CN107604096B - 一种用于乙型肝炎病毒检测的核酸序列及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于检测乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)的核酸序列及试剂盒，属于分子诊断技术领域。本发明提供的检测HBV的引物及探针能特异地扩增并检测A‑I 9个HBV基因型的病毒DNA。本发明还公开了用于检测乙型肝炎病毒的试剂盒，能实现快速、灵敏、准确的检测HBV病毒各种亚型的准确拷贝数。本发明具有操作简便、特异性强、敏感性高、成本低廉及高通量等优点，可用于临床HBV病毒DNA的快速超敏检测，为临床慢性乙型肝炎(Chronic Hepatitis B,CHB)的诊断和治疗提供参考依据。

Description

一种用于乙型肝炎病毒检测的核酸序列及试剂盒

技术领域

本发明属于分子诊断技术领域，具体涉及一种用于乙型肝炎病毒检测的核酸序列及试剂盒。

背景技术

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，简称乙肝病毒或HBV)是一种DNA病毒，属于嗜肝DNA病毒科(hepadnaviridae)。根据目前所知，HBV就只对人和猩猩有易感性，引发乙型病毒性肝炎疾病。慢性乙型肝炎(Chronic Hepatitis B,CHB)是由于HBV在人肝细胞中慢性感染所致的一种肝脏炎症疾病，并可引起多器官损害的一种疾病。主要侵犯儿童及青壮年，其持续进展可导致肝硬化、肝功能衰竭及肝癌。CHB广泛流行于世界各国，据估计，全球有超过2.4亿人慢性感染乙型肝炎(乙肝表面抗原阳性持续至少6个月)。每年有超过68.6万人死于乙型肝炎并发症，包括肝硬化和肝癌。乙型肝炎是影响卫生工作者的一大职业危害。因此，它已成为严重威胁人类健康的世界性疾病，也是我国当前流行最为广泛、危害性最严重的一种疾病。乙型病毒性肝炎无一定的流行期，一年四季均可发病，但多属散发。近年来乙肝发病率呈明显增高的趋势。中国HBV感染人数超过7亿，其中有约1.2亿携带者，超过2000万慢性感染者，且每年新增HBV感染人数约50万，是世界上HBV感染率最高的国家之一。

目前对于CHB患者最主要的治疗措施是抗病毒治疗，目前应用最广泛的一类药物是核苷(酸)类似物(包括拉米夫定、阿德福韦酯、替比夫定、恩替卡韦、替诺福韦酯等)，以及干扰素等其他药物。而抗病毒治疗的疗效监测及诊疗方案的修订则需要对患者血清中的HBV病毒载量进行检测，也就是准确定量患者血中HBV DNA的拷贝数。在国内外CHB治疗指南中均指出，无论是采用何种抗HBV治疗方案，均需要采用HBV DNA定量检测试剂及方法对抗HBV疗效进行评估，将CHB患者外周血中的HBV DNA控制在现有检测手段检测不到的水平。HBV DNA定量检测试剂是指利用包括实时荧光聚合酶链反应(polymerase chainreaction，PCR)或其他的分子生物学方法在内的核酸检测技术，以HBV基因序列为检测靶标，对人血清、血浆及其他人体样本中的HBV DNA进行体外定量检测的试剂。结合临床表现和其他实验室指标，可作为乙型肝炎辅助诊断的指标之一，还可通过对血液中HBV DNA浓度的检测可用于HBV感染的辅助诊断、治疗适应症的选择及抗病毒疗效的判断。目前，国内外进行HBV DNA定量检测采用的最常见也是最主流的方法均为实时荧光定量PCR方法。中国CFDA于2013发布的《乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸定量检测试剂注册技术审查指导原则》中建议HBV DNA定量检测试剂的最低检出限应不高于30IU/mL。美国肝病协会指出，在抗HBV治疗中，HBV DNA定量水平应尽可能小于或等于10IU/mL，欧洲肝病研究协会则指出，将HBVDNA定量水平控制在10-15IU/mL可有效防止疾病复发。超敏检测HBV DNA有助于随时监测低病毒复制HBV患者的诊断和抗病毒治疗效果的监测。

