CN108490093A - 一种开关型硫醇荧光标记试剂的荧光检测应用及其合成方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于荧光标记技术领域，提供一种开关型硫醇荧光标记试剂的荧光检测应用及其合成方法。该标记试剂结构以咔唑为母体环，马来酰亚胺为反应基团与同位素标记基团；其中，该标记试剂通过咔唑为荧光团，马来酰亚胺为反应活性基团，用于荧光检测样品中巯基化合物的含量。本发明合成方法简便，易于实现，得到的开关型荧光标记试剂，标记反应速率快，无背景干扰，灵敏性高，合成方法简便。

Description

一种开关型硫醇荧光标记试剂的荧光检测应用及其合成方法
技术领域
本发明属于有机小分子稳定同位素标记技术应用领域，具体涉及一种开关型硫醇荧光标记试剂及其合成方法与应用。
背景技术
高效液相色谱分析技术(简称HPLC)由于其高灵敏度和高选择性而被广泛应用于生命分析、环境检测、食品评估等研究领域。然而，目前可应用的马来酰亚胺类荧光标记试剂数量有限，并且现有荧光标记试剂与硫醇加成产物荧光不明显，背景干扰率高，合成步骤复杂，其应用受到一定的限制，现有技术却并没有给出行之有效的完整解决方案。
发明内容
本发明的目的是提供一种反应速率快、无背景干扰、灵敏性高、合成方法简便的开关型硫醇荧光标记试剂；本发明同时提供其具体合成方法与荧光检测应用。
本发明所提供的开关型硫醇荧光标记试剂是以咔唑为母体环，马来酰亚胺为反应基团与同位素标记基团。在荧光检测应用中，该标记试剂通过咔唑为荧光团，马来酰亚胺为反应活性基团，用于荧光检测样品中巯基化合物的含量。
所述开关型硫醇荧光标记试剂的化学名称为：N-(4-(咔唑-9-基)-苯基)-N-马来酰亚胺，其化学结构式为：
所提供的开关型硫醇荧光标记试剂的合成方法，包括将咔唑与4-溴乙酰苯胺进行取代反应，得到中间体Ⅰ9-((4-乙酰氨基)-苯基)-咔唑，然后中间体Ⅰ在碱性条件下加热水解，得到中间体Ⅱ9-((4-氨基)-苯基)-咔唑；将中间体Ⅱ与马来酸酐进行酰化缩合反应，生成目标产物N-(4-(咔唑-9-基)-苯基)-N-马来酰亚胺。
具体优选包括以下步骤：
1)取代反应：将咔唑和4-溴乙酰苯胺溶解到二甲亚砜中，并与碘化亚铜、二叔戊酰甲烷和碳酸钾混合，油浴130℃反应12h，反应结束待反应液冷却至25℃后抽滤，得抽滤液，然后将抽滤液与(10-30)wt％的NaCl混合析出沉淀，回收沉淀固体并干燥，得到中间体Ⅰ9-((4-乙酰氨基)-苯基)-咔唑；
2)水解反应：将中间体Ⅰ溶解于溶有氢氧化钾水溶液的二甲亚砜溶液中，于100℃反应2小时，冷却后，将反应液与水混合，回收析出固体并干燥，用乙醇重结晶制得中间体Ⅱ9-((4-氨基)-苯基)-咔唑；
3)酰化反应：将马来酸酐溶解到丙酮中，滴加溶有中间体Ⅱ的丙酮溶液，于25℃反应1小时，反应结束后将反应液溶剂蒸干，回收固体并干燥；固体干燥后加入乙酸酐溶解，再加入无水乙酸钠，于85℃下反应1小时，待反应液冷却到25℃后慢慢倒入冰水中，回收固体并干燥，用乙腈重结晶至少三次得目标产物N-(4-(咔唑-9-基)-苯基)-N-马来酰亚胺。
进一步，在步骤1)的所述取代反应中，咔唑与4-溴乙酰苯胺摩尔比为1:1.5，碘化亚铜、二叔戊酰甲烷和碳酸钾的加入量分别为咔唑质量的25％、22％和50％。
进一步，在步骤2)的所述水解反应中，氢氧化钾的加入量为9-((4-氨基)-苯基)-咔唑质量的30％。
进一步，在步骤3)的所述酰化反应中，9-((4-氨基)-苯基)-咔唑与马来酸酐的摩尔比为1:1.1，乙酸钠的加入量为9-((4-氨基)-苯基)-咔唑质量的10％。
本发明所提供的上述开关型硫醇荧光标记试剂的应用中，具体用于检测样品中硫醇的浓度，步骤为：
a.配制磷酸盐缓冲溶液和五组不同浓度硫醇标准品的乙腈溶液，硫醇标准品溶液中硫醇标准品浓度分别为1μM、10μM、100μM、1mM和10mM；配制N-(4-(咔唑-9-基)-苯基)-N-马来酰亚胺荧光标记试剂的乙腈溶液；
b.分别按分组依次将体积比1:2:1的磷酸盐缓冲溶液、硫醇标准品乙腈溶液和标记试剂溶液混合，于40℃的水浴中反应10min；反应完成后，取10μL进入高效液相色谱仪中检测分析，设置荧光激发波长290nm，荧光发射波长368nm，得到硫醇标准品色谱分离图，以硫醇浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标绘制硫醇浓度工作曲线；
