WO1993015222A1 - Procede pour eviter les risques de contamination, notamment applicable aux techniques d'amplification de l'adn ou de l'arn - Google Patents

Procede pour eviter les risques de contamination, notamment applicable aux techniques d'amplification de l'adn ou de l'arn Download PDF

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WO1993015222A1
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medium
tube
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Cyrille Feray
Christian Brechot
Valérie THIERS
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Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm)
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5021—Test tubes specially adapted for centrifugation purposes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Definitions

  • the present invention relates to a process making it possible to carry out at least two successive stages, in particular at least two successive reactions occurring in an aqueous medium, the product of the first reaction serving as a substrate for the following reaction, necessary for the molecular biology experience, and avoiding the risks of contamination.
  • the process according to the invention finds a particularly advantageous application in the technique of amplification of DNA sequences by PCR (polymerase Chain Reaction).
  • PCR is a very generally used technique to allow the detection of sequences very little represented in a biological sample.
  • One of the major drawbacks of this technique is the possibility of false positives due to contaminants. These are mostly made up of the PCR amplification products previously carried out. If one wishes to prevent the amplification products from contaminating subsequent reactions, one is obliged to physically separate the different stages of the reaction.
  • the proposed modification (Nested PCR) consists in carrying out two successive amplifications. One re-amplifies, for example, 1/50 of the first PCR using primers in an internal position relative to the primers of the first PCR. This results in a sensitivity close to 100%.
  • the specificity of the amplified sequence is total since four different hybridizations are necessary and this, on a small DNA sequence.
  • the size of the amplified fragments is known and compared with molecular weight markers. As amplification is visible from less than 5 initial targets, a simple reading of an agarose gel is sufficient. The use of a confirmation method by molecular hybridization proves, under these conditions, superfluous.
  • the present invention aims, among other objectives, to remedy the drawbacks presented by the DNA or RNA amplification techniques used hitherto, and in particular by the Nested PCR technique, by proposing a method making it possible, in particular, to '' carry out two successive amplifications in the same tube and without having to open it after the first amplification.
  • the present invention provides, in its most general aspect, a process which makes it possible to carry out at least two successive stages, in particular at least two successive reactions preferably occurring in an aqueous medium, necessary for a molecular biology experiment, the product of the first reaction serving as a substrate for the following reaction and which avoids the risks of contamination.
  • the tube in which the implementation of the process according to the invention is carried out can be constituted by an Eppendorf tube.
  • the medium (A) which is deposited at the bottom of the tube is covered with a mineral oil (for example "Heavy Ore Oil” from Sigma).
  • the medium (B) deposited directly on the oil forms an aqueous drop which spreads and joins the walls of the tube. This drop remains suspended in the oil and is separated from (A) by a thickness of oil. Centrifugation, for example at 5000 g, after carrying out the reaction in the medium (A) or (B), makes it possible to bring this drop to the bottom of the tube and to mix (A) and (B).
  • the drop (B) is created automatically.
  • the different oil-water interfaces resist shock, handling and temperature changes (95o-10oC).
  • a tube with a volume (A) of 50 ⁇ l and a volume (B) of 150 ⁇ l can keep its appearance at room temperature for several days.
  • the aqueous drops can also be loaded with glycerol (used in enzyme buffers).
  • a tube prepared by the process according to the present invention can be frozen.
  • the bubbles remain tight when thawing.
  • Several freeze-thaw changes in no way modify the device according to the invention.
  • the method according to the invention was implemented on an Eppendorf 500 ⁇ l non-silicone tube.
  • the volume of (B) so that the upper bubble is maintained must be at least 100 ⁇ l.
  • This tube can however be modified, so that the minimum volume of solution (B) is reduced to less than 50 ⁇ l, as will be indicated below.
  • FIG. 1a represents a tube prepared in accordance with the present invention, before centrifugation
  • FIG. 1b represents the same tube, after centrifugation
  • FIG. 2 represents a tube according to the invention, modified so as to reduce the volume of the drop (B),
  • FIG. 3 illustrates, in the application of the method according to the invention to the realization of a Nested PCR, the position of the primers.
  • FIG. 1b shows the same tube, after centrifugation. The drop B descended to the bottom of the tube and mixed with A.
  • the method according to the invention was implemented on an Eppendorf microtube of 500 ⁇ l non-silicone.
  • the prepared tube had the following characteristics:
  • the volume of drop A is generally between 20 and 75 ⁇ l and that of drop B between 100 and 200 ⁇ l.