但是，目前临床常用的HBV DNA定量试剂盒的灵敏度绝大部分都在500-1000IU/mL(约2800-5600拷贝/mL)左右，在检出限附近及以下的检测灵敏度和稳定性均欠佳，已无法满足临床最新的诊疗(30IU/mL以下)需求。此外，现在的荧光定量方法都是采用人工标准品进行相对定量，无法准确定量HBV的准确拷贝数，做到绝对定量，特别是极低拷贝的病毒载量难以检出，每次检测均需做标准曲线，操作难度也较大，重现性较差；其次，但HBV病毒自发突变率较高，因此不断有新增亚型出现。中国国内近年流行病学调查显示，我国HBV感染患者主要是A-D型，但随着全球各地人们的流动越来越频繁和HBV患者人群的不断扩大，目前全球已发现有9个基因型(A～I)，每个基因型又可分为不同亚型，且存在基因型之间的重组现象。现有的定量试剂设计的引物探针往往基于几年前的HBV感染型别及序列信息，无法满足新出现亚型的检测需求，导致检测灵敏度下降，稳定性欠佳，性能指标达不到临床诊断和治疗的要求。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，提供一种操作简便、结果准确、成本低廉、超敏(检出限低至5IU/mL)和高通量的一种用于乙型肝炎病毒检测的核酸序列及试剂盒，满足临床CHB抗病毒诊疗需求。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：一种用于乙型肝炎病毒检测的核酸序列，包括用于特异检测A-I 9个基因型的HBV病毒DNA的两重引物和探针，具体包括如下：

(1)扩增HBV病毒各基因型的引物序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1～4所示；

(2)扩增HBV病毒各基因型的探针序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；

(3)扩增人内参基因ERG基因的引物序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：6～7所示；

(4)扩增人内参基因ERG基因的探针序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；

其中，HBV探针SEQ ID NO：5序列的5’端标记FAM荧光基团，3’端标记MGB淬灭基团，人ERG基因探针SEQ ID NO：8序列的5’端标记VIC荧光基团，3’端标记MGB淬灭基团，上述8条核酸序列在一次检测中共同使用。

本发明还包括以下技术方案：一种用于乙型肝炎病毒检测的试剂盒，该试剂盒包括如下试剂：

(1)2*supermix：该PCR反应液中含有DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液、dATP、dCTP、dTTP和dGTP等；

(2)引物探针预混合液：将SEQ ID NO：1～8所示的引物及探针各自用双蒸水溶解，每条引物的浓度为100μM，每条探针的浓度为10μM；1～8各核酸序列的母液以9:9:9:9:25:9:9:25的比例混合。

(3)阳性对照：含有HBV C基因型质粒和人ERG基因质粒的血清样本；

(4)阴性对照：含有人ERG基因质粒的血清样本；

(5)内参质粒：含有人ERG基因质粒浓度为约20000拷贝/μL的水溶液。

本发明还包括以下技术方案，用于乙型肝炎病毒检测的试剂盒在检测HBV准确拷贝数中的应用，主要步骤如下：

(1)抽提HBV患者、阳性对照、阴性对照血清样本中的DNA；

(2)用上述设计的试剂盒进行HBV病毒载量的准确定量；

扩增体系如下：2*supermix 10μL；引物探针预混合液1μL；HBV患者、阳性对照、阴性对照样本抽提模板DNA 9μl；总体系20μl；PCR扩增条件为：95℃10min；60个循环(94℃15s，60℃60s)，98℃10min；4℃，hold；

(3)将扩增完毕的PCR板放入微滴读取仪，对每一扩增完的样本进行微滴读取仪的荧光分析，在阴阳性对照结果合格、样本内参基因ERG结果正常的前提下，计算样本反应孔中HBV DNA的准确拷贝数，最终得出样本中HBV DNA的准确载量。

上述本试剂盒的有益效果如下：

1)本发明中设计引物和探针时，充分参考了最近几年新出现的HBV基因型及亚型，通过NCBI基因数据库下载了超过300个常见HBV A-I 9个基因型的全基因序列，并且针对其高度保守的位置设计了两对可以检测所有9个基因型及不同亚型的引物和探针序列，通过设计简并碱基增加了不同基因型的匹配度，两对引物可以两两组成四种扩增组合，达到了高退火温度下，保持高特异性和高扩增成功率的突出效果，能成功检出所有9个基因型。

