CN112359146A - 一种用于快速检测乙型肝炎病毒基因的试剂盒及其检测方法 - Google Patents

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陈超
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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

本发明属临床医学诊断领域，涉及乙型病毒性肝炎的诊断，以及感染病学、分子生物学和细胞生物学等领域。更具体地，本发明涉及血液中乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)基因的核酸扩增检测方法，提供了一种用于快速检测乙型肝炎病毒基因的试剂盒及其检测方法。本申请RPA与CRISPR/Cas13a的基因编辑系统相结合，可以便携、快速、精确地检测乙型肝炎病毒，具有很好的灵敏度和特异性。

Description

一种用于快速检测乙型肝炎病毒基因的试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明属临床医学诊断领域，涉及乙型病毒性肝炎的诊断，以及感染病学、分子生物学和细胞生物学等领域。更具体地，本发明涉及血液中乙型肝炎病毒(Hepatitis Bvirus，HBV)基因的核酸扩增检测方法，提供了一种用于快速检测乙型肝炎病毒基因的试剂盒及其检测方法。
背景技术
乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染引起的以肝脏病变为主的一种传染病。临床上以肝功能损害、食欲减退、恶心、上腹部不适、肝区痛、乏力为主要表现，部分患者可有黄疸发热。部分乙肝患者可慢性化，甚至发展成肝硬化，少数可发展为肝癌。主要通过血和血制品、母婴传播及性接触传播。
HBV属嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)正嗜肝DNA病毒属(OrthoHepadnavirus)。HBV感染者血清中电镜下可见3种不同形态的颗粒。第一种为直径22nm的小球形空心颗粒，第二种为22nmx40-100nm的管状颗粒。这两种颗粒均为包膜成分，不含病毒的核酸。第三种为直径42nm的球形颗粒，称Dane颗粒，由包膜、核壳和核心组成。包膜由HBsAg组成；核壳由乙型肝炎核心抗原(HBcAg)组成；核心内有部分环状双链DNA和DNA聚合酶。
HBV基因组为部分环状双链DNA，由正链和负链组成，负链为长链。呈闭合型的环状DNA，全长约3200个核苷酸。正链为短链，呈半闭合型的环状DNA，全长为负链的50％-75％。
目前，常用HBV-DNA检测方法主要是荧光定量PCR法。荧光定量PCR法是一种集PCR技术、荧光信号检测和数据分析于一体的核酸定量检测技术。荧光定量PCR使用了特异性探针，能够对靶序列进行特异性的识别，具有引物探针双重控制，且综合了荧光标记技术、激光检测技术、数码显像技术，具有高特异性、高灵敏性，高准确性及低假阳性率等特点。其中热循环模块和荧光检测模块是荧光定量PCR不可缺少的组成部分，因此荧光定量PCR往往需要昂贵笨重的特殊仪器。这使得荧光定量PCR不适合在非实验室环境中使用。
重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase polymerase amplification，RPA)技术是一种可应用于低温(37℃左右)的等温扩增技术，反应体系包括能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、具有链置换活性的DNA聚合酶、DNA单链结合蛋白(single strand DNA-binding protein，SSB)和Mg2+等，利用引物-重组酶复合物扫描DNA链，进而促进DNA链上对应同源位点的识别、结合、互换，通过DNA聚合酶和SSB共同作用合成互补新链，随着反应的进行，扩增产物以指数状态增长。RPA可作为一种便携、快速、性价比高的检测工具，实现实验室外的现场精确检测。
发明内容
本发明提供了一种灵敏度和特异性更强的检测乙型肝炎病毒的试剂盒及其检测方法。
本发明提供用于快速检测乙型肝炎病毒的引物，所述引物为重组酶聚合酶扩增DNA引物：
引物1-5′-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTGGTTCTTCTG-3′
引物2-5′-TCCCGTGCTGGTTGTTGAGGATCCTGGAATTAGAG-3′。
所述引物用于制备快速检测乙型肝炎病毒的试剂盒的应用。
用于快速检测乙型肝炎病毒的试剂盒，包括：重组酶聚合酶扩增体系和Cas13反应体系；所述重组酶聚合酶扩增体系包括TwistAmp液态重组酶聚合酶扩增试剂盒和重组酶聚合酶扩增DNA引物：
引物1-5′-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTGGTTCTT-CTG-3′
引物2-5′-TCCCGTGCTGGTTGTTGAGGATCCTGGAATTAGAG-3′
所述Cas13反应体系包括重组CRISPR-Cas13a蛋白、单链引导RNA和单链RNA探针。
单链引导RNA：
5′-ACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACGACAAACGGGCAACAUACCUUGAUAGUC-3′
单链RNA探针：
5′-FAM-TUUUUUC-BHQ-1-3′。
具体的，
