FR2648152A1 - Procede de detection et/ou d'identification d'acides nucleiques par amplification et hybridation en solution et ses applications - Google Patents

Procede de detection et/ou d'identification d'acides nucleiques par amplification et hybridation en solution et ses applications Download PDF

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Abstract

Procédé de détection et/ou d'identification de faibles quantités d'acides nucléiques par amplification et hybridation en solution ainsi que ses applications, à l'aide des étapes suivantes : (1) une étape d'enrichissement en séquence(s) cible(s) par : (a) mise en contact de l'échantillon biologique mis en solution avec au moins une paire d'amorces appropriées, pour amplifier au moins un fragment de ladite/lesdites séquences d'acide nucléique cible, permettant d'obtenir une solution d'amplification d'enrichissement; et (b) au moins une dilution appropriée de la solution d'amplication d'enrichissement obtenue en a; (2) une étape de détection des séquences cibles amplifiées, par : (c) mise en contact d'une fraction de la solution obtenue en b avec au moins une paire d'amorces différente de celle de l'étape a, l'une desdites amorces étant associée à un système de capture Ac, et l'autre amorce étant choisie dans le groupe qui comprend les amorces simples As et les amorces associées à un système de détection Ad, de manière à obtenir des produits double brin d'extension de la/les séquences cibles qui comportent une amorce de détection Ad ou une amorce simple As intégrée dans un brin et une amorce de capture Ac intégrée dans le brin complémentaire et permettant d'obtenir une solution d'amplification de détection; (d) mise en contact de la solution d'amplification de détection avec un support approprié qui capte les fragments d'acides nucléiques porteurs de l'amorce de capture Ac intégrée; (e) détection des copies d'acide nucléique cible double brin retenues sur ledit support.

Description

La présente invention est relative a un procédé de détection et/ou d'identification de faibles quantités d'acides nucléiques par aiplifîcation et hybridation en solution ainsi qu'à ses applications.
La réaction de polymérisation en channe (PCR) a été développée par SAIKI R. et al. (Science, 1985, 220, 1350).
Cette technique permet notamment d'amplifier des séquences d'ADN double brin et est basée sur le fonctionnement cyclique d'une ADN polymérase, laquelle enzyme est capable de copier un brin d'ADN, utilisé comme matrice, en un brin complémentaire par élongation à partir de l'extrémité 3' OH libre d'une amorce oligonucléo tidique
La technique PCR consiste à effectuer n cycles successifs d'amplification, au cours desquels deux amorces dirigent l'amplification de la séquence d'ADN double brin qu'elles encadrent.
Un cycle d'amplification est composé de trois étapes permettant de réaliser successivement la dénaturation de l'ADN (95'C), l'hybridation des amorces (37-55 C) et l'extension des brins d'ADN par 1'ADN polymérase.
Cette technique d'amplification est plus particulièrement décrite dans la Demande de Brevet européen
CETUS 201 184.
Les deux amorces oligonucléotidiques mises en oeuvre dans la PCR sont de préférence simple brin et doivent être suffisamment longues pour amorcer la synthèse du produit d'extension en présence de l'ADN polymérase.
Pour éviter l'addition d'enzymes à chaque cycle. une ADN polymérase pouvant résister à 100'C, la
Taq ADN polymérase, décrite dans la Demande de Brevet européen CETUS 258 017, est ajoutée dès le début du procédé et permet de réaliser jusqu'à 40 cycles d'amplification consécutifs. La Taq polymérase a permis d'une part d'automatiser le procédé d'amplification et d'autre part d'augmenter la spécificité de l'amplification.
En effet, l'étape d'extension est réalisée å la température optimale de fonctionnement de l'enzyie, soit 37 C pour une ADN polymérase classique (fragment de
Klenow) et 70-80 C pour la Taq polymérase. Il résulte de ces conditions de températures très différentes que l'amplification est plus spécifique avec la Taq polymérase qu'avec le fragment de Klenow ; en effet, à 37'C des séquences d'ADN n'ayant par exemple que 60 à 80 * d'homologie entre elles, forment un complexe d'hybridation stable.
Toutefois, même avec la Taq polymérase, l'hybridation des amorces est à l'origine d'amplifications non spécifiques qui peuvent diminuer l'efficacité de ladite amplification. La PCR ne présente donc pas une spécificité parfaite, une hybridation partielle pouvant engendrer une copie fautive et comme l'amorce est intégrée, elle se copiera ensuite de façon exponentielle. La spécificité est, en effet, liée à la longueur et à la séquence des amorces utilisées. Elle dépend aussi de la température à laquelle 50 % des séquences sont sous forme double brin (Tm), des températures des différentes phases du cycle et de la nature du tampon.
Une autre limitation de la PCR est liée au rendement, qui varie considérablement au cours des cycles successifs.