  • the good behavior of the upper drop depends on the inside diameter of the tube. It is possible to reduce this diameter by introducing a ring into the tube, as shown in FIG. 2. Thus, if a ring is introduced into the tube meeting the above characteristics and if this ring decreases the internal diameter of the tube by 25%, a drop of 50 ⁇ l is then maintained indefinitely above the ring.
  • the process according to the invention is particularly suitable for carrying out reactions having an amplification product as substrate.
  • Nested PCR is carried out with primers amplifying sequences of the DNA of the hepatitis B virus.
  • the starting DNA is that extracted from a reference serum of a patient in which the viral sequences can be detected by a filtration-hybridization method (spot-test
  • the total volume (DNA + mix) is 50 ⁇ l.
  • the quantity of primers c and d is 5 pmoles.
  • the reaction medium (A) is covered with mineral oil and an upper compartment (B) is created, the volume of which is 150 ⁇ l.
  • the buffer and ⁇ dNTP concentrations are identical to the previous ones.
  • the amount of primers a and b is 80 pmol. However, this compartment does not contain the TAQ polymerase enzyme.
  • a 4-fold dilution of the amount of DNA already amplified is obtained.
  • the other parameters of the PCR are also equivalent. 35 cycles at 58 ° C. are then programmed during which the internal fragment will be preferably amplified due to the respective concentrations of the primers and the use of short elongation times (30 s).
  • the method using the method according to the invention shows a visible band on gel up to the 6th dilution (10) corresponding to ten initial copies (wells 2 to 8).
  • the presence of PCR inhibitor is observed on the extraction of undiluted serum.
  • the problem of contamination of Nested PCR is reduced to that of a PCR in a single step.
  • composition with conventional one-step PCR using primers c and d.
  • a PCR of 35 cycles is carried out (30 s at 94 ° C; 1 min at 58 ° C; 1 min at 74 ° C) using primers c and d in a volume of 50 ⁇ l and with 1 U of TAQ Pol Cetus on a 5 ⁇ l aliquot of the dilutions 0, -1 and -2 used previously.
  • a gain in sensitivity for the Nested PCR of 10 is obtained compared to the PCR in a single step.
  • a Nested PCR was carried out, using the method according to the invention and the primers cd '/ ab' on dilutions already tested with a Target DNA.
  • This DNA can only be amplified by internal primers.
  • the concentration of the enzyme is 2.5 U / 50 ⁇ l.
  • the amplification of the internal fragment can then be obtained from the internal primers.
  • the performance of the PCR carried out under these conditions is equivalent to that obtained with "fresh enzyme" and under usual conditions with a visible band until the dilution 10 -2 in both cases.
  • the method according to the invention can receive many other applications, in particular in the field of PCR or other techniques derived therefrom. As an indication, some of the possible applications of the process according to the invention have been summarized in the table below.
  • the mix is a PCR containing the TAQ pol enzyme, the primers, and the DNA to be analyzed.
  • the bubble A containing a hybridization buffer and a probe specific for the amplification product is mixed by centrifugation with the PCR made in B.
  • the different hybridization times adapted to the probe used are carried out in a
  • thermoa l-cycl er can accept the entire tube.
  • the hybridization product can then be deposited on a gel or even be filtered in the case of a spot.
  • oligonucleotide modifying spectroscopically in the event of hybridization.
  • Such an oligonucleotide could be used either as internal primers of a Nested PCR, or even as a hybridization probe.
  • a PCR is carried out without opening the tubes, which thereby makes it possible to resolve the problem of contamination.
  • lysis buffers are cell or serum lysis buffer using Proteinase K.
  • the buffer is a PCR mix with 2.5 U of the TAQ enzyme and the primers. After action of the sonication of the tube and of Proteinase K for 1 hour, inactivation of Proteinase K for 10 min at 95oC, a centrifugation is made followed by a PCR adapted to the primers used.
  • RT - Nested PCR Realization of RT - PCR in a single tube.
  • a buffer A compatible with reverse transcription (RT) and TAQ Polymerase an RT - PCR is carried out in one of the two buffers containing the RNA.
  • Solution B comprises primers internal to those used in A.
  • a Nested PCR is then prepared after centrifugation. In this way, RT - Nested PCR is carried out in a single tube.
  • a standard PCR is made in buffer B with the DNA to be analyzed.
  • buffer A a PCR is made with the mix used for the PCR carried out in B with enzyme, but without DNA and with primers internal to the previous ones. Centrifugation is done after PCR.
  • This contamination is either the entire target, or the amplification product used in the diagnosis, or even the small amplification product used as a control.
  • This control if positive, reflects contamination. This process is equivalent to a tube check.
