CN105671209A - 一种检测牛冠状病毒的引物、探针、试剂盒及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测牛冠状病毒的引物、探针、试剂盒及方法，所述引物如SEQ？ID？NO:1和SEQ？ID？NO:2所示，所述探针如SEQ？ID？NO:3所示。以待测样本的RNA反转录得到的cDNA作为模板，进行荧光定量PCR扩增，比较扩增曲线CT值。本发明通过在牛冠状病毒保守基因，即N基因处设计定量PCR引物，并采用探针法建立荧光定量PCR方法。本发明操作简单实用，特异性强、敏感度高，重复性好，适应现代化养殖场快速准确的检测需要。

Description

一种检测牛冠状病毒的引物、探针、试剂盒及方法

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，更具体地，本发明涉及一种检测牛冠状病毒的引物、探针、试剂盒及方法。

背景技术

牛冠状病毒(bovinecoronavirus,BCV)是引起成年牛冬痢和新生犊牛腹泻(腹泻粪便中常带有血液和粘液)的最主要的病原之一，BCV的感染在全世界各国广泛分布。美国科学家Mebus等人(MebusCA,StairEL,RhodesMB,etal.Pathologyofneonatalcalfdiarrheainducedbyacoronavirus-likeagent[J].VetPathol,1973,10:45-64.)在发病的犊牛和成年牛的粪便病料中检出了BCV病毒，随后世界其他国家也报道了该病的发生。我国学者宋广林等人(宋广林，董惠兰，滕庆，等.犊牛流行性腹泻病原研究[J].畜牧兽医学报,1985,16:121-122.)于1985年首次报道了BCV在中国的存在，随后我国各地均有报道(傅彩霞，靳兴军，郑瑞峰，等.北京地区规模化奶牛场三种病毒性腹泻病的血清学调查[J].动物医学进展，2012.33(5):85-88)。

BCV在我国已有多次暴发，对新生犊牛造成较高的死亡率。快速诊断此病是有效降低损失的重要手段。

目前，常用的牛冠状病毒检测方法有：(1)Elisa抗体检测方法:它的原理是牛感染牛冠状病毒后产生抗体，通过抗体的检测确定是否感染牛冠状病毒；(2)病毒的分离纯化方法：通过对病毒的细胞培养纯化，确定是否感染牛冠状病毒。

现有方法存在以下缺点：(1)Elisa抗体检测方法：该法的前提是牛感染牛冠状病毒并产生抗体，由于从感染病毒到产生抗体需要一定的时间，这对病毒的检测在时间上有一定的局限性，不能及时准确的检测到牛冠状病毒；另外，免疫过牛冠状病毒疫苗，或者之前感染过牛冠状病毒的牛，后续抗体会在一定时间内持续存在，即使当牛体内没有病毒时也会检测到抗体，抗体检测结果阳性也无法说明牛体内是否存在牛冠状病毒。(2)病毒的分离纯化方法：该法为经典的病原学诊断方法，但操作起来费时费力，牛冠状病毒的分离培养一般较为困难，尤其是初次的分离培养。因此，病毒分离纯化法也不能很好的满足现代化养殖快速有效的病原学检测需要。

发明内容

基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明在牛冠状病毒N基因处设计定量PCR引物，并采用探针法建立荧光定量PCR方法，提供了一种检测牛冠状病毒的引物、探针、试剂盒及方法。

为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：

一种检测牛冠状病毒的引物，所述引物如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示。

上述检测牛冠状病毒的引物在制备检测牛冠状病毒的试剂盒中的应用。

一种检测牛冠状病毒的探针，所述探针如SEQIDNO:3所示。

在其中一些实施例中，所述探针的3’端结合有荧光淬灭基团TAMRA，5’端结合有荧光报告基团FAM。

一种检测牛冠状病毒的试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物和探针。

一种检测牛冠状病毒的方法，采用上述的引物和探针，包括以下步骤：

以待测样本的RNA反转录得到的cDNA作为模板，进行荧光定量PCR扩增，比较扩增曲线CT值；

其中，所述荧光定量PCR的扩增体系为：q-pcrMix酶10μL，引物SEQIDNO:1和SEQIDNO:2各0.2μL，SEQIDNO:3探针0.1μL，分子生物学用水7.46μL，Rox参比染料0.04μL，cDNA模板2μL；

所述荧光定量PCR的扩增反应程序为：50℃2min；95℃2min，95℃3s，60℃30s，40个循环。

在其中一些实施例中，所述反转录包括如下步骤：

(1)、将RNA加入到预混液1中，混合均匀后，65℃保温5min后迅速冰上急冷3min，所述预混液1的配方为：50μM的RandomPrimer1μL，10mMeach的dNTPMixture1μL；

