CN102702074B

CN102702074B - 一种以咔唑为荧光团的磺酰氯类化合物的制备方法

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Publication number: CN102702074B
Application number: CN201210186190.1A
Authority: CN
Inventors: 王赪胤; 张毅; 袁宇; 胡效亚
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2012-06-07
Filing date: 2012-06-07
Publication date: 2014-01-01
Anticipated expiration: 2032-06-07
Also published as: CN102702074A

Abstract

一种以咔唑为荧光团的磺酰氯类化合物的制备方法，涉及环境、医药、食品及卫生领域中醇和胺类物质的检测技术领域。以前体化合物咔唑、N-溴代丁二酰亚胺、甲醇钠、碘苯、氯磺酸和二氯亚砜为原料进行制备，得到一种新的以咔唑为荧光母体环的磺酰氯类化合物，本发明可作为一种荧光分子探针用于环境、医药、食品及卫生领域中醇和胺类物质的检测，也可作为诊断疾病及质量监控的标记试剂。

Description

一种以咔唑为荧光团的磺酰氯类化合物的制备方法

技术领域

本发明涉及环境、医药、食品及卫生领域中醇和胺类物质的检测技术领域，特别是用于检测的荧光分子探针的合成技术。

背景技术

目前，应用柱前衍生化试剂对于不具有发色基团的醇和胺类物质的分析已有许多报道，而针对痕量分析所开发设计的荧光衍生剂也相继有报道。在这些标记试剂的制备中，绝大多数产品是在已有制备方法上的改进或是根据已有方法进行制备并将其应用于高效液相色谱柱前衍生研究中。此外，多数标记试剂在应用时有一定的局限性，具体表现在：

（1）大多数标记试剂对空气中的水分较敏感，且进行衍生反应时易水解，其水解产物会对衍生产物产生一定的干扰。

（2）某些标记试剂由于其本身结构所致，其检测灵敏度不够，从而无法对痕量化合物进行检测。

（3）某些标记试剂与醇和胺类物质进行衍生反应时所形成的衍生产物稳定性较低，从而影响后续的检测分析，甚至会造成检测结果出现严重偏差。

（4）某些标记试剂本身具有一定的毒性，或是在与样品进行衍生反应后产生一些有毒物质和腐蚀性气体。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的以咔唑为荧光团的磺酰氯类化合物。

本发明以咔唑为荧光团的磺酰氯类化合物为3,6–二甲氧基–9–苯基咔唑–1–磺酰氯，具有以下分子结构式：

Figure 2012101861901100002DEST_PATH_IMAGE001

本发明其分子量为401.05，熔点为134–136℃，经过核磁氢谱鉴定得到上述分子结构式，本发明具有荧光发色团咔唑母体环、辅助取代基团甲氧基和苯基及反应基团氯磺酰基（—SO₂Cl），可以作为一种荧光分子探针，用于环境、医药、食品及卫生领域中醇和胺类物质的检测，也可作为诊断疾病及质量监控的标记试剂。

本发明另一目的是提供上述以咔唑为荧光团的磺酰氯类化合物的制备方法。

本发明先将咔唑和N–溴代丁二酰亚胺反应成生3,6–二溴咔唑，再将3,6–二溴咔唑和甲醇钠反应成生3,6–二甲氧基咔唑，再将3,6–二甲氧基咔唑和碘苯反应生成3,6–二甲氧基–9–苯基咔唑，最后将3,6–二甲氧基–9–苯基咔唑、氯磺酸和二氯亚砜反应生成3,6–二甲氧基–9–苯基咔唑–1–磺酰氯。

其中，在制备3,6–二溴咔唑时，以前体化合物咔唑和N–溴代丁二酰亚胺为原料，硅胶为催化剂，在二氯甲烷溶液中室温搅拌反应至结束，经过滤，将滤过液以乙酸乙酯萃取，再经无水乙醇重结晶得到3,6–二溴咔唑。