  • the two initial amplification products have one of their terminal sequences in common and can themselves serve as primers for a PCR. These techniques are used to make constructs which are then subcloned and used for mutagenesis experiments or even to obtain longer fragments at the end of sequencing.
  • a Nested PCR using the method according to the invention would make it possible to add a very significant signal gain to the PCR in situ and thereby reduce the total number of cycles.
  • the amplification product is by definition a source of contamination, two possibilities can be chosen to eliminate these products.
  • the first consists in trying to specifically destroy the amplification products possibly present in the tube before starting the PCR reaction. This approach is based on the biochemical differences between the native target and the amplification products: size, protruding 5 ′ hydroxylated or “blunt” ends, special nucleotides incorporated into the PCR reactions.
  • the second is to make the amplification products inoperable by chemical treatment, after PCR, while being able to analyze the result of the reaction.
  • the present invention also extends to kits or kits for diagnostic or research purposes, which make use of the process according to the invention.

Abstract

Procédé permettant d'effectuer au moins deux réactions successives, le produit de la première réaction servant de substrat à la réaction suivante, en évitant les risques de contamination, notamment applicable aux techniques d'amplification de l'ADN ou de l'ARN. Le procédé permettant de réaliser au moins deux étapes successives nécessaires à une expérience de biologie moléculaire dans un même tube, type tube Eppendorf, consiste à: déposer dans le tube un volume du premier milieu réactionnel (A), recouvrir le milieu (A) d'une huile, déposer le second milieu réactionnel (B) directement sur une huile, mélanger, après la réalisation de la réaction dans le milieu (A) et/ou (B) les milieux (A) et (B), incuber dans le mix A + B obtenu une réaction avec pour substrat, les produits de la ou des réactions(s) précédente(s), les différentes opérations étant effectuées, sans que l'on ait à ouvrir ledit tube.

Description

PROCEDE POUR EVITER LES RISQUES DE CONTAMINATION, NOTAMMENT APPLICABLE AUX TECHNIQUES D'AMPLIFICATION DE L'ADN OU DE L'ARN
Procédé permettant d'effectuer au moins deux réactions successives, le produit de la première réaction servant de substrat à la réaction suivante, en évitant les risques de contamination, notamment applicable aux techniques d'amplification de l'ADN ou de l'ARN.
La présente invention concerne un procédé permettant d'effectuer au moins deux étapes successives, notamment au moins deux réactions successives se produisant dans un milieu aqueux, le produit de la première réaction servant de substrat à la réaction suivante, nécessaires à l'exécution d'une expérience de biologie moléculaire, et évitant les risques de contamination.
Le procédé conforme à l'invention trouve une application particulièrement avantageuse dans la technique d'amplification de séquences d'ADN par PCR (polymerase Chain Reaction).
La PCR est une technique très généralement utilisée pour permettre la détection de séquences très peu représentées dans un échantillon biologique. L'un des inconvénients majeurs de cette technique réside dans la possibilité de faux positifs dus à des contaminants. Ceux-ci sont constitués la plupart du temps par les produits d'amplification de PCR antérieurement effectuées. Si l'on veut éviter que les produits d'amplification contaminent les réactions ultérieures, on est obligé de séparer physiquement les différentes étapes de la réaction.
Le protocole utilisé pour éviter les contaminations en PCR est le suivant :
1) Extraction de l'ADN ou de l'ARN dans une pièce ne contenant pas de produits amplifiés (1ère pièce) ; utilisation d'un hôte à flux laminaire et de pipettes Pasteur en plastique à usage unique ;
2) Préparation des réactifs (aliquotés avant PCR) et du mix de réaction dans une pièce ne contenant pas d'autres ADN que les ol igonucléot ides de synthèse servant d'amorces (2ème pièce) ;
3) Mélange de l'ADN à tester avec le mix dans la 1ère pièce et mise en route de la PCR dans la 1ère pièce ;
4) Ouverture et exploitation des résultas dans un laboratoire d'hybridation (3ème pièce) ;
5) Utilisation de pipettes microman à déplacement mécanique positif pour déposer la solution d'ADN dans le tampon PCR.
Il faut supposer dans ce système que la troisième pièce ne puisse être une source de contamination pour les autres. Ceci se vérifie rarement dans les structures de recherche fondamentale ou de biologie médicale actuelles. Aussi, après cinq ans d'existence, la PCR demeure une technique relativement peu utilisée en biologie médicale ou dans tous les domaines où il est utile de pratiquer l'analyse d'un grand nombre d'échantillons.