c.依次将体积比1:2:1的磷酸盐缓冲溶液、经柱纯化/膜过滤后的样品和标记试剂溶液混合，于40℃的水浴中反应10min；反应完成后，取10μL进入高效液相色谱仪中检测分析，设置荧光激发波长290nm，荧光发射波长368nm，得到样品色谱峰面积，代入得到的硫醇浓度工作曲线中，既得样品中所含硫醇的浓度。
优选的，在步骤a中，磷酸盐缓冲溶液的pH＝7.4、浓度为10mM，硫醇标准品乙腈溶液的浓度为100mM。
优选的，在步骤b中，硫醇标准品溶液为100μL，经柱纯化/膜过滤后的样品为100μL。
本发明所带来的综合有益效果如下：
(1)与常见的芳基卤化物、苯并呋喃磺酰卤等标记试剂相比，本发明荧光标记试剂与硫醇反应迅速，在室温及生理pH环境下即可进行。(2)对巯基化合物的选择性高，能在生理pH下选择性地与硫醇化合物反应，加成产物比较稳定。(3)自身无荧光，在与硫醇加成后荧光显著增强，这种荧光开关效应极大地降低了检测过程中的背景信号干扰。(4)本发明的标记试剂标记反应速度快，对硫醇的标记反应可在10分钟内充分完成；(5)标记试剂合成步骤简单，化学性质稳定，产率较高，经分离提纯后，化学纯度达99.5％以上，具有标记反应速率快、标记产率高、对硫醇选择性高等优点，有利于增强硫醇类化合物分析的准确性和灵敏性，可应用于生命分析、环境分析、食品分析等研究领域中，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1是实施例1制备的荧光标记试剂的合成反应路线图。
图2是实施例1制备的荧光标记试剂的核磁1HNMR图谱。
图3是实施例2荧光标记试剂与硫醇化合物的荧光发射图。
图4是实施例3荧光标记试剂与硫醇化合物的反应路线图。。
图5是实施例3本发明荧光标记试剂衍生5种硫醇标准品的色谱分离图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步描述。
本发明的开关型硫醇荧光标记试剂是以咔唑为荧光团，马来酰亚胺为反应活性基团，其中马来酰亚胺基团通过苯环与咔唑荧光团相连，使化合物的平面性增加，共轭程度增强，由于马来酰亚胺基团的强吸电子效应，使标记试剂的量子产率显著下降，表现为无荧光。而且，其能在中性条件或弱碱性条件下选择性地与硫醇化合物反应，生成具有强荧光的衍生产物，与硫醇加成后荧光显著增强，这种荧光开关效应极大地降低了检测过程中的背景信号干扰。
实施例1
本发明所述开关型硫醇荧光标记试剂的合成共有3步。
开关型荧光标记试剂具体合成流程如图1所示，操作步骤如下：
1、中间体Ⅰ9-((4-乙酰氨基)-苯基)-咔唑的制备
250mL三口烧瓶中加入10g咔唑和16.5g4-溴乙酰苯胺，加入150mL二甲亚砜作为溶剂，加入5g碳酸钾、2.5g碘化亚铜与3mL二叔戊酰甲烷，油浴130℃反应12h过夜；反应结束待反应液冷却至室温25℃后抽滤，然后将抽滤液倒入25wt％的NaCl水溶液中析出沉淀，回收沉淀固体并干燥，得到中间体Ⅰ9-((4-乙酰氨基)-苯基)-咔唑，收率为85wt％。
2、中间体Ⅱ9-((4-氨基)-苯基)-咔唑的制备
250mL三口烧瓶中加入10g中间体Ⅰ，加入100mL二甲亚砜与20mL50％的氢氧化钾溶液，油浴加热并控制反应温度在100℃，搅拌反应2小时；冷却后将反应液沿着烧杯壁慢慢倒入600mL水中，并搅拌5分钟；将析出的固体过滤并干燥，用乙醇重结晶制得中间体Ⅱ9-((4-氨基)-苯基)-咔唑，收率为90wt％。
3、目标产物N-(4-(咔唑-9-基)-苯基)-N马来酰亚胺的制备
在100mL的圆底烧瓶中加入2.5g马来酸酐和20mL丙酮，搅拌至马来酸酐完全溶解后，滴加约25mL含有4g中间体Ⅱ的丙酮溶液，继续搅拌1小时后，将溶剂蒸干，回收固体并干燥，固体干燥后加入乙酸酐溶液溶解，再加入0.5g无水乙酸钠，然后用85℃的油浴加热反应1小时，待反应液冷却后沿烧杯壁慢慢倒入500mL冰水中，将析出的固体过滤并干燥，用乙腈重结晶三次，得到N-(4-(咔唑-9-基)-苯基)-N马来酰亚胺纯品，收率为60wt％。
产物表征：
1H NMR(CDCl3,500MHz,ppm)δ8.27(d,J＝7.8Hz,2H),7.77(d,J＝8.6Hz,2H),7.66(d,J＝8.6Hz,2H),7.48–7.42(m,4H),7.31(ddd,J＝7.9,5.7,2.3Hz,2H),2.59–2.41(m,2H)；如图2所示.
