FI80476C - Foerbaettrat hybridisationsfoerfarande, vid foerfarandet anvaent redskap och reagensfoerpackning. - Google Patents
Foerbaettrat hybridisationsfoerfarande, vid foerfarandet anvaent redskap och reagensfoerpackning. Download PDFInfo
- Publication number
- FI80476C FI80476C FI874466A FI874466A FI80476C FI 80476 C FI80476 C FI 80476C FI 874466 A FI874466 A FI 874466A FI 874466 A FI874466 A FI 874466A FI 80476 C FI80476 C FI 80476C
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- nucleic acid
- target nucleic
- particles
- filter
- hybridization
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
- C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
- C12N15/101—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by chromatography, e.g. electrophoresis, ion-exchange, reverse phase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
- C12Q1/705—Specific hybridization probes for herpetoviridae, e.g. herpes simplex, varicella zoster
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Virology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
80476
Parannettu hybridisaatiomenetelmä, menetelmässä käytettävä väline ja reagenssipakkaus
Keksinnön kohteena on menetelmä hybridisaation parantamiseksi 05 suodatuksen avulla. Keksinnön kohteena on myös menetelmässä käytettävä väline ja reagenssipakkaus.
Menetelmässä käytettävä kerroshybridisaatio on kuvattu suomalaisessa patentissa FI 63596 ja liuoshybridisaation 10 perusperiaate on kuvattu mm. suomalaisessa patentissa FI 72146. Liuoshybridisaatio suoritetaan liuosfaasissa käyttämällä vähintäin kahta, kohdenukleiinihapon kanssa hybridisoituvaa, keskenään eihomologista koetinta, joista vähintäin yksi, detektorikoetin, on varustettu tai 15 varustettavissa tunnistettavalla leimalla ja vähintäin yksi, kiinnitinkoetin, voidaan kiinnittää joko affiniteettiparin muodostuksen kautta tai kemiallisen reaktion avulla toiseen komponenttiin, joka on kiinnitetty kiinteään kantajaan.
20 Keksinnön mukaisessa menetelmässä voidaan myös käyttää liuoksessa tapahtuvaa hybridisaatiota, jossa detektori- tai kiinnitinkoetin on korvattu modifioidulla alukkeella. Modifioitujen alukkeiden käyttö hybridi säätiössä on kuvattu patenttihakemuksessa US 024,604. Menetelmässä käytetään kahta 25 kohdenukleiinihapon vastakkaisille polariteeteille komplementaarista modifioitua aluketta. Lisäksi tarvitaan vähintäin yksi, kohdenukleiinihapon kanssa selektiivisesti hybridisoi-tuva nukleiinihappokoetin, joka ei ole homologinen edellä mainittujen alukkeiden kanssa. Mikäli modifioitu aluke toimii 30 detektorikoettimena ts. se on varustettu tai varustettavissa tunnistettavalla leimalla, kyseinen selektiivinen koetin on liuoshybridisaatiossa käytettävän kiinnitinkoettimen kaltainen, ts. se on varustettu tai varustettavissa 2 80476 affiniteetti- tai reaktioparin toisella osapuolella. Mikäli modifioitu aluke toimii kiinnitinkoettimena, selektiivinen koetin toimii vastaavasti detektorikoettimena, ts. se on varustettu tai varustettavissa tunnistettavalla leimalla.
05
Menetelmässä annetaan modifioitujen alukkeiden hybridisoitua yksisäikeiseksi tehtyjen kohdenukleiinihapon vastinsäikeiden kanssa. Tämän jälkeen seosta inkuboidaan templaatin, ts. kohdenukleiinihappomolekyylin, tunnistavan polymeraasin ja 10 nukleotidien läsnäollessa, jonka ansiosta alukkeet voivat pidentyä jopa useita tuhansia emäksiä käsittäviksi ketjuiksi. Polymerisaatioreaktio uusitaan tarvittaessa, kunnes saadaan kulloinkin halutun herkyyden saavuttamiseksi tarvittava määrä kohdenukleiinihappomolekyylien kopioita, joista kukin on 15 varustettu yhdellä modifioidulla alukkeella. Mikäli kohdenukleiinihappo on yksisäikeinen RNA, käytetään aloitusvaiheessa käänteiskopioijaentsyymiä, jonka avulla valmistetaan ensin cDNA-säie. Polymerisaation jälkeen hybridisoidaan modifioiduilla alukkeilla varustetut 20 kohdenukleiinihappomolekyylien kopiot ja selektiivinen koetin.
Kerroshybridisaatio suoritetaan käyttämällä vähintäin kahta, kohdenukleiinihapon kanssa hybridisoituvaa, keskenään ei-25 homologista koetinta, joista toinen, kiinnitinkoetin, on kiinnitetty kiinteään kantajaan ja toinen, detektorikoetin, on varustettu tai varustettavissa tunnistettavalla leimalla. Voidaan myös käyttää kiintokantajahybridisaatiota, jossa modifioitu aluke toimii detektorikoettimena (US 024,604).
30 Tällöin menetelmässä käytettävä, kohdenukleiinihapon kanssa selektiivisesti hybridisoituva nukleiinihappokoetin, on kiinnitetty mikropartikkeliin.
Sekä kerros- että liuoshybridisaatiomenetelmissä ylimääräinen 35 detektorikoetin erotetaan kohdenukleiinihapon, kiinnitinkoet-timien ja detektorikoettimien välille muodostuneesta
II
3 8G476
hybridistä pesemällä huolellisesti kiinteään kantajaan (filtteri, dipstick, mikrotiitterilevy ym.) sidotut hybridit. Siinä tapauksessa että kiintokantajana käytetään mikropartikkeleita, erotus tapahtuu sentrifugoimalla ja 05 pesemällä partikkeleita useita kertoja, kuten liuoshybridi-saatiota käsittelevässä julkaisussa Nucleic Acids. Res. 14, 5037-5048, 1986 ja kerroshybridisaatiota käsittelevässä suomalaisessa patenttihakemuksessa FI 8603782 on kuvattu. Mikropartikkelit voidaan myös pakata kromatografiakolumniin 10 ja eluoida ylimääräinen detektorikoetin kolumnista (FI
72146). Modifioituja alukkeita käytettäessä erotus tapahtuu samoilla menetelmillä kuin kerros- ja liuoshybridisaatio-menetelmässä.
15 Kohdenukleiinihapon kiinnittäminen partikkeleihin tapahtuu esimerkiksi siten, että kohdenukleiinihappo saa hybridisoitua partikkeliin sidotun nukleiinihappokoettimen kanssa tai koettimen kanssa, joka on kiinnitettävissä partikkeliin, tai annetaan kohdenukleiinihapon kanssa hybridisoituneen 20 nukleiinihappokoettimen kiinnittyä partikkeleihin, tai kiinnitetään kohdenukleiinihappomolekyylien kopiot partikkeleihin modifioitujen alukkeiden välityksellä, joiden avulla ne on polymerisoitu.
25 Keksinnön mukaisessa menetelmässä hybridisoitu (kuten vaatimuksissa 3,5,7 ja 10 on kuvattu) tai hybridisoimaton (kuten vaatimuksissa 4,6,8,9 ja 11 on kuvattu) nukleiini-happonäyte imetään suodattimen läpi ruiskuun, jossa kohdenukleiinihappo hybridisoidaan tarvittaessa ja 30 kiinnitetään samassa ruiskussa oleviin tai sinne hybridisaa-tion jälkeen lisättyihin partikkeleihin nukleiinihappokoettimen välityksellä, tai kiinnitetään partikkeleihin kohdenukleiinihappomolekyylien kopiot modifioitujen alukkeiden välityksellä, joiden avulla ne on polymerisoitu.
35 Kiinnityksen jälkeen ruiskussa olevat partikkelit erotetaan hybridisaatioliuoksesta suodattamalla ja partikkeleita pestään ruiskussa sopivan monta kertaa ylimääräisen « 80476 detektorikoettimen tai modifioidun alukkeen, jota käytetään detektorikoettimena, poistamiseksi. Kohdenukleiinihappo tunnistetaan kulloinkin sopivalla menetelmällä.
05 Keksinnön tarkoituksena on kahden tai useamman, samassa astiassa tapahtuvan, suodatuksen avulla nopeuttaa ja helpottaa hybridisaatiomenetelmien suoritusta sekä lisäksi parantaa niiden herkkyyttä, toistettavuutta ja taloudellisuutta. Keksinnön mukaisen menetelmän avulla on 10 myös mahdollista tehdä ilman hankalia esikäsittelyvaiheita nukleiinihappomäärityksiä näytteistä, joka sisältää runsaasti vaikeasti poistettavia biologisia epäpuhtauksia.
Keksinnön mukaisessa menetelmässä käytetään kiintokantajana 15 sopivasti esikäsiteltyjä partikkeleita. Partikkelien erottamisessa hybridisaatioseoksesta on ilmennyt useita ongelmia perinteisiä suoritustapoja käytettäessä, varsinkin silloin kun näytteessä on ollut runsaasti liukenemattomia biologisia epäpuhtauksia. Sentrifugointimenetelmässä näitä epäpuhtauksia 20 ei saada erilleen määritettävistä hybrideistä, vaan ne erottuvat hybridisaatioliuoksesta partikkelien mukana. Lisäksi osa partikkeleista joutuu hukkaan toistuvien pesujen yhteydessä, kun ne tarttuvat sentrifuugin ja pesuastioiden seinämiin. Kromatografiakolumnien käyttö on taas etenkin 25 rutiinitesteissä hidasta ja hankalaa ja lisäksi kallista.