所述重组酶聚合酶扩增体系包括：
Figure BDA0002809482440000021
所述Cas13反应体系包括：
Figure BDA0002809482440000031
试剂盒检测乙型肝炎病毒基因的方法，包括如下步骤：
1)重组酶聚合酶扩增
(1)取HBV阳性对照稀释成3x105拷贝/μl，3x104拷贝/μl，3x103拷贝/μl，3x102拷贝/μl，3x10拷贝/μl，取1μl加入以下反应体系：
Figure BDA0002809482440000032
(2)加入1.25μl的20x核心反应混合液，混匀离心；
(3)加入1μl模板(不同稀释度的质粒模板和阴性对照)；
(4)在管盖上加入1.25μl乙酸镁(MgOAc，280mM)；
(5)颠倒混匀，离心后39度孵育20min。
2)用Cas13蛋白检测HBV
(1)取上述1ul反应产物加入Cas13反应体系，加入384孔透明圆底酶标板充分混合。设3个复孔：
Figure BDA0002809482440000033
Figure BDA0002809482440000041
(2)反应时间30min。
(3)检测：用多功能酶标仪检测仪，检测480nm激发光520nm发射波长的荧光强度。
本申请RPA与CRISPR/Cas13a的基因编辑系统相结合，可以便携、快速、精确地检测乙型肝炎病毒，具有很好的灵敏度和特异性。
附图说明
图1实施例1随时间荧光强度变化曲线。
图2实施例1加入模板浓度对荧光强度的影响。
具体实施方式
(一)材料
(1)重组酶聚合酶扩增DNA引物：
引物1-5′-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTGGTTCTTCTG-3′
引物2-5′-TCCCGTGCTGGTTGTTGAGGATCCTGGAATTAGAG-3′
上述引物均于上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
(2)单链引导RNA：
5′-ACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACGACAAACGGGCAACAUACCUUGAUAGUC-3′,于上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
(3)单链RNA探针：5′-FAM-TUUUUUC-BHQ-1-3′，
于上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
(4)TwistAmp液态重组酶聚合酶扩增试剂盒，包含20x核心反应混合液、2倍反应缓冲液、280mM乙酸镁(MgOAc)、10x电子混合液，购于TwistDx公司。
(5)Trizma盐酸缓冲液-400mM Tris pH 7.4(Sigma Aldrich)。
(6)重组CRISPR-Cas13a蛋白，购于上海惠诚生物科技有限公司。
(7)RNase酶抑制剂,购于上海碧云天生物技术有限公司。
(8)NxGen T7RNA聚合酶，购于Lucigen公司。
(9)10mM NTP混合液，购于上海生工生物工程技术服务有限公司。
(10)氯化镁溶液(120mM)，用六合氯化镁加ddH2O配成。
(二)方法：
1.重组酶聚合酶扩增
(1)取HBV阳性对照稀释成3x105拷贝/μl，3x104拷贝/μl，3x103拷贝/μl，3x102拷贝/μl，3x10拷贝/μl，取1μl加入以下反应体系：
Figure BDA0002809482440000051
(2)加入1.25μl的20x核心反应混合液，混匀离心；
(3)加入1μl模板(不同稀释度的质粒模板和阴性对照)；
(4)在管盖上加入1.25μl乙酸镁(MgOAc，280mM)；
(5)颠倒混匀，离心后39度孵育20min。
2.用Cas13蛋白检测HBV
(1)取上述1ul反应产物加入Cas13反应体系，加入384孔透明圆底酶标板充分混合。设3个复孔：
Figure BDA0002809482440000052
Figure BDA0002809482440000061
(2)反应时间30min。
(3)检测：用多功能酶标仪检测仪，检测480nm激发光520nm发射波长的荧光强度。
(三)结果
随着加入模板样本浓度的下降，孔内荧光强度逐渐下降，到30分钟时实验组相对于阴性组差异达到较为显著的程度(见图1)。重复进行实验共计3次，统计30分钟时各浓度梯度的荧光强度，可见样本浓度为30拷贝/μl时与对照组仍有明显差异。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 一种用于快速检测乙型肝炎病毒基因的试剂盒及其检测方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaaattaata cgactcacta taggggctgc tatgcctcat cttcttgttg gttcttctg 59
<210> 2
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcccgtgctg gttgttgagg atcctggaat tagag 35
<210> 3
<211> 57
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg acaaacgggc aacauaccuu gauaguc 57
<210> 4
<211> 6
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
uuuuuc 6

