하이브리드화 이후에도 변하지 않기 때문에 텍사스 레드(TR) 578 올리고뉴클레오티드와 578-BD(BIODIPY)가 고정 표적으로 균일하게 하이브리드화된 세포주에 나타난 바와 같이 형광체가 하이브리드화 반응에 영향을 미치지 않음을 알 수 있다. GuSCN에서 미스매치 프로브에 대한 완전한 기본 프로브는 평균 20배 증가하여 염기쌍의 미스매치를 검출할 수 있다.
상기에서, 본 발명의 특정한 양태를 설명을 목적으로 본 명세서에 기재하였으나 본 발명의 취지와 범위에서 벗어나지 않는 한 여러가지 변형이 가능함을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명은 첨부된 청구 범위를 제외하고는 한정되지 않는다.

Claims (24)

  1. 리간드 쌍의 표지된 제1 구성원 세트를 당해 제1 구성원이 제2 구성원에 결합될 수 있는 충분한 시간 동안 일정 조건하에서 하나 이상의 제2 구성원을 함유하는 생물학적 샘플과 결합(여기서, 태그는 특정한 제1 구성원과 상관 관계를 가지고, 분광분석 또는 전위차 측정으로 검출가능하다)시키는 단계(a),
    결합된 제1 구성원과 제2 구성원을 결합되지 않은 구성원으로부터 분리시키는 단계(b),
    태그를 표지된 제1 구성원으로부터 절단하는 단계(c) 및
    당해 태그를 분광분석 또는 전위차 측정으로 검출하고, 이로부터 제1 구성원의 제2 구성원으로의 결합을 검출하는 단계(d)를 포함하여, 리간드 쌍의 제1 구성원의 제 2구성원으로의 결합을 검출하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 제1 구성원이 고형 지지체에 결합되는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 태그의 검출에 질량분석, 적외선 분광분석, 자외선 분광분석 또는 정전위 전류 측정을 이용하는 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 4개 이상의 표지된 제1 구성원이 결합되고 각각의 태그가 선택된 핵산 단편에 대해 유일한 방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 결합된 제1 구성원과 제2 구성원이 겔 전기영동, 모세관 전기영동, 미소채널 전기영동, HPLC, 크기 배제 크로마토그래피 및 여과로 이루어진 그룹으로부터 선택된 방법으로 결합되지 않은 구성원으로부터 분리되는 방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 표지된 제1 구성원이 산화, 환원, 산 불안정화, 염기 불안정화, 효소적, 전기화학적, 가열 및 광 불안정화 방법으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 방법으로 절단되는 방법.
  7. 핵산을 생물학적 샘플로부터 노출시키는 단계(a),
    노출된 핵산을 표지된 핵산 프로브가 핵산에 하이브리드화되기에 충분한 시간 동안 일정 조건하에 하나 이상의 선택된 표지된 핵산 프로브와 결합(여기서, 태그는 특정한 핵산 프로브와 상관 관계를 가지고, 분광분석 또는 전위차 측정으로 검출가능하다)시키는 단계(b),
    하이브리드화된 프로브를 하이브리드화되지 않은 프로브로부터 분리시키는 단계(C),
    당해 태그를 표지된 단편으로부터 절단하는 단계(d) 및
    당해 태그를 분광분석 또는 전위차 측정으로 검출하고, 이로부터 생물학적 샘플의 운전자 발현 패턴을 결정하는 단계(e)를 포함하여, 선택된 생물학적 샘플로부터의 유전자 발현 패턴을 분석하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 노출된 핵산이 고체 지지체에 결합되는 방법.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 하이브리드화된 프로브가 겔 전기영동, 모세관 전기영동, 미소채널 전기영동, HPLC, 여과 및 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 방법으로 하이브리드화되지 않은 프로브로부터 분리되는 방법.
