CN105461752B - 一种高选择性比值型荧光探针及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高选择性比值型荧光探针及其应用，具体涉及下式I所示的化合物以及在式I的基础上设计的式II所示的荧光探针，含有所述荧光探针的检测组合物和检测试剂盒。本发明还涉及使用该荧光分子或检测试剂盒检测或定位相邻巯基蛋白质的方法。所示式I和II的结构式如下所示，各基团定义如文中所述：

Description

一种高选择性比值型荧光探针及其应用

技术领域

本发明属于荧光探针领域，具体涉及一种高选择性比值型荧光探针及其在定量检测活细胞蛋白质相邻巯基及活细胞荧光原位成像方法中的应用。

背景技术

细胞内氧化还原环境的变化深刻地影响着细胞内各种生理功能。相邻巯基蛋白质，作为氧化还原平衡中还原端的顶点，密切参与各类氧化还原的调节，在酶活性的调节、细胞信号转导、疾病发生进程等方面起着非常关键的作用。由于蛋白质的巯基修饰基本没有光谱学特性，无法直接测量，而一般的检测手段常常需要破坏细胞再通过化学方法检测，通常无法得到相邻巯基蛋白在细胞内分布的信息。而细胞结构的破坏会导致细胞内各细胞器氧化还原环境，以及各种与相邻巯基相关酶类的重新分布。荧光成像可以提供大量直观，动态的信息，是进行生命科学研究的主要手段之一。

钱永健等基于相邻巯基与三价砷特异性结合的特点设计合成出了用于双砷荧光探针FLAsH及其类似物(Science 1998,281,269-272；US 6008278)，但是该类探针只用于发展一种蛋白质标记策略，涉及到的相邻巯基蛋白是通过外源性导入的多肽链，内源性的细胞中的相邻巯基蛋白反而被外加的一定浓度的EDT给抑制住。

Ebright,R.H.等发展一类基于内源性相邻巯基蛋白的双砷探针(US20040019104，US20060141531)，该类探针虽然可以同细胞内内源性的相邻巯基蛋白作用，但是该类探针也只用于发展一种蛋白质标记策略，并非将该类探针用于检测相邻巯基蛋白以及与之密切相关的氧化还原信号转导和氧化还原蛋白质组学研究。同时，该类探针上连接了两个砷基团，在化学计量学上并不能同单一的一个含相邻巯基的蛋白结合，容易在同一个探针分子上连接上不同种类的相邻巯基蛋白。

因此，以上两类探针只注重于发展一种蛋白质标记策略，并不能用于原位检测活细胞内源性的蛋白质相邻巯基。因此，设计合成特异性的蛋白质相邻巯基小分子荧光探针，发展蛋白质相邻巯基的原位荧光成像技术及相关蛋白质组技术，对系统性地研究与揭示蛋白质巯基氧化还原状态在信号转导这一与许多重要疾病相关的重大生命科学领域中的功能与作用具有重要意义，是当前研究十分迫切的任务。

CN102807588已设计出一类用于活细胞内蛋白质相邻巯基检测和原位成像的小分子荧光探针。为了进一步消除外部背景干扰，提高检测信号的信噪比，本发明进一步设计并合成一种可以实现对细胞内蛋白质相邻巯基分布强度进行荧光定量检测和比值型荧光成像的比值型小分子荧光探针就显得非常有价值。

发明内容

本发明设计合成一类基于荧光共振能量转移(FRET)原理的比值型小分子荧光探针，建立对不同氧化还原条件下细胞内蛋白质相邻巯基分布强度的荧光定量检测和比值型荧光成像方法。

因此，本发明第一方面提供下式I所示的化合物：

式I中，

R₁为H或羟基；

R₂为H或C1-C3烷基；

R₃为H或C1-C3烷基；

m为1、2或3；和

n为1－5的整数。

在一个具体实施例中，R₁为羟基。

在一个具体实施例中，R₂和R₃都为H。

在一个具体实施例中，式I化合物为：

本发明另一方面提供具有下式II结构的比值型小分子荧光探针：

式II中，

D为能量供体；

A为能量受体；

m为1、2或3；和

n为1－5的整数。

在一个具体实施例中，D为香豆素、萘酰亚胺、氟硼吡咯、荧光素、罗丹明、花菁染料等荧光团。

在一个具体实施例中，A为香豆素、萘酰亚胺、氟硼吡咯、荧光素、罗丹明、花菁染料、偶氮类荧光淬灭剂等。

在一个具体实施例中，式II化合物的VTAF1部分(即除A和D以外的式II结构)通过包括但不限于氨基与羧基缩合，氨基烷基化等方式与荧光团连接。这些连接方式是本领域技术人员根据式II化合物与荧光分子上的相应连接基团而能够容易地确定的。