La courbe d'amplification peut être schémati- quement diviséq en deux phases
- une phase exponentielle ou la quantité Q de séquences cibles obtenues peut être reliée à la quantité
Qo de séquences cibles initiales, au facteur d'amplification x et au nombre de cycles n par la formule suivante : Q : Qo (1 + x)
- une phase où le facteur x chute brutalement et la quantité Q tend vers une valeur maximale Qm.
D'autres Demandes de Brevet décrivent des méthodes d'amplification d'acides nucléiques qui ont pour but de pallier les inconvénients de la PCR.
La Demande de Brevet européen MOLZCULAR
DIAGNOSIS Inc., n 297 379 décrit une méthode d'amplification d'une séquence d'acide nucléique cible spécifique dans un échantillon par
(a) mise en contact dans des conditions appropriées à l'hybridation de : (i) deux amorces d'acide nucléiques immobilisées, ou immobilisables avec (ii) un échantillon contenant la séquence cible ; (b) mise en contact du produit résultant de l'étape (a) avec une enzyme d'extension et au moins un résidu d'acide nucléique dans des conditions permettant l'élongation des amorces hybridées ; (c) dénaturation du produit de l'étape (b) pour produire des séquences d'acide nucléique cibles immobilisées ; (d) répétition au moins une fois des étapes (a), (b) et (c), le produit de l'étape (c) du cycle précédent étant utilisé dans l'étape (a) (ii).
La méthode décrite dans cette Demande 297 379 permet d'utiliser des amorces oligonucléotidiques fixés sur un support solide pour l'amplification d'une séquence et le produit amplifié est ainsi directement prêt à être détecté.
Dans la méthode décrite dans la Demande de
Brevet européen Synthex, n 300 796, on détecte un fragment cible d'acide nucléique contenu dans une séquence d'acide nucléique par la formation de copies multiples d'une séquence polynucléotidique dite primaire à partir de cette séquence cible. Ceci est réalisé notamment en introduisant dans le milieu où se trouve l'échantillon d'acide nucléique à analyser, un polynucléotide dit "modèle", constitué d'une séquence matrice complémentaire de la séquence polynucléotidique primaire, répétée plusieurs fois, chaque séquence matrice étant reliée à la suivante par l'intermédiaire d'au moins un site de restriction spécifique.
La séquence cible de l'acide nucléique à détecter s'hybride avec la séquence modèle et après clivage par une enzyme de restriction appropriée, on forme un, produit d'extension du fragment de la séquence cible hybride en présence de ladite séquence modèle, puis on obtient, après un nouveau clivage, de multiples copies de la séquence polynucléotidique primaire, qui ensuite peut être détectée par tout moyen approprié.
Cette méthode augmente la sensibilité de la
PCR, notamment en présence de quantités très faibles d'acide nucléique sans en augmenter toutefois la spécifi- cite.
En ce qui concerne l'hybridation des séquences amplifiées et leur détection, plusieurs techniques ont été proposées
- l'hybridation entre la sonde de détection et la séquence d'acide nucléique cible peut être réalisée sur support solide (dot blot, Southern blot) ; on peut citer notamment la Demande de Brevet européen CETUS 200 362 qui décrit la technique d'amplification, associée à une méthode d'hybridation, pour la détection d'une séquence d'acide nucléique
- l'hybridation entre la sonde et la séquence d'acide nucléique peut être réalisée en solution.
Cette hybridation en solution présente des avantages d'efficacité et de rapidité.
Plusieurs procédés d'hybridation en solution ont été décrits dans 1'Art antérieur
- KOHNE D. (American Ciin. Review; nov. 1986) décrit une méthode de détection des Legionella et des Ny- coplasma pneumoniae par hybridation avec des sondes radioactives d'ADN. Les séquences cibles répétitives des
ARN ribosomaux appartenant aux microorganismes présents dans les échantillons biologiques sont hybridés à des sondes radioactives de l'ADN. Les duplex ADN-ARN sont séparés par fixation sur hydroxyapatite. La méthode est limitée aux organismes présentant des séquences naturelles répétitives et les bruits de fond sont relativement importants. Le principal inconvénient du système est qu'il repose sur la discrimination des simples chatnes par rapport aux doubles chaînes et non sur la séparation des hybrides spécifiques de la séquence par rapport à l'excès de-sonde
- le Brevet US 4 486 539 décrit une méthode d'hybridation de type sandwich à une seule étape, dans laquelle on a une sonde de détection (spi) marquée et une sonde de capture (Sz) immobilisée sur un support solide, pour la séparation de l'acide nucléique cible, du mélange réactionnel. Dans une telle méthode on n'obtient pas une hybridation suffisante en moins de 12 heures
- la méthode d'hybridation en solution est plus particulièrement décrite dans le Brevet britannique 2 169 403 et le Brevet français 85 19394.
Dans cette méthode on utilise deux sondes différentes (S1 et St) qui sont dans la même phase 'en solution. La sonde de détection (Si) est marquée avec un marqueur détectable et un fragment ayant une affinité pour un autre composant est fixée à la sonde de capture (Si).