  10. 제7항 또는 제8항에 있어서, 표지된 프로브가 산화, 환원, 산 불안정화, 염기 불안정화, 효소적, 전기화학적, 가열 및 광 불안정화 방법으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 방법으로 절단되는 방법.
  11. 제7항 또는 제8항에 있어서, 태그가 비행시간형 질량 분광분석, 4중극형 질량 분광분석, 자기 섹터 질량 분광분석 및 전기 섹터 질량 분광분석으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 방법으로 검출되는 방법.
  12. 제7항 또는 제8항에 있어서, 태그가 전량 측정 검출기와 전류 측정 검출기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 검출기를 이용하는 정전위 전류 측정으로 검출되는 방법.
  13. 제1항에 있어서, 표지된 제1 구성원이 하기 화학식의 화합물인 방법.
    Tms-L-X
    상기식에서,
    Tms는 질량 분광분석기로 검출가능한 유기 그룹으로서, 당해 그룹은 탄소; 수소 및 불소 중의 하나 이상; 및 산소, 질소, 황, 인 및 요오드로부터 선택된 임의의 원자를 포함하고,
    L은 Tms 함유 잔기를 화합물의 나머지로부터 절단시킬 수 있는 유기 그룹이고, 여기서, Tms 함유 잔기는 화합물을 질량 분광분석할 때 단일 이온화 전하 상태를 유지하고 3급 아민, 4급 아민 및 유기산으로부터 선택된 관능기를 포함하며,
    X는 목적 분자이다.
  14. 제1항에 있어서, 표지된 제1 구성원이 하기 화학식의 화합물인 방법.
    Tms-L-X
    상기식에서,
    Tms는 질량 분광분석기로 검출가능한 유기 그룹으로서, 당해 그룹은 탄소; 수소 및 불소 중의 하나 이상; 및 산소, 질소, 황, 인 및 요오드로부터 선택된 임의의 원자를 포함하고,
    L은 Tms 함유 잔기를 화합물의 나머지로부터 절단시킬 수 있는 유기 그룹이고, 여기서, Tms 함유 잔기는 화합물을 질량 분광분석할 때 단일 이온화 전하 상태를 유지하고 3급 아민, 4급 아민 및 유기산으로부터 선택된 관능기를 포함하며,
    -L-X는 화학식 9이다.
    화학식 9
    위의 화학식 9에서,
    b, c, d 또는 e 위치의 하나 이상은 수소, 알킬, 알콕시, 불소, 염소, 하이드록실, 카복실레이트 또는 아미드로 치환되고,
    R1은 수소 또는 하이드로카빌이고,
    R2는 목적 분자(MOI)를 포함한다.
  15. 제1항에 있어서, 표지된 제1 구성원이 하기 화학식의 화합물인 방법.
    Tms-L-X
    상기식에서,
    Tms는 질량 분광분석기로 검출가능한 유기 그룹으로서, 당해 그룹은 탄소; 수소 및 불소 중의 하나 이상; 및 산소, 질소, 황, 인 및 요오드로부터 선택된 임의의 원자를 포함하고, 화학식 T2-(J-T3-)n-를 갖는데, 여기서, T2는 수소, 불소, 요오드, 산소, 질소, 황 및 인 중의 하나 이상과 탄소로부터 형성되고 질량이 15 내지 500달톤인 유기 잔기이고,
    T3은 수소, 불소, 요오드, 산소, 질소, 황 및 인 중의 하나 이상과 탄소로부터 형성되고 질량이 50 내지 1000달톤인 유기 잔기이며,
    J는 직접 결합이거나, 아미드, 에스테르, 아민, 설파이드, 에테르, 티오에스테르, 디설파이드, 티오에테르, 우레아, 티오우레아, 카바메이트, 티오카바메이트,쉬프 염기, 환원된 쉬프 염기, 이민, 옥심, 하이드라존, 포스페이트, 포스포네이트, 포스포르아미드, 포스폰아미드, 설포네이트, 설폰아미드 및 탄소-탄소 결합으로부터 선택된 관능기이고,
    n은 1 내지 50의 정수로서, n이 1보다 큰 경우 T3 및 J는 각각 독립적으로 선택되고,
    L은 Tms 함유 잔기를 화합물의 나머지로부터 절단시킬 수 있는 유기 그룹이고, 여기서, Tms 함유 잔기는 화합물을 질량 분광분석할 때 단일 이온화 전하 상태를 유지하고 3급 아민, 4급 아민 및 유기산으로부터 선택된 관능기를 포함하며,
    X는 목적 분자(MOI)이다.