在一个具体实施例中，D为7-氨基香豆素，A为1,8-萘酰亚胺。

在一个具体实施例中，本发明式II化合物为：

本发明还提供一种检测组合物，该组合物含有本发明式II所示的化合物和适宜的溶剂。

溶剂的例子可以是，例如任何可溶解本发明式II所示的化合物并与所培养的细胞相容的各种溶剂。这类溶剂的例子包括但不限于PBS溶液(例如含有5－15mM PBS、1－10mMEDTA、和0.1－1.0％DMSO，pH7.4；优选含有10mM PBS、5mM EDTA、0.5％DMSO，pH7.4)，HEPES缓冲液(例如含有5－15mM HEPES、1－10mM EDTA和0.1－1％％DMSO，pH7.4；优选含有10mMHEPES、5mM EDTA和0.5％DMSO，pH7.4)，Tris缓冲液(25mM Tris碱,1.92M甘氨酸)，和MOPS缓冲液(例如含有15-25mM MOPS、25-75mM NaCl和0.5-1.5mM EDTA，pH7.0；优选含有20mMMOPS、50mM NaCl和1mM EDTA，pH7.0)等。

本发明还提供一种检测试剂盒，该试剂盒含有本发明式II所示的化合物或本发明的检测组合物，以及任选地指导技术人员使用该试剂盒检测或定位相邻巯基蛋白质的说明书。

本发明的探针分子能够与蛋白质上相邻巯基特异性作用。因此，本发明还包括式II化合物在相邻巯基蛋白质的检测或定位中的应用。

本发明还包括一种检测或定位相邻巯基蛋白质的方法，所述方法包括将本发明的式II所示的探针分子给予检测对象，和检测所述化合物中的荧光分子，从而检测或定位所述相邻巯基蛋白质。

在一具体实施例中，本发明采用荧光比值检测技术对相邻巯基蛋白进行离体检测。在此实施例中，通过利用本发明的荧光探针结合相邻巯基蛋白前后的荧光波长发生移动，利用荧光移动前后两个波长处两种荧光信号强度的比值达到定量检测蛋白质相邻巯基的目的。

在一具体实施例中，本发明采用荧光共聚焦显微镜研究细胞内蛋白质相邻巯基强度分布，利用比值型荧光成像技术检测亚细胞水平上蛋白质分布。具体为利用荧光探针结合细胞内相邻巯基蛋白前后发生不同波长的两种荧光信号，从而利用双通道荧光信号对亚细胞器上的相邻巯基蛋白进行成像检测，从而达到检测细胞水平上相邻巯基蛋白在活细胞内的荧光定量检测。

本发明的方法还可结合电泳技术和流式细胞仪，进行与相邻巯基蛋白相关的氧化还原蛋白质组学研究。

在一具体实施例中，本发明方法利用本发明探针分子原位检测生物体内内源性相邻巯基蛋白。

在一具体实施例中，本发明方法利用本发明的探针分子进行氧化还原蛋白质组学研究。

可用于本发明探针分子进行检测的相邻巯基蛋白指一类包含一对及以上的空间上邻近巯基的蛋白质，包括但不限于硫氧还蛋白(Trx)和牛血清蛋白(BSA)，其中Trx蛋白含有一对相邻巯基，牛血清蛋白含有17对相邻巯基。在该类蛋白质中，相邻巯基不一定在序列上相互挨近，但是必须在空间上足够邻近以至能够使它们在氧化条件下成二硫键，在还原条件下能以邻近巯基形式存在。如果蛋白质上一对巯基满足在氧化条件下能够成为二硫键，那么该对巯基就被称为相邻巯基。

本发明的检测对象或检测样品可包括例如，各种组织、器官和血液，这些组织、器官和血液中的细胞，细胞培养物等。任何需要检测和/或定位其相邻巯基蛋白的对象或样品都可用于本发明。