Après hybridation, l'hybride formé entre Si, la séquence d'acide nucléique cible-et Si peut 6.re séparé de la solution d'hybridation à l'aide de l'autre partie de la paire d'affinité.
Dans cette méthode, les hybridations sandwich de type ADN-ADN sont peu efficaces, l'hybride dérivé de la séquence cible ayant tendance à se reformer et à rejeter les sondes, plus courtes, de capture et de détection
- les Demandes de Brevets européens 70685 et 70687 proposent une méthode qui dispenserait de séparer physiquement la sonde hybridée de la sonde non hybridée.
Ils proposent l'utilisation d'une paire de sondes qui s'hybrident dans des positions contiguës sur une séquence cible, l'une porte un catalyseur de chimiluminescence (peroxydase, luminol), l'autre une molécule absorbant l'émission chimiluminescente (rhodamine par exemple). La lumière absorbée est émise à une longueur d'onde différente., Il n'y a plus de support solide et la mesure s'effectue directement en solution. HELLER H. et MORRISON
L. (Rapid Detection of Infectious Agents, Kingsbury D. et
Falkow S. Ed. pp. 245-256, Academic Press New-York)
- on peut également citer la Demande de Brevet européen CETUS 229 701 qui décrit un procédé de détection de virus par amplification et hybridation soit sur support solide, soit en solution. Dans ce dernier cas, la séquence d'acide nucléique amplifiée et hybridée en solution å une sonde oligonucléotidique marquée, s'hybride spécifiquement à la séquence cible, ladite sonde étant détectée par la technique de restriction oligomérique. Le fragment de sonde marquée obtenu par clivage par l'enzyme de restriction appropriée est séparé sur gel d'électrophorèse et le gel est autoradiographié.
- la Demande de Brevet français 88 03107 décrit pour sa part une méthode de dosage d'acides nucléiques dans laquelle les sondes de capture jouent le r81e d'amorces modifiées, lesdites amorces étant incorporées dans des copies de l'acide nucléique cible dont la présence est ensuite détectée par au moins une sonde de détection sélective.
Les systèmes de capture sont insérés par PCR aux deux extrémités d'une double chaîne de DNA-djrivOe de la cible & l'aide d'amorces modifiées. Le duplex est dénaturé et une sonde.oligonucléotidique de grande longueur marquée est hybridée à l'un des deux simples brins obtenus.
Dans ce procédé le duplex final, dérivé de. la séquence biologique recherchée et portant à chacune de ses extrémités un système de capture par un support solide, doit être dénaturé. Il est ensuite mis en présence d'une sonde oligonucléotidique de détection qui est plus courte. Il existe une réaction de compétition entre les simples brins de la cible qui ont tendance à se renaturer rapidement et l'hybridation de la sonde avec un, simple brin du duplex. La sonde étant plus courte l'association (sonde)-(chalne de la cible) est beaucoup plus instable que l'association (chaîne de la cible)-(chatne de la cible). Il faut utiliser une sonde oligonucléotidique de grande longueur ou de grandes quantités de chaînes courtes pour jouer sur la loi d'action de masse.
Il en résulte nécessairement une augmentation du bruit de fond et une consommation importante de réactifs.
Dans une variante, les systèmes de détection sont insérés aux deux extrémités du duplex par PCR à l'aide d'amorces modifiées. Une sonde de capture pour le support est hybridée sur l'une des deux channes du support après dénaturation du duplex obtenu. Les problèmes de compétition mentionnés ci-dessus sont les mêmes.
Toutefois, toutes les méthodes d'amplification et/ou de détection d'acides nucléiques de l'Art antérieur, en solution, qui sont les seules à être aisément automatisables, n'éliminent pas les contaminants éventuels (séquences homologues) ' et entraînent par l'amplification de telles séquences des faux positifs, comme précisé en particulier dans l'article au nom 'de
Y.M.D. LO et al., paru dans Lancet (1988, ii, 679), qui fait apparaître cet inconvénient de la réaction de polymérisation en chaine dû à sa sensibilité. Pour pallier cet inconvénient important, les Auteurs de cet article préconisent de prendre un soin particulier dans la préparation de la matrice d'ADN avant l'amplification.
Ces différentes méthodes n'évitent cependant pas l'amplification exponentielle de séquences homologues non spécifiques, conséquence directe de l'intégration physique des amorces dans les brins néosynthétisés.
En effet, des molécules synthétisées à la suite d'une hybridation imparfaite de l'amorce avec des séquences non cibles sont amplifiées exponentiellement car elles portent désormais strictement la séquence amorce.
De plus, dans les méthodes de détection par amplification et hybridation de l'Art antérieur, les échantillons sont toujours très purifiés, la question d'une contamination éventuelle des échantillons par le milieu de prélèvement n'étant jamais évoquée.