2)本发明中采用的是一种基于微滴式数字PCR系统的检测体系，将每一样本的20μL反应液通过乳化分成20000个独立的液滴，对病毒载量较低的样本来说，每个液滴中包含的HBV拷贝数为1或0，通过专用软件自动检测每个液滴的荧光信号，再计数总的阳性液滴数，就能得到准确的HBV DNA拷贝数，病毒载量较高的样本只需进行一定比例的稀释，也能得到准确的结果。

3)本发明所述的试剂盒及检测方法实现了真正意义上的绝对定量，相比传统的荧光定量PCR试剂及方法学，免去了相对定量标准曲线的制备和检测，降低了实验偏差，准确性极高，重现性好；且在每一个单独液滴里的多重检测体系只会增加该液滴中HBV的荧光信号，保证了不同基因型均能有效检出，却不会影响最终定量结果的准确性；多重引物和简并碱基的设计使整个检测实现了超高的灵敏度，每反应能检测到低至1拷贝的HBV DNA，检测限低至5IU/mL，对比现有定量试剂盒有极大的提升；无需标准曲线，本发明所述的试剂盒及微滴式的数字PCR检测系统配制简单，整个流程自动化程度高，效果好，操作非常简便易上手，适宜临床应用及推广。

附图说明

图1为阳性对照品检测结果图。Ch1通道为FAM通道，检测HBV DNA拷贝数，紫色直线为阈值线，2000以上的蓝色荧光点即为HBV阳性液滴，计算机自动换算成拷贝浓度；Ch2通道为VIC通道，检测内参基因人ERG基因拷贝数，紫色直线为阈值线，2000以上的绿色荧光点即为ERG基因阳性液滴，计算机自动换算成拷贝浓度。

图2为阴性对照品检测结果图。Ch1通道为FAM通道，检测HBV DNA拷贝数，无阳性液滴，荧光信号均低于2000；Ch2通道为VIC通道，检测内参基因人ERG基因拷贝数，紫色直线为阈值线，2000以上的绿色荧光点即为ERG基因阳性液滴，计算机自动换算成拷贝浓度。

图3为1例HBV感染患者检测结果图。Ch1通道为FAM通道，检测HBV DNA拷贝数，紫色直线为阈值线，2000以上的蓝色荧光点即为HBV阳性液滴，计算机自动换算成拷贝浓度；Ch2通道为VIC通道，检测内参基因人ERG基因拷贝数，紫色直线为阈值线，2000以上的绿色荧光点即为ERG基因阳性液滴，计算机自动换算成拷贝浓度。该患者血清中HBV DNA浓度为50.7IU/mL(289拷贝/mL)。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制本发明。

实施例1：检测HBV DNA和人内参基因ERG的引物和探针由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成，序列如下，：

扩增HBV DNA的引物：

F1(SEQ ID NO：1)：5′-cywcggayggaaaytgcac-3′；

R1(SEQ ID NO：2)：5′-aggcccachcccatagg-3′；

F2(SEQ ID NO：3)：5′-ctctaygtwtccctchtgytgctgt-3′；

R2(SEQ ID NO：4)：5′-cactagtaaaytgagccadgagaaa-3′；

检测HBV DNA的探针：

PHBV(SEQ ID NO：5)：5′-tgtattcccatcccatc-3′；

其中，w代表简并碱基(a或t)，y代表简并碱基(c或t)，h代表简并碱基(a或t或c)，d代表简并碱基(a或t或g)；HBV探针PHBV(SEQ ID NO：5)序列的5’端标记FAM荧光基团，3’端标记MGB淬灭基团，

扩增人ERG基因的引物：

F3(SEQ ID NO：6)：5′-cagaacacagcagagggaagg-3′；

R3(SEQ ID NO：7)：5′-aagctcccacttccataaaggc-3′；

检测人ERG基因的探针：

PERG(SEQ ID NO：8)：5′-aggagtcccaggctc-3′；

其中，人ERG基因探针PERG(SEQ ID NO：8)序列的5’端标记VIC荧光基团，3’端标记MGB淬灭基团。

实施例2：HBV DNA定量试剂盒的制备方法。

(1)PCR反应液：2*supermix(购于美国Bio-rad公司，货号1863026)，为2*PCR反应预混液，其中含有本发明所述的PCR反应缓冲液、热启动DNA聚合酶、Mg²⁺及dNTPs等组分，-20℃保存；