本发明还包括式II所示的探针分子的制备方法，包括设计合成了一个稳定的蛋白质相邻巯基受体二巯基丙醇及其类似物保护的对氨基亚砷酸(VTAF1)，和通过引入能够发生荧光共振能量转移的一对荧光团和适当的连接臂修饰，从而合成了所示探针分子。制备本发明探针分子的示范性实施例可参见本申请的实施例中的流程。本领域技术人员可根据实际所要制备的探针分子，适当改变所述流程中的反应物质和条件，这些都在本领域技术人员所掌握的知识范围之内。

本发明与现有技术相比，其有益效果体现在：

1.合成的相邻巯基受体VTAF1在生理环境中有较好的氧化还原耐受性，稳定性较好；同时该受体对蛋白质相邻巯基具有较高的选择性，蛋白质上的其他基团如氨基、羧基和单巯基等不存在干扰。另外该类受体可以分别在两端修饰荧光团作为构建FRET探针。

2.合成了一系列基于FRET原理的比值型小分子荧光探针以及相应的对照探针，可以满足活细胞内源性蛋白质相邻巯基定量检测的需求。

3.利用荧光共聚焦成像技术及其分析软件，首次实现了对于活细胞内源性蛋白质相邻巯基的定量检测和动态跟踪。

4.利用电泳技术和流式细胞仪，结合小分子荧光的特点，首次实现了对于不同氧化还原环境下细胞内源性蛋白质相邻巯基变化的动态、定量跟踪检测。

附图说明

图1为设计合成的比值型小分子荧光探针VTAF定量检测蛋白质相邻巯基的模型示意图。

图2为目标探针pH滴定测试，显示pH对探针VTAF吸收和发射光谱的影响。其中：(a)pH对探针吸收光谱的影响。插图显示最大吸收随pH值的变化。(b)pH对探针发射光谱的影响。(c)最大发射540nm和两个最大发射峰强度的比率470/540随随pH值的变化。激发波长405nm,狭缝5/10。

图3为合成的小分子荧光探针VTAF对于模型相邻巯基蛋白rBSA的时间响应和浓度检测。其中：(a)加入rBSA后VTAF的荧光强度随时间的变化。激发波长405nm。时间为加入rBSA后立即检测，2,4,8,10分钟以至60分钟；(b)VTAF的荧光光谱随着rBSA浓度的变化。405nm激发，探针与蛋白的反应时间为60分钟。此图所示的各曲线从上到下依次对应于：VTAF+1.0eq rBSA、VTAF+0.8eq rBSA、VTAF+0.6eq rBSA、VTAF+0.4eq rBSA、VTAF+0.2eqrBSA、VTAF+0.1eq rBSA、VTAF+0.07eq rBSA和VTAF 2μM。(c)根据b图中的470nm和540nm处的荧光强度做比值(I₄₇₀/I₅₄₀)，以浓度为横坐标，比值(I₄₇₀/I₅₄₀)为纵坐标作图。(d)比值和浓度分别取对数log10后再作图获得浓度与比值间的线性关系(线性相关系数为R²＝0.99867)。

图4为VTAF对于rBSA的选择性。采用荧光光谱和SDS-PAGE电泳显示小分子荧光探针对于含有相邻巯基的蛋白rBSA具有很好的选择性。其中：(a)VTAF对rBSA的选择性响应。405nm激发，探针与加入物质的反应时间为60分钟，1μM探针中加入1当量(1μM)rBSA,100当量(100μM)各种氨基酸(包括含单个巯基的氨基酸)。可以看出其他各类常见氨基酸对VTAF不存在响应，显示出VTAF对rBSA具有较好的选择性。(b)为oBSA对VTAF检测rBSA的干扰。探针与加入物质的反应时间为60分钟，2μM探针中加入1当量(2μM)rBSA和1当量(2μM)oBSA。可以看出oBSA对VTAF没有响应。其中rBSA为含有17对相邻巯基的牛血清蛋白，oBSA为利用氧化剂双氧水将相邻巯基成二硫键后的牛血清蛋白。此图中，各曲线从上到下依次表示VTAF+1eq rBSA、VTAF+1eq oBSA和VTAF 2μM。(c)为根据a图和b图中的470nm和540nm处的荧光强度做比值(I₄₇₀/I₅₄₀)，以各类检测干扰物为横坐标，比值(I₄₇₀/I₅₄₀)为纵坐标作图。(d)为SDS-PAGE电泳显示小分子荧光探针对于含有相邻巯基的蛋白rBSA具有很好的选择性。VTAFC为小分子探针VTAF的一个阴性参照物。