C'est pourquoi, la Demanderesse s'est en conséquence donné pour but de pourvoir à un procédé de détection tant qualitatif que semi-quantitatif et d'identification de faibles quantités d'acides nucléiques par amplification et hybridation en solution, qui répond mieux aux nécessités de la pratique que les procédés de l'Art antérieur, notamment en ce qu'il est facile à automatiser, spécifique, sensible, rapide et économique et en ce que la présence de contaminants éventuels (débris cellulaires, protéines par exemple) n'a pratiquement pas d'influence sur ladite détection.
La présente invention a pour objet un procédé de détection et d'identification en solution de faibles quantités d'acides nucléiques (séquence unique et/ou mélange de séquences d'acides nucléiques) présentes dans un échantillon biologique, par amplification enzymatique et hybridation, caractérisé en ce qu'après mise en solution appropriée de l'échantillon biologique pour extraire le/les acides nucléiques, ledit procédé comprend la détection d'une séquence d'acide nucléique ou d'un mélange de séquences à l'aide des étapes suivantes
(1) une étape d'enrichissement en séquence(s) cibles(s) par (a) mise en contact de l'échantillon biologique mis en solution avec au moins une paire d'amorces appropriées, pour amplifier au moins un fragment de ladite/lesdites séquences d'acide nucléique cible1 lesdites amorces délimitant le fragment de la/les séquences cibles & détecter, s'hybridant à ladite/lesdites séquences cibles et permettant d'obtenir une solution d'amplification d'enrichissement ; et (b) au moins une dilution appropriée de la solution d'amplification d'enrichissement obtenue en (a), pour dé- placer l'équilibre des produits de ladite amplification en faveur des séquences cibles amplifiées, par rapport å la solution initiale
(2) une étape de détection desdites séquences cibles amplifiées1 par (c) mise en contact d'une fraction de la solution d'amplification d'enrichissement obtenue en (b) avec au moins une paire d'amorces différente de celle de l'étape (a), l'une desdites amorces étant associée à un système de capture (Ac), et l'autre amorce étant choisie dans le groupe qui comprend les amorces simples (As) et les amorces associées à un système de détection (Ad), de manière à obtenir des produits double brin d'extension de la/les séquences cibles qui comportent une amorce de détection (Ad) ou une amorce simple (As) intégrée dans un brin et une amorce de capture (Ac) intégrée dans.le brin complémentaire et permettant d'obtenir une solution d'amplification de détection (d) mise, en contact de la solution d'amplification de détection avec un support approprié qui capte les fragments d'acides nucléiques porteurs de l'amorce de capture -(Ac) intégrée ; (e) détection des copies d'acide nucléique cible double brin retenues sur ledit support, par tout moyen approprié.
On entend par amorce simple (As), une séquence oligonucleotidique simple brin non modifiée, qui s'hybride à une séquence cible à détecter.
On entend par amorce de capture (Ac), une sé- quence d'acide nucléique simple brin modifiée notamment par au moins une moitié de paire d'affinité et qui s'hybride à une séquence cible ; par exemple, a une extrémité de la channe oligonucléotidique une ou plusieurs biotines peuvent être fixées. L'amorce de capture peut également être un oligonucléotide branché.
On entend par amorce de détection (Ad), une séquence d'acide nucléique simple brin modifiée par un système de détection et qui s'hybride à une séquence cible ; par exemple, l'oligonucléotide peut être marqué en son extrémité 5' par un phosphore-32.
Conformément à l'invention, les étapes (a) et (b) sont répétées au moins une fois.
Selon un mode de mise en oeuvre avantageux de l'invention, la dilution de l'étape (b) est comprise entre 1/200è et 1/100 000è.
Cette dilution permet d'initialiser l'amplification de détection à partir d'un matériel biologique purifié et enrichi en séquences cibles.
Cet enrichissement en séquences cibles par dilution de la solution d'amplification de l'étape (a) permet de mettre les séquences contaminantes dans des conditions peu propices à leur amplification lors de l'amplification de détection.
Le nombre de cycles de l'amplification de dé- tection est notamment choisi en fonction de la dilution et de la nature de l'échantillon, de façon àsconserver l'amplification de détection, un caractère exponentiel et à obtenir des résultats nettement améliorés par rapport aux techniques de l'Art antérieur. En effet, la diminution de concentration en séquences contaminantes par rapport à l'échantillon biologique initial permet notamment de diminuer la concentration en amorces å utiliser 'au cours de l'amplification de détection. Ceci présente un avantage important, car les amorces de l'amplification de détection sont coûteuses et plus difficiles à synthétiser.
La méthode conforme à l'invention est dénommée par les Inventeurs hybrido-essai.
Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux de l'invention, les paires d'amorces de l'étape (a) sont choisies dans le groupe qui comprend les paires amorce simple-amorce simple (Asl-As2), les paires amorce simple-amorce modifiée par un système de capture (Asl- Ac), les paires amorce simple-amorce modifiée par un système de détection (Asl-Ad).
