CN105603122A - 一种乙型肝炎病毒ymdd基因突变检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种乙型肝炎病毒YMDD基因突变检测试剂盒，其特征在于，包括：DNA提取试剂，PCR反应预混液，热启动Taq酶、UDG酶，阳性质控品，以及阴性质控品，其中，所述PCR反应预混液中具有上游引物：5′-CCGTTTCTCCTGGCTCAGTTTACTAG-3′，以及下游引物：5′-GGGACTCAAGATGTTGTACAGACTTGG-3′。本发明的乙型肝炎病毒YMDD基因突变检测试剂盒，(1)检测速度快；(2)特异性好；(3)灵敏度高；能够准确稳定的检测到1％的突变株。(4)重复性好；(5)准确度高；能够准确区分YIDD和YVDD两种突变。
Description
技术领域
本发明涉及一种乙型肝炎病毒YMDD基因突变检测试剂盒，属于基因检测领域。
背景技术
我国2006年乙型肝炎流行病学调查表明，我国1-59岁一般人群HBsAg携带率为7.18％，5岁以下儿童的HBsAg仅为0.96％。据此推算，我国现有的慢性乙型肝炎病毒感染者约9300万人，其中慢性乙型肝炎患者约2000万例。2013年乙型肝炎新增962,974例，占同年病毒性肝炎的76.92％；死亡病例达550例，占同期病毒性肝炎死亡人数的74.42％。乙肝不仅严重影响人民身体健康，而且还造成了重大经济损失。据统计，我国每年因乙肝所致的直接经济损失约300亿～500亿元。同时，由于我国的乙肝患者年龄大多在20～50岁之间，是社会的中坚力量。因此，乙肝的预防与治疗具有重大的社会意义。随着社会进步和人民生活水平的提高，我国政府对乙肝的预防与治疗日益重视，医疗保障体系覆盖率不断扩大，乙肝知晓率和就诊率不断提高，乙肝用药市场保持了快速增长的势头。在各类乙肝用药中，抗病毒类药物市场份额较大，且增长较快。2011～2013年，我国抗病毒类乙肝用药保持着19.90％的复合增长率，2013年市场规模达到132.24亿元。在我国乙肝抗病毒用药市场中，阿德福韦酯、恩替卡韦、拉米夫定等主要药品占有70％左右的市场份额。其中拉米夫定仍是销量较大的一线用药，市场保有量很大。
通过抗病毒药物的运用，乙型肝炎病毒已得到有效治疗。但是，长期单一治疗通常不能完全抑制病毒的复制，而会出现耐药突变，拉米夫定耐药是抗病毒药物中最常见发生的耐药突变药物。这种耐药突变主要是YMDD基序上的蛋氨酸(M)被异亮氨酸(I)和缬氨酸(V)替代的结果。当乙型肝炎病毒的YMDD突变为YIDD(204I)或YVDD(204V)时，就会发生拉米夫定耐药。并随治疗时间延长而突变率逐渐增高，一般治疗1年的变异率为24％，2年约38％，治疗3年后变异的发生率49％。而阿德福韦酯、恩替卡韦治疗3年后得变异分别只占到11％和1.2％。耐药一旦发生，将极大降低乙型肝炎病毒对拉米夫定的敏感性，治疗效果显著下降，抗病毒疗效将降低。乙型肝炎病毒的DNA会重新回升，部分患者会出现肝炎急性发作，甚至肝功能失常因此。因此，通过检测YMDD的突变判断乙型肝炎病毒对拉米夫定的敏感性，在指导患者临床用药，监控患者抗病毒疗效方面有重大意义。准确、简便的拉米夫定耐药株检测对慢性乙型肝炎病人的疗程管理十分必要，能为临床用药能提供有力的证据。
目前，对乙型肝炎病毒YMDD变异株的基因诊断方法中主要有DNA测序法，PCR-RFLP、聚合酶链反应-酶联免疫吸附法(PCR-ELISA)，基因芯片技术、熔解曲线分析法和实时荧光定量PCR。其中DNA测序法是检测YMDD变异株的金标准，但其操作麻烦，耗时过长。PCR-RFLP和聚合酶链反应-酶联免疫吸附法(PCR-ELISA)虽然能较好的鉴别野生株和变异株，但易产生污染而引起假阳性，另相对于荧光探针分析，在灵敏度及特异性上都有一定差异。基因芯片技术具有高通量、快速、高灵敏等优势但其检测需要昂贵的仪器，专业的配套人员，高昂的价格限制了临床诊断应用。熔解曲线分析法具有快速、方便、经济的特点，但此该法的敏感度和特异性不高。
发明内容
本发明的目的在于提
本发明采用了如下技术方案：
本发明提供一种乙型肝炎病毒YMDD基因突变检测试剂盒，其特征在于，包括：DNA提取试剂，PCR反应预混液，热启动Taq酶、UDG酶，阳性质控品，以及阴性质控品，其中，所述PCR反应预混液中具有上游引物：5′-CCGTTTCTCCTGGCTCAGTTTACTAG-3′，以及下游引物：5′-GGGACTCAAGATGTTGTACAGACTTGG-3′。