在制备3,6–二甲氧基咔唑时，以3,6–二溴咔唑和甲醇钠为原料，以碘化亚铜为催化剂，在N,N–二甲基甲酰胺溶液中回流搅拌反应至结束，采用乙酸乙酯萃取，柱层析纯化得到3,6–二甲氧基咔唑。

在制备3,6–二甲氧基–9–苯基咔唑时，以3,6–二甲氧基咔唑和碘苯为原料，以碳酸铯和铜粉为催化剂，在乙腈溶液中回流搅拌反应至结束，采用乙酸乙酯萃取，柱层析纯化得到3,6–二甲氧基–9–苯基咔唑。

在制备3,6–二甲氧基–9–苯基咔唑–1–磺酰氯时，以3,6–二甲氧基–9–苯基咔唑和氯磺酸为原料，在二氯甲烷溶液中室温搅拌反应至结束，将反应后的溶液旋干后加入二氯亚砜，在N,N–二甲基甲酰胺溶液中室温搅拌3小时后，将溶液倒入冰水中，乙酸乙酯萃取，柱层析得到3,6–二甲氧基–9–苯基咔唑–1–磺酰氯。

上述3,6–二甲氧基–9–苯基咔唑和氯磺酸的投料摩尔比为1︰1.5。采用该摩尔比的目的是：控制反应中生产磺酸基团的数量，过低的氯磺酸用量无法使磺化反应进行完全，过高的氯磺酸用量会使反应生成多取代的磺酸基团，而产生副产物。

本发明工艺步骤合理、简单，合成的物质稳定性好，具体特点有：

1、在3,6–二溴咔唑的合成步骤中采用硅胶催化，使得反应能够很好地控制溴取代基的数目，其具有反应温度低、药品毒性小、产品收率高、催化剂与溶剂可循环使用等优点。

2、对于3,6–二甲氧基咔唑的合成步骤，具有特异性强，产品收率高等优点。

3、对于3,6–二甲氧基–9–苯基咔唑的合成步骤的最大优点在于：由于采用了乙腈做溶剂，乙腈的沸点只有81.1℃，使得反应温度低，所用的碱为碳酸铯，其碱性相对较弱，避免产生过多的副产物。

4、在3,6–二甲氧基–9–苯基咔唑–1–磺酰氯的合成步骤中，先采用氯磺酸进行磺化反应，再用二氯亚砜进行氯化反应，可以很好地控制生成氯磺酰基的数目，可避免生成多取代氯磺酰基，副产物多的现象。

本发明的第三个目的是提供以咔唑为荧光团的磺酰氯类化合物，即3,6–二甲氧基–9–苯基咔唑–1–磺酰氯的用途。

其用途是：将咔唑为荧光团的磺酰氯类化合物作为荧光分子探针用于检测胺类物质。

所述胺类物质为L–羟脯氨酸、L–脯氨酸或N–乙基甘氨酸中的至少任意一种。

具体应用方法是：将所述以咔唑为荧光团的磺酰氯类化合物与待检样品进行衍生化反应，然后通过高效液相色谱进行分离检测，取得待检样品中游离的L–羟脯氨酸、L–脯氨酸或N–乙基甘氨酸含量。

本发明提供的一种以咔唑为荧光团的磺酰氯类化合物是一类新的化合物，它以供电子基团甲氧基和苯基作为辅助取代基团增强整个分子的共轭性，以氯磺酰基（—SO₂Cl）作为反应基团，其可作为一种荧光分子探针用于环境、医药、食品及卫生领域中醇和胺类物质的检测，也可作为诊断疾病及质量监控的标记试剂。该类标记试剂用于衍生化反应，所得衍生产物有较好的稳定性，可稳定数周，其所建立的方法有较好的重现性，仪器响应值高，检测灵敏度可达fmol，使得其可进行超微量组份的检测分析。此外，该标记试剂在温和的条件下较易进行反应，且在与反应物进行反应时只需过量几倍便可使反应进行完全，过量的标记试剂可被完全水解且水解产物完全不干扰衍生产物的检测分析。