Selon un autre mode de mise en oeuvre de l'invention, les paires d'amorces de l'étape (c) sont des paires amorce modifiée par un système de capture-amorce modifiée par un système de détection (Ac-Ad), l'une desdites amorces pouvant présenter éventuellement une séquence identique à celle de l'amorce Ac ou Ad de l'étape (a) selon le cas, l'autre amorce comprenant une séquence d'acide nucléique incluse entre les deux amorces de l'étape (a).
Au cours de l'amplification de détection on peut procéder, en même temps, dans le même tube à essai, à l'amplification de détection de plusieurs séquences cibles à condition d'utiliser comme amorce de capture des oligonucléotides branchés. Les duplex comportait des oligonucléotides branchés ont un brin d'ADN monocaténaire libre. Ce brin libre d'ADN simple brin permet de réaliser à l'aide d'un oligonucléotide complémentaire attaché & un support, une fixation sélective.
Le système de capture est avantageusement une moitié de paire d'affinité. Un tel système permettra à l'oligonucléotide de se fixer sur le support possédant l'autre moitié de la paire d'affinité.
On peut citer notamment comme paires d'affinité, les paires biotine-avidine ou streptavidine, dérivé de métal lourd-groupe thio, divers homopolynuclXo- tides comme poly dG-poly dC, poly dA-poly dT et poly dApoly dU ainsi que divers oligonucléotides de séquences spécifiques comme dans le cas, par exemple des amorces branchées. D'autres paires de composants peuvent également être utilisées si elles présentent une affinité assez forte pour permettre la liaison spécifique des amorces de capture (Ac) incorporées dans les copies de l'acide nucléique cible au support solide ; les ligands et les conjugués peuvent être parties d'une paire d'affinité.
Le système de détection est avantageusement choisi dans le groupe qui comprend les isotopes (125I, 395, 3in), les fluorophores, un système fluorescent de type. lanthanide, un système enzymatique colorimétrique (phosphatase alcaline, perozydase), un système enzymatique fluorimétrique.
Selon encore un autre mode de -mise en oeuvre du procédé conforme à l'invention, lorsqu'une amorce de détection (Ad) est intégrée dans un brin d'acide nucléique cible, au cours de l'étape (c), la détection de l'étape (e) est réalisé à l'aide de ladite amorce de détection (Ad).
Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux du procédé conforme à l'invention, lorsqu'une amorce simple (As) est intégrée dans un brin au cours-de l'étape (c), la détection de l'étape (e) est réalisée par hybride dation des copies d'acide nucléique cible double brin re- tenues sur le- support avec une sonde de détection appropriée.
Le procédé conforme à l'invention présente un certain nombre d'avantages sur les procédés de l'Art an térieur
- une spécificité accrue, dans la mesure où au moins trois amorces différentes sont utilisées ;
- une diminution du bruit de fond
- une sensibilité accrue, dans la mesure où l'on dilue fortement l'échantillon lors de l'amplification d'enrichissement ; en effet, cette forte dilution permet
. d'être toujours en phase exponentielle de l'amplification uniquement pour les séquences cibles, c'est-à-dire lorsque la quantité Q de séquences cibles obtenues peut être reliée au facteur d'amplification x et au nombre des cycles n par la formule Q - Qo (1 + x)
d'avoir un rapport séquences cibles/séquences non spécifiques nettement supérieur å 1 dès le début de l'amplification de détection
de diminuer à la fois les réactions de compétition liées aux produits d'extension des acides nucléiques contaminants et aux composants présents dans le milieu biologique (débris cellulaires, protéines, biotine naturelle...) et les réactions de compétition qui se produisent pour la fixation sur le support du produit d'extension double brin obtenu lors de l'amplification de détection.
Le procédé conforme à l'invention est notamment applicable à la détection des maladies génétiques, des maladies infectieuses et des maladies tumorales tant humaines, animales que végétales ainsi qu'au typage cellulaire.
La présente invention a; en outre, pour objet, un coffret, kit ou ensemble coordonné, prêt à l'emploi, pour la mise en oeuvre du procédé conforme à l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend outre des quantités utiles de tampons et de réactifs appropriés pour la mise en oeuvre de ladite détection
- des doses appropriées d'au moins une première paire d'amorces appropriées, pour la réalisation de l'étape (a) dudit procédé
- des doses appropriées d'au moins une deuxième paire d'amorces appropriées, pour la réalisation de l'étape (c) dudit procédé ; et
- éventuellement des doses appropriées d'une sonde appropriée, pour la réalisation de l'étape (e) dudit procédé.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère å des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention.
I1 doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
Lors de l'hybrido-essai conforme à l'invention, le nombre de cycles au cours de l'amplification d'enrichissement, la dilution et le nombre de cycles au cours de l'amplification de détection dépendent de la séquence cible à amplifier et à détecter de la dilution et de la nature de l'échantillon.