  16. 제1항에 있어서, 표지된 제 1구성원이 하기 화학식의 화합물인 방법.
    Tms-L-X
    상기식에서,
    Tms는 질량 분광분석기로 검출가능한 유기 그룹으로서, 당해 그룹은 탄소; 수소 및 불소 중의 하나 이상; 및 산소, 질소, 황, 인 및 요오드로부터 선택된 임의의 원자를 포함하고,
    L은 Tms 함유 잔기를 화합물의 나머지로부터 절단시킬 수 있는 유기 그룹이고, 여기서, Tms 함유 잔기는 화합물을 질량 분광분석할 때 단일 이온화 전하 상태를 유지하고 3급 아민, 4급 아민 및 유기산으로부터 선택된 관능기를 포함하며,
    X는 목적 분자(MOI)이고, 당해 화합물은 또한 화학식 5를 갖는다.
    화학식 5
    위의 화학식 5에서,
    G는 (CH2)1-6이고, 여기서, 하나의 CH2 그룹 또는 CH2 그룹 중의 하나의 CH2 그룹에서의 수소는 -(CH2)c-아미드-T4로 대체되고,
    T2 및 T4는 화학식 Cl-25N0-9O0-9HαFβ의 유기 잔기이고, 여기서, α와 β의 합은 C, N 및 O 원자의 채워지지 않은 원자가를 만족시키기에 충분한 값이며,
    아미드는 이고,
    R1은 수소 또는 C1-10 알킬이며,
    c는 0 내지 4의 정수이고,
    n은 1 내지 50의 정수로서, n이 1보다 큰 경우 G, c, 아미드, R1 및 T4는 서로 독립적으로 선택된다.
  17. 제1항에 있어서, 표지된 제 1구성원이 하기 화학식의 화합물인 방법.
    Tms-L-X
    상기식에서,
    Tms는 질량 분광분석기로 검출가능한 유기 그룹으로서, 당해 그룹은 탄소; 수소 및 불소 중의 하나 이상; 및 산소, 질소, 황, 인 및 요오드로부터 선택된 임의의 원자를 포함하고,
    L은 Tms 함유 잔기를 화합물의 나머지로부터 절단시킬 수 있는 유기 그룹이고, 여기서, Tms 함유 잔기는 화합물을 질량 분광분석할 때 단일 이온화 전하 상태를 유지하고 3급 아민, 4급 아민 및 유기산으로부터 선택된 관능기를 포함하며,
    X는 목적 분자(MOI)이고, 당해 화합물은 또한 화학식 6을 갖는다.
    화학식 6
    위의 화학식 6에서,
    G는 (CH2)1-6이고, 여기서, 하나의 CH2 그룹 또는 CH2 그룹 중의 하나의 CH2 그룹에서의 수소는 -(CH2)c-아미드-T4로 대체되고,
    T2 및 T4는 화학식 Cl-25N0-9O0-9HαFβ의 유기 잔기이고, 여기서, α와 β의 합은 C, N 및 O 원자의 채워지지 않은 원자가를 만족시키기에 충분한 값이며,
    아미드는 이고,
    R1은 수소 또는 C1-10 알킬이며,
    c는 0 내지 4의 정수이고,
    T5는 화학식 C1-25N0-9O0-9HαFβ의 유기 잔기이고, 여기서, α와 β의 합은 C, N 및 O 원자의 채워지지 않은 원자가를 만족시키기에 충분한 값이고, T5는 3급 또는 4급 아민 또는 유기산을 포함하며,
    m은 0 내지 49의 정수로서, m이 1보다 큰 경우 G, c, 아미드, R1 및 T4는 서로 독립적으로 선택된다.
