CN105176980A - 一种可同步检测7种鱼类病毒的多重pcr方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种可同步检测7种鱼类病毒的多重PCR方法，使用的多重PCR的引物组，其引物的序列分别为SEQ？ID？NO:1-36，本发明采用特殊的多重PCR技术，设计、筛选了9套共36条特异性引物，建立了单管、同步扩增鱼类病毒特异性基因片段的方法，并对扩增体系和方法进行优化，最终实现了对7种常见鱼类病毒的高通量、高灵敏度、快速、同步检测。

Description

一种可同步检测7种鱼类病毒的多重PCR方法

技术领域

本发明属于水产病害微生物检测技术领域，具体涉及一种可同步检测7种鱼类病毒的方法。

背景技术

随着社会经济的快速发展，水产养殖业也呈现出养殖规模和养殖技术的空前提高，尤其在集约化养殖和工厂化养殖方面发展迅速，这给人民的生活带来了营养和健康。但在海水经济鱼类的养殖过程中，病毒性疾病的暴发往往会给养殖业带来巨大的危害。淋巴囊肿病毒(lymphocystisdiseasevirus,LCDV)、细胞肿大病毒属虹彩病毒(Megalocytivirus,Mega)、赤点石斑鱼神经坏死病毒(red-spottedgroupernervousnecrosisvirus,RGNNV)、传染性造血器官坏死病毒(infectioushaematopoieticnecrosisvirus,IHNV)、传染性胰脏坏死病毒(infectiouspancreaticnecrosisvirus,IPNV)、病毒性出血败血症病毒(viralhemorrhagicsepticemiavirus,VHSV)和传染性鲑鱼贫血症病毒(infectioussalmonanaemiavirus,ISAV)是养殖鱼类主要的病毒性病原，它们均能引起传染性、暴发性疾病，同时伴随着高死亡率，给养殖企业造成严重的经济损失，进而对整个产业带来伤害。大菱鲆红体病虹彩病毒(turbotreddishbodyiridovirus,TRBIV)是细胞肿大病毒属虹彩病毒的一个成员，主要感染我国养殖的大菱鲆。因此，建立这些病原的快速、有效、低成本的检测方法，对保障养殖鱼类健康、防治疾病发生具有重要的意义。

针对上述鱼类病毒，目前已有一些检测方法如核酸探针、常规PCR、RT-PCR、荧光定量PCR、环介导等温扩增(LAMP)等，还有可对17种鱼类病原同时进行检测的尼龙膜基因芯片方法(中国发明专利CN201010243398.3)。这些方法虽然能检测鱼类病毒，但都存在着致病的缺陷：核酸探针方法检测灵敏度低，低于10⁵拷贝的病毒无法检出，不能满足防控疾病的需求；常规PCR、RT-PCR、荧光定量PCR、环介导等温扩增(LAMP)等方法，因引物相互干扰，各病毒基因的扩增必须在不同的反应管中进行，故通常仅能对一种或几种病毒进行检测，无法对上述7种鱼类病毒同步、快速检测，检测效率低，不能满足未知病原样品的多病毒筛查需求；尼龙膜基因芯片方法虽然可以对17种鱼类病原同时检测，但其仍依赖常规PCR和RT-PCR方法，需要在多个反应管中对病原分别扩增，而不是在同一个反应管内对各病原进行扩增，因此工作量大，容易出现操作失误；且该方法应用尼龙膜点杂交技术对扩增结果进行检测，采用肉眼观察判断检测结果，灵敏度偏低且不易标准化，实际应用范围有限。

发明内容

本发明的目的是提供一种可同步检测7种鱼类病毒的多重PCR方法，从而弥补现有技术的不足。

本发明经反复摸索，设计出一组病毒特异性的套式PCR引物和通用性的超级引物，通过富集、加标签、分离、扩增等四大步骤，实现了在一支反应管中对7种病毒9个基因的同步、高灵敏性、高特异扩增。本发明克服了多重PCR技术用于鱼类病毒检测时存在的引物设计困难、反应相互干扰、扩增效率和准确度差等缺点，是现有鱼类多病毒同步检测技术的突破。

本发明首先提供一种多重PCR的引物组，其引物的序列分别为SEQIDNO:1-36；

所述的引物组用于制备检测淋巴囊肿病毒LCDV、细胞肿大病毒属虹彩病毒Mega、赤点石斑鱼神经坏死病毒RGNNV、传染性造血器官坏死病毒IHNV、传染性胰脏坏死病毒IPNV、病毒性出血败血症病毒VHSV、传染性鲑鱼贫血症病毒ISAV的制品；

所述的制品，优选为基因芯片；

本发明另一方面提供一种基因芯片，所述的芯片在玻璃片基上固定有用于检测的巴囊肿病毒LCDV、细胞肿大病毒属虹彩病毒Mega、赤点石斑鱼神经坏死病毒RGNNV、传染性造血器官坏死病毒IHNV、传染性胰脏坏死病毒IPNV、病毒性出血败血症病毒VHSV、传染性鲑鱼贫血症病毒ISAV的探针，所述探针的序列分别为SEQIDNO:37-46；