Il a été proposé de modifier la technique PCR, afin d'améliorer la spécificité des séquences amplifiées. La modification proposée (Nested PCR) consiste à effectuer deux amplifications successives. On réamplifie, par exemple, 1/50 de la première PCR en utilisant des amorces en position interne par rapport aux amorces de la première PCR. Il en résulte une sensibilité proche de 100 %.
La spécificité de la séquence amplifiée est totale puisque quatre hybridations différentes sont nécessaires et ce, sur une petite séquence d'ADN. La taille des fragments amplifiés est connue et comparée à des marqueurs de poids moléculaires. Une amplification étant visible à partir de moins de 5 cibles initiales, une simple lecture d'un gel d'agarose suffit. L'utilisation d'une méthode de confirmation par hybridation moléculaire s'avère, dans ces conditions, superflue.
L'un des inconvénients majeurs de cette technique réside dans le problème des contaminations, car il faut obligatoirement ouvrir le tube dans lequel a été effectuée la première amplification pour réaliser la seconde amplification. La possibilité de contaminer la deuxième PCR par des produits d'amplification de la première PCR est donc importante. De fait, l'emploi de cette méthode reste limité. La seule possibilité pour ne pas contaminer est de réaliser la Nested PCR sur une série de dilutions connues, en débutant la seconde série de PCR par les plus faibles dilutions. Dans ces conditions, la sensibilité de la "Nested PCR" sur les faibles dilutions est telle que l'amplification de moins de 5 séquences cibles initiales peut être détectée sur gel d'agarose.
La présente invention vise, entre autres objectifs, à remédier aux inconvénients présentés par les techniques d'amplification d'ADN ou d'ARN utilisées jusqu'ici, et en particulier par la technique Nested PCR, en proposant un procédé permettant, notamment, d'effectuer deux amplifications successives dans un même tube et sans avoir à ouvrir celui-ci après la première amplification.
La présente invention propose, dans son aspect le plus général, un procédé qui permet de réaliser au moins deux étapes successives, notamment au moins deux réactions successives se produisant de préférence dans un milieu aqueux, nécessaires à une expérience de biologie moléculaire, le produit de la première réaction servant de substrat à la réaction suivante et qui évite les risques de contamination.
Le procédé conforme à l'invention est caractérisé en ce qu'il consiste successivement :
- à déposer dans un tube, type tube Eppendorf, un volume du premier milieu réactionnel (A),
- à recouvrir le milieu réactionnel (A) d'une huile, à déposer le second milieu réactionnel (B) directement sur cette huile,
- à mélanger, après la réalisation de la réaction dans le milieu (A) et/ou (B), les milieux (A) et (B),
- et éventuellement, à incuber dans le mix A + B obtenu une réaction avec pour substrat, les produits de la ou des réaction(s) précédente(s).
Le tube dans lequel est effectuée la mise en oeuvre du procédé conforme à l'invention, peut être constitué par un tube Eppendorf. Le milieu (A) que l'on dépose au fond du tube est recouvert d'une huile minérale (par exemple "Heavy Minerai Oil" de Sigma). Le milieu (B) déposé directement sur l'huile, forme une goutte aqueuse qui s'étale et rejoint les parois du tube. Cette goutte reste suspendue dans l'huile et est séparée de (A) par une épaisseur d'huile. Une centrifugation, par exemple à 5000 g, après la réalisation de la réaction dans le milieu (A) ou (B), permet de faire descendre cette goutte au fond du tube et de mélanger (A) et (B).
La goutte (B) se crée de façon automatique. Les différentes interfaces huile-eau résistent aux chocs, aux manipulations et aux changements de températures (95º-10ºC). A titre indicatif, un tube comportant un volume (A) de 50 μl et un volume (B) de 150 μl peut conserver à température ambiante son apparence pendant plusieurs jours. Les gouttes aqueuses peuvent être chargées également en glycérol (utilisé dans les tampons enzymatiques).
Un tube préparé par le procédé conforme à la présente invention peut être congelé. Les bulles demeurent étanches en se décongelant. Plusieurs congélations-décongélations ne modifient, en aucune fagon, le dispositif conforme à l'invention.
Pour s'assurer de la bonne étanchéité des deux compartiments, on a utilisé un bleu de dépôt dilué au 1/100 dans le compartiment supérieur (B).
A titre d'exemple, le procédé conforme à l'invention a été mis en oeuvre sur un tube Eppendorf de 500 μl non siliconé. Avec un tel tube, le volume de (B) pour que la bulle supérieure se maintienne doit être de 100 μl au minimum. Ce tube peut toutefois être modifié, afin que le volume minimal de la solution (B) soit abaissé à moins de 50 μl, comme il sera indiqué ci-après.