Keksinnön mukaisessa menetelmässä mainitut ongelmat on voitu poistaa.
30 Keksinnön mukaisen menetelmän avulla päästään kätevästi eroon näytteessä olleista liukenemattomista biologisista epäpuhtauksista. Verrattuna sentrifugointi- ja kromatogra-fiamenetelmiin tämän menetelmän etuna on pesujen helppous ja nopeus. Pesut ovat myös tehokkaita, koska partikkelit 35 resuspendoituvat välittömästi ja täydellisesti pesuliuokseen. Partikkeleiden hukkaantuminen pesujen yhteydessä, jota aina tapahtuu sentrifugointimenetelmässä, estyy kun suodatukset il 5 80476 tapahtuvat samassa astiassa. Tämä parantaa menetelmän herkkyyttä ja toistettavuutta.
Keksinnön kohteena on myös kyseisessä menetelmässä käytettävä 05 väline ja reagenssipakkaus. Välineeseen kuuluu astia, edullisesti kertakäyttöruisku, johon on sijoitettu sopivalla tavalla esikäsitellyt partikkelit ja vähintäin yksi suodatin, joka on kiinnitetty tai kiinnitettävissä astiaan. Suodatin valitaan siten, että kohdenukleiinihappo ja detektori- sekä 10 kiinnitinkoettimet läpäisevät sen, mutta liukenemattomat biologiset epäpuhtaudet ja partikkelit eivät läpäise.
Suodatin voi olla myös suodatinjärjestelmä, esim. suodatin-kasetti, jonka sisällä partikkelit ovat valmiina. Reagenssipakkaukseen kuuluu edellä mainitun välineen lisäksi 15 kulloinkin tarvittavat koettimet ja alukkeet sopivasti käsiteltyinä. Se voi myös sisältää muita menetelmässä tarvittavia reagensseja pakkauksineen, esim. detektori-koettimen havaitsemisessa käytettäviä reagensseja.
20 Seuraavassa on kuvattu yksityiskohtaisemmin tärkeimmät hybridisaatiomenetelmät, joihin keksinnön mukaista menetelmää voidaan soveltaa. Keksinnön mukaisen menetelmän käyttö ei kuitenkaan rajoitu seuraavassa kuvattuihin menetelmiin vaan on selvää, että alan asiantuntija voi soveltaa menetelmän 25 periaatetta muihinkin hybridisaatiomenetelmiin.
1 Suodatuksen avulla parannettu liuoshybridisaatio
Hybridisaatio tehdään liuoksessa olosuhteissa, jotka on 30 kuvattu aiemmin (FI 72146). Hybridisaation jälkeen reaktioliuos suodatetaan, jolloin hybridit sekä ylimääräinen detektorikoetin ja kiinnitinkoetin läpäisevät suodattimen mutta hybridisaatioliuoksessa mahdollisesti mukana olevat liukenemattomat biologiset epäpuhtaudet jäävät ulkopuolelle. 35 Suodattimeen jääneet hybridit voidaan tarvittaessa ottaa talteen huuhtomalla suodatinta hybridisaatioliuoksella, jossa « 6 80476 ei ole nukleiinihappoja. Tämän jälkeen hybridien annetaan kiinnittyä partikkeleihin olosuhteissa, jotka valitaan menetelmässä käytettävän affiniteetti- tai reaktioparin perusteella.
05
Vaihtoehtoisesti voidaan suorittaa hybridisaatio vasta suodatuksen jälkeen. Tällöin on edullisinta lisätä partikkelit vasta hybridisaation jälkeen, koska partikkelien lisääminen ennen hybridisaatiota vaikuttaa haitallisesti hybridisaatio-10 kinetiikkaan.
Kiinnittymisen jälkeen partikkelit erotetaan hybridisaatio-liuoksesta suodattamalla ja ylimääräinen detektorikoetin pestään partikkeleista suodattamalla pesunestettä suodattimen 15 läpi sopivan monta kertaa.
Hybridien detektioon liittyvät jatkotoimenpiteet riippuvat kulloinkin valitusta detektointitavasta. Käytettäessä radioaktiivista detektorikoetinta voidaan mittaus tehdä 20 suoraan partikkeleista tai suodattimista tai detektorikoetin voidaan irrottaa partikkeleista esimerkiksi natriumhydrok-sidilla.
Natriumhydroksidieluointi toimii lisäpesuna lisäten testin 25 herkkyyttä ja on helppo suorittaa suodattamalla. Mikäli käytetään entsymaattista detektiota, väriliuos suodatetaan reaktion jälkeen eroon partikkeleista ja mitataan.
Eräs menetelmän toteutustapa on esitetty kuvasarjassa a-g 30 (Kuva 1), jossa hybridisaatioliuos suodatetaan ruiskun avulla. Menetelmän vaiheet ovat seuraavat:
Vaihe a Detektorikoetinten (1), kiinnitinkoetinten (2) ja kohdenukleiinihapon (3) hybridisaatio suoritetaan erillisessä astiassa.
35 Vaihe b Tarvittaessa lisätään partikkelit (4) ja asetetaan suodatin (5) ruiskuun (6).
Vaihe c Imetään hybridisaatioliuos ruiskuun.
Il 7 80476
Vaihe d Huuhdotaan tarvittaessa suodatin imemällä sen läpi hybridisaatioliuosta (7), jossa ei ole nukleiinihappoja.
Vaihe e Kiinnitetään hybridit partikkeleihin, affiniteetti-tai reaktioparin muodostumiselle edullisissa olosuhteissa.
05 Vaihe f Erotetaan hybridisaatioliuos partikkeleista tyhjentämällä ruisku ja pestään ruiskussa olevat partikkelit vapaiksi hybridisoitumattomista detektorikoettimista pesunesteellä (8).
Vaihe g Eluoidaan detektorikoettimet partikkeleista 10 eluointinesteeseen (9) ja detektoidaan detektorikoettimet supernatantista. Vaihtoehtoisesti voidaan vaihe g korvata mittaamalla detektorikoettimet suoraan partikkeleista tai suodattimista.
15 Reagenssipakkaukseen kuuluu vähintäin kaksi kohdenukleiini-hapon kanssa hybridisoituvaa, keskenään eihomologista koetinta, joista vähintäin yksi, detektorikoetin, on varustettu tai varustettavissa tunnistettavalla leimalla, ja vähintäin yksi, kiinnitinkoetin on varustettu alueella tai 20 komponentilla tai varustettavissa komponentilla, jolla on affiniteettia tai reaktiviteettia toiseen komponenttiin. Näiden lisäksi pakkaukseen kuuluu vähintäin yksi suodatin ja astia, edullisesti ruisku, jossa on tai johon voidaan yhdistää kyseinen suodatin ja partikkeleita, joihin on 25 kiinnitetty edellä mainittu toinen komponentti.
2 Suodatuksen avulla parannettu liuoshybridisaatio, jossa käytetään modifioitua aluketta detektorikoettimena 30 Kopioidaan kohdenukleiinihappomolekyylit, kuten aiemmin on kuvattu (patenttihakemus US 024,604) käyttäen kahta, kohdenukleiinihapon vastakkaisille polariteeteille komplementaarista aluketta, jotka on varustettu tai varustettavissa tunnistettavalla leimalla. Tämän jälkeen hybridisoidaan 35 modifioiduilla alukkeilla varustetut kohdenukleiinihappomole-kyylien kopiot ja niiden kanssa selektiivisesti hybridi-soituva kiinnitinkoetin, joka on varustettu alueella tai e 8G476 komponentilla tai varustettavissa komponentilla, jolla on affiniteettia tai reaktiviteettia toiseen komponenttiin. Kiinnitinkoetin ei saa olla homologinen menetelmässä käytettävien modifioitujen alukkeiden kanssa. Hybridisaatio-05 liuos suodatetaan astiaan, edullisesti ruiskuun, jossa kiinnityksen partikkeleihin on määrä tapahtua. Suodatin pestään tarvittaessa, jonka jälkeen annetaan hybridien kiinnittyä partikkeleihin sopivissa olosuhteissa. Mikäli hybridisaatio suoritetaan vasta suodatuksen jälkeen, lisätään 10 partikkelit edullisesti vasta hybridisaation jälkeen.
Kiinnityksen jälkeen partikkelit erotetaan hybridisaati-oliuoksesta ja ylimääräisestä modifioidusta alukkeesta suodattamalla ja pesemällä haluttu määrä kertoja. Detektio 15 voidaan suorittaa joko suoraan partikkeleista tai suodattimesta tai eluoimalla modifioiduilla alukkeilla varustetut kohdenukleiinihappomolekyylien kopiot partikkeleista ja mittaamalla leima supernatantista.