  18. 제1항에 있어서, 표지된 제 1구성원이 하기 화학식의 화합물인 방법.
    Tms-L-X
    상기식에서,
    Tms는 질량 분광분석기로 검출가능한 유기 그룹으로서, 당해 그룹은 탄소; 수소 및 불소 중의 하나 이상; 및 산소, 질소, 황, 인 및 요오드로부터 선택된 임의의 원자를 포함하고,
    L은 Tms 함유 잔기를 화합물의 나머지로부터 절단시킬 수 있는 유기 그룹이고, 여기서, Tms 함유 잔기는 화합물을 질량 분광분석할 때 단일 이온화 전하 상태를 유지하고 3급 아민, 4급 아민 및 유기산으로부터 선택된 관능기를 포함하며,
    X는 목적 분자(MOI)이고, 당해 화학물은 또한 화학식 7을 갖는다.
    화학식 7
    위의 화학식 7에서,
    G는 (CH2)1-6이고, 여기서, 하나의 CH2 그룹 또는 CH2 그룹 중의 하나의 CH2 그룹에서의 수소는 -(CH2)C,-아미드-T4로 대체되고,
    T2 및 T4는 화학식 C1-25N0-9O0-9HαFβ의 유기 잔기이고, 여기서, α와 β의 합은 C, N 및 O 원자의 채워지지 않은 원자가를 만족시키기에 충분한 값이며,
    아미드는 이고,
    R1은 수소 또는 C1-10 알킬이며,
    c는 0 내지 4의 정수이고,
    T5는 화학식 C1-25N0-9O0-9HαFβ의 유기 잔기이고, 여기서, α와 β의 합은 C, N 및 0 원자의 채워지지 않은 원자가를 만족시키기에 충분한 값이고, T5는 3급 또는 4급 아민 또는 유기산을 포함하며,
    m은 0 내지 49의 정수로서, m이 1보다 큰 경우 G, c, 아미드, R1 및 T4는 서로 독립적으로 선택된다.
  19. 제7항에 있어서, 표지된 핵산 프로브가 하기 화학식의 화합물인 방법.
    Tms-L-X
    상기식에서,
    Tms는 질량 분광분석기로 검출가능한 유기 그룹으로서, 당해 그룹은 탄소; 수소 및 불소 중의 하나 이상; 및 산소, 질소, 황, 인 및 요오드로부터 선택된 임의의 원자를 포함하고,
    L은 Tms 함유 잔기를 화합물의 나머지로부터 절단시킬 수 있는 유기 그룹이고, 여기서, Tms 함유 잔기는 화합물을 질량 분광분석할 때 단일 이온화 전하 상태를 유지하고 3급 아민, 4급 아민 및 유기산으로부터 선택된 관능기를 포함하며,
    X는 핵산 프로브를 포함한다.
  20. 제7항에 있어서, 표지된 핵산 프로브가 하기 화학식의 화합물인 방법.
    Tms-L-X
    상기식에서,
    Tms는 질량 분광분석기로 검출가능한 유기 그룹으로서, 당해 그룹은 탄소; 수소 및 불소 중의 하나 이상; 및 산소, 질소, 황, 인 및 요오드로부터 선택된 임의의 원자를 포함하고,
    L은 Tms 함유 잔기를 화합물의 나머지로부터 절단시킬 수 있는 유기 그룹이고, 여기서, Tms 함유 잔기는 화합물을 질량 분광분석할 때 단일 이온화 전하 상태를 유지하고 3급 아민, 4급 아민 및 유기산으로부터 선택된 관능기를 포함하며,
    -L-X는 화학식 9이다.