L'invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui suit, donné à titre non limitatif, se référant aux dessins ci-annexés, dans lesquels:
la figure la représente un tube préparé conformément à la présente invention, avant la centrifugation, et la figure 1b représente le même tube, après centrifugation,
la figure 2 représente un tube conforme à l'invention, modifié de manière à réduire le volume de la goutte (B),
la figure 3 illustre, dans l'application du procédé conforme à l'invention à la réalisation d'une Nested PCR, la position des amorces.
On a représenté, de façon schématique, sur la figure la un tube, type tube Eppendorf, préparé par le procédé conforme à l'invention, avant centrifugation. On a déposé au fond du tube le volume du premier milieu réactionnel (goutte A) puis on a recouvert la goutte A d'une huile minérale. On a déposé sur cette huile le second milieu réactionnel qui forme aussitôt une goutte aqueuse (goutte B) qui s'étale et reste suspendue dans l'huile. On a représenté sur la figure lb le même tube, après centrifugation. La goutte B est descendue au fond du tube et s'est mélangée à A.
Dans un exemple de réalisation le procédé conforme à l'invention a été mis en oeuvre sur un microtube Eppendorf de 500 μl non siliconé. Le tube préparé présentait les caractéristiques suivantes :
goutte A 50 μl
goutte B 100 μl huile minérale 300 μl
espace mort 50 μl
volume total 500 μl.
Avec un tel tube, le volume de la goutte A est généralement compris entre 20 et 75 μl et celui de la goutte B entre 100 et 200 μl.
La bonne tenue de la goutte supérieure dépend du diamètre intérieur du tube. Il est possible de réduire ce diamètre par introduction d'un anneau dans le tube, comme on l'a représenté sur la figure 2. C'est ainsi que si l'on introduit un anneau dans le tube répondant aux caractéristiques précitées et que si cet anneau diminue de 25 % le diamètre interne du tube, une goutte de 50 μl est alors maintenue indéfiniment au-dessus de l'anneau.
Le procédé conforme à l'invention est particulièrement adapté à la mise en oeuvre de réactions ayant pour substrat un produit d'amplification.
Il va être donné, ci-dessous, un exemple de mise en oeuvre du procédé conforme à l'invention, appliqué à la réalisation d'une Nested PCR.
Exemple :
On réalise deux différentes Nested PCR en utilisant les amorces, cd/ab et cd'/ab' (figure 3).
Matériel
La Nested PCR est effectuée avec des primers amplifiant des séquences de l'ADN du virus de l'hépatite B. L'ADN de départ est celui extrait d'un sérum de référence d'un patient dans lequel les séquences virales peuvent être détectées par une méthode de filtration-hybridation (spot-test
Méthode L'ADN à tester est mélangé à un mix de PCR contenant dNTPs (200 μM), un tampon PCR (MgCl2 = 1,5 mM), les amorces c et d et 2,5 Unités d'enzyme TAQ polymérase. Le volume total (ADN + mix) est de 50 μl. La quantité de primers c et d est de 5 pmoles. On recouvre le milieu réactionnel (A) d'huile minérale et on crée un compartiment supérieur (B) dont le volume est de 150 μl. Les concentrations de tampon et de dNTP γ sont identiques aux précédentes. La quantité d'amorces a et b est de 80 pmoles. Ce compartiment ne contient toutefois pas d'enzyme TAQ polymérase.
Réalisation de la PCR
Après 25 cycles dans un "thermal-Cycler" pendant lesquels la cible a été amplifiée grâce aux amorces c et d dans le compartiment (A), une centrifugation à 5000 g pendant 5 mn à 10°C provoque la fusion de (A) et de (B).
Une dilution d'un facteur 4 de la quantité d'ADN déjà amplifié est obtenue. Le rapport en concentration amorces internes/amorces externes dans la phase A+B est inférieur à celui proposé dans les différents protocoles de Nested PCR déjà publiés (80/5=16). Les autres paramètres de la PCR sont par ailleurs équivalents. 35 cycles à 58°C sont alors programmés pendant lesquels le fragment interne va être préfèrentiellement amplifié en raison des concentrations respectives des primers et de l'utilisation de temps d'élongation courts (30 s).
Résultats de la Nested PCR utilisant le procédé conforme à l'invention.