进一步，本发明的乙型肝炎病毒YMDD基因突变检测试剂盒，还可以具有这样的特征：其中，所述DNA提取试剂成分为：莎梵婷，CTAB，乙醇，氯化钾。
进一步，本发明的乙型肝炎病毒YMDD基因突变检测试剂盒，还可以具有这样的特征：其中，所述PCR反应预混液中具有第一探针：5′-CCCCAATACCACATCATCAATATAACTGAAAGCCAGACAG-3′，其中5′标记FAM基团，3′标记TAMARA基团。
进一步，本发明的乙型肝炎病毒YMDD基因突变检测试剂盒，还可以具有这样的特征：其中，所述PCR反应预混液中具有第二探针：5′-CCCAATACCACATCATCCACATAACTGAAAGCCAGACAG-3′，其中5′标记CY5基团，3′标记TAMARA基团。
进一步，本发明的乙型肝炎病毒YMDD基因突变检测试剂盒，还可以具有这样的特征：其中，所述PCR反应预混液中具有第三探针：5′-GCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCCCCCAC-3′，其中5′标记ROX基团，3′标记TAMARA基团。
进一步，本发明的乙型肝炎病毒YMDD基因突变检测试剂盒，还可以具有这样的特征：制备阴性质控品，即野生型YMDD基因时所用的引物为：第一正向引物EWF1：5′-CTGCTCAAGGAACCTCTATGT-3′，第一反向引物EWR1:5′-GACACACTTTCCAATCAATAGG-3′。
进一步，本发明的乙型肝炎病毒YMDD基因突变检测试剂盒，还可以具有这样的特征：制备阳性质控品中的突变型YIDD基因片段时所用的引物为：第二正向引物EIF1:5′-GGCTTTCAGTTATATTGATGATGTG-3′，第二反向引物EIR1:5′-CACATCATCAATATAACTGAAAGCC-3′。
进一步，本发明的乙型肝炎病毒YMDD基因突变检测试剂盒，还可以具有这样的特征：制备阳性质控品中的突变型YIDD基因片段时所用的引物为：第三正向引物EVF1:5′-GCTTTCAGTTATGTGGATGATGTG-3′，第三反向引物EVR1:5′-CACATCATCCACATAACTGAAAGC-3′。
阳性质控品可采用I/V阳性血清或血浆对照。其为YMDD基因突变体YIDD和YVDD基序中部分核酸片段连接到T载体，加入灭活HBV阴性血清或血浆为基质建立的模拟临床样本。
阴性质控品可采用灭活的HBV阴性血清或血浆。
发明的有益效果
本试剂盒和传统的诊断法比较，具有以下优势：
(1)检测速度快；
(2)特异性好；
(3)灵敏度高；能够准确稳定的检测到1％的突变株。
(4)重复性好；
(5)准确度高；能够准确区分YIDD和YVDD两种突变。
具体实施方式
下面结合具体实施实例，对本发明进一步说明，但发明的保护范围并不限于此。
本发明的乙型肝炎病毒YMDD基因突变检测试剂盒组成：
每个试剂盒为48个反应，主要成分包括：
(1)DNA提取试剂
DNA提取试剂成分为：莎梵婷，0.1-0.5mmol/L；十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，1-2％；乙醇，0.5-1％；氯化钾，100-300mmol/L。
(2)荧光PCR试剂
荧光定量PCR试剂成分为：乙型肝炎病毒YMDD基因突变PCR反应液(2×)；480uL的10×HotStartPCR缓冲液(热启动聚合酶链反应缓冲液)，25mMMgCl2；dNTPMix2.5mM；上游引物HF，10mM；下游引物HR，10mM；探针PHI，10mM；探针PHV，10mM；探针PHW，10mM；灭菌ddH2O；TaqDNA聚合酶19.2uL；UDG酶9.6uL。
(3)质量控制品
质量控制品成分为：阳性对照品：I/V阳性血清或血浆模拟临床样本使用国家参考品进行标定，浓度为1000IU/mL左右，10mL。阴性对照品：灭活，HBV阴性血清或血浆临床样本，10mL。
实施例2：乙型肝炎病毒YMDD基因突变检测试剂盒检测YMDD突变基因。
具体方法为：
(1)质控品的构建：PCR(聚合酶链式反应)法