20 Reagenssipakkaukseen kuuluu kaksi aluketta, jotka ovat komplementaarisia kohdenukleiinihapon vastakkaisille polariteeteille ja jotka on varustettu tai varustettavissa tunnistettavalla leimalla, kohdenukleiinihapon kanssa selektiivisesti hybridisoituva nukleiinihappokoetin, 25 kiinnitinkoetin, joka on varustettu alueella tai komponentilla tai varustettavissa komponentilla, jolla on affiniteettia tai reaktiviteettia toiseen komponenttiin ja joka ei ole homologinen edellä mainittujen modifioitujen alukkeiden kanssa. Näiden lisäksi pakkaukseen kuuluu vähintäin yksi 30 suodatin ja astia, edullisesti ruisku, jossa on tai johon voidaan yhdistää kyseinen suodatin ja partikkeleita, joihin on kiinnitetty edellä mainittu toinen komponentti.
11 9 80476 3 Suodatuksen avulla parannettu liuoshybridisaatio, jossa käytetään modifioitua aluketta kiinnitinkoettimena
Kopioidaan kohdenukleiinihappomolekyylit aiemmin kuvatulla 05 tavalla (patenttihakemus US 024,604) käyttäen kahta kohdenuk-leiinihapon vastakkaisille polariteeteille komplementaarista aluketta, jotka on varustettu alueella tai komponentilla tai varustettavissa komponentilla, jolla on affiniteettia tai reaktiviteettia toiseen komponenttiin. Hybridisoidaan modifi-10 oiduilla alukkeilla varustetut kohdenukleiinihappomolekyylien kopiot ja niiden kanssa selektiivisesti hybridisoituva detek-torikoetin, joka on varustettu tai varustettavissa tunnistettavalla leimalla. Detektorikoetin ei saa olla homologinen menetelmässä käytettävien modifioitujen alukkeiden kanssa.
15 Hybridisaatioliuos suodatetaan astiaan, edullisesti ruiskuun, suodatin pestään tarvittaessa ja kiinnitetään modifioiduilla alukkeilla varustetut kohdenukleiinihappomolekyylien kopiot partikkeleihin. Mikäli hybridisaatio suoritetaan vasta suodatuksen jälkeen, lisätään partikkelit astiaan edullisesti 20 vasta hybridisaation jälkeen.
Kiinnityksen jälkeen partikkelit erotetaan hybridisaatio-liuoksesta ja ylimääräisistä detektorikoettimista suodattamalla ja pesemällä haluttu määrä kertoja ja suoritetaan 25 detektointi kuten kohdassa 1 on kuvattu.
Reagenssipakkaukseen kuuluu kaksi aluketta, jotka ovat komplementaarisia kohdenukleiinihapon vastakkaisille polariteeteille ja jotka on varustettu tai varustettavissa 30 alueella tai komponentilla tai varustettavissa komponentilla, jolla on affiniteettia tai reaktiviteettia toiseen komponenttiin ja kohdenukleiinihapon kanssa selektiivisesti hybridisoituva nukleiinihappokoetin, detektorikoetin, joka on varustettu tai varustettavissa tunnistettavalla leimalla ja 35 joka ei ole homologinen modifioidun alukkeen kanssa. Näiden 10 80476 lisäksi pakkaukseen kuuluu vähintäin yksi suodatin ja astia, edullisesti ruisku, jossa on tai johon voidaan yhdistää kyseinen suodatin ja partikkeleita, joihin on kiinnitetty edellä mainittu toinen komponentti.
05 4 Suodatuksen avulla parannettu kerroshybridisaatiomenetelmä
Keskenään esihybridisoidut tai edullisesti hybridisoimattomat kohdenukleiinihappomolekyylit ja detektorikoettimet sisältävä 10 hybridisaatioliuos suodatetaan liukenemattomien biologisten epäpuhtauksien poistamiseksi. Suodattimeen jääneet kohdenukleiinihappomolekyylit voidaan tarvittaessa ottaa talteen huuhtomalla suodatinta hybridisaatioliuoksella, jossa ei ole nukleiinihappoja. Tämän jälkeen suoritetaan kohdenukleiin 15 hapon ja partikkeleihin kiinnitettyjen kiinnitinkoettimien välinen hybridisaatio sekä samalla kohdenukleiinihapon ja detektorikettimien välinen hybridisaatio, mikäli ei ole suoritettu esihybridisaatiota. Lopuksi partikkelit erotetaan hybridisaatioliuoksesta suodattamalla ja ylimääräinen 20 detektorikoetin pestään partikkeleista ja suoritetaan detektointi joko suoraan partikkeleista tai pesuliuoksesta kuten liuoshybridisaatiomenetelmän kohdalla on edellä kuvattu.
25 Kuvasarjassa a-f (Kuva 2) esitetään toteutustapa, jossa käytetään ruiskua.
Vaihe a Lisätään tarvittaessa ruiskuun (1) partikkelit (2), joihin kiinnitinkoetin (3) on kiinnitetty. Samoin kiinnitetään suodatin (4).
30 Vaihe b Imetään kohdenukleiinihapon (5) ja detektorikoet-timen (6) sisältävä hybridisaatioliuos ruiskuun.
Vaihe c Huuhdotaan tarvittaessa suodatin imemällä sen läpi hybridisaatioliuosta (7), jossa ei ole nukleiinihappoa.
35 Vaihe d Suoritetaan hybridisaatio.
Il 11 80476
Vaihe e Erotetaan hybridisaatioliuos partikkeleista tyhjentämällä ruisku ja pestään ruiskussa olevat partikkelit vapaiksi hybridisoitumattomista koettimista pesunesteellä (8). Vaihe f Eluoidaan detektorikoettimet partikkeleista 05 eluointinesteeseen (9) ja detektoidaan detektorikoettimet supernatantista.
Edellä esitetty toteutus on vain suuntaa-antava ja alan asiantuntija pystyy sen avulla keksimään vaihtoehtoisia 10 sovellutustapoja. Vaihe a voidaan kokonaan jättää pois, mikäli partikkelit ja suodatin on kiinnitetty etukäteen.
Ennen vaihetta c voidaan tehdä esihybridisaatio, jossa hybridisoidaan kohdenukleiinihappo ja detektorikoetin keskenään. Kuten liuoshybridisaatiossakin, voidaan vaihe f 15 korvata mittaamalla detektorikoetin suoraan partikkeleista.
Menetelmässä käytettävään reagenssipakkaukseen kuuluu vähintäin kaksi kohdenukleiinihapon kanssa hybridisoituvaa, keskenään eihomologista koetinta, joista vähintäin yksi, 20 detektorikoetin on varustettu tai varustettavissa tunnistettavalla leimalla ja vähintäin yksi, kiinnitinkoetin, on kiinnitetty partikkeleihin. Näiden lisäksi pakkaukseen kuuluu vähintäin yksi suodatin ja astia, edullisesti ruisku, jossa on tai johon voidaan yhdistää kyseinen suodatin.
25 5 Suodatuksen avulla parannettu kiintokantajahybridisaatio, jossa käytetään modifioitua aluketta detektorikoettimena
Kopioidaan kohdenukleiinihappomolekyylit käyttäen kahta, 30 kohdenukleiinihapon vastakkaisille polariteeteille komplementaarista aluketta, jotka on varustettu tai varustettavissa tunnistettavalla leimalla. Nukleiinihappoliuos suodatetaan astiaan, edullisesti ruiskuun, ja suodatin pestään tarvittaessa hybridisaatioliuoksella, jossa ei ole 35 nukleiinihappoja. Hybridisoidaan modifioiduilla alukkeilla varustetut kohdenukleiinihappomolekyylien kopiot ja niiden kanssa selektiivisesti hybridisoituva partikkeliin 12 80476 kiinnitetty nukleiinihappokoetin. Nukleiinihappokoetin ei saa olla homologinen modifioitujen alukkeiden kanssa. Seuraavaksi erotetaan partikkelit hybridisaatioliuoksesta ja ylimääräisestä modifioidusta alukkeesta suodattamalla ja 05 pesemällä haluttu määrä kertoja. Detektointi suoritetaan joko suoraan partikkeleista tai eluoimalla modifioiduilla alukkeilla varustetut kohdenukleiinihappomolekyylien kopiot partikkeleista ja mittaamalla leima supernatantista.
10 Reagenssipakkaukseen kuuluu kaksi aluketta, jotka ovat komplementaarisia kohdenukleiinihapon vastakkaisille polariteeteille ja jotka on varustettu tai varustettavissa tunnistettavalla leimalla, kohdenukleiinihapon kanssa selektiivisesti hybridisoituva nukleiinihappokoetin, 15 kiinnitinkoetin, joka on kiinnitetty partikkeliin ja joka ei ole homologinen edellä mainittujen modifioitujen alukkeiden kanssa. Näiden lisäksi pakkaukseen kuuluu vähintäin yksi suodatin ja astia, edullisesti ruisku, jossa on tai johon voidaan yhdistää kyseinen suodatin ja partikkeleita, joihin 20 on kiinnitetty edellä mainittu toinen komponentti.
Liuoshybridisaatiomenetelmän käytännön toteutus on kuvattu seuraavassa esimerkin avulla.
25 Esimerkki 1
Hybridien talteenotto liuoshybridisaatiossa Pandex-avidin suodatusmenetelmällä.
30 Materiaalit
Kiintokantajina käytetään polystyreenipartikkeleita, jotka on päällystetty avidiinilla (Epicon ™ Avidinpolystyrene Assay Particles, Pandex Laboratories, Inc., USA). Partikkeleiden 35 halkaisija on keskimäärin 0.8 //m, ja pienestä koosta johtuen ne pysyvät tasaisesti jakaantuneina liuoksessa. Partikkelit ovat saatavissa 5 % (w/v) suspensiona. Irtonaisen avidiinin li 13 80476 poistamiseksi partikkelit sonikoidaan ja pestään kerran ennen käyttöä.