Le procédé utilisant le procédé conforme à l'invention, fait sur une série de 8 dilutions de 10 en 10, montre une bande visible sur gel jusqu'à la 6ème dilution (10 ) correspondant à une dizaine de copies initiales (puits 2 à 8). Il n'y a pas d ' amp l i f i cat i on dans la dilution suivante (9) contenant théoriquement soit une copie, soit zéro, ni dans le contrôle eau ne contenant pas d'ADN(10). on observe sur l'extraction de sérum non dilué la présence d'inhibiteur de la PCR.
Avec le procédé conforme à l'invention, le problème des contaminations de la Nested PCR est ramené à celui d'une PCR en une seule étape.
On peut procéder alors à une interprétation de l'aspect quantitatif des signaux. On observe une décroissance nette des signaux suivant les dilutions croissantes des cibles initiales. Une bande d'une taille de 210 bp est visible dans les faibles dilutions. Elle correspond à une amplification de l'amorce a et de l'amorce d. En effet, 4 produits différents peuvent théoriquement se former (c+d ; a+b ; c+b ; a+d) dans une Nested PCR. Dans cette réaction, l'apparition d'une ou plusieurs bandes dépend de la quantité initiale de cible et des temps d'élongation programmés. La probabilité de formation de ces produits d'amplification "parasites" est d'autant plus grande que la quantité initiale de cible est importante.
Composition avec une PCR conventionnelle en une seule étape utilisant les amorces c et d.
On effectue une PCR de 35 cycles (30 s à 94°C ; 1 mn à 58ºC ; 1 mn à 74°C) en utilisant les amorces c et d dans un volume de 50 μl et avec 1 U de TAQ Pol Cetus sur un aliquote de 5 μl des dilutions 0,-1 et -2 utilisées précédemment. On obtient un gain de sensibilité pour la Nested PCR de 10 par rapport à la PCR en une seule étape.
Résultats de la Nested PCR conventionnelle.
On a réalisé une Nested PCR sur le même matériel avec des amorces différentes (c, a, b' et d'), mais en utilisant la procédure classique. On a ouvert, entre les deux PCR, les tubes de la première PCR par ordre décroissant de dilution (de 0 à 8). On constate que, malgré l'utilisation du protocole anti-contamination et de pipettes à déplacement positif, la deuxième PCR a été contaminée par la première.
On retrouve la présence d'une bande minoritaire à 340 correspondant à l'amplification a-d' pour les mêmes faibles dilutions (0,-1, -2 et -3).
L'activité de la TAQ polymérase Cetus après 25 cycles d'amplification (durée à 94ºC = 17 mn 30).
Afin d'estimer l'activité de la TAQ polymérase au début de la seconde amplification, on a effectué une Nested PCR, en utilisant le procédé conforme à l'invention et les amorces cd'/ab' sur des dilutions déjà testées d'un ADN cible. Cet ADN ne peut être amplifié que par les amorces internes. Avant la première PCR, la concentration de l'enzyme est de 2,5 U/50 μl. Après centrifugation, l'amplification du fragment interne peut alors être obtenue à partir des amorces internes. Les performances de la PCR faite dans ces conditions sont équivalentes à celles obtenues avec de "l'enzyme fraîche" et dans des conditions habituelles avec une bande visible jusqu'à la dilution 10 -2 dans les deux cas.
Mise en évidence de l'imperméabilité réciproque des deux tampons A et B.
Pour que .le procédé conforme à l'invention puisse être mis utilement en oeuvre, il est essentiel que les deux compartiments soient mutuellement étanσhes.
Pour s'assurer de la bonne étanchéité des deux compartiments (A) et (B), il ne peut être fait appel à l'utilisation des colorants qui est une technque trop imprécise. On a donc procédé de la manière qui suit. On a placé en (B) une dilutioin de témoin positif pour l'amplification HIV et en (A) un tampon PCR comportant les amorces pol3 et la TAQ polymérase. Après PCR et 24 heures d'autoradiographie, il n'est pas noté d'amplification pol3 dans le tube.
Le procédé conforme à l'invention peut recevoir de nombreuses autres applications, en particulier dans le domaine de la PCR ou d'autres techniques dérivées de celle-ci. A titre indicatif, on a résumé dans le Tableau, ci-après, quelques-unes des applications possibles du procédé conforme à l'invention.
Parmi ces applications, on peut citer plus particulièrement :
PCR et hybridation par une sonde en une étape.
Le mix est une PCR contenant l'enzyme TAQ pol, les amorces, et l'ADN à analyser. Après PCR, la bulle A contenant un tampon d'hybridation et une sonde spécifique du produit d'amplification est mélangée par centrifugation à la PCR faite en B. Les différents temps d'hybridation adaptés à la sonde utilisée sont réalisés dans un
" therma l-cycl er " pouvant accepter le tube dans son entier. Le produit d'hybridation peut être alors déposé sur un gel ou encore être filtré dans le cas d'un spot.