Found:C 78.11,H 4.14,N 8.28,O 9.46；Calculated:C 78.09,H 4.17,N 8.28,O9.46.
MS:m/z 338.4[M+H]+.
实施例2
本实施例采用实施例1所述方法合成本发明开关型硫醇荧光标记试剂，同时验证所述开关型荧光标记试剂荧光性质：
用乙腈配制浓度为1μM的N-(4-(咔唑-9-基)-苯基)-N-马来酰亚胺溶液和相同浓度的苯乙硫醇标准品溶液。如图3所示，标记试剂在与苯乙硫醇反应前，该试剂无荧光，反应后荧光显著增强。荧光最佳激发和发射波长分别为290nm和368nm。同时，以色氨酸标准溶液为参比溶液，计算N-(4-(咔唑-9-基)-苯基)-N-马来酰亚胺与其硫醇衍生物的荧光量子产率分别为0.004和0.415。
实施例3
本实施例采用实施例1所述方法合成本发明开关型硫醇荧光标记试剂，同时将该荧光标记试剂检应用于巯基样品(烤虾)检测：
(1)配制pH＝7.4、浓度为10mM的磷酸盐缓冲溶液；分别配制浓度为1×10-4mol/L的本发明荧光标记试剂的乙腈溶液；选用的硫醇标准品含五种，分别为2-甲基-1-丙硫醇、2-甲基-1-丁硫醇、糠基硫醇、2-甲基-3-呋喃硫醇和苯乙硫醇，配制五组不同浓度的混合标准品乙腈溶液，各组浓度分别为1μM、10μM、100μM、1mM和10mM。
(2)依次将50μL磷酸盐缓冲溶液、100μL硫醇标准品溶液和50μL荧光标记试剂的乙腈溶液加到2mL的安剖瓶中，于40℃的水浴中反应10min。N-(4-(咔唑-9-基)-苯基)-N-马来酰亚胺与硫醇反应式如图4所示。反应完成后取10μL进入高效液相色谱仪中分析，设置荧光激发波长为290nm，荧光发射波长为368nm，得到硫醇标准品色谱图，在10分钟内实现了5种硫醇分析物的完全分离。以硫醇浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标绘制硫醇浓度的标准曲线，图5示出了浓度为1×10-6mol/L的硫醇混合标准品色谱图。
(3)同时，于同样的条件下用本发明荧光标记试剂标记经柱纯化/膜过滤后的烤虾实际样品。本发明柱纯化可采用常规纯化分离柱进行处理或者采用现有0.22μm有机滤膜过滤，在本实施例中具体采用LiChrolut-EN固相小柱进行分离纯化。将处理的烤虾样品用荧光标记试剂标记后，进入高效液相色谱仪中分析，将所得到的峰面积代入标准曲线中，即可求得烤虾样品中所含相应硫醇的浓度。以上参考了优选实施例对本发明进行了描述，但本发明的保护范围并不限制于此，任何落入权利要求的范围内的所有技术方案均在本发明的保护范围内。在不脱离本发明的范围的情况下，可以对其进行各种改进并且可以用等效物替换其中的部件。尤其是，只要不存在结构冲突，各个实施例中所提到的各项技术特征均可以任意方式组合起来。

Claims (10)

1.一种开关型硫醇荧光标记试剂的荧光检测应用，其特征在于：该标记试剂结构以咔唑为母体环，马来酰亚胺为反应基团与同位素标记基团；
其中，该标记试剂通过咔唑为荧光团，马来酰亚胺为反应活性基团，用于荧光检测样品中巯基化合物的含量。
2.根据权利要求1所述的荧光检测应用，其特征在于，所述开关型硫醇荧光标记试剂的化学名称为：N-(4-(咔唑-9-基)-苯基)-N-马来酰亚胺，其化学结构式为：
。
3.根据权利要求2所述的荧光检测应用，其特征在于，包括以下步骤：