Hybridisaatioliuoksen suodattamiseen ja kiintokantajapartik-05 keleiden erottamiseen liuoksesta käytetään polyvinyyli-difluorifilttereitä, joiden huokoskoko on 0,45 //m (Millex-HVj3, Millipore).
Hybridit kiinnitetään partikkeleihin 1 ml:n kertakäyttöruis-10 kuissa, joissa pesut on kätevä tehdä.
Hybridisaatio 15 Kohde-DNA:na oli plasmidi pBR-322, joka oli linearisoitu EcoRI-entsyymillä. Detektorikoettimina käytettiin 32P leimattua plasmidia pKTH 1300. Kiinnitinkoettimina käytettiin fotobiotinyloituja faageja mKTH 1301 ja 1302. Detektori- ja kiinnitinkoettimien valmistus on kuvattu julkaisussa Journal 20 of Biotechnology, Voi. 5, 267-277, 1987. Hybridisaatio tapahtui 120 /vl:ssa liuosta, jossa määrässä reagensseja oli seuraavasti: kohde-DNA:ta 10®, 109 tai 1010 molekyyliä, radioaktiivista koetinta 4,6xl05 cpm eli 7x10® molekyylia ja biotinyloitua mKTH 1301 ja 1302 lxlO10 molekyyliä kumpaakin. 25 Lisäksi hybridisaatioliuoksessa oli 0,6 H natriumkloridia, 20 mM natriumfosfaattia, 1 mM EDTA ja 0,1 % natriumdodekyyli-sulfaattia (SDS). Hybridisaatioaika oli kolme tuntia ja lämpötila 65°C.
30 Hybridien talteenotto 20 μΐ sonikoitua, kerran pestyä Pandex-avidin-partikkeleiden 5 % suspensiota lisättiin 1 ml:n kertakäyttöruiskuihin. Tämän jälkeen Millex Ηνχ3- filtteriyksiköt asennettiin ruiskuihin 35 ja 120 μΐ reaktioliuosta imettiin ruiskuihin. Hybridien huuhtomiseksi filttereiltä imettiin lisäksi 120 μΐ DNA-vapaata hybridisaatioliuosta ruiskuun, jonka jälkeen kokonaistilavuus ruiskuissa oli 260 μΐ. Hybridien 14 80476 kiinnittyminen partikkeleihin annettiin tapahtua 37°C:ssa 15 min 'end over end'-sekoitulaitteessa. Kiinnittymisen jälkeen partikkelit pestiin pesuliuoksella, jossa oli 15 mH natriumkloridia, 1,5 mN natriumsitraattia ja 0,2 % SDS, ja 05 jonka lämpötila oli 50°C. Aluksi partikkelit pestiin viisi kertaa vetämällä ruisku täyteen (1 ml) pesuliuosta ja poistamalla se välittömästi. Lisäksi pestiin kaksi kertaa antaen pesuliuoksen vaikuttaa kahden minuutin ajan kerrallaan. Pesujen jälkeen detektorikoetin eluoitiin 10 hybrideistä vetämällä ruiskuun 125 μΐ liuosta, jossa oli 0,2 M natriumhydroksidia ja 1 mM EDTA. Liuoksen annettiin vaikuttaa 5 min huoneenlämpötilassa, jonka jälkeen käsittely toistettiin kerran. Natriurahydroksidisupernatantteihin lisättiin 2 ml AquasolR-tuikenestettä ja niiden 15 radioaktiivisuus mitattiin beta-laskurilla.
Tulokset
Tulokset voidaan tiivistää seuraavaan taulukkoon: 20
Kohde-DNA1> spesif.cpm21 signaali/tausta 10® 4012 8,0 10* 27551 49,0 25 101 0 46515 82,0 1) Molekyylien lukumäärä 2) cpm on keskiarvo kolmesta rinnakkaisesta määrityksestä; 30 spesifisestä cpm:stä on vähennetty O-näytteen antama signaali (573 cpm) li is 80476
Kerroshybridisaatiomenetelmän sekä liuoshybridisaatiomene-telmän, jossa käytetään modifioituja alukkeita, toteutus on kuvattu seuraavissa esimerkeissä.
05 Esimerkki 2
Hybridien talteenotto suodattamalla kerroshybridisaatiossa Reagenssit 10
Kerroshybridisaation reagenssit olivat peräisin Neisseria gonorrhoeaen 4.2 kb kryptisestä plasmidista (pJDl)(Korch,C., Hagblom,P. & Normark,S. ,1983. Sequence-specific DNA modification in Neisseria gonorrhoeae. Journal of 15 Bacteriology 155, 1324-32). Kohde-DNA oli yhdistelmäplasmidi Flol/pUMl, joka sisälsi N. gonorrhoeae kryptisen plasmidin pBR322:ssa. Kiinnitinkoettimena käytettiin yhdistelmä-plasmidia pKTHl368, joka sisälsi N. gonorrhoeae kryptisestä plasmidista 1.3 kb Hinfl-Tagl fragmentin plasmidissa pATl53. 20 Detektorikoettimena käytettiin yhdistelmäfaageja mKTHl369 ja mKTHl370, jotka (molemmat polariteetit) sisälsivät 1.7 kb Hinfl-Hinfl fragmentin M13 mplO faagissa. Kohde-DNA (Flol/pUMl) linearisoitiin EcoRl:llä.
25 Leimaus
Detektorikoettimina käytetyt faagit mKTH1369 ja mKTHl370 leimattiin [a-32PJdCTP:llä spesifiseen aktiviteettiin noin 108 cpm/yt/g (Amersham, U.K.) käyttäen alukepidennystä ja 30 DNA-polymeraasi I Klewnowin fragmenttia. Plasmidi pKTHl368, jota käytettiin mikropartikkeleihin sitoutuneen plasmidi-DNA:n kvantitoinnissa tracerina, oli leimattu spesifiseen aktiviteettiin noin 10® cpm//yg [ a-3 2 P JdCTP: llä käyttäen nick-translaatiota.
ie 80 4 76
Riinnitinkoettimien kiinnitys mikropartikkeleihin
Kiinnitinkoetin kiinnitettiin polystyreenipartikkeleihin (o»4,5/t/m), joiden pinnalla on sekundäärisiä hydroksiryhmiä.
05 Partikkeleiden hydroksiryhmät aktivoitiin lisäämällä 0,29 g (l,5mmol) p-tolueenisulfonyylikloridia ja 60μ1 (0,75 mmol) pyridiiniä 30 mg:aan partikkeleita, jotka olivat 1 ml:ssa asetonia, seosta inkuboitiin 'end-over-end' sekoitus-laitteessa huoneenlämpötilassa 20 tuntia. Partikkelit 10 siirrettiin vesiliuokseen pesemällä niitä asetonilla, jonka vesipitoisuus kasvoi asteittaisesti. Lopuksi partikkelit pestiin kerran 0,2M boraattipuskurilla pH 9,5 ja sen jälkeen suspentoitiin samaan puskuriin konsentraatioksi 30mg/ml. Plasmidi pKTHl368 denaturoitiin ja fragmentoitiin keittämällä 15 5 min 0,2M natr iumhydroksidissa. 10//g pKTHl366 :aa ja 1 mg aktivoituja partikkeleita inkuboitiin 75^1:ssa 0,2M boraattipuskuria pH 9,5 huoneenlämpötilassa 18 h 'end-over-end' sekoituslaitteessa. Partikkelit erotettiin liuoksesta sentrifugoimalla. Kiinnittyneen DNA:n määrä 20 kvantitoitiin käyttäen radioaktiivisesti leimattua pKTHl368:aa tracerina. Reagoimattomat p-tolueenisulfonyyli-ryhmät sidottiin IM Tris-HCl puskurilla pH 9,0 huoneen-lämpötilassa 4h. Partikkelit suspentoitiin liuokseen, joka sisälsi 0,05M Tris-HCl pH 7,5 , 0,1M NaCl ja 0,01% 25 natriumdodekyylisulfaattia (SDS), konsentraatioksi 30mg/ml ja säilytettiin +4°C:ssa.
Hybridisaatio ja hybridien talteenotto 30 Hybridisaatio suoritettiin Imi kertakäyttöruiskuissa, joihin oli asennettu Millex HV1j-filtteriyksiköt (filtterit kuten esimerkissä 1). Ruiskuihin lisättiin 1 mg partikkeleita määritystä kohden, mikä vastaa 3,7xl010 kiinnitinkoetin-molekyyliä (61fmol). Detektorikoettimina käytettiin 2x10® 35 molekyyliä 300000 cpm (0,3fmol) 32P:llä leimattuja yhdistelmäfaageja mKTHl369 ja mKTHl370 reaktiota kohden.