模板DNA获得：采用HBV检测阳性的临床样本，提取DNA获得。
需要合成的引物为：
第一正向引物EWF1：5′-CTGCTCAAGGAACCTCTATGT-3′
第一反向引物EWR1:5′-GACACACTTTCCAATCAATAGG-3′
第二正向引物EIF1:5′-GGCTTTCAGTTATATTGATGATGTG-3′
第二反向引物EIR1:5′-CACATCATCAATATAACTGAAAGCC-3′
第三正向引物EVF1:5′-GCTTTCAGTTATGTGGATGATGTG-3′
第三反向引物EVR1:5′-CACATCATCCACATAACTGAAAGC-3′
采用PCR方法得到YMDD野生型基因片段，采用重叠PCR方法得到突变基因YIDD和YVDD片段，过程如下：
YMDD野生型基因片段获得：
①反应体系：
②然后以获得的DNA为模板，加入引物EWF1(10uM)、EWR1(10uM)各1uL，扩增YMDD野生型基因片段；
③以获得的DNA为模板，加入引物EWF1(10uM)、EIR1(10uM)，扩增YIDD-1片段；加入引物EIF1(10uM)、EWR1(10uM)各，扩增YIDD-2片段；以获得的YIDD-1、YIDD-2片段为模板，加入引物EWF1(10uM)、EWR1(10uM)，扩增YIDD基因片段；
④以获得的DNA为模板，加入引物EWF1(10uM)、EVR1(10uM)，扩增YVDD-1片段；加入引物EVF1(10uM)、EWR1(10uM)各，扩增YVDD-2片段；以获得的YVDD-1、YVDD-2片段为模板，加入引物EWF1(10uM)、EWR1(10uM)，扩增YVDD基因片段；
⑤常规PCR扩增上述基因(体系为常规PCR体系，模版取5uL，引物取1uL；反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性45s，50℃退火45s、72℃延伸30s，循环30次，72℃延伸10min)。
⑥2％琼脂糖凝胶鉴定、DNA胶纯化试剂盒回收纯化目的片段。即为YMDD野生型，YIDD和YVDD基因片段。
⑦将基因加A尾巴后连接到T载体(生工生物试剂盒)，抽提质粒，纯化后，加入HBV阴性血清或血浆为基质，即为阳性质控品。
结果：
①得到了特异性的458bp的片段。
②YMDD野生型，YIDD和YVDD基因片段分别连接到T载体后，菌落PCR鉴定结果(菌液取1uL)，扩增得到458bp的片段。此片段是乙型肝炎病毒(HBV)C区的458bp片段，该片段位于HBV基因组的534到991碱基位置。野生型YMDD所对应的458bp片段的序列如序列表中的序列6所示。
③重叠PCR方法得到了正确的质控品。分别命名：pYMDD、pYIDD、pYVDD。
(2)检测方法的初步建立
①样本处理：取待测的质控品pYMDD、pYIDD、pYVDD各取200uL，加入50uLDNA提取液，吸打混匀，瞬时离心后取上清供PCR扩增用。
②引物、探针
上游引物HF序列为：5′-CCGTTTCTCCTGGCTCAGTTTACTAG-3′，
下游引物HR序列为：5′-GGGACTCAAGATGTTGTACAGACTTGG-3′，
第一探针PHI-FAM序列为：
FAM-5′-CCCCAATACCACATCATCAATATAACTGAAAGCCAGACAG-3′，
第二探针PHV-CY5序列为：
CY5-5′-CCCAATACCACATCATCCACATAACTGAAAGCCAGACAG-3′，
第三探针PHW-ROX序列为：
ROX-5′-GCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCCCCCAC-3′。
③反应体系：
自主优化的基本体系为：45ul
PCR扩增
取5uL上述提取的DNA加入PCR反应液中，混匀后放入荧光PCR仪器(ABI7500)，按下列反应参数进行扩增反应：(50℃处理2min，95℃变性10min，95℃变性15s、60℃退火延伸1min(采集荧光)，循环45次，38℃处理5s)。
分析扩增曲线，作如下结果判定：
PCR反应混合液FAM荧光信号高于阈值，表明标本中有HBVDNA的YIDD突变。一般荧光阈值的默认设置是3－15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，下同。