图5为用VTAF对活细胞内蛋白质相邻巯基进行荧光成像检测和荧光半定量分析。其中：(a)为荧光比值型成像图。PAO为对氨基苯亚砷酸，可以抑制细胞内蛋白质相邻巯基与VTAF的结合。VTAFC为VTAF的一个阴性对照。(b)根据a图中的荧光强度进行半定量分析细胞内蛋白质相邻巯基的强度。

图6为VTAF应用于流式细胞仪中检测悬浮细胞HL-60上蛋白质相邻巯基在氧化还原试剂刺激下的强度变化。(a)为流式细胞仪检测时的输出结果；(b)根据a图的面积以VTAF组细胞的荧光强度作为基准，做出的平均荧光强度对各类处理细胞样品作图。其中DTT为还原剂，Diamide为氧化剂，blank为细胞不加任何试剂时的空白对照。

具体实施方式

FRET探针对于靶标分子识别存在两条信息相互关联的通道。当探针识别蛋白质上相邻巯基的时候，荧光发射在两条通道中被重新分配，识别事件同时由两个信息通道来表达。因此，FRET探针对于识别信号就建立起一种更加先进的内部校准方法，减少了探针对于蛋白质上相邻巯基进行荧光定量检测时的外部因素的干扰。为了实现对蛋白质上相邻巯基的定量检测，进一步增加信噪比，提高检测与成像灵敏度，本发明设计合成了比值型FRET探针用于相邻巯基检测，即结构式II所示的荧光探针。该探针采用相邻巯基特异性受体VTAF1(见结构式I)，在两边分别连接荧光能量供体和能量受体。

适用于本发明的能量供体(D)可包括但不限于为香豆素、萘酰亚胺、氟硼吡咯、荧光素、罗丹明、花菁染料等荧光团。

适用于本发明的能量受体(A)可包括但不限于为香豆素、萘酰亚胺、氟硼吡咯、荧光素、罗丹明、花菁染料、偶氮类荧光淬灭剂等。

本发明式II化合物的VTAF1部分(即除A和D以外的式II结构)通过包括但不限于氨基与羧基缩合，氨基烷基化等方式与荧光团连接。这些连接方式是本领域技术人员根据式II化合物与荧光分子上的相应连接基团而能够容易地确定的。

图1显示了本发明比值型小分子荧光探针VTAF定量检测蛋白质相邻巯基的模型示意图，其中主要利用设计的这些荧光小分子具有在单一波长激发下发射两种荧光信号的特点，当探针未与蛋白质相邻巯基结合前，单一波长激发下能量供体发射的荧光信号转移到能量受体上使得能量受体发射荧光；探针与蛋白质相邻巯基结合后，相邻巯基选择性地与VTAF1发生置换反应从而切断探针分子使得能量受体离去，能量供体则结合到蛋白质相邻巯基上。使得相邻巯基蛋白发射能量供体的荧光信号。利用结合前后荧光信号从能量受体到能量供体的改变以及两种荧光信号的比值，可以实现对于活细胞蛋白质相邻巯基的定量检测。

可采用本发明的荧光比值检测技术对相邻巯基蛋白进行离体定量检测，利用本发明的荧光小分子探针结合相邻巯基蛋白前后的荧光信号在两个不同的信号通道上的强度分布以及它们的比率进行定量检测。

本发明可采用荧光共聚焦显微镜对活细胞内源性蛋白质相邻巯基分布强度进行荧光定量检测分析。

本发明还可利用探针与细胞内蛋白质相邻巯基作用后，可以将荧光团定点标记到靶蛋白的相邻巯基上，从而实现对于细胞内蛋白质相邻巯基变化的动态可视化跟踪。

本发明还可结合电泳技术和流式细胞仪，进行与蛋白质相邻巯基相关的氧化还原蛋白质组学研究。

本发明的检测通常是离体或体外检测。检测对象可以是各种细胞，包括动物细胞或植物细胞，也可以是培养了细胞的培养基、上清液等等。

下面通过实施例对本发明作进一步阐述，其目的仅在于更好理解本发明的内容。因此，本发明的保护范围不受所举之例的限制。实施例中所用到的试剂，除非另有说明，否则都是从市场上直接购得的，其均依常规方法使用。