(2)引物探针预混合液：将SEQ ID NO：1～8所示的核苷酸序列交由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成，拿到干粉后，用去离子水分别将6条引物稀释至100uM浓度，将两条探针稀释至10uM浓度，然后将8条引物探针母液以9:9:9:9:25:9:9:25的比例混合，-20℃保存；

(3)阳性对照：含有HBV C基因型质粒(购自中检所标准品稀释)和人ERG基因质粒的血清样本，其中，含HBV C基因型质粒浓度为约100拷贝/μl，人ERG基因质粒浓度为约100拷贝/μl，-20℃保存；

(4)阴性对照：含有人ERG基因质粒的血清样本，其中，人ERG基因质粒浓度为约100拷贝/μl，-20℃保存。

(5)内参质粒：含有人ERG基因质粒浓度为约20000拷贝/μL的水溶液。

实施例3：检测方法。

仪器：Eppendorf Mastercycler pro S定性PCR仪，Bio-rad QX200微滴式数字PCR系统(包括微滴生成仪、封膜仪、微滴读取仪)，BECKMAN22R台式微量冷冻离心机，WH-866型涡旋振荡器(太仓华利达)，低速板式离心机(安徽中佳)。

(1)HBV患者样本、阳性对照、阴性对照DNA模板的制备：采用QIAGEN公司血清病毒抽提试剂盒(柱式法，货号57704)，按照试剂盒说明书操作，患者样本抽提前先往500μL血清中加入2.5μL内参质粒，再进行抽提；阴阳性对照样本均直接取500μL进行抽提，用50μL洗脱液进行洗脱，作为PCR反应模板备用。

(2)以步骤(1)得到的核酸为模板，利用3对特异性引物和两条特异荧光探针进行HBV DNA和人内参基因ERG基因的扩增检测，具体包括如下步骤；

(2a)PCR反应液配制：从-20℃冰箱取出试剂盒的各组分，室温融化，放冰盒上备用。加样前10分钟之内，按检测样本数配置PCR反应液Xμl：

X＝(10μl PCR反应液+1μl引物探针预混合液)×(n份样本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照)。

振荡混匀后，10000rpm瞬时离心10s，按每人份11μl分装到八联PCR反应管中，传至样本制备区备用。

(2b)加样：向分装好试剂的反应孔中，分别加入HBV感染患者、阴阳性血清抽提DNA模板9μl(若模板保存在-20℃，使用前置室温解冻，以10000rpm离心10s)，空白对照孔加入9μl双蒸水。盖上八联管盖，涡旋震荡，板式离心机2000rpm离心1min。

(2c)微滴生成：将八联PCR管中的20μl PCR反应液转移至QX200微滴生成仪专用卡夹(共有三行，每行8孔，依次为微滴行、样本行和生成油行)的样品行的8孔中，生成油行对应的8孔加入配套的微滴生成油70μL(Bio-rad公司，货号1863005)，放入微滴生成仪中，自动生成微滴于上方微滴行；

(2d)PCR扩增：将生成的40μL微滴转移至96孔PCR反应板，封膜仪封铝膜，放入定性PCR仪中，反应条件如下：95℃预变性10min；60个循环(94℃15s，60℃60s)，98℃10min，4℃hold，扩增完成降至4℃时即可取出。

(3)微滴读取仪进行结果分析，具体包括如下步骤：

(3a)简单设置每个反应孔样本信息，开始运行，仪器会自动对每个孔的约20000个微滴进行荧光读取和分析，并自动计算浓度结果，也可手动微调：

检测合格标准：阳性对照Ch1通道(FAM通道，HBV DNA，蓝色荧光点)结果250-500拷贝/μL左右，Ch2通道(VIC通道，人内参基因ERG，绿色荧光点)250-500拷贝/μL左右，阴性对照VIC通道250-500拷贝/μL左右，Ch1通道无阳性信号；空白对照两个通道都没有信号；

样本结果：内参通道有阳性信号，结果合格，样本中HBV DNA拷贝数计算公式如下：

样本中HBV DNA浓度(IU/mL)＝测试孔HBV浓度结果(拷贝/μL)20÷9×100÷5.7(拷贝/IU)＝测试孔HBV浓度结果×39(IU/mL)