PCR反应混合液CY5荧光信号高于阈值，表明标本中有HBVDNA的YVDD突变；
PCR反应混合液ROX荧光信号高于阈值，表明标本含有HBVDNA；定性判断：当ROX荧光信号高于阈值，CY5/FAM荧光信号高于阈值时，表示发生了YIDD/YVDD突变，或者发生了YIDD和YVDD的混合突变。当ROX荧光信号低于阈值，实验需重复。
定量测定：可根据CY5/FAM荧光信号与ROX荧光信号Ct值的差异计算出YIDD/YVDD突变株在病毒群体中的相对比例。计算公式为：突变比例＝2ΔCt×100％，其中ΔCt为ROX荧光信号与CY5或FAM荧光信号Ct值之差。
④方法的准确性和特异性
模拟临床样本临界值检测，结果显示，检测HBVYMDD基序的2个突变型YVDD和YIDD均为阳性。
检测野生型HBV核酸样本，甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒，结果显示，YVDD和YIDD均为阴性。干扰物质胆红素，游离血红蛋白，拉米夫定、阿德福韦酯和恩替卡韦药物等，对检测结果无影响。
⑤方法的灵敏度
模拟临床样本10倍梯度稀释，取5uL为模板，荧光定量检测。结果显示，对HBV野生型病毒、YIDD突变体和YVDD突变体病毒的最低检测量均为1×103IU/ml。
模拟临床样本按照比例混合，结果显示，能够准确稳定的检测到1％的突变株。
⑥方法的重复性
2个突变型各进行10管相同的反应体系，扩增后，结果显示，具有相同的Ct值，说明方法的重复性较好。
Claims (8)
1.一种乙型肝炎病毒YMDD基因突变检测试剂盒，其特征在于，包括：
DNA提取试剂，PCR反应预混液，热启动Taq酶、UDG酶，阳性质控品，以及阴性质控品，
其中，所述PCR反应预混液中具有上游引物：5′-CCGTTTCTCCTGGCTCAGTTTACTAG-3′，以及
下游引物：5′-GGGACTCAAGATGTTGTACAGACTTGG-3′。
2.如权利要求1所述的乙型肝炎病毒YMDD基因突变检测试剂盒，其特征在于：
其中，所述DNA提取试剂成分为：莎梵婷，CTAB，乙醇，氯化钾。
3.如权利要求1所述的乙型肝炎病毒YMDD基因突变检测试剂盒，其特征在于：
其中，所述PCR反应预混液中具有第一探针：5′-CCCCAATACCACATCATCAATATAACTGAAAGCCAGACAG-3′，其中5′标记FAM基团，3′标记TAMARA基团。
4.如权利要求1所述的乙型肝炎病毒YMDD基因突变检测试剂盒，其特征在于：
其中，所述PCR反应预混液中具有第二探针：5′-CCCAATACCACATCATCCACATAACTGAAAGCCAGACAG-3′，其中5′标记CY5基团，3′标记TAMARA基团。
5.如权利要求1所述的乙型肝炎病毒YMDD基因突变检测试剂盒，其特征在于：
其中，所述PCR反应预混液中具有第三探针：5′-GCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCCCCCAC-3′，其中5′标记ROX基团，3′标记TAMARA基团。
6.如权利要求1所述的乙型肝炎病毒YMDD基因突变检测试剂盒，其特征在于：
制备阴性质控品时所用的引物为：第一正向引物EWF1：5′-CTGCTCAAGGAACCTCTATGT-3′，
第一反向引物EWR1:5′-GACACACTTTCCAATCAATAGG-3′。
7.如权利要求1所述的乙型肝炎病毒YMDD基因突变检测试剂盒，其特征在于：
制备阳性质控品中的突变型YIDD基因片段时所用的引物为：第二正向引物EIF1:5′-GGCTTTCAGTTATATTGATGATGTG-3′，
第二反向引物EIR1:5′-CACATCATCAATATAACTGAAAGCC-3′。
8.如权利要求1所述的乙型肝炎病毒YMDD基因突变检测试剂盒，其特征在于：
制备阳性质控品中的突变型YIDD基因片段时所用的引物为：第三正向引物EVF1:5′-GCTTTCAGTTATGTGGATGATGTG-3′，
第三反向引物EVR1:5′-CACATCATCCACATAACTGAAAGC-3′。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20160525 |