实施例1

以7-氨基香豆素和1,8-萘酰亚胺为能量供体和受体荧光团的目标探针的合成，其合成路线如下：

PAO：对氨基苯胂酸(10.85g，50mmol)溶解在甲醇中，加热回流使溶液变澄清，再滴加苯肼(10.30mL,100mmol),10分钟滴加完毕。产生大量氮气，当氮气变得很少的时候，继续回流1小时。反应液在90℃浓缩，加入水85mL和0.1M氢氧化钠水溶液(85mL)，乙醚(2×75mL)洗涤,水相中加入氯化铵水溶液(1M,40mL)置于0℃冰箱结晶析出大量白色针状晶体对氨基苯胂酸氧化物，真空干燥得到产品5.54g(收率53％)。置于KOH中充Ar气保存。

VTAF1：VTA1(129mg,0.64mmol)溶解在5mL无水乙醇中,在回流下滴加二巯基丙醇(10eq,6.4mmol)，滴加完毕后，反应液继续搅拌回流10分钟。TLC显示原料VTA1消失，新点产生。反应液在干冰/丙酮条件下冷冻后，用甲苯(2×53mL)共沸蒸除一部分二巯基丙醇，得到乳黄色固体粗品，仍然有很大味道的二巯基丙醇残留。硅胶柱层析(DCM/MeOH,v/v,100/1)得到白色晶体94mg(57％得率)；¹H NMR(CDCl₃,400MHz)δ7.52(d,J＝8.0Hz,2H),7.37(d,J＝8.0Hz,2H),6.85(br s,2H),4.10-4.05(m,1H),3.83(dd,J＝12.8,1.4Hz,1H),3.57-3.49(m,2H),2.84(dd,J＝12.8,4.4Hz,1H)；¹³C NMR(CDCl₃,100MHz)δ139.46,136.38,131.58,118.41,64.60,58.49,42.89。

VTAF2:香豆素(86mg,0.33mmol)溶解在无水DMF中，加入HATU(125mg,0.33mmol)，VTAF1(94mg,0.33mmol)和DIPEA(58μL,0.33mmol)。反应液在氩气保护下室温搅拌过夜。TLC显示反应结束，减压蒸除溶剂得到粗品。硅胶柱层析(纯DCM)分离得到VTAF2黄色固体(111mg,63％得率)。¹H NMR(CDCl₃,400MHz)δ10.95(s,1H),8.73(s,1H),7.81-7.72(m,3H),7.45-7.29(m,2H),6.65(d,J＝7.6Hz,1H),6.50(s,1H),4.22-4.06(m,1H),3.53-3.44(m,4H),3.31-3.13(m,3H),2.56-2.52(m,1H),1.24(t,J＝7.2Hz,6H)；¹³C NMR(CDCl₃,100MHz)δ163.05,161.28,157.79,152.93,148.57,145.85,132.74,132.01,131.44,130.53,120.19,110.30,108.56,96.58,57.25,57.01,45.18,42.80,12.51；MS(ESI)m/z 532[(M+H)⁺,100％]。

VTAF3:VTAF2(232mg,0.44mmol)溶解在10mL干燥二氯甲烷中，加入三乙胺NEt₃(94μL,0.66mmol)和对硝基苯基氯甲酸酯(133mg,0.66mmol)。反应液加热回流4小时，然后冷至室温25℃继续搅拌72小时。加入10mL水淬灭反应，取有机相，饱和食盐水洗一次(10mL)。有机相无水硫酸钠干燥，蒸除溶剂后得到黄色粗品。柱层析梯度洗脱(DCM:MeOH,v/v,50:1)得到黄色固体纯品(215mg,70％)。¹H NMR(CDCl₃,400MHz)δ11.00(s,1H),8.79(s,1H),8.30(d,J＝8.8Hz,1H),7.78(d,J＝8.4Hz,2H),7.65(d,J＝8.4Hz,2H),7.48(d,J＝8.8Hz,1H),7.41(d,J＝8.8Hz,1H),6.70(d,J＝9.2Hz,1H),6.55(s,1H),4.34-4.15(m,3H),3.93(d,J＝12.8Hz,1H),3.50(q,J＝7.2Hz,4H),2.87(dd,J＝13.2,4.4Hz,1H),1.28(t,J＝7.2Hz,6H)；¹³C NMR(CDCl₃,100MHz)δ163.15,161.50,157.85,155.39,153.03,151.95,148.69,145.45,139.41,137.22,131.49,125.34,121.75,120.39,115.73,110.35,109.57,108.58,96.59,68.78,53.34,45.20,29.71,12.45；m/z698[(M+H)⁺,100％]。