L'amplification d'enrichissement peut com- prendre, à titre d'exemple non limitatif, entre 20 et 40 cycles, la dilution peut être comprise entre l/200è et 1/100 000è et l'amplification de détection peut comprendre de 3 à 15 cycles ; en ce cas! les concentrations en amorce, lors de l'amplification de détection sont dix fois plus faibles que celles de l'amplification d'enrichissement, tout en obtenant dans le produit final un taux d'incorporation très élevé d'amorce (environ 75 8).
Un autre exemple .de mise en oeuvre du procédé conforme à l'invention comprend deux séries d'amplification d'enrichissement qui peuvent, à titre d'exemple non limitatif, être envisagées comme suit
- lere amplification d'enrichissement (10-40 cycles), dilution l/200è ;
- 2ème amplification d'enrichissement à par tir de la solution obtenue .(10-40 cycles), dilution 1/1000è;
- amplification de détection (3-15 cycles).
Exemple 1: Détection du virus de papillome humain de type 16 (HPV 16) à l'aide du procédé conforme à l'invention. utilisant deux amorces simples (Asl et As2) pour 1'amplification d'enrichissement et une paire d'amorce Ad-Ac pour l'amplification de détection.
- Préparation du support
Les supports utilisés ici sont des tubes en polystyrène à ailettes recouverts dans un premier temps par de la sérum-albumine-bovine (BSA) liée à de la biotine puis, dans un second temps, par de l'avidine.
5 g de BSA-biotine dans 500 pl de tampon phosphate (0,05 M pH 7,3) sont incubés 2 heures a température ambiante dans les tubes à ailettes. Le liquide est vidé et remplacé par 500 l d'une solution d'avidine à 5 mg/ml dans le même tampon qu'on laisse incuber deux heures à température ambiante. Les sites libres du support sont ensuite bloqués par une solution à 20 g/ml d'ADN de sperme de hareng dénaturé et sonifié. Les tubes peuvent être conservés dans ce-milieu plusieurs semaines & +4 C.
- L'amplification d'enrichissement:
La solution d'ADN à tester est soumise à la première amplification dans un milieu contenant en un volume total de 50 sjl : 50 pmoles de chacune des deux amorces Asl et As2, 300 M de chacun des quatre désoxyribonucléosides triphosphates (c'est-à-dire dATP, dCTP, dGTP et dTTP) ( Boehringer Mannheim), 1,5 mM de MgCl2, 50 mM de KC1J 10 mM de Tris-HCl pH 8,9, 0,01 % (P/V) de gélatine et 2,5 unités de Taq DNA polymérase (Amersham).
Trente cycles d'amplification sont effectués grâce à un appareil automatique (un cycle correspondant à 90 s de dénaturation à 92 C, 90 s d'hybridation à 50'C et 120 s de polymérisation à 72 C).
- L'amplification de détection:
2 l de chaque échantillon préalablement am plifié dans un volume de 50 tal sont dilués dans 400 tal d'eau. 2 rl de cette solution (soit un 1/5000e de l'amplification d'enrichissement) sont ensuite soumis à l'amplification de détectionde 12 cycles en un volume total de 25 tal dans le milieu d'amplification précédemment décrit en présence des amorces modifiées : soit 5 pmole6 d'oligonucléotide biotinylé en 5' Ac3 et 5 pmoles d'oligonucléotide Ad4 marqué en 5' par du 32P,-l'activité spécifique de ladite sonde étant volontairement limitée à 50 000 cpm/pmole ; l'activité totale par échantillon est de 250 000 cpm environ.
La figure 1 montre le principe du procédé décrit dans l'exemple 1. La paire d'amorces de l'amplification d'enrichissement est représentée par les amorces simples Asi et As2 ; la paire d'amorces de l'amplification de détection est représentée par les amorces Ad4 marquées en 5' au 32P et l'amorce Ac3 biotinylée.
- Fixation sur tube et détection de l'ADN produit:
La totalité des 25 tal issue de l'amplification de détectionest transférée dans un tube recouvert d'avidine contenant 475 l de tampon de fixation, ST (NaCl 0,5 M, Tris-HCl 50 mM pH 9,5). La fixation se déroule en une heure à 50 C. Les tubes sont ensuite vidés et rincés par 1 ml de ST-Tween 20 al l, une fois 5 min à température ambiante, une fois 5 min à 50 C et une fois 5 min à 50 C par 1 ml de ST 0.1x-Tween 20 à 1 %.
La radioactivité fixée sur les tubes est ensuite comptée directement par effet Cerenkov. Les -résultats sont exprimés par le rapport "R" de l'activité fixée dans le tube sur l'activité totale de départ (soit 250 000 cpm environ).
Btude 2 : Etube cinétique de l'amplification de détection.