a.配制磷酸盐缓冲溶液和五组不同浓度硫醇标准品的乙腈溶液，硫醇标准品溶液中硫醇标准品浓度分别为1μM、10μM、100μM、1mM和10mM；配制N-(4-(咔唑-9-基)-苯基)-N-马来酰亚胺荧光标记试剂的乙腈溶液；
b.分别按分组依次将体积比1:2:1的磷酸盐缓冲溶液、硫醇标准品乙腈溶液和标记试剂溶液混合，于40℃的水浴中反应10min；反应完成后，取10μL进入高效液相色谱仪中检测分析，设置荧光激发波长290nm，荧光发射波长368nm，得到硫醇标准品色谱分离图，以硫醇浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标绘制硫醇浓度工作曲线；
c.依次将体积比1:2:1的磷酸盐缓冲溶液、经柱纯化/膜过滤后的样品和标记试剂溶液混合，于40℃的水浴中反应10min；反应完成后，取10μL进入高效液相色谱仪中检测分析，设置荧光激发波长290nm，荧光发射波长368nm，得到样品色谱峰面积，代入得到的硫醇浓度工作曲线中，既得样品中所含硫醇的浓度。
4.根据权利要求3所述的荧光检测应用，其特征在于，在步骤a中，磷酸盐缓冲溶液的pH＝7.4、浓度为10mM，硫醇标准品乙腈溶液的浓度为100mM。
5.根据权利要求3所述的荧光检测应用，其特征在于，在步骤b中，各组硫醇标准品溶液为100μL，经柱纯化/膜过滤后的样品为100μL。
6.一种如权利要求1-5中任一项所述荧光检测应用所采用的开关型硫醇荧光标记试剂的合成方法，其特征在于，将咔唑与4-溴乙酰苯胺进行取代反应，得到中间体Ⅰ9-((4-乙酰氨基)-苯基)-咔唑，然后中间体Ⅰ在碱性条件下加热水解，得到中间体Ⅱ9-((4-氨基)-苯基)-咔唑；将中间体Ⅱ与马来酸酐进行酰化缩合反应，生成目标产物N-(4-(咔唑-9-基)-苯基)-N-马来酰亚胺。
7.根据权利要求6所述的合成方法，其特征在于，该合成方法具体包括以下步骤：
1)取代反应：将咔唑和4-溴乙酰苯胺溶解到二甲亚砜中，并与碘化亚铜、二叔戊酰甲烷和碳酸钾混合，油浴130℃反应12h，反应结束待反应液冷却至25℃后抽滤，得抽滤液，然后将抽滤液与(10-30)wt％的NaCl水溶液混合析出沉淀，回收沉淀固体并干燥，得到中间体Ⅰ9-((4-乙酰氨基)-苯基)-咔唑；
2)水解反应：将中间体Ⅰ溶解于溶有氢氧化钾水溶液的二甲亚砜溶液中，于100℃反应2小时，冷却后，将反应液与水混合，回收固体并干燥，用乙醇重结晶制得中间体Ⅱ9-((4-氨基)-苯基)-咔唑；
3)酰化反应：将马来酸酐溶解到丙酮中，滴加溶有中间体Ⅱ的丙酮溶液，于25℃反应1小时，反应结束后将反应液溶剂蒸干，回收固体并干燥；固体干燥后加入乙酸酐溶解，再加入无水乙酸钠，于85℃下反应1小时，待反应液冷却到25℃后慢慢倒入水中，回收固体并干燥，用乙腈重结晶至少三次得目标产物N-(4-(咔唑-9-基)-苯基)-N-马来酰亚胺。
8.根据权利要求7所述的合成方法，其特征在于，在步骤1)的所述取代反应中，咔唑与4-溴乙酰苯胺摩尔比为1:1.5，碘化亚铜、二叔戊酰甲烷和碳酸钾的加入量分别为咔唑质量的25％、22％和50％。
9.根据权利要求7所述的合成方法，其特征在于，在步骤2)的所述水解反应中，氢氧化钾的加入量为9-((4-氨基)-苯基)-咔唑质量的30％。
10.根据权利要求7所述的合成方法，其特征在于，在步骤3)的所述酰化反应中，9-((4-氨基)-苯基)-咔唑与马来酸酐的摩尔比为1:1.1，乙酸钠的加入量为9-((4-氨基)-苯基)-咔唑质量的10％。
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