Il est également possible d'envisager l'utilisation d'un ol igonucléotide se modifiant spectroscopiquement en cas d'hybridation. Un tel ol igonucléotide pourrait être utilisé, soit comme amorces internes d'une Nested PCR, soit encore comme sonde d'hybridation. En recourant à un système qui permet d'analyser l'hybridation à travers le tube, on réalise une PCR sans ouverture des tubes, ce qui permet par là-même de régler le problème des contaminations.
Analyse PCR directe sur prélèvement biologique. On a proposé des techniques d'extraction rapide de l'ADN ou de l'ARN sérique ou cellulaire mettant en oeuvre des "tampons de lyse". Ceux-ci permettent d'éviter une extraction conventionnelle par phénol-chloroforme et de traiter le prélèvement afin qu'il puisse être directement amplifiable. Ces techniques utilisent une enzyme protéolytique et un détergent compatible avec la PCR (NP40, Triton). On peut également avoir recours, à la place du détergent, à des procédures physiques (chauffage, sonication). Le tampon A est un tampon de lyse cellulaire ou sérique utilisant de la Protéinase K. Le tampon est un mix de PCR avec 2,5 U de l'enzyme TAQ et les amorces. Après action de la sonication du tube et de la Protéinase K pendant 1 heure, inactivation de la Protéinase K pendant 10 mn à 95ºC, une centrifugation est faite suivie d'une PCR adaptée aux amorces utilisées.
Réalisation d'une RT - PCR dans un seul tube. En utilisant un tampon A compatible avec la reverse transcription (RT) et la TAQ Polymérase, on réalise une RT - PCR dans l'un des deux tampons contenant l'ARN. La solution B comprend des amorces internes à celles utilisés en A. Une Nested PCR est alors préparée après centrifugation. On réalise, de la sorte, une RT - Nested PCR dans un seul tube.
Réalisation de deux PCR simultanées.
Contrôle interne de contami nation .
Une PCR standard est faite dans le tampon B avec l'ADN à analyser. Dans le tampon A, une PCR est faite avec le mix utilisé pour la PCR réalisée en B avec enzyme, mais sans ADN et avec des amorces internes aux précédentes. La centrifugation est faite après PCR. Ainsi, si une amplification de petite taille apparaît, elle reflète une contamination survenue dans le mix ou le tube. Cette contamination est, soit la cible entière, soit le produit d'amplification utilisé dans le diagnostic, soit encore le produit d'amplification de petite taille servant de contrôle. Ce contrôle, s'il est positif, reflète une contamination. Ce procédé équivaut à un contrôle par tube.
Ligation par PCR.
Différents procédés pour synthétiser un produit d'amplification à partir de deux autres produits d'amplification ont été décrits. Les deux produits d'amplification initiaux ont une de leurs séquences terminales commune et peuvent servir eux-mêmes d'amorces pour une PCR. Ces techniques sont utilisées pour fabriquer des constructions qui ensuite sont sous-clonées et servent à des expériences de mutagénèse ou bien encore pour obtenir des fragments plus longs à fin de séquençage.
PCR in situ.
Il s'agit d'une technique récemment développée, publiée en juillet 1990 dans "Amplification and détection of lentiviral DNA inside cells, Haase H. T. et al., Proc. Nat. Acad. Sci., July 1990, No. 87 ; 13 ; 4971-4975". Dans un premier temps, des cellules sont traitées par formaldéhyde. Rendues ainsi perméables aux différents réactifs de PCR, une réaction de PCR in situ est alors réalisée en utilisant 2 couples d'amorces cible spécifiques tels qu'ils sont représentés sur la figure 3. Ce choix d'amorces permet la ligation par PCR des différents brins dont l'élongation est inachevée dans les conditions intra-cellulaires (interaction protéines-ADN). Les cellules sont ensuite analysées en hybridation in situ. Le rendement de cette PCR in situ est estimé à 12 % par cycle, soit une méthode 100 fois plus sensible que l'hybridation in situ.
Une Nested PCR utilisant le procédé conforme à l'invention permettrait d'ajouter un gain de signal très important à la PCR in situ et par là-même de diminuer le nombre total de cycles.
Procédés de décontamination.