De l'ADN de cellules Caski contenant le génome viral d'HPV 16 (virus du papillome humain de type 16) et de l'ADN génomique humain utilisé en temps que témoin négatif ont été soumis à une amplification d'enrichissement puis de détection selon le protocole précédemment décrit dans l'exemple 1. Au cours de l'amplification de détection, une quantité aliquote a été prélevée tous les deux cycles. La détection en tube de l'ADN produit a été effectuée comme précédemment décrit.
Les résultats sont montrés dans le tableau I, ci-après
Figure img00170001
<tb> <SEP> Cycle <SEP> N <SEP> 0 <SEP> 2 <SEP> 4 <SEP> 6 <SEP> 8 <SEP> 10 <SEP> 12 <SEP> 14 <SEP> 16 <SEP> 18 <SEP> 20
<tb> cpm <SEP> Total <SEP> x103 <SEP> 200 <SEP> 177 <SEP> 189 <SEP> j <SEP> <SEP> 189 <SEP> 239 <SEP> 217 <SEP> 183 <SEP> 197 <SEP> 193 <SEP> 211 <SEP> 200 <SEP> i
<tb> cpm <SEP> tube <SEP> x103 <SEP> 0.8 <SEP> 1.1 <SEP> 2.8 <SEP> 7.4 <SEP> 28.1 <SEP> 53.9 <SEP> 67.4 <SEP> 79.4 <SEP> 81.7 <SEP> 85.5 <SEP> 80.5
<tb> R <SEP> = <SEP> T# <SEP> en <SEP> % <SEP> 0.4 <SEP> 0 <SEP> 6 <SEP> 1.4 <SEP> 3.9 <SEP> 11.7 <SEP> 24.8 <SEP> 37.7 <SEP> 40.2 <SEP> 42.2 <SEP> 40.4 <SEP> 40.1
<tb>
12 à 15 cycles d'amplification de détection suffisent. Le facteur x de l'expression (1+x)n correspondant au rendement de l'amplification a été estimé à 0,70 entre les cycles O et 10, comme le montre la figure 2, qui comporte en abscisse le nombre de cycles et en ordonnée R (R étant le rapport de l'activité fixée dans le tube sur l'activité totale de départ).
Exemple 3 : Détection du virus du papillome humain de type 16 (HPV 16) à l'aide du procédé conforme à l'invention utilisant deux amorces simples As1 et As2 pour l'amplification d'enrichissement, une paire AC3-AXO pour l'amplification de détection et une sonde #d5 pour la détection.
On procède comme dans l'exemple l ; la différence porte sur la paire d'amorces de l'amplification de détection et sur la détection.
L'oligonucléotide As4 n'est pas marqué est la révélation est assurée, après dénaturation de l'échantillon & 100'C, par une hybridation avec 0,1 pmole de sonde Ad5 (35-mer) marquée en 5' par du 32P.
L'activité spécifique de la sonde est forte (2,5.10' cpm/pmole) et l'activité totale par échantillon est de 250 000 cpm environ.
La sonde marquée Ad5 de révélation est ajou tée après transfert de la solution d'amplification de détection dans un tube recouvert d'avidine contenant 475 tal de tampon de fixation ST, comme précisé dans l'exemple t.
La figure 3 montre le principe du procédé décrit dans l'exemple 3. La paire d'amorces de l'amplification d'enrichissement est représentée par les amorces simples As1 et As2 ; la paire d'amorces de l'amplification de détection est représentée par l'amorce simple As4 et l'amorce de capture Ac3, biotinylée. La sonde de détection est représentée par la sonde Ad5 marquée au 3iP.
Exemple 4 : Mise en évidence de l'ADN d'HPV 16 dans des biopsies suspectes du col de l'utérus.
L'ADN des biopsies est extrait classiquement au phénol-chloroforme après lyse de la cellule et digestion des protéines (Maniatis et coll, Holecular cloning,
A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). Sur les 12 échantillons, 4 étaient fortement positifs (R > 25 %), 3 étaient positifs (R > 10 %) , les négatifs gardant un bruit de fond très bas (R < 1%) (R étant le rapport de l'activité fixée dans le tube sur l'activité totale de départ). Les valeurs issues de cette technique conforme à l'invention sont corrélées avec -les résultats obtenus par hybridation classique sur filtre, mais présentent, de manière inattendue, une sensibilité nettement supérieure.
Exemple 5 : Mise en évidence d'HPV 16 dans des écouvillonnages vaginaux.
Les écouvillonnages vaginaux sont simplement remis en suspension dans du PBS stérile puis centrifugés.
Le culot est repris par 200 sjl d'eau et porté à 100'C pendant 15 min. Le surnageant est récupéré et congelé à 20'C. Sur 8 échantillons traités selon le protocole précédemment décrit (exemple 1), un seul s'est révélé faiblement positif (R = 2.5 t), les autres ayant une activité comparable à celle des témoins négatifs (R C l b) ces résultats étant toujours corrélés avec ceux issus de la technique d'hybridation sur filtre.
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de sés modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention.