VTAF4:将乙二胺(32mL,479mmol)溶解在30mL乙醇中，加入三乙胺(2.8mL)，冰浴冷却至0℃，搅拌下往反应液中滴加10mL乙醇溶解的Boc酸酐(4.7mL,20.4mmol)溶液，滴加完毕，升至室温继续反应1小时。反应完毕，减压蒸除溶剂。粗产品溶解在50mL二氯甲烷中，用稀醋酸洗三次，收集水相，用2M的NaOH水溶液调pH至9左右后用二氯甲烷萃取三次，取有机相，无水碳酸钾干燥后，除去溶剂得到无色液体2.83g，收率86.7％。GC-MS 95％，161(M+H)。直接用于下一步反应。

VTAF5:4-溴-5-硝基-1,8-萘酐(161mg,0.5mmol)溶解在无水乙醇(20mL)中，滴加VTAF4(80mg,0.5mmol)乙醇溶液(10mL)。反应液加热回流40分钟。TLC显示反应结束，减压蒸除溶剂。粗品用硅胶柱层析(DCM:甲醇,50:1,v/v)分离得到VTAF5黄色固体(167mg,72％得率)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.73(d,J＝8.0Hz,1H),8.54(d,J＝8.0Hz,1H),8.23(d,J＝8.0Hz,1H),7.94(d,J＝8.0Hz,1H),4.87(br s,1H),4.37(t,J＝5.6Hz,2H),3.56-3.55(m,2H),1.27(s,9H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ163.13,162.37,156.08,151.34,135.94,132.40,131.33,130.63,125.62,124.19,123.51,122.35,121.19,79.36,40.61,39.06,28.15。

VTAF6:VTAF5(93mg,0.2mmol)溶解在15mL乙二醇单甲醚中，滴加二甘醇胺(0.1mL,1.0mmol)，反应液回流下搅拌3小时。反应结束后减压蒸除溶剂，得到粗品。硅胶柱层析(CH₂Cl₂:甲醇,15:1,v/v)分离纯化得到VTAF6棕黄色固体(56mg,51％得率)。¹H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.73(d,J＝8.0Hz,2H),6.21(d,J＝7.2Hz,2H),4.41(br,3H),3.87(br,2H),3.64-3.62(m,8H),3.37-3.33(m,2H),3.24-3.11(m,8H),1.16(s,9H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ164.25,162.32,156.31,152.47,133.17,131.44,110.23,106.54,72.36,72.19,68.44,63.42,61.19,49.77,43.75,28.17；MS(ESI)m/z547[(M+H)+,100％]。

VTAF7:VTAF6(56mg,0.1mmol)溶解在10mL的三氟乙酸/二氯甲烷(TFA/DCM,v/v,30:70)中搅拌45分钟。反应结束用甲苯共沸(100mL×2)蒸除溶剂后，残留物质溶解在10mL二氯甲烷中，饱和NaHCO₃洗涤两次(100mL×2)。有机相用无水Na₂SO4干燥，减压蒸除溶剂，得到深棕色油状液体。硅胶柱层析梯度洗脱(DCM:MeOH,10:1至2:1,v/v)分离得到VTAF7为棕色糖浆状物质(38mg,85％得率)。¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ7.72(d,J＝8.4Hz,2H),6.42(d,J＝8.4Hz,2H),4.02(br,2H),3.86-3.62(m,16H),3.03(br,2H)；¹³C NMR(100MHz,CD₃OD)δ164.25,152.90,132.85,131.26,109.87,109.37,106.27,72.35,68.45,60.92,60.84,43.60,39.88,39.44；MS(ESI)m/z447[(M+H)⁺,100％]。

VTAF:VTAF7(45mg,0.1mmol)溶解在5mL干燥DMF中，加入三乙胺(14μL,0.1mmol)和VTAF3(84mg,0.12mmol)。反应液在室温下搅拌过夜。减压蒸除溶剂后，得到粗品为黄色固体。硅胶柱层析，梯度洗脱(DCM:MeOH,v/v,25:1to10:1)得到嫩黄色固体(31mg,31％)。¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ10.90(s,1H),8.74(s,1H),8.31(d,J＝8.0Hz,2H),7.74(d,J＝8.4Hz,2H),7.62(d,J＝8.4Hz,2H),7.48(d,J＝9.2Hz,1H),6.71(d,J＝7.2Hz,2H),6.56(s,1H),6.48(br s,1H),5.56(br s,1H),4.39-4.31(m,2H),4.17-4.12(m,2H),4.01-3.46(m,22H),2.72-2.70(m,1H),2.35-2.22(m,2H),1.73-1.61(m,6H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ164.82,163.12,161.31,160.90,157.84,154.49,153.32,152.95,148.66,139.43,137.37,133.35,131.48,131.41,120.24,110.28,109.85,109.84,108.60,106.62,96.63,72.25,70.23,68.47,60.89,54.62,45.32,43.66,43.18,40.33,39.84,12.44；HRMS(ES+)C₄₆H₅₃N₆O₁₁NaS₂As([M+Na]⁺)理论值1027.2327,实际值1027.2336。