附图说明

图1为本发明合成的3,6–二甲氧基–9–苯基咔唑–1–磺酰氯的核磁氢谱图。

图2为Hyp、Pro及NEG标准溶液和DPCS–Cl 衍生反应后的衍生物的色谱图。

图3为骨髓瘤病人血浆衍生谱图。

图4为衍生产物峰面积随时间变化的色谱图。

具体实施方式

一、3,6–二甲氧基–9–苯基咔唑–1–磺酰氯的合成步骤：

1、在带磁力搅拌的100 mL的圆底烧瓶中加入含1.00 g咔唑、16 g硅胶、2.14 g N-溴代丁二酰亚胺及50 mL二氯甲烷，室温下搅拌10小时后，然后抽滤，净化，再加入适量蒸馏水并用乙酸乙酯多次萃取，减压旋蒸掉溶剂后，固体用无水乙醇重结晶，过滤、干燥后得到3,6–二溴咔唑。

2、将带磁力搅拌的100 mL的圆底烧瓶放入冰水浴中，氩气保护后向其中加入0.85 g钠，将10 mL无水甲醇缓慢滴入，当金属钠全部溶解生成甲醇钠后，再加入0.6 g 3,6-二溴咔唑、1.48 g碘化亚铜、20 mL无水N,N-二甲基甲酰胺，加热回流4小时，反应结束，停止加热，冷却，硅藻土净化后，将反应混合物加入适量蒸馏水并用乙酸乙酯多次萃取，有机层用无水硫酸钠充分干燥，减压旋蒸掉溶剂后，柱层析纯化，得到3,6–二甲氧基咔唑。

3、在带磁力搅拌的100 mL的圆底烧瓶中加入2.93 g碳酸铯、0.18 g铜粉、1.09 g 3,6-二甲氧基咔唑、25 mL 无水乙腈、1.10 g碘苯，氩气保护下搅拌，加热回流24 h至反应结束，停止加热，冷却，硅藻土净化后，将反应混合物加入适量蒸馏水并用乙酸乙酯多次萃取，有机层用无水硫酸钠充分干燥，减压旋蒸掉溶剂后，柱层析纯化，得到3,6–二甲氧基–9–苯基咔唑。

4、将40 μL氯磺酸（溶于1 mL二氯甲烷中）、含0.10 g 3,6-二甲氧基-9-苯基咔唑的二氯甲烷（3,6-二甲氧基-9-苯基咔唑溶于1 mL二氯甲烷中）缓慢滴入25 mL的希兰克试管中，滴加完毕后，室温反应4小时，停止反应，过滤，用4 mL无水N,N-二甲基甲酰胺溶解固体，再加入150 μL二氯亚砜，在30℃下反应，三小时后停止反应，将混合溶液倒入冰水中并用乙酸乙酯多次萃取，有机层用无水硫酸钠充分干燥，减压旋蒸掉溶剂后，柱层析纯化，得到3,6–二甲氧基–9–苯基咔唑–1–磺酰氯。

5、验证取得的3,6–二甲氧基–9–苯基咔唑–1–磺酰氯具有以下分子结构式的方法：

如图1所示，将以上步骤4合成的产品经过核磁氢谱鉴定得到下述分子结构式：

Figure 2012101861901100002DEST_PATH_IMAGE002

二、应用：利用3,6–二甲氧基–9–苯基咔唑–1–磺酰氯作为荧光标记试剂测定骨髓瘤病人血浆中的L–羟脯氨酸、L–脯氨酸和N–乙基甘氨酸：

1、仪器与条件：

Agilent technologies 1200 series 高效液相色谱仪；分析柱为Shim-Pack VP-ODS(150×4.6 mm I.D.，5 um，岛津)；柱温设置为25 ℃，流动相流速为1.0 mL/min，荧光检测器激发波长为318 nm，发射波长为440 nm，进样量10 μL。洗脱程序为梯度洗脱，0 min：乙腈：水=25%：75%；15 min：乙腈：水=25%：75%；30 min：乙腈：水=30%：70%；40 min：乙腈：水=25%：75%。