Le produit d'amplification étant par définition source de contamination, deux possibilités peuvent être retenues pour éliminer ces produits. La première consiste à essayer de détruire spécifiquement les produits d'amplification éventuellement présents dans le tube avant de débuter la réaction de PCR. Cette approche repose sur les différences biochimiques entre la cible native et les produits d'amplification : taille, extrémités 5' hydroxylées protudantes ou "blunt", nucléotides spéciaux incorporés dans les réaction de PCR. La seconde est de rendre inampl ifiables les produits d'amplification par un traitement chimique, après PCR, tout en pouvant analyser le résultat de la réaction.
Dans les deux cas, que la décontamination soit effectuée par destruction spécifique des produits d! amplification avant PCR, soit par inactivation des produits d'amplification après PCR, on aura avantageusement recours au procédé conforme à la présente invention.
La présente invention s'étend également aux kits ou nécessaires à des fins diagnostiques ou de recherche, qui font utilisation du procédé conforme à l'invention.
Celui-ci permet de réaliser des kits "intégrés" dans lesquels deux étapes successives peuvent être réalisées dans un même tube (cf. Tableau).
Le procédé conforme à l'invention, notamment appliqué aux techniques d'amplification de l'ADN ou de l'ARN, présente de nombreux avantages. Il permet, en particulier :
- de raccourcir les temps opératoires nécessaires à l'exploitation par PCR d'un prélèvement biologique, en réduisant les manipulations,
- d'abaisser le coût des analyses, en réduisant le nombre de tubes nécessaires à l'exécution de ces analyses,
- de régler, lorsqu'il est appliqué à la Nested PCR, le problème des contaminations dues aux produits d'ampl ification.
Figure imgf000018_0001

Claims

REVENDICATIONS..
1. Procédé permettant de réaliser au moins deux étapes successives, notamment au moins deux réactions successives se produisant en milieu aqueux, nécessaires à une expérience de biologie moléculaire, le produit de la première réaction servant de substrat à la réaction suivante, dans un même tube, type tube Eppendorf, caractérisé en ce qu'il consiste :
- à déposer dans le tube un volume du premier milieu réactionnel (A)
- à recouvrir le milieu (A) d'une huile,
- à déposer le second milieu réactionnel (B)
directement sur une huile,
- à mélanger, après la réalisation de la réaction dans le milieu (A) et/ou (B) les milieux (A) et (B),
- à incuber dans le mix A + B obtenu une réaction avec pour substrat, les produits de la ou des réaction(s) précédente(s),
les différentes opérations étant effectuées, sans que l'on ait à ouvrir ledit tube.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on dépose au fond du tube le premier milieu réactionnel sous la forme d'une goutte (A), en ce que l'on recouvre la goutte (A) d'une huile minérale, en ce que l'on dépose sur ladite huile le second milieu réactionnel (B), celui-ci formant une goutte aqueuse (B) séparée de (A) par une épaisseur d'huile, et en ce que, après réaction dans (A) et/ou (B), on fait descendre la goutte (A) au fond du tube, notamment par centrifugation, réalisant ainsi le mélange de (A) et (B).
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, appliqué à la réalisation d'une Nested PCR, caractérisé en ce que le milieu (A) comporte l'ADN à tester, des nucléosides triphosphates, un tampon PCR, un enzyme de polymérisation et une paire d'amorces externes, en ce que le milieu (B) comporte un tampon PCR, des nucléosides triphosphates et une paire d'amorces internes, en ce que l'on mélange, après une première amplification réalisée en (A), les milieux (A) et (B) et en ce que l'on réalise sur le mix A + B une seconde amplification.
4. Procédé selon la revendication 1, appliqué à la réalisation en une seule étape d'une PCR et d'une hybridation par une sonde, caractérisé en ce que le milieu (B) comporte l'ADN à tester, une paire d'amorces et une enzyme de polymérisation tandis que (A) comporte un tampon d'hybridation et une sonde spécifique au produit d'amplification, en ce que, après réalisation de la PCR en (B), on mélange (A) et (B) et en ce que l'on analyse les résultats de l'hybridation.
5. Procédé selon la revendication 1, appliqué à une PCR effectuée directement sur un prélèvement biologique, caractérisé en ce que le milieu (A) est constitué par un tampon de lyse cellulaire ou sérique utilisant une enzyme protéolytique, en ce que le milieu (B) est un mix de PCR contenant une enzyme de polymérisation et une paire d'amorces et en ce que, après inactivation de l'enzyme, on mélange (A) et (B) et on effectue une PCR.
6. Tube, type tube Eppendorf, caractérisé en ce qu'il est obtenu selon le procédé défini dans l'une des revendications 1 et 2.
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