实施例2：目标探针pH滴定测试

目标探针的pH滴定实验。用Sartorius basic pH-Meter PB-20测试溶液pH，取探针储液10^-3M 200μL稀释成20mL的超纯水溶液得到10^-5M探针水溶液。用2N盐酸和1N NaOH溶液调pH，在pH计中数值稳定30秒不变后进行读数。然后取3mL溶液在比色皿中用VarianCary 100紫外-可见分光光度计和Varian Cary Eclipse荧光光度计进行吸收和发射光谱测试。将最大吸收值和发射值对pH值在origin中拟合得到目标探针的pH滴定曲线。由此可以读出探针适合应用的最佳pH窗口。结果见图2，在生理条件下(pH7.4左右)，该探针可以不受外界条件影响，保持稳定的荧光性能。

实施例3

利用荧光比值检测技术和电泳进行相邻巯基蛋白的离体测试，以还原性牛血清蛋白(rBSA)作为模型蛋白，在实施例中合成的探针VTAF作为小分子荧光探针，分别进行选择性、浓度梯度和动力学测试。

1.测试探针对于相邻巯基蛋白的选择性

用40μM的微量比色皿，将探针稀释成1μM，然后加入各种含不同巯基形式的化学物质和蛋白质。采用水浴循环控制测试温度在37℃，激发波长405nm。利用Varian CaryEclipse荧光光度计中的Scan模块进行光谱测试，所得荧光数据根据需要在origin中进行数据拟合和计算。结果如图4所示。从图中可以看出探针VTAF对于各种氨基酸没有响应，尤其是对于含单巯基的小分子氨基酸，即使在过量的加入量下VTAF的荧光光谱仍然没有改变(图4a)。同时，我们将氧化性牛血清蛋白(oBSA)单独与还原性牛血清蛋白做选择性比较测试(图4b)。在2μM VTAF存在下，oBSA在470nm左右可以看到微弱的响应，我们认为oBSA上仍然存在一些未完全氧化的相邻巯基，从而导致VTAF在470nm处有微弱的响应信号出现。但这并不影响VTAF对rBSA的高选择性检测。所得结果处理获得荧光比值和各干扰物质的谱图如图4c所示，可以非常清晰地看到VTAF对于相邻巯基蛋白rBSA具有较好的选择性。同时电泳实验结果也显示VTAF对rBSA有较好的响应(图4d)。

2.测试探针的时间动力学

用40μM的微量比色皿，将探针稀释成1μM，然后加入1当量(1μM)的还原性牛血清蛋白(rBSA)，立即进行数据采集。采用水浴循环控制测试温度在37℃，激发波长405nm。利用Varian Cary Eclipse荧光光度计中的Scan模块进行光谱测试。结果如图3a所示。当加入等当量的rBSA后，VTAF的荧光光谱在470nm处出现发射峰并且随着时间逐渐增强，60分钟后基本保持不变；540nm的峰值随着时间略有增强。可见VTAF对于rBSA有好的响应速度。

3.测试探针对相邻巯基蛋白的浓度梯度

用40μM的微量比色皿，将探针稀释成1μM，然后加入不同浓度的还原性牛血清蛋白(rBSA)。采用水浴循环控制测试温度在37℃，反应60分钟后，激发波长405nm。利用VarianCary Eclipse荧光光度计中的scan模块进行光谱测试。所得数据在origin软件中进行拟合和计算。结果如图3所示。当rBSA浓度从0到2μM增加的时候，在470nm处的荧光逐渐增强，而540nm处荧光略有增强(图3b)。利用470nm的荧光强度对于540nm处的荧光强度作比值，可得比值和rBSA浓度的关系(图3c)，进一步对于比值和rBSA浓度分别取对数，可得比值和rBSA浓度的线性关系(线性相关系数为R²＝0.99867，图3d)。可见VTAF可以实现对于rBSA浓度的较好定量检测。相比于CN102807588已设计出的一类用于蛋白质相邻巯基检测的小分子荧光探针，VTAF可以利用双通道荧光信号进行比值型检测，从而达到精确的定量检测蛋白质相邻巯基的目的。