    화학식 9
    위의 화학식 9에서,
    b, c, d 또는 e 위치의 하나 이상은 수소, 알킬, 알콕시, 불소, 염소, 하이드록실, 카복실레이트 또는 아미드로 치환되고,
    R1은 수소 또는 하이드로카빌이고,
    R2는 핵산 프로브를 포함한다.
  21. 제7항에 있어서, 표지된 핵산 프로브가 하기 화학식의 화합물인 방법.
    Tms-L-X
    상기식에서,
    Tms가 질량 분광분석기로 검출가능한 유기 그룹으로서, 당해 그룹은 탄소; 수소 및 불소 중의 하나 이상; 및 산소, 질소, 황, 인 및 요오드로부터 선택된 임의의 원자를 포함하고, 화학식 T2-(J-T3-)n-를 갖는데, 여기서, T2는 수소, 불소, 요오드, 산소, 질소, 황 및 인 중의 하나 이상과 탄소로부터 형성되고 질량이 15 내지 500달톤인 유기 잔기이고,
    T3은 수소, 불소, 요오드, 산소, 질소, 황 및 인 중의 하나 이상과 탄소로부터 형성되고 질량이 50 내지 1000달톤인 유기 잔기이며,
    J는 직접 결합이거나, 아미드, 에스테르, 아민, 설파이드, 에테르, 티오에스테르, 디설파이드, 티오에테르, 우레아, 티오우레아, 카바메이트, 티오카바메이트,쉬프 염기, 환원된 쉬프 염기, 이민, 옥심, 하이드라존, 포스페이트, 포스포네이트, 포스포르아미드, 포스폰아미드, 설포네이트, 설폰아미드 및 탄소-탄소 결합으로부터 선택된 관능기이고,
    n은 1 내지 50의 정수로서, n이 1보다 큰 경우 T3 및 J는 각각 독립적으로 선택되고,
    L은 Tms 함유 잔기를 화합물의 나머지로부터 절단시킬 수 있는 유기 그룹이고, 여기서, Tms 함유 잔기는 화합물을 질량 분광분석할 때 단일 이온화 전하 상태를 유지하고 3급 아민, 4급 아민 및 유기산으로부터 선택된 관능기를 포함하며,
    X는 핵산 프로브를 포함한다.
  22. 제7항에 있어서, 표지된 핵산 프로브가 하기 화학식의 화합물인 방법.
    Tms-L-X
    상기식에서,
    Tms는 질량 분광분석기로 검출가능한 유기 그룹으로서, 당해 그룹은 탄소, 수소 및 불소 중의 하나 이상; 및 산소, 질소, 황, 인 및 요오드로부터 선택된 임의의 원자를 포함하고,
    L은 Tms 함유 잔기를 화합물의 나머지로부터 절단시킬 수 있는 유기 그룹이고, 여기서, Tms 함유 잔기는 화합물을 질량 분광분석할 때 단일 이온화 전하 상태를 유지하고 3급 아민, 4급 아민 및 유기산으로부터 선택된 관능기를 포함하며,
    X는 핵산 프로브를 포함하고, 당해 화합물은 또한 화학식 5를 갖는다.
    화학식 5
    위의 화학식 5에서,
    G는 (CH2)1-6이고, 여기서, 하나의 CH2 그룹 또는 CH2 그룹 중의 하나의 CH2 그룹에서의 수소는 -(CH2)c-아미드-T4로 대체되고,
    T2 및 T4는 화학식 C1-25N0-9O0-9HαFβ의 유기 잔기이고, 여기서, α와 β의 합은 C, N 및 0 원자의 채워지지 않은 원자가를 만족시키기에 충분한 값이며,
    아미드는 이고,
    R1은 수소 또는 C1-10 알킬이며,
    c는 0내지 4의 정수이고,
    n은 1 내지 50의 정수로서, n이 1보다 큰 경우 G, c, 아미드, R1 및 T4는 서로 독립적으로 선택된다.