Claims (5)

    REVENDICATIONS -(2) une étape de détection des séquences cibles amplifiées, par (c) mise en contact d'une fraction de la solution d'amplification d'enrichissement obtenue en (b) avec au moins une paire d'amorces différente de celle de l'étape (a), l'une desdites amorces étant associée à un système de capture (Ac), et l'autre amorce étant choisie dans le groupe qui comprend les amorces simples (As) et les amorces associées à un système de détection (Ad), de manière à obtenir des produits double brin d'extension de la/les séquences cibles qui comportent une amorce de détection (Ad) ou une amorce simple (As) intégrée dans un brin et une amorce de capture (Ac) intégrée dans le brin complémentaire et permettant d'obtenir une solution d'amplification de détection (d) mise en contact de la solution d'amplification de détection avec un support approprié qui capte les fragments d'acides nucléiques porteurs de l'amorce de capture (Ac) intégrée ; (e) détection des copies d'acide nucléique cible double brin retenues sur ledit support, par tout moyen. approprié.
  1. (1) une étape d'enrichissement en séquence(s) cibles(s) par (a) mise en contact de l'échantillon biologique mis en solution avec au moins une paire d'amorces appropriées, pour amplifier au moins un fragment de ladite/lesdites séquences d'acide nucléique cible, lesdites amorces délimitant le fragment de la/les séquences cibles à détecter, s'hybridant à ladite/lesdites séquences cibles et permettant d'obtenir une solution d'amplificatiòn d'enrichissement ; et (b) au moins une dilution appropriée de la solution d'amplication d'enrichissement obtenue en (a)
    l-) Procédé de détection et d'identification en solution de faibles quantités d'acides nucléiques (sé- quence unique et/ou mélange de séquences d'acides nu cléiques) présentes dans un échantillon biologique, par amplification enzymatique et hybridation, caractérisé en ce qu'après une mise en solution appropriée de l'échantillon biologique pour extraire le/les acides nucléiques, ledit procédé comprend la détection d'une séquence d'acide nucléique ou d'un mélange de séquences à l'aide des étapes suivantes
  2. 2 ) Procédé selon la revendication 1, carac terse en ce que les étapes (a) et (b) sont répétées au moins une fois.
  3. 3 ) Procédé selon la revendication t ou la revendication 2, caractérisé en ce que la dilution de l'étape (b) est comprise entre 1/200è et 1/100 000è.
    As2), les paires amorce simple-amorce modifiée par un système de capture (Asl-Ac), les paires amorce simpleamorce modifiée par un système de détection (Asl-Ad).
  4. 4') Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les paires d'amorces de l'étape (a) sont choisies dans le groupe qui comprend les paires amorce simple-amorce simple (Asl-
  5. 5 ) Procédé selon l'une quelconque des revendications l à 4, caractérisé en ce que les paires d'amorces de l'étape (c) sont des paires : amorce modifiée par un système de capture-amorce modifiée par un système de détection (Ac-Ad), l'une desdites amorces pou vant présenter éventuellement une séquence identique celle de l'amorce Ac ou Ad de l'étape~ (a) selon le cas, l'autre amorce comprenant une séquence d'acide nucléique incluse entre les deux amorces de l'étape (a).
    C ) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 å 5, caractérisé en ce que lorsqu'une amorce de détection (Ad) est intégrée dans un brin d'acide nucléique cible, au cours de l'étape (c), la détection de l'étape (e) est réalisée à l'aide de ladite amorce de dé tection (Ad).
    7') Procédé selon l'une quelconque des revendications t b 5, caractérisé en ce que lorsqu'une amorce simple (Ae) est intégrée dans un brin au cours de l'étape (c), la détection de l'étape (e) est réalisée par hybridation des copies d'acide nucléique cible double brin retenues sur le support avec une sonde de détection appropriée.
    8') Application du procédé selon l'une quelconque des revendications l & 7, à la détection des maladies génétiques tànt humaines, animales que végétales.
    9 ) Application du procédé selon l'une quelconque des revendications i.a 7, à la détection des mala dies infectieuses tant humaines, animales que végétales.
    10' ) Application du procédé selon l'une quelconque des revendications l à 7, à la détection des mala dies tumorales tant humaines, animales que végétales.
    il') Application du procédé selon l'une quelconque des revendications t à 7, au typage cellulaire.
    - éventuellement des doses appropriées d'une sonde appropriée, pour la réalisation de l'étape (e) dudit procédé.
    - des doses appropriées d'au moins une deuxième paire d'amorces appropriées, pour la réalisation de l'étape (c) dudit procédé ; et
    - des doses appropriées d'au moins une première paire d'amorces appropriées. pour la réali6ation de l'étape (a) dudit procédé
    12') Coffret, kit ou ensemble coordonné, prêt à l'emploi, pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications t à 7, caractérisé en ce qu'il comprend outre des quantités utiles de tampons et de réactifs appropriés pour la mise en oeuvre de ladite détection
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