(3b)如果样本中HBV DNA浓度过高，导致测试孔中浓度结果超过5000拷贝/μL，则对应原始样本中超过2*10⁵拷贝/μL，为了达到最佳准确性，需对样本进行稀释10倍，再进行检测。

实施例4：部分临床CHB样本检测

将本发明所述的检测试剂盒用于乙肝WHO国际标准品(NIBSC code：10/264，浓度约为8.5E+05IU/mL)和部分临床CHB患者样本的检测，方法参照实施例3，结果与市场上现有性能最佳的乙型肝炎超敏检测试剂，瑞士罗氏公司的AmpliPrep/ HBV Test,v2.0(PCR-荧光法，检测限20IU/mL)进行比对，检测结果如表1：

表1样品检测结果对照表

在标准品梯度稀释、3平行重复的比对结果可以看出，利用本发明提供的引物探针和试剂盒，采用优选的扩增检测体系，在的样本中，两种方法学的结果差异不大，但是在病毒载量低于100IU/mL的样本中，本发明的试剂盒的检测性能要优于比对试剂盒，准确性和精密度都好于比对试剂盒，且因比对试剂盒的灵敏度只有20IU/mL，低于20IU的梯度稀释品无法测出具体数值，只能依据曲线有无抬头判读为≦20IU/mL或阴性。

在对20例临床样本进行的比对实验结果显示，高次方两种方法学一致性较好，低于100IU/mL的结果差异较大；比对试剂盒的性能评价资料显示，低于100IU/mL的结果线性较差，而本发明所用的方法体系无需标准曲线，可以做到准确定量，因此在低次方的样本检测中优势明显。

本试剂盒具有操作简便快捷，灵敏、准确度高，成本低的优势，能对HBV感染患者进行HBV DNA的准确定量，能有利于医师进行快速诊断，及时修正治疗方案。本发明的试剂盒技术门槛低，易于推广，具有很好的应用前景。

序列表

<110> 杭州迪安医学检验中心有限公司

<120> 一种用于乙型肝炎病毒检测的核酸序列及试剂盒

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cywcggaygg aaaytgcac 19

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aggcccachc ccatagg 17

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctctaygtwt ccctchtgyt gctgt 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cactagtaaa ytgagccadg agaaa 25

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tgtattccca tcccatc 17

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cagaacacag cagagggaag g 21

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aagctcccac ttccataaag gc 22

<210> 8

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aggagtccca ggctc 15

Claims (4)

1.一种用于乙型肝炎病毒检测的核酸序列，其特征在于，包括用于特异检测A-I9个基因型的HBV病毒DNA的两重引物和探针，具体包括如下：

(1)扩增HBV病毒各基因型的引物序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1～4所示；

(2)扩增HBV病毒各基因型的探针序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；

(3)扩增人内参基因ERG基因的引物序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：6～7所示；

(4)扩增人内参基因ERG基因的探针序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；

其中，HBV探针SEQ ID NO：5序列的5’端标记FAM荧光基团，3’端标记MGB淬灭基团，人ERG基因探针SEQ ID NO：8序列的5’端标记VIC荧光基团，3’端标记MGB淬灭基团，

上述8条核酸序列在一次检测中共同使用。

2.一种用于乙型肝炎病毒检测的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括如下试剂：

(1)2*supermix：含有DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液、dATP、dCTP、dTTP和dGTP；

(2)引物探针预混合液：将SEQ ID NO：1～8所示的引物及探针各自用双蒸水溶解，每条引物的浓度为100μM，每条探针的浓度为10μM；SEQ ID NO：1～8各核酸序列的母液以9:9:9:9:25:9:9:25的比例混合；

(3)阳性对照：含有HBV C基因型质粒和人ERG基因质粒的血清样本；

(4)阴性对照：含有人ERG基因质粒的血清样本；

(5)内参质粒：含有人ERG基因质粒浓度为20000拷贝/μL的水溶液。

3.根据权利要求2所述的一种用于乙型肝炎病毒检测的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照中，含HBV C基因型质粒浓度为100拷贝/μL，人ERG基因质粒浓度为100拷贝/μL。

4.根据权利要求2所述的一种用于乙型肝炎病毒检测的试剂盒，其特征在于，所述阴性对照样本中，人ERG基因质粒浓度为100拷贝/μL。