Claims (6)

1.用于快速检测乙型肝炎病毒的引物，所述引物为重组酶聚合酶扩增DNA引物：
引物1-5′-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTGGTTCTTCTG-3′
引物2-5′-TCCCGTGCTGGTTGTTGAGGATCCTGGAATTAGAG-3′。
2.权利要求1所述引物用于制备快速检测乙型肝炎病毒的试剂盒的应用。
3.一种用于快速检测乙型肝炎病毒的试剂盒，包括：重组酶聚合酶扩增体系和Cas13反应体系；
所述重组酶聚合酶扩增体系包括TwistAmp液态重组酶聚合酶扩增试剂盒和重组酶聚合酶扩增DNA引物：
引物1-5′-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTGGTTCTTCTG-3′
引物2-5′-TCCCGTGCTGGTTGTTGAGGATCCTGGAATTAGAG-3′
所述Cas13反应体系包括重组CRISPR-Cas13a蛋白、单链引导RNA和单链RNA探针
单链引导RNA：
5′-ACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACGACAAACGGGCAACAUACCUUGAUAGUC-3′
单链RNA探针：
5′-FAM-TUUUUUC-BHQ-1-3′。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述重组酶聚合酶扩增体系包括：
Figure FDA0002809482430000011
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述Cas13反应体系包括：
Figure FDA0002809482430000012
Figure FDA0002809482430000021
。
6.权利要求3-5任一所述试剂盒检测乙型肝炎病毒基因的方法，包括如下步骤：
1)重组酶聚合酶扩增
(1)取HBV阳性对照稀释成3x105拷贝/μl，3x104拷贝/μl，3x103拷贝/μl，3x102拷贝/μl，3x10拷贝/μl，取1μl加入以下反应体系：
Figure FDA0002809482430000022
(2)加入1.25μl的20x核心反应混合液，混匀离心；
(3)加入1μl模板(不同稀释度的质粒模板和阴性对照)；
(4)在管盖上加入1.25μl乙酸镁(MgOAc，280mM)；
(5)颠倒混匀，离心后39度孵育20min。
2)用Cas13蛋白检测HBV
(1)取上述1ul反应产物加入Cas13反应体系，加入384孔透明圆底酶标板充分混合；设3个复孔：
Figure FDA0002809482430000023
Figure FDA0002809482430000031
(2)反应时间30min；
(3)检测：用多功能酶标仪检测仪，检测480nm激发光520nm发射波长的荧光强度。
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