(2)、将上述反应液加入到RT预混液2中反应如下：30℃10min、42℃60min、70℃15min，即得cDNA，所述预混液2的配方为：5×PrimeScriptBuffer4μL，40U/μL的RNaseInhibitor0.5μL，200U/μL的PrimeScriptReverseTranscriptase1μL，RNasefreeH₂O4.5μL。

与现有技术相比，本发明具有以下显著效果：

本发明的检测牛冠状病毒的引物和探针具有很高的特异性和灵敏度，荧光定量PCR法相对于现有的牛冠状病毒病原检测方法，操作简单实用，特异性强、敏感度高，重复性好，适应现代化养殖场快速准确的检测需要。

附图说明

图1为本发明试验例1中荧光定量PCR的引物特异性实验扩增结果；

图2为本发明试验例2中普通PCR的扩增图，M为Maker，1为阳性样品，2为阴性对照，目的片段730bp；

图3为本发明试验例3中荧光定量PCR的敏感性实验扩增结果。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例来详细说明本发明。

以下实施例中涉及的实验材料如无特殊说明，均来源于市售，以下实施例中所采用的操作均为本领域技术人员所熟知的常规操作。

实施例1检测牛冠状病毒的引物、探针和方法

1、引物和探针设计

目的片段扩增：根据GenBank所公布的牛冠状病毒N基因序列(GB︱EU401981.1︱)，设计出定量PCR扩增引物，并于所设计的扩增引物中间设计探针引物，定量PCR引物和探针由上海基康生物技术有限公司合成，序列如下：

上游引物：TCCTTAAGTGGGCCGATCAG(SEQIDNO:1)

下游引物：GAGCTCTTCTACCCCTGGTTTG(SEQIDNO:2)

探针：5'FAM-CCGACCAATCTAGAAAT-3'TAMRA(SEQIDNO:3)

所述探针P的3’端结合的是荧光淬灭基团TAMRA，探针P的5’端结合的是荧光报告基团FAM。

2、检测方法

包括以下步骤：

(1)、样品RNA的提取

阳性对照组(牛冠状病毒阳性粪便)：取1g牛冠状病毒阳性粪便(经普通PCR检测并测序确定为牛冠状病毒)，添加500μL生理盐水，漩涡震荡20s，10000r/min离心3min，取200μL上清液作为阳性对照液。

待检样品组(疑似感染冠状病毒粪便)：取1g疑似感染冠状病毒粪便，加入500μL生理盐水，置于旋涡震荡仪震荡20s，然后10000r/min离心3min，取200μL上清液作为待检液。

阴性对照组(稀释粪便用生理盐水)：取200μL的生理盐水作为阴性对照液。

采用RNA试剂盒(AxyPrep病毒DNA/RNA小量试剂盒)，按照说明步骤提取以上各组样品的RNA。

(2)、反转录

采用TaKaRa反转录酶体系(宝生物工程有限公司)，按照说明步骤分别对上述各样品提取所得的RNA进行反转录，得到cDNA。

反转录体系和过程：8μL各组提取所得RNA模板加入到2μL预混液1(TakaRa公司，RandomPrimer(50μM)1μL，dNTPMixture(10mMeach)1μL)中，混合均匀后，65℃保温5min后迅速冰上急冷3min。

将所得的共10μL反应液加入到RT预混液2(TakaRa公司，5×PrimeScriptBuffer4μL，RNaseInhibitor(40U/μL)0.5μL，PrimeScriptReverseTranscriptase(200U/μL)1μL，RNasefreeH2O4.5μL)中反应如下：30℃10min、42℃60min、70℃15min，以上反应无循环。

(3)荧光定量PCR

以上述cDNA作为模板，置于ABI公司的7500Fast定量PCR扩增仪上进行荧光定量PCR反应，荧光定量PCR反应体系(20μL，购自LifeTechnologies公司)：q-pcrMix酶10μL，荧光定量PCR上下游引物各0.2μL，探针0.1μL，分子生物学用水7.46μL，Rox参比染料0.04μL，模板2μL。

所述荧光定量PCR反应程序为：50℃2min；95℃5min，95℃10s，60℃50s，40个循环。

(4)样品检测结果判定

扩增曲线CT值小于35的判定为阳性，CT值大于35且小于40的判定为阴性，需重复检测，若第二次检测仍在此区间，即判定为阳性。本实施例的样本的检测结果见表1。

表1检测结果

样品	CT值	结果判定
			阳性对照组(牛冠状病毒阳性粪便)	23	阳性
待检样品组(疑似感染冠状病毒粪便)	28	阳性
			阴性对照组(稀释粪便用生理盐水)	无扩增	阴性