作为优选，上述的基因芯片上还设置有表面化学质控(QC-1)和空白对照质控(QC-4)；

表面化学质控(QC-1)为一段荧光素标记的优选的寡核苷酸序列，其序列为SEQIDNO:47(5′-ACAAGGGATATCGCTGGGT-3′)，该序列不产生稳定的二级结构，与上述鱼类病毒病原的基因序列也没有同源性；

空白对照质控(QC-4)为ddH₂O。

本发明所述的多重PCR和基因芯片用于非疾病诊断治疗目的病毒检测，所述病毒为淋巴囊肿病毒LCDV、细胞肿大病毒属虹彩病毒Mega、赤点石斑鱼神经坏死病毒RGNNV、传染性造血器官坏死病毒IHNV、传染性胰脏坏死病毒IPNV、病毒性出血败血症病毒VHSV、传染性鲑鱼贫血症病毒ISAV。

本发明还提供一种使用上述多重PCR和基因芯片检测淋巴囊肿病毒LCDV、细胞肿大病毒属虹彩病毒Mega、赤点石斑鱼神经坏死病毒RGNNV、传染性造血器官坏死病毒IHNV、传染性胰脏坏死病毒IPNV、病毒性出血败血症病毒VHSV、传染性鲑鱼贫血症病毒ISAV核酸是否存在的方法，检测不以疾病诊断治疗为目的；所述方法包括如下的步骤：

1)提取待检测样品的DNA和RNA；

2)将提取的RNA反转录制备cDNA；

3)进行多重PCR扩增和产物标记；

首先进行第一步PCR扩增：在PCR扩增液中添加引物组、提取的DNA和制备的cDNA进行扩增反应，获得预扩增产物；

其中PCR扩增液中，在50μL反应体系中含有0.05U/μL的Taq酶、Mg²⁺浓度为2mmol/L的10×PCRBuffer，0.25mmol/L的dNTPs，0.36μmol/L的引物组各引物的混合物；

第一步PCR扩增的反应程序如下：94℃5min；94℃15s，56℃15s，72℃15s，15个循环；94℃15s，70℃15s，6个循环；72℃3min；4℃保存备用；

将预扩增产物进行过滤，取洗脱液作为第二步PCR扩增的模板。

第二步PCR扩增体系：在单个200μl的PCR反应管中，含2.5U/μLTaqDNA聚合酶0.6μL，10×PCRBuffer(Mg²⁺plus)5μL，2.5mmol/LdNTPs5μL，10μmol/L正向通用引物(Fs)1μL，40μmol/LCy3标记的反向通用引物(Rs)1μL，模板(上述洗脱液)10μL，ddH₂O至50μL。

其中所使用的正向通用引物Fs的序列为SEQIDNO:48(5′-CAGGCCACGTTTTGTCATGC-3′)、反向通用引物Rs的序列为SEQIDNO:49(5′-TTCTTTGCGTTATGTCTCTG-3′)；

其中反向通用引物的5′端用荧光素标记，作为实施例的优选，所述的荧光素标记为Cy3标记；

第二步PCR扩增的反应程序：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，30个循环；72℃3min；4℃保存备用。

4)将Cy3标记的第二步扩增产物配制成杂交液，与预先制作好的基因芯片杂交；杂交结束后清洗，在基因芯片扫描仪上采集荧光信号，判断检测结果。判断标准如下：表面化学质控(QC-1)有清晰的荧光信号，同时空白对照质控(QC-4)无荧光信号表示杂交结果有效，此时各病毒探针位点有荧光信号即为病毒阳性，否则为病毒阴性；表面化学质控(QC-1)无荧光信号，或者空白对照质控(QC-4)有荧光信号，表示杂交结果无效。

常规多重PCR反应体系当中，随着目标片段种类数量的增加，反应体系的组成和反应过程的复杂性大大增加，从而极大地降低了检测方法的灵敏度和检测结果的可靠性。本发明采用特殊的多重PCR技术，设计、筛选了9套共36条特异性引物，建立了单管、同步扩增鱼类病毒特异性基因片段的方法，并对扩增体系和方法进行优化，最终实现了对7种常见鱼类病毒的高通量、高灵敏度、快速、同步检测。

附图说明

图1：基因芯片微阵列示意图，其中QC-1：表面化学质控；QC-4：空白对照质控；

图2：多重PCR第一步PCR扩增条件和参数的优化，其中A：TaqDNA聚合酶浓度；B：Mg²⁺浓度；C：dNTP浓度；D：引物浓度；E：退火温度；

图3：多重PCR对7种病毒9个基因的检测灵敏度；

图4：多重PCR对7种病毒9个基因的检测特异性；

图5：多重PCR对7种病毒9个基因的同步扩增；

图6：病鱼样品检测结果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1：引物和探针设计

根据GenBank中己公布的7种鱼类病毒的9段基因序列(包括LCDV、TRBIV、Mega和RGNNV的衣壳蛋白(CP)、IHNV核蛋白(N)、IPNV的VP5、VHSV的糖蛋白(G)、ISAV的核蛋白(NS)和基质蛋白(MA)等基因)，经反复比对和分析，使用PrimerPremier5.0分别设计病毒特异性的多重PCR引物，各引物序列及扩增片段大小详见表1。其中各内引物(Fi)的5′端有一段通用接头，正向接头的序列为SEQIDNO:48(5′-CAGGCCACGTTTTGTCATGC-3′)，反向接头序列为SEQIDNO:49(5′-TTCTTTGCGTTATGTCTCTG-3′)。这两段接头也作为单独的扩增引物使用，分别称之为正向通用引物Fs和反向通用引物Rs，Rs的5′端用Cy3标记。