2、确定3,6–二甲氧基–9–苯基咔唑–1–磺酰氯衍生产物的激发和发射波长：

将3,6–二甲氧基–9–苯基咔唑–1–磺酰氯用乙腈配制成浓度为10 μmol/L的标准溶液。

用F-4500荧光分光光度计测定，测得其激发波长E_x=318 nm，发射波长E_m=440 nm。

3、确定L–羟脯氨酸（Hyp）、L–脯氨酸（Pro）和N–乙基甘氨酸（NEG）与3,6–二甲氧基–9–苯基咔唑–1–磺酰氯（DPCS–Cl）进行衍生化反应的条件：

取50 μg/mL 3,6–二甲氧基–9–苯基咔唑–1–磺酰氯的乙腈溶液600 μL于10 mL具塞磨口锥形瓶中，再依次加入100 μmol/L的L–羟脯氨酸、L–脯氨酸和N–乙基甘氨酸标液各40 μL，超纯水60 μL及pH=10的磷酸盐缓冲液20 μL，混合摇匀后将其放入60℃恒温水浴30 min。冷却至室温后，溶液经过0.22 μm过滤膜过滤后，将反应生成物进行高效液相色谱法（HPLC）分析，如图2所示，峰1为3,6–二甲氧基–9–苯基咔唑–1–磺酰氯（DPCS–Cl）的水解峰；峰2为3,6–二甲氧基–9–苯基咔唑–1–磺酰氯（DPCS–Cl）和L–羟脯氨酸的衍生产物（DPCS–Hyp）峰；峰3为3,6–二甲氧基–9–苯基咔唑–1–磺酰氯（DPCS–Cl）和L–脯氨酸的衍生产物（DPCS–Pro）峰；峰4为3,6–二甲氧基–9–苯基咔唑–1–磺酰氯（DPCS–Cl）和N–乙基甘氨酸的衍生产物（DPCS–NEG）峰。

衍生化反应的方程式如下：

Figure 2012101861901100002DEST_PATH_IMAGE004

4、绘制L–羟脯氨酸、L–脯氨酸和N–乙基甘氨酸各标准溶液与DPCS–Cl进行衍生反应的线性标准曲线：

分别配制浓度为0.1 μmol/L、1.0 μmol/L、10.0 μmol/L、20.0 μmol/L、30.0 μmol/L、50.0 μmol/L和100.0 μmol/L的L–羟脯氨酸、L–脯氨酸和N–乙基甘氨酸标准溶液，并分别将各标准溶液与DPCS–Cl进行衍生反应，以获得标准曲线，其线性相关系数均大于0.999；线性范围均是5.0~5000 nmol/L；检出限达到fmol，其数据见表1。

Figure 2012101861901100002DEST_PATH_IMAGE005

5、实际骨髓瘤病人血液中游离L–羟脯氨酸、L–脯氨酸和N–乙基甘氨酸的检测：

多发性骨髓瘤病人血浆的前处理：取实际血样约1 mL于离心管中，在3500 r/min条件下离心15分钟，去除红细胞；离心结束后取上层清液200 μL，加入800 μL乙腈溶液，在11000 r/min条件下离心10 min去除蛋白质。取上层清夜放在-4 ℃的冰箱中，冷藏备用。

样品的衍生化反应：取50 μg/mL 3,6–二甲氧基–9–苯基咔唑–1–磺酰氯的乙腈溶液600 μL于10 mL具塞磨口锥形瓶中，再依次加入处理后的血浆40 μL，超纯水140 μL及pH=10的磷酸盐缓冲液20 μL，混合摇匀。盖子塞紧后将其放入60 ℃恒温水浴30 min。冷却至室温后，溶液经过0.22 μm过滤膜过滤后进行后续的HPLC分析。