试验例1特异性检测

以牛轮状病毒、牛流行热病毒、牛病毒性腹泻病毒和牛传染性鼻气管炎病毒的标准毒株细胞培养液进行特异性检测。使用实施例1中所提供的方法和引物探针，进行荧光定量PCR扩增，结果显示，除阳性对照组外均没有扩增曲线，扩增结果见图1。

试验例2敏感性检测

质粒的制备

根据GenBank所公布的牛冠状病毒N基因序列(GB︱EU401981.1︱)，采用Primerexpress软件设计出普通PCR扩增引物，对实施例1中所得的cDNA为模板进行普通PCR扩增。

普通PCR引物为：

上游引物：CTTAGTGGCATCCTTGCC(SEQIDNO:4)

下游引物：GCTCTACTACTGGATTGC(SEQIDNO:5)

普通PCR扩增片段为730bp，见图2。按照胶回收试剂盒(GelExtraCtionKit试剂盒)对切割下的目的条带进行胶回收，将回收的目的片段连接PMD-18-T载体制备质粒，将质粒转染感受态大肠杆菌DH5α，涂板并筛选转染成功的单菌落，挑取菌落摇菌后做菌液PCR鉴定。按照质粒提取试剂盒(PlasmidMiniKitⅠ)说明提取质粒提取阳性菌液的质粒。质粒经测序和比对，核对正确后方可使用。

经核酸蛋白测定仪测算出起始质粒拷贝数，以此作为标准品。经测定，本次所得质粒浓度为3.82×10⁹copies/μL。然后将质粒做10倍浓度稀释，取原始质粒浓度梯度的10^-5-10^-9稀释倍数的质粒做模板，各浓度梯度取2μL为模板，按照实施例1中所述方法进行定量PCR检测，以出现定量PCR阳性曲线的最高稀释倍数为本试验例检测方法的最高敏感度。结果显示，最小检出模板浓度为3.82copies/μL，见图3。

试验例3荧光定量PCR的重复性实验

采用不同浓度梯度的标准质粒，各浓度梯度按实施例1的方法在同一反应中重复测定5次，计算出各重复样品的变异系数(CV)。实验结果显示(表2)，各稀释梯度重复样品Ct值得变异系数皆小于2％，显示本发明的荧光定量PCR重复性良好。

表2荧光定量PCR重复性实验

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (8)

1.一种检测牛冠状病毒的引物，其特征在于，所述引物如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示。

2.权利要求1所述的引物在制备检测牛冠状病毒的试剂盒中的应用。

3.一种检测牛冠状病毒的探针，其特征在于，所述探针如SEQIDNO:3所示。

4.根据权利要求3所述的检测牛冠状病毒的探针，其特征在于，所述探针的所述探针的3’端结合有荧光淬灭基团，5’端结合有荧光报告基团。

5.根据权利要求4所述的检测牛冠状病毒的探针，其特征在于，所述荧光淬灭基团为TAMRA，所述荧光报告基团为FAM。

6.一种检测牛冠状病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物和权利要求3～5任一项所述的探针。

7.一种检测牛冠状病毒的方法，其特征在于，采用权利要求1所述的引物和权利要求3～5任一项所述的探针，包括以下步骤：

以待测样本的RNA反转录得到的cDNA作为模板，进行荧光定量PCR扩增，比较扩增曲线CT值；

其中，所述荧光定量PCR的扩增体系为：q-pcrMix酶10μL，引物SEQIDNO:1和SEQIDNO:2各0.2μL，SEQIDNO:3探针0.1μL，分子生物学用水7.46μL，Rox参比染料0.04μL，cDNA模板2μL；

荧光定量PCR的扩增反应程序为：50℃2min；95℃2min，95℃3s，60℃30s，40个循环。

8.根据权利要求7所述的检测牛冠状病毒的方法，其特征在于，所述反转录包括如下步骤：

(1)、将RNA加入到预混液1中，混合均匀后，65℃保温5min后迅速冰上急冷3min，所述预混液1的配方为：50μM的RandomPrimer1μL，10mMeach的dNTPMixture1μL；

(2)、将上述反应液加入到RT预混液2中反应如下：30℃10min、42℃60min、70℃15min，即得cDNA，所述预混液2的配方为：5×PrimeScriptBuffer4μL，40U/μL的RNaseInhibitor0.5μL，200U/μL的PrimeScriptReverseTranscriptase1μL，RNasefreeH₂O4.5μL。