此外，根据GenBank中己公布的上述7种鱼类病毒的9段基因序列，结合上述多重PCR扩增的最终扩增产物序列，本发明经反复比对和分析，使用AlleleID7.0分别设计病毒特异性的核酸探针，并将设计出的探针在NCBI上进行比对(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，确保这些探针与其它病原基因序列没有相似性。此外，还在探针5′端额外连上一段长度为15mer的poly(dT)作为间隔臂，以减少探针与芯片片基之间的空间位阻，提高杂交效率。各探针序列详见表2。

表1：设计的各引物序列及目标产物长度

表2：用于基因芯片的各鱼类病毒探针序列

实施例2：对7种鱼类病毒9个特异性基因的同步扩增和检测

本发明仅用于非疾病诊断和治疗目的的鱼类病毒检测，例如对饲料、养殖水体、养殖用具和死亡鱼体的检测。检测步骤如下所述。

(1)样品组织核酸的提取。取样品约0.02～1g置于1.5ml塑料微量离心管中，用一次性研磨棒将样品快速磨碎至浆状，然后使用“海洋动物组织DNA提取试剂盒”(天根生化科技有限公司，北京)和TRizol(宝生物生物工程有限公司，大连)分别提取DNA和RNA。具体操作步骤按照试剂盒或试剂的说明书进行。

(2)反转录制备cDNA。检测RGNNV、IHNV、IPNV、VHSV、ISAV等RNA病毒时，需要对RNA模版进行反转录，使用北京全式金生物公司的“一步法gDNA去除和cDNA合成试剂盒”进行。具体方法是：在200μl的微量离心管中，加入5～500ngRNA样品，1μl随机引物(0.1μg/μl)，10μl反转录缓冲液(2×TSReactionMix)，1μl反转录酶(RT/RIEnzymeMix)，1μl基因组DNA降解酶(gDNARemover)，DEPC处理水补足至20μl。将上述反应体系置于25℃10min，而后42℃30min，然后85℃5min，最后4℃保存备用。检测LCDV、Mega、TRBIV等DNA病毒不需要反转录，直接使用提取的DNA模版即可。

(3)多重PCR引物混合物(PrimerMix)的准备。取合成的表1中的各引物，分别稀释至100μmol/L；然后各取等量，加入新的微量离心管中并调整使每条引物的终浓度至2μmol/L，分装、保存于-20℃备用。

(4)多重PCR扩增和产物标记。

第一步PCR扩增体系：在单个200μl的PCR反应管中，含2.5U/μLTaqDNA聚合酶0.6μL，10×PCRBuffer(Mg²⁺plus)5μL，2.5mmol/LdNTPs5μL，2μmol/LPrimerMix5μL，提取的DNA模板和制备的cDNA模版各1μL，ddH₂O补充至50μL。扩增反应程序：94℃5min；94℃15s,55℃15s,72℃15s,15个循环；94℃15s，70℃15s，6个循环；72℃3min；4℃保存。

产物经0.5mL50kD超滤管(密里博，德国)离心，洗脱液作为第二步PCR扩增的模板。第二步PCR扩增体系：在单个200μl的PCR反应管中，含2.5U/μLTaqDNA聚合酶0.6μL，10×PCRBuffer(Mg²⁺plus)5μL，2.5mmol/LdNTPs5μL，10μmol/L正向通用引物Fs(SEQIDNO:485’-CAGGCCACGTTTTGTCATGC-3’)1μL，40μmol/LCy3标记的反向通用引物Rs(SEQIDNO:495’-Cy3-TTCTTTGCGTTATGTCTCTG-3’)1μL，模板(上述洗脱液)10μL，ddH₂O至50μL。扩增反应程序：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，30个循环；72℃3min；4℃保存。

(5)检测用基因芯片的制备。由于各病毒的多重PCR扩增产物大小相近，不能使用常规的琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果。故本发明通过基因芯片技术对上述扩增产物进行杂交检测(王胜强，耿伟光，李晋，等。基因芯片检测鱼类病毒的方法建立与优化[J]。中国动物检疫，2015,32(7)：77-81,84)。主要方法是：取病毒特异性的且与上述多重PCR扩增产物互补的10条寡核苷酸探针(探针序列见表2)点样在醛基修饰玻片上(百傲生物，上海)，其中针对Mega的扩增产物设计两条探针Mega-1和Mega-2，玻片上另设置5组表面化学质控(QC-1，SEQIDNO:475′-ACAAGGGATATCGCTGGGT-