如图3所示的骨髓瘤病人血浆衍生谱图，图中：峰a为3,6–二甲氧基–9–苯基咔唑–1–磺酰氯（DPCS–Cl）的水解峰；峰1为3,6–二甲氧基–9–苯基咔唑–1–磺酰氯（DPCS–Cl）和L–羟脯氨酸的衍生产物（DPCS–Hyp）峰；峰2为3,6–二甲氧基–9–苯基咔唑–1–磺酰氯（DPCS–Cl）和L–脯氨酸的衍生产物（DPCS–Pro）峰；峰3为3,6–二甲氧基–9–苯基咔唑–1–磺酰氯（DPCS–Cl）和N–乙基甘氨酸的衍生产物（DPCS–NEG）峰。

将检测的实际样品中衍生产物的峰面积带入线性回归方程得到游离L–羟脯氨酸、L–脯氨酸和N–乙基甘氨酸的含量。

表2为采用以上方法测出的不同骨髓瘤病人血浆中游离L–羟脯氨酸、L–脯氨酸和N–乙基甘氨酸的含量：

三、本发明特点：

1、从图2中可见：该标记试剂的水解产物峰1出峰最早，能够与衍生产物达到完全分离，对衍生产物的检测不产生干扰。

2、该衍生产物的检测线达到fmol水平。

3、从图4中可见：L–羟脯氨酸（Hyp）、L–脯氨酸（Pro）和N–乙基甘氨酸（NEG）与3,6–二甲氧基–9–苯基咔唑–1–磺酰氯（DPCS–Cl）分别形成的衍生产物峰面积在数周内没有明显变化，说明衍生产物具有较好的稳定性。

4、从该标记试剂的合成及整个衍生过程来看，其并未产生有毒物质和腐蚀性气体。

Claims

1.一种以咔唑为荧光团的磺酰氯类化合物的制备方法，所述磺酰氯类化合物的分子结构式为：

Figure 2012101861901100001DEST_PATH_IMAGE001

其特征在于先将咔唑和N–溴代丁二酰亚胺反应成生3,6–二溴咔唑，再将3,6–二溴咔唑和甲醇钠反应成生3,6–二甲氧基咔唑，再将3,6–二甲氧基咔唑和碘苯反应生成3,6–二甲氧基–9–苯基咔唑，最后将3,6–二甲氧基–9–苯基咔唑、氯磺酸和二氯亚砜反应生成3,6–二甲氧基–9–苯基咔唑–1–磺酰氯。

2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于在制备3,6–二溴咔唑时，以前体化合物咔唑和N–溴代丁二酰亚胺为原料，硅胶为催化剂，在二氯甲烷溶液中室温搅拌反应至结束，经过滤，将滤过液以乙酸乙酯萃取，再经无水乙醇重结晶得到3,6–二溴咔唑。

3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于在制备3,6–二甲氧基咔唑时，以3,6–二溴咔唑和甲醇钠为原料，以碘化亚铜为催化剂，在N,N–二甲基甲酰胺溶液中回流搅拌反应至结束，采用乙酸乙酯萃取，柱层析纯化得到3,6–二甲氧基咔唑。

4.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于在制备3,6–二甲氧基–9–苯基咔唑时，以3,6–二甲氧基咔唑和碘苯为原料，以碳酸铯和铜粉为催化剂，在乙腈溶液中回流搅拌反应至结束，采用乙酸乙酯萃取，柱层析纯化得到3,6–二甲氧基–9–苯基咔唑。

5.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于在制备3,6–二甲氧基–9–苯基咔唑–1–磺酰氯时，以3,6–二甲氧基–9–苯基咔唑和氯磺酸为原料，在二氯甲烷溶液中室温搅拌反应至结束，将反应后的溶液旋干后加入二氯亚砜，在N,N–二甲基甲酰胺溶液中室温搅拌3小时后，将溶液倒入冰水中，乙酸乙酯萃取，柱层析得到3,6–二甲氧基–9–苯基咔唑–1–磺酰氯。

6.根据权利要求5所述制备方法，其特征在于：3,6–二甲氧基–9–苯基咔唑和氯磺酸的投料摩尔比为1︰1.5。