70μ1 reaktioliuosta, joka sisälsi 0,6M NaCl, 60mM
II
17 80476 natriumsitraattia pH 7,6 (4xSSC), 20mM natriumfosfaattia ja 0. 25% SDS, detektorikoettimet ja alla olevan taulukon mukaiset määrät kohde-DNA:ta imettiin ruiskuihin. Kohde-DNA:n huuhtomiseksi filttereiltä imettiin lisäksi 30/jl DNA-vapaata 05 hybridisaatioliuosta ruiskuun, jonka jälkeen kokonaistilavuus ruiskuissa oli 100/ul. Hybridisaatioaika oli 5 h ja -lämpötila 65°C. Hybridisaation jälkeen partikkelit pestiin 5 kertaa liuoksella, jossa oli 0,lxSSC ja 0,2% SDS lämpötilassa 55°C, imemällä liuosta filtterin läpi. Pesujen jälkeen hybridien 10 eluutio ja detektio suoritettiin kuten on kuvattu esimerkissä 1.
Tulokset 15 Tulokset voidaan tiivistää seuraavaan taulukkoon:
Kohde-DNA 1) Spesifinen cpm2 3 4) signaali/tausta 20 4x107 762 8,5 10* 963 10,7 4x10» 6877 76,4 25 109 12925 143,6 ) molekyylien lukumäärä 2 30 2) CMP on keskiarvo neljästä rinnakkaismäärityksestä; 3 0-näytteele saatu signaali (90cpm) on vähennetty spesifisestä 4 cpm:stä ie 80476
Esimerkki 3
Hybridien talteenotto liuoshybridisaatiossa Pandex-avidin suodatusmenetelmällä käyttäen modifioitua aluketta 05 detektorikoettimena
Materiaalit ja reagenssit
Kiintokantaja, filtteri ja astia olivat kuten esimerkissä 1. 10 Kohdenukleiinihappo oli yhdistelmäplasmidi (pBR322/CMV
HindZII L), johon oli kloonattu 12,3 kiloemäksen pituinen fragmentti sytomegaloviruksen genomista (CMV, AD 169, ATCC VR-538). Käytetyt detektorialukkeet (Pa, Pb, kuva 3) olivat 20 nukleotidin pituisia ja ne syntetisoitiin standardimene-15 telmin automaattista syntetisaattoria käyttäen. Ne vastasivat kahta sytomegalovirukselle spesifisen kloonin aluetta, jotka olivat 111 nukleotidin etäisyydellä toisistaan. Kaksi selektiivistä kiinnitinkoetinta (S2, S2, kuva 3) tunnistivat kumpikin detektorialukkeiden välissä sijaitsevan alueen 20 kohdenukleiinihapon vastinsäikeistä. Detektorialukkeiden P· ja Pb 5'-päät leimattiin 32P:lla spesifiseen aktiviteettiin 4xl09 CPM/>g käyttäen alalla tunnettua polynukleotidikinaasin ja gamma-32P-ATP:n välistä reaktiota (Maniatis et ai., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor 25 Laboratory, 1982).
Kiinnitinkoettimen 3'-päihin lisättiin biotinyloidut nukleotidit käyttäen bio ll-dUTP:tä (Bethesda Research Laboratories, BRL) ja terminaalista tranferaasia (Promega 30 Biotech.) kuten Riley et ai. ovat kuvanneet julkaisussa DNA, 5 (4), ss. 333-337, 1986. Kohdeplasmidi linearisoitiin katkaisemalla restriktioentsyymillä EcoRI. DNA-polymeraasi, Klenowin fragmentti oli ostettu Boehringer-Mannheimilta.
Il 19 80476
Kohdenukleiinihapon kopiointi
Suoritettiin neljä eri reaktiota käyttämällä 0, 104, 106 ja 10· molekyyliä (vastaten 0, 2xl0-20, 2xl0-ia ja 2xl0*16 05 moolia) kohde-DNA:ta. Tämän lisäksi kaikissa neljässä reaktiossa oli 50^1:n kokonaistilavuudessa seuraavat reagenssit: 2 pmol kumpaakin aluketta, 0,5mM kutakin neljää deoksinukleosiditrifosfaattia (dATP, dCTP, dGTP ja dTTP) ja lOmM Tris-Cl (pH 7,5), lOmM MgCl2, 50 mM NaCl ja 10mM 10 ditiotreitolia. Seosta kuumennettiin 100°C:ssa kahden minuutin ajan, inkuboitiin viiden minuutin ajan 37°C:ssa, jonka jälkeen lisättiin 1 */1 (vastaten yhtä yksikköä) DNA-polymeraasia. Seuraavaksi seosta inkuboitiin jälleen 10 minuuttia 37°C:ssa. DNA:ta syntetisoiva sykli muodostui siis 15 kuumennuksesta, sitä seuraavasta detektorialukkeiden hybridisoitumisesta ja inkubaatiosta lisäämällä DNA-polymeraasia 37°C:ssa. Sykli toistettiin 16 kertaa.
Hybridisaatio 20
Viimeisen syklin jälkeen näyte kuumennettiin vielä 100°C:een, jonka jälkeen lisättiin 10 pmol selektiivistä kiinnitin-koetinta ja NaCl (0,9M), EDTA:a (2mM), natriumfosfaattia (pH 7,5; 20mM) ja natriumdodekyylisulfaattia (0,1%). Tilavuus 25 laimeni 100 //l:aan. Ilmoitetut konsentraatiot ovat loppukonsentraatioita. Hybridisaatioaika oli 1 tunti ja lämpötila 50°C.
Hybridien talteenotto 30 1 ml kertakäyttöruiskuihin lisättiin Pandex-avidin-partik-kelit ja asennettiin Millex HVX3-filtteriyksiköt, kuten esimerkissä 1 on kuvattu. Ruiskuihin imettiin 100 μϊ reaktioliuosta. Hybridien huuhtomiseksi filttereiltä 35 ruiskuun imettiin lisäksi 120 μΐ DNA-vapaata hybridisaatio-liuosta, jonka jälkeen kokonaistilavuus ruiskussa oli 240 μΐ. Hybridien kiinnittyminen partikkeleihin ja partikkeleiden 20 80476 pesut suoritettiin kuten esimerkissä 1 on kuvattu. Pesujen jälkeen modifioiduilla alukkeilla varustetut kohdenukleiini-happomolekyylit detektoitiin kuten esimerkissä 1.
05 Tulokset
Tulokset voidaan tiivistää seuraavaan taulukkoon: 10 Kohde-DNA1> 32P-aktiivisuus kerätyissä hybrideissä 2) (taustan ylittävä cpm) 16 sykliä 15 0 0 2x10" 2 0 1050 20 2x10"18 15000 2x10"16 51300 25 1 ) moolia 2) kahden rinnakaismäärityksen keskiarvo
II
21 80476
Esimerkki 4
Hybridien talteenotto liuoshybridisaatiossa Pandex-avidin suodatusmenetelmällä käyttäen modifioitua aluketta 05 kiinnitinkoettimena
Kohde-DNA sekä materiaalit ja reagenssit olivat samat kuin esimerkissä 3 lukuunottamatta seuraavia poikkeuksia: Kiinnitinalukkeita (Pa, Pb, kuva 3) ei leimattu 32P:lla vaan 10 niiden 5'-päät modifioitiin liittämällä niihin biotinitähde. Tämä kemiallinen modifikaatio tehtiin käyttämällä tunnettuja menetelmiä, jotka Chollet ja Kawashima ovat kuvanneet julkaisussa Nucleic Acids Research, 13, ss. 1529-1541, 1985. Kahden selektiivisen koettimen (S1, S2, kuva 3) 5'-päät 15 leimattiin tässä tapauksessa, jotta ne voisivat toimia detektorikoettimina. Niiden spesifiset aktiivisuudet olivat noin 2xl09 ja 2,5xl09 cpm//ug.
Kohde-DNA:n kopiointi ja hybridisaatio suoritettiin kuten 20 esimerkissä 3 on kuvattu. Biotinyloituja kiinnitinalukkeita lisättiin kuitenkin 10 kertaisina määrinä, siis 20 pmol kutakin reaktiota kohden. Suoritettiin 16 sykliä kuten esimerkissä 3 on kuvattu, jonka jälkeen näytteet kuumennettiin 100°C:een ja lisättiin 0,5 pmol kumpaakin 25 32P:lla leimattua koetinta Sj ja S2 . Hybridisaatio suoritettiin samoissa olosuhteissa kuin on kuvattu esimerkissä 3.
Tämän jälkeen hybridien talteenotto suoritettiin kuten 30 esimerkissä 3 on kuvattu.