  23. 제7항에 있어서, 표지된 핵산 프로브가 하기 화학식의 화합물인 방법.
    Tms-L-X
    상기식에서,
    Tms는 질량 분광분석기로 검출가능한 유기 그룹으로서, 당해 그룹은 탄소; 수소 및 불소 중의 하나 이상; 및 산소, 질소, 황, 인 및 요오드로부터 선택된 임의의 원자를 포함하고,
    L은 Tms 함유 잔기를 화합물의 나머지로부터 절단시킬 수 있는 유기 그룹이고, 여기서, Tms 함유 잔기는 화합물을 질량 분광분석할 때 단일 이온화 전하 상태를 유지하고 3급 아민, 4급 아민 및 유기산으로부터 선택된 관능기를 포함하며,
    X는 핵산 프로브를 포함하고, 당해 화합물은 또한 화학식 6을 갖는다.
    화학식 6
    위의 화학식 6에서,
    G는 (CH2)1-6이고, 여기서, 하나의 CH2 그룹 또는 CH2 그룹 중의 하나의 CH2 그룹에서의 수소는 -(CH2)c-아미드-T4로 대체되고,
    T2 및 T4는 화학식 C1-25N0-9O0-9HαFβ의 유기 잔기이고, 여기서, α와 β의 합은 C, N 및 O 원자의 채워지지 않은 원자가를 만족시키기에 충분한 값이며,
    아미드는 이고,
    R1은 수소 또는 C1-10 알킬이며,
    c는 0내지 4의 정수이고,
    T5는 화학식 Cl-25N0-9O0-9HαFβ의 유기 잔기이고, 여기서, α와 β의 합은 C, N 및 O 원자의 채워지지 않은 원자가를 만족시키기에 충분한 값이고, T5는 3급 또는 4급 아민 또는 유기산을 포함하며,
    m은 0 내지 49의 정수로서, m이 1보다 큰 경우 G, c, 아미드, R1 및 T4는 서로 독립적으로 선택된다.
  24. 제7항에 있어서, 표지된 핵산 프로브가 하기 화학식의 화합물인 방법.
    Tms-L-X
    상기식에서,
    Tms는 질량 분광분석기로 검출가능한 유기 그룹으로서, 당해 그룹은 탄소; 수소 및 불소 중의 하나 이상; 및 산소, 질소, 황, 인 및 요오드로부터 선택된 임의의 원자를 포함하고,
    L은 Tms 함유 잔기를 화합물의 나머지로부터 절단시킬 수 있는 유기 그룹이고, 여기서, Tms 함유 잔기는 화합물을 질량 분광분석할 때 단일 이온화 전하 상태를 유지하고 3급 아민, 4급 아민 및 유기산으로부터 선택된 관능기를 포함하며,
    X는 핵산 프로브를 포함하고, 당해 화합물은 또한 화학식 7을 갖는다.
    화학식 7
    위의 화학식 7에서,
    G는 (CH2)1-6이고, 여기서, 하나의 CH2 그룹 또는 CH2 그룹 중의 하나의 CH2 그룹에서의 수소는 -(CH2)c-아미드-T4로 대체되고,
    T2 및 T4는 화학식 Cl-25N0-9O0-9HαFβ의 유기 잔기이고, 여기서, α와 β의 합은 C, N 및 O 원자의 채워지지 않은 원자가를 만족시키기에 충분한 값이며,
    아미드는 이고,
    R1은 수소 또는 C1-10 알킬이며,
    c는 0 내지 4의 정수이고,
    T5는 화학식 C1-25N0-9O0-9HαFβ의 유기 잔기이고, 여기서, α와 β의 합은 C, N 및 O 원자의 채워지지 않은 원자가를 만족시키기에 충분한 값이고, T5는 3급 또는 4급 아민 또는 유기산을 포함하며,
    m은 0 내지 49의 정수로서, m이 1보다 큰 경우 G, c, 아미드, R1 및 T4는 서로 독립적으로 선택된다.
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