实施例5

利用实施例1中合成的探针VTAF对MCF-7(人乳腺癌)细胞中的相邻巯基蛋白进行细胞器定位研究。

1.VTAF对活细胞相邻巯基蛋白比值型荧光成像检测：将MCF-7细胞用PBS洗两次,然后用5μM VTAF在37℃下进行标记。为了研究PAO，DTT和Diamide对细胞中的相邻巯基蛋白的作用。将5μM PAO,or 10mM DTT or 50μM Diamide加入标记细胞中。30分钟后，吸掉培养液，用PBS冲洗一次(或者不用冲洗)，再加入新鲜的无血清培养基DMEM。Leica TCS SP5 II共聚焦显微镜进行荧光成像(Leica TCS SP5 IIConfocal Laser Scanning Microscopewith HC×PLAPO 63X oil objective(NA:1.4))。激发波长405nm，接收通道，香豆素通道：450-490nm；萘酰亚胺通道：530-590nm。荧光半定量用ImageJ和Leica TCS SP5 II自带软件Leica LAS AF Lite进行计算。结果如图5所示。有图可见，VTAF加入细胞后，香豆素通道(450-490nm)的荧光信号较强；萘酰亚胺通道(530-590nm)的荧光信号较弱，这是因为结合细胞内的相邻巯基蛋白后，VTAF的香豆素部分结合到相邻巯基蛋白上，FRET被抑制从而发射香豆素的荧光。当加入相邻巯基抑制剂PAO后，萘酰亚胺通道的荧光信号重新变得较强，那是因为加入PAO后，PAO抑制了VTAF与蛋白质相邻巯基的结合从而使得FRET能够正常发生。这样就将香豆素发射的荧光转移到萘酰亚胺上从而发射萘酰亚胺的荧光。VTAF的阴性对照VTAFC的成像就进一步说明了VTAF可以实现对细胞内相邻巯基蛋白高选择性成像(图5a)。另外利用ImageJ等软件对获得的细胞荧光信号进行处理后获得细胞内荧光比值信号，该半定量信号与蛋白质相邻巯基强度成正相关。从而实现对于细胞内相邻巯基蛋白的半定量检测。而CN102807588已设计出一类用于活细胞内蛋白质相邻巯基检测和原位成像的小分子荧光探针NPE，只能用于定性检测活细胞内蛋白质相邻巯基，VTAF则可以实现半定量检测。

实施例6

VTAF应用于流式细胞仪中定量检测悬浮细胞中蛋白质相邻巯基对于氧化应激的动态变化：悬浮细胞HL60在35mm的培养皿中培养到80％融合后收取。用PBS洗三次(每次2mL)后，加入新鲜的无血清培养基2mL。最后加入VTAF和不同的氧化还原试剂(DTT和Diamide)共孵育30分钟后。离心去掉培养液，PBS清洗两次后加入新鲜的无血清培养基用流式细胞仪(FACScan flowcytometer(BD Biosciences Pharmingen,USA))进行检测。激发波长405nm，接收信号425-475nm(450nm，带宽50nm，该接受通道为绿色通道)收集的荧光信号用FACSDiva软件和FlowJo软件进行处理。

结果如图6所示。空白样品和阴性对照标记上荧光的细胞数10以下，说明这两个细胞样品基本没有响应。VTAF处理后的标记上荧光的细胞则为10³，说明VTAF对于细胞内的相邻巯基蛋白有响应，同时利用不同的氧化还原试剂(DTT和Diamide)刺激细胞诱导细胞内的蛋白质相邻巯基含量发生变化，被VTAF标记的细胞数则相应地发生变化。由此可见VTAF可以实现对细胞内蛋白质相邻巯基对于氧化应激的动态变化的实时跟踪定量检测。

虽然以具体实施例的方式阐述了本发明，但应理解，在不偏离本发明精神和范围的情况下，可对本发明做出各种合适的修改和变动，这些修改和变动都在本发明的范围之内。

Claims (1)

1.下式所示的化合物在制备非疾病的诊断和治疗的活细胞内蛋白质相邻巯基对于氧化应激的动态变化的实时跟踪定量检测中使用的检测组合物或检测试剂盒中的应用：