22 80476
Tulokset
Tulokset voidaan tiivistää seuraavaan taulukkoon: 05
Kohde-DNA1) 32P-aktiivisuus kerätyissähybrideissä 2) (traustan ylittävä cpm) 16 sykliä 10 0 0 2x10' 2 0 1420 15 2x10“18 18500 2x10"16 68300 20 1 ) moolia 2 ) kahden rinnakkaismäärityksen keskiarvo n
Claims (19)
1. Menetelmä nukleiinihappojen hybridisaatiomäärityksen parantamiseksi suodatuksen avulla, tunnettu siitä, 05 että hybridisoitu tai hybridisoimaton nukleiinihapponäyte imetään suodattimen läpi ruiskuun, jossa kohdenukleiinihappo hybridisoidaan tarvittaessa ja kiinnitetään samassa ruiskussa oleviin tai sinne hybridisaation jälkeen lisättyihin partikkeleihin nukleiinihappokoettimen välityksellä tai 10 kiinnitetään partikkeleihin kohdenukleiinihappomolekyylien kopiot modifioitujen alukkeiden välityksellä, joiden avulla ne on polymerisoitu, jonka jälkeen ruiskussa olevat partikkelit erotetaan suodattamalla ja niitä pestään sopivan monta kertaa samassa ruiskussa ja kohdenukleiinihappo tunnis-15 tetaan kulloinkin sopivalla menetelmällä.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä tunnettu siitä, että nukleiinihapponäyte suodatetaan ruiskuun, jossa kohdenukleiinihappo saa hybridisoitua partikkeliin sidotun 20 nukleiinihappokoettimen kanssa tai koettimen kanssa, joka on kiinnitettävissä partikkeliin, tai annetaan kohdenukleiini-hapon kanssa hybridisoituneen nukleiinihappokoettimen kiinnittyä partikkeleihin, tai kiinnitetään kohdenukleiinihappomolekyylien kopiot partikkeleihin modifioitujen 25 alukkeiden välityksellä, joiden avulla ne on polymerisoitu, jonka jälkeen ruiskussa olevat partikkelit erotetaan suodattamalla ja niitä pestään sopivan monta kertaa samassa ruiskussa ja kohdenukleiinihappo tunnistetaan kulloinkin sopivalla menetelmällä. 30
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä tunnettu siitä, että siinä suoritetaan seuraavat vaiheet: a) suoritetaan kohdenukleiinihapon ja kiinnitin- ja detektorikoettimien välinen hybridisaatio 35 b) suodatetaan hybridisaatioliuos 24 8 0 4 7 6 c) tarvittaessa otetaan talteen suodattimeen jääneet hybridit huuhtomalla suodatinta hybridisaatioliuoksella, jossa ei ole nukleiinihappoja d) kiinnitetään hybridit partikkeleihin 05 e) erotetaan partikkelit hybridisaatioliuoksesta f) pestään partikkelit vapaiksi hybridisoitumattomista detek-torikoettimista g) kohdenukleiinihappo tunnistetaan kulloinkin sopivalla menetelmällä. 10
4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä tunnettu siitä, että siinä suoritetaan seuraavat vaiheet: a) suodatetaan hybridisaatioliuos b) tarvittaessa otetaan talteen suodattimeen jääneet kohde-15 nukleiinihappomolekyylit huuhtomalla suodatinta hybridisaatioliuoksella, jossa ei ole nukleiinihappoja c) suoritetaan kohdenukleiinihapon ja kiinnitin- ja detektorikoettimen välinen hybridisaatio d) lisätään partikkelit 20 e) kiinnitetään hybridit partikkeleihin f) erotetaan partikkelit hybridisaatioliuoksesta g) pestään partikkelit vapaiksi hybridisoitumattomasta detektorikoettimesta h) kohdenukleiinihappo tunnistetaan kulloinkin sopivalla 25 menetelmällä
5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä tunnettu siitä, että siinä suoritetaan seuraavat vaiheet: a) kohdenukleiinihappomolekyylit kopioidaan käyttämällä kahta 30 kohdenukleiinihapon vastakkaisille polariteeteille komplementaarista aluketta, jotka on varustettu tai varustettavissa tunnistettavalla leimalla b) hybridisoidaan modifioidulla alukkeilla varustetut kohdenukleiinihappomolekyylien kopiot ja niiden kanssa 35 selektiivisesti hybridisoituva kiinnitinkoetin, joka on varustettu alueella tai komponentilla tai varustettavissa komponentilla, jolla on affiniteettia tai reaktiviteettia K 25 80476 toiseen komponenttiin ja joka ei ole homologinen modifioitujen alukkeiden kanssa c) suodatetaan hybridisaatioliuos d) tarvittaessa otetaan talteen suodattimeen jääneet hybridit 05 huuhtomalla suodatinta hybridisaatioliuoksella, jossa ei ole nukleiinihappoja e) kiinnitetään hybridit partikkeleihin f) erotetaan partikkelit hybridisaatioliuoksesta g) pestään partikkelit vapaiksi ylimääräisistä modifioiduista 10 alukkeista h) modifioidulla alukkeella varustetut kohdenukleiinihappo-molekyylien kopiot tunnistetaan kulloinkin sopivalla menetelmällä.
6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä tunnettu siitä, että siinä suoritetaan seuraavat vaiheet: a) kohdenukleiinihappomolekyylit kopioidaan käyttämällä kahta, kohdenukleiinihapon vastakkaisille polariteeteille komplementaarisia aluketta, jotka on varustettu tai 20 varustettavissa tunnistettavalla leimalla b) suodatetaan modifioidulla alukkeella varustetut kohdenuk-leiinihappomolekyylien kopiot sisältävä liuos c) tarvittaessa otetaan talteen suodattimeen jääneet modifioidulla alukkeella varustetut kohdenukleiinihappomole- 25 kyylien kopiot huuhtomalla suodatinta hybridisaatioliuoksella, jossa ei ole nukleiinihappoja d) hybridisoidaan modifioidulla alukkeella varustetut kohdenukleiinihapporaolekyylien kopiot ja niiden kanssa selektiivisesti hybridisoituva kiinnitinkoetin, joka on 30 varustettu alueella tai komponentilla tai varustettavissa komponentilla, jolla on affiniteettia tai reaktiviteettia toiseen komponenttiin ja joka ei ole homologinen modifioitujen alukkeiden kanssa e) lisätään partikkelit 35 f) kiinnitetään hybridit partikkeleihin g) erotetaan partikkelit hybridisaatioliuoksesta 26 80476 h) pestään partikkelit vapaiksi ylimääräisistä modifioiduista alukkeista i) modifioidulla alukkeella varustetut kohdenukleiinihappo-molekyylien kopiot tunnistetaan kulloinkin sopivalla 05 menetelmällä.
7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä tunnettu siitä, että siinä suoritetaan seuraavat vaiheet: a) kohdenukleiinihappomolekyylit kopioidaan käyttämällä kahta 10 kohdenukleiinihapon vastakkaisille polariteeteille komplementaarista aluketta, jotka on varustettu alueella tai komponentilla tai varustettavissa komponentilla, jolla on affiniteettia tai reaktiviteettia toiseen komponenttiin b) hybridisoidaan modifioidulla alukkeella varustetut 15 kohdenukleiinihappomolekyylien kopiot ja niiden kanssa selektiivisesti hybridisoituva detektorikoetin, joka on varustettu tai varustettavissa tunnistettavalla leimalla ja joka ei ole homologinen modifioitujen alukkeiden kanssa c) suodatetaan hybridisaatioliuos 20 d) tarvittaessa otetaan talteen suodattimeen jääneet hybridit huuhtomalla suodatinta hybridisaatioliuoksella, jossa ei ole nukleiinihappoja e) kiinnitetään hybridit partikkeleihin f) erotetaan partikkelit hybridisaatiliuoksesta 25 g) pestään partikkelit vapaiksi ylimääräisistä detektorikoettimista h) modifioidulla alukkeella varustetut kohdenukleiinihappomolekyylien kopiot tunnistetaan kulloinkin sopivalla menetelmällä. 30
8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä tunnettu siitä, että siinä suoritetaan seuraavat vaiheet: a) kohdenukeliinihappomolekyylit kopioidaan käyttämällä kahta kohdenukleiinihapon vastakkaisille polariteeteille komplemen-35 taarista aluketta, jotka on varustettu alueella tai komponentilla tai varustettavissa komponentilla, jolla on affiniteettia tai reaktiviteettia toiseen komponenttiin I! 27 8 0 4 7 6 b) suodatetaan modifioidulla alukkeella varustetut kohdenuk-leiinihappomolekyylien kopiot sisältävä liuos c) tarvittaessa otetaan talteen suodattimeen jääneet modifioidulla alukkeella varustetut kohdenukleiinihappo- 05 molekyylien kopiot huuhtomalla suodatinta hybridisaatioliuoksella, jossa ei ole nukleiinihappoja d) hybridisoidaan modifioidulla alukkeella varustetut kohde-nukleiinihappomolekyylien kopiot ja niiden kanssa selektiivisesti hybridisoituva detektorikoetin, joka on varustettu tai 10 varustettavissa tunnistettavalla leimalla ja joka ei ole homologinen modifioitujen alukkeiden kanssa e) lisätään partikkelit f) kiinnitetään hybridit partikkeleihin g) erotetaan partikkelit hybridisaatioliuoksesta 15 h) pestään partikkelit vapaiksi ylimääräisistä detektorikoet-timista i) modifioidulla alukkeella varustetut kohdenukleiinihappo-molekyylien kopiot tunnistetaan kulloinkin sopivalla menetelmällä. 20
9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä tunnettu siitä, että siinä suoritetaan seuraavat vaiheet: a) kohdenukleiinihappomolekyylit ja detektorikoettimet sisältävä hybridisaatioliuos suodatetaan 25 b) tarvittaessa otetaan talteen suodattimeen jääneet kohdenukleiinihappomolekyylit huuhtomalla suodatinta hybridisaatioliuoksella, jossa ei ole nukleiinihappoja c) suoritetaan detektorikoettimien, kohdenukleiinihappomole-kyylien ja partikkeleihin kiinnitettyjen kiinnitinkoettimien 30 välinen hybridisaatio d) erotetaan partikkelit hybridisaatioliuoksesta e) pestään partikkelit vapaiksi ylimääräisistä detektori-koettimista g) kohdenukleiinihappo tunnistetaan kulloinkin sopivalla 35 menetelmällä 28 80476
10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä tunnettu siitä, että kohdenukleiinihappomolekyylit ja detektorikoettimet esihybridisoidaan ennen suodatusta, jolloin vaiheessa c suoritetaan vain edellä muodostuneen 05 hybridin ja kiinnitinkoettimien välinen hybridisaatio.
11. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä tunnettu siitä, että siinä suoritetaan seuraavat vaiheet: a) kohdenukleiinihappomolekyylit kopioidaan käyttämällä 10 kahta, kohdenukleiinihapon vastakkaisille polariteeteille komplementaarista aluketta, jotka on varustettu tai varustettavissa tunnistettavalla leimalla b) suodatetaan modifioidulla alukkeella varustetut kohdenuk-leiinihappomolekyylien kopiot sisältävä liuos 15 c) tarvittaessa otetaan talteen suodattimeen jääneet modifioidulla alukkeella varustetut kohdenukleiinihappo-molekyylien kopiot huuhtomalla suodatinta hybridisaatio-liuoksella, jossa ei ole nukleiinihappoja d) hybridisoidaan modifioidulla alukkeella varustetut 20 kohdenukleiinihappomolekyylien kopiot ja niiden kanssa selektiivisesti hybridisoituva partikkeliin kiinnitetty nukleiinihappokoetin joka ei ole homologinen modifioitujen alukkeiden kanssa e) erotetaan partikkelit hybridisaatioliuoksesta 25 f) pestään partikkelit vapaaksi ylimääräisistä modifioiduista alukkeista g) modifioidulla alukkeella varustetut kohdenukleiinihappomolekyylien kopiot tunnistetaan kulloinkin sopivalla menetelmällä 30
12. Patenttivaatimuksen 3, 4, 7, 8, 9 tai 10 mukainen menetelmä tunnettu siitä, että kohdenukleiinihappo tunnistetaan eluoimalla detektorikoettimet partikkeleista ja mittaamalla detektorikoettimen määrä supernatantista. Il
29. O 4 7 6
13. Patenttivaatimuksen 5, 6 tai 11 mukainen menetelmä tunnettu siitä, että modifioidulla alukkeella varustetut kohdenukleiinihappomolekyylien kopiot tunnistetaan eluoimalla ne partikkeleista ja mittaamalla leima supernatan- 05 tista.
14. Väline nukleiinihappojen hybridisaatiomäärityksen parantamiseksi vaatimuksen 1 mukaisella menetelmällä tunnettu siitä, että siihen kuuluu ruisku, johon on 10 sijoitettu sopivalla tavalla esikäsitellyt partikkelit ja vähintäin yksi suodatin, joka on kiinnitetty tai kiinnitettävissä ruiskuun.
15. Reagenssipakkaus nukleiinihappojen hybridisaatiomää- 15 rityksen parantamiseksi vaatimuksen 1 mukaisella menetelmällä tunnettu siitä, että siihen kuuluu vähintäin kaksi kohdenukleiinihapon kanssa hybridisoituvaa, keskenään eihomologista koetinta, joista vähintäin yksi, detektori-koetin, on varustettu tai varustettavissa tunnistettavalla 20 leimalla, ja vähintäin yksi, kiinnitinkoetin on varustettu alueella tai komponentilla tai varustettavissa komponentilla, jolla on affiniteettia tai reaktiviteettia toiseen komponenttiin sekä ruisku, jossa on tai johon voidaan yhdistää suodatin, sekä vähintäin yksi suodatin ja partikkeleita, 25 joihin on kiinnitetty edellä mainittu toinen komponentti.
16. Reagenssipakkaus nukleiinihappojen hybridisaatiomäärityk-sen parantamiseksi vaatimuksen 1 mukaisella menetelmällä tunnettu siitä, että siihen kuuluu kaksi aluketta, 30 jotka ovat komplementaarisia kohdenukleiinihapon vastakkaisille polariteeteille ja jotka on varustettu tai varustettavissa tunnistettavalla leimalla, kohdenukleiinihapon kanssa selektiivisesti hybridisoituva nukleiinihappo-koetin, kiinnitinkoetin, joka on varustettu alueella tai 35 komponentilla tai varustettavissa komponentilla, jolla on affiniteettia tai reaktiviteettia toiseen komponenttiin ja 30 80476 joka ei ole homologinen modifioitujen alukkeiden kanssa/ vähintäin yksi suodatin ja ruisku, jossa on tai johon voidaan yhdistää kyseinen suodatin ja partikkeleita, joihin on kiinnitetty edellä mainittu toinen komponentti. 05
17. Reagenssipakkaus nukleiinihappojen hybridisaatiomääri-tyksen parantamiseksi vaatimuksen 1 mukaisella menetelmällä tunnettu siitä, että siihen kuuluu vähintäin kaksi aluketta, jotka ovat komplementaarisia kohdenukleiinihapon 10 vastakkaisille polariteeteille ja jotka on varustettu tai varustettavissa alueella tai komponentilla tai varustettavissa komponentilla, jolla on affiniteettia tai reaktiviteettia toiseen komponenttiin ja kohdenukleiinihapon kanssa selektiivisesti hybridisoituva nukleiinihappokoetin, 15 detektorikoetin, joka on varustettu tai varustettavissa tunnistettavalla leimalla ja joka ei ole homologinen modifioitujen koettimien kanssa sekä vähintäin yksi suodatin ja ruisku, jossa on tai johon voidaan yhdistää kyseinen suodatin ja partikkeleita, joihin on kiinnitetty edellä 20 mainittu toinen komponentti.
18. Reagenssipakkaus nukleiinihappojen hybridisaatiomene-telmän parantamiseksi vaatimuksen 1 mukaisella menetelmällä tunnettu siitä, että siihen kuuluu vähintäin kaksi -:· 25 kohdenukleiinihapon kanssa hybridisoituvaa, keskenään eihomologista koetinta, joista vähintäin yksi, detektori-koetin on varustettu tai varustettavissa tunnistettavalla leimalla ja vähintäin yksi, kiinnitinkoetin, on kiinnitetty partikkeleihin sekä vähintäin yksi suodatin ja ruisku, jossa 30 on tai johon voidaan yhdistää kyseinen suodatin. Il si 80476
19. Reagenssipakkaus nukleiinihappojen hybridisaatiomääri-tyksen parantamiseksi vaatimuksen 1 mukaisella menetelmällä tunnettu siitä, että siihen kuuluu kaksi aluketta, jotka ovat komplementaarisia kohdenukleiinihapon vastakkai-05 sille polariteeteille ja jotka on varustettu tai varustettavissa tunnistettavalla leimalla, kohdenukleiinihapon kanssa selektiivisesti hybridisoituva nukleiinihappokoetin, kiinnitinkoetin, joka on kiinnitetty partikkeliin ja joka ei ole homologinen edellä mainittujen modifioitujen alukkeiden 10 kanssa sekä vähintäin yksi suodatin ja ruisku, jossa on tai johon voidaan yhdistää kyseinen suodatin ja partikkeleita, joihin on kiinnitetty edellä mainittu toinen komponentti. 32 80476
Priority Applications (9)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI874466A FI80476C (fi) | 1987-10-09 | 1987-10-09 | Foerbaettrat hybridisationsfoerfarande, vid foerfarandet anvaent redskap och reagensfoerpackning. |
| AU21781/88A AU618278B2 (en) | 1987-10-09 | 1988-09-01 | An improved hybridization method, a kit therefor, and a reagent package |
| DK198805510A DK174957B1 (da) | 1987-10-09 | 1988-10-03 | Hybridiseringsmetode |
| DE3855709T DE3855709T2 (de) | 1987-10-09 | 1988-10-07 | Hybridisierungsverfahren und Reagenzsatz dafür |
| ES88309414T ES2095206T3 (es) | 1987-10-09 | 1988-10-07 | Metodo de hibridacion y estuche de reactivos para el mismo. |
| EP88309414A EP0317074B1 (en) | 1987-10-09 | 1988-10-07 | Hybridization method and reagent kit therefor |
| AT88309414T ATE146529T1 (de) | 1987-10-09 | 1988-10-07 | Hybridisierungsverfahren und reagenzsatz dafür |
| JP63254666A JP2705811B2 (ja) | 1987-10-09 | 1988-10-08 | 核酸を検出する方法、それに用いる器具およびキット |
| GR970400168T GR3022457T3 (en) | 1987-10-09 | 1997-01-31 | Hybridization method and reagent kit therefor |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI874466 | 1987-10-09 | ||
| FI874466A FI80476C (fi) | 1987-10-09 | 1987-10-09 | Foerbaettrat hybridisationsfoerfarande, vid foerfarandet anvaent redskap och reagensfoerpackning. |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI874466A0 FI874466A0 (fi) | 1987-10-09 |
| FI874466A FI874466A (fi) | 1989-04-10 |
| FI80476B FI80476B (fi) | 1990-02-28 |
| FI80476C true FI80476C (fi) | 1990-06-11 |
Family
ID=8525215
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI874466A FI80476C (fi) | 1987-10-09 | 1987-10-09 | Foerbaettrat hybridisationsfoerfarande, vid foerfarandet anvaent redskap och reagensfoerpackning. |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0317074B1 (fi) |
| JP (1) | JP2705811B2 (fi) |
| AT (1) | ATE146529T1 (fi) |
| AU (1) | AU618278B2 (fi) |
| DE (1) | DE3855709T2 (fi) |
| DK (1) | DK174957B1 (fi) |
| ES (1) | ES2095206T3 (fi) |
| FI (1) | FI80476C (fi) |
| GR (1) | GR3022457T3 (fi) |
Families Citing this family (23)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5753433A (en) * | 1909-12-05 | 1998-05-19 | Boehringer Mannheim Gmbh | Method for the sensitive detection of nucleic acids |
| US5856092A (en) * | 1989-02-13 | 1999-01-05 | Geneco Pty Ltd | Detection of a nucleic acid sequence or a change therein |
| CA2011818A1 (en) * | 1989-03-17 | 1990-09-17 | Fred T. Oakes | Methods for purification, amplification and detection of a nucleic acid |
| FR2648152A1 (fr) * | 1989-06-12 | 1990-12-14 | Oris Ind Cie | Procede de detection et/ou d'identification d'acides nucleiques par amplification et hybridation en solution et ses applications |
| JPH03123500A (ja) * | 1989-10-06 | 1991-05-27 | Canon Inc | 核酸の分別方法 |
| DE4001154A1 (de) * | 1990-01-17 | 1991-07-18 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur herstellung von modifizierten nukleinsaeuren |
| CA2032331A1 (en) * | 1990-01-22 | 1991-07-23 | Annie L. Wu | Method and kits for detecting human leukocyte antigen dna |
| IL97222A (en) * | 1990-02-16 | 1995-08-31 | Orion Yhtymae Oy | Method and Responder for Determining Special Changes to Nucleotide |
| US6013431A (en) | 1990-02-16 | 2000-01-11 | Molecular Tool, Inc. | Method for determining specific nucleotide variations by primer extension in the presence of mixture of labeled nucleotides and terminators |
| FR2660925B1 (fr) * | 1990-04-11 | 1994-07-01 | Inst Nat Sante Rech Med | Procede de fixation d'une sequence nucleotidique sur un support solide, applications et necessaires pour leur mise en óoeuvre. |
| US6004744A (en) | 1991-03-05 | 1999-12-21 | Molecular Tool, Inc. | Method for determining nucleotide identity through extension of immobilized primer |
| US6071699A (en) | 1996-06-07 | 2000-06-06 | California Institute Of Technology | Nucleic acid mediated electron transfer |
| JP2000503845A (ja) * | 1996-01-23 | 2000-04-04 | ラピジーン，インコーポレイテッド | サイジング技術を用いる核酸分子の分析のための方法および組成物 |
| BR9707060A (pt) * | 1996-01-23 | 1999-12-28 | Rapigene Inc | Métodos e composições para detectar o ligamento de par ligante usando indicador não-fluorescente. |
| WO1997035033A1 (en) | 1996-03-19 | 1997-09-25 | Molecular Tool, Inc. | Method for determining the nucleotide sequence of a polynucleotide |
| US7381525B1 (en) | 1997-03-07 | 2008-06-03 | Clinical Micro Sensors, Inc. | AC/DC voltage apparatus for detection of nucleic acids |
| US7745142B2 (en) | 1997-09-15 | 2010-06-29 | Molecular Devices Corporation | Molecular modification assays |
| WO2000063437A2 (en) | 1999-04-20 | 2000-10-26 | Illumina, Inc. | Detection of nucleic acid reactions on bead arrays |
| US20060275782A1 (en) | 1999-04-20 | 2006-12-07 | Illumina, Inc. | Detection of nucleic acid reactions on bead arrays |
| CA2380258C (en) | 1999-07-26 | 2008-07-15 | Clinical Micro Sensors, Inc. | Sequence determination of nucleic acids using electronic detection |
| US6518024B2 (en) | 1999-12-13 | 2003-02-11 | Motorola, Inc. | Electrochemical detection of single base extension |
| WO2001061043A2 (en) | 2000-02-16 | 2001-08-23 | Illumina, Inc. | Parallel genotyping of multiple patient samples |
| EP1359228B1 (en) * | 2002-04-23 | 2013-11-27 | Accenture Global Services Limited | DNA authentification based on scattered-light detection |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1256005A (en) * | 1983-09-26 | 1989-06-20 | W. Peter Hansen | Sandwich hybridization method for nucleic acid detection |
| EP0200113A3 (en) * | 1985-04-30 | 1987-03-18 | Pandex Laboratories, Inc. | A method of solid phase nucleic acid hybridization assay incorporating a luminescent label |
| TW203120B (fi) * | 1985-10-04 | 1993-04-01 | Abbott Lab | |
| JPS6298257A (ja) * | 1985-10-25 | 1987-05-07 | Nitto Electric Ind Co Ltd | 免疫学的測定法 |
| US4855225A (en) * | 1986-02-07 | 1989-08-08 | Applied Biosystems, Inc. | Method of detecting electrophoretically separated oligonucleotides |
| CA1290664C (en) * | 1986-03-05 | 1991-10-15 | Nanibhushan Dattagupta | Solution-phase single hybridization assay for detecting polynucleotide sequences |
| JPS62273453A (ja) * | 1986-05-21 | 1987-11-27 | Tosoh Corp | 免疫反応測定装置に用いるｂ／ｆ分離装置 |
| GB8629740D0 (en) * | 1986-12-12 | 1987-01-21 | Iq Bio Ltd | Immunoassay |
| AU622104B2 (en) * | 1987-03-11 | 1992-04-02 | Sangtec Molecular Diagnostics Ab | Method of assaying of nucleic acids, a reagent combination and kit therefore |
-
1987
- 1987-10-09 FI FI874466A patent/FI80476C/fi not_active IP Right Cessation
-
1988
- 1988-09-01 AU AU21781/88A patent/AU618278B2/en not_active Expired
- 1988-10-03 DK DK198805510A patent/DK174957B1/da not_active IP Right Cessation
- 1988-10-07 EP EP88309414A patent/EP0317074B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-10-07 ES ES88309414T patent/ES2095206T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1988-10-07 DE DE3855709T patent/DE3855709T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1988-10-07 AT AT88309414T patent/ATE146529T1/de not_active IP Right Cessation
- 1988-10-08 JP JP63254666A patent/JP2705811B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1997
- 1997-01-31 GR GR970400168T patent/GR3022457T3/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU2178188A (en) | 1989-04-13 |
| DE3855709T2 (de) | 1997-04-17 |
| FI874466A0 (fi) | 1987-10-09 |
| EP0317074A3 (en) | 1991-01-30 |
| DK174957B1 (da) | 2004-03-22 |
| EP0317074B1 (en) | 1996-12-18 |
| ATE146529T1 (de) | 1997-01-15 |
| EP0317074A2 (en) | 1989-05-24 |
| DK551088A (da) | 1989-04-10 |
| AU618278B2 (en) | 1991-12-19 |
| JPH01222800A (ja) | 1989-09-06 |
| DE3855709D1 (de) | 1997-01-30 |
| FI80476B (fi) | 1990-02-28 |
| ES2095206T3 (es) | 1997-02-16 |
| DK551088D0 (da) | 1988-10-03 |
| FI874466A (fi) | 1989-04-10 |
| JP2705811B2 (ja) | 1998-01-28 |
| GR3022457T3 (en) | 1997-04-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI80476C (fi) | Foerbaettrat hybridisationsfoerfarande, vid foerfarandet anvaent redskap och reagensfoerpackning. | |
| US5476769A (en) | Method for assays of nucleic acid, a reagent combination and a kit therefor | |
| EP0457824B1 (en) | Detection of a nucleic acid sequence or a change therein | |
| US5856092A (en) | Detection of a nucleic acid sequence or a change therein | |
| EP0276302B1 (en) | Nucleic acid probe assay methods and compositions | |
| CA2026280C (en) | Biotin-labelled dna by polymerase chain reaction and detection thereof | |
| US5932413A (en) | DNA probe assay using neutrally charged probe strands | |
| WO1999060159A2 (en) | Method for using unequal primer concentrations for generating nucleic acid amplification products | |
| WO1991015768A1 (en) | Process and composition for performing dna assays | |
| Jungell-Nortamo et al. | Nucleic acid sandwich hybridization: enhanced reaction rate with magnetic microparticles as carriers | |
| AU5359690A (en) | Polymerase chain reaction products incorporating reporter moieties and affinity seperation | |
| WO2011080068A1 (en) | Method for polynucleotide hybridization | |
| WO2004050910A1 (en) | Method for hybridisation of immobilized genomic dna | |
| EP0421469B1 (en) | Method for separating a target oligonucleotide | |
| Rashtchian et al. | Labeling and detection of nucleic acids | |
| JPH01314965A (ja) | 検体中の目的核酸の検出法 | |
| AU723602B2 (en) | Biotin-labelled DNA by polymerase chain reaction and detection thereof | |
| JPH1014572A (ja) | プローブライブラリーの製造方法、該製造方法により得られたプローブライブラリー、該プローブライブラリーから他のｄｎａまたはｒｎａとハイブリッドするプローブを精製する方法、及び該方法により精製したプローブ | |
| AU5354790A (en) | Process for rapid nucleic acid detection |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC | Transfer of assignment of patent |
Owner name: SANGTEC MEDICAL AB |
|
| FG | Patent granted |
Owner name: SANGTEC MOLECULAR DIAGNOSTICS AB |
|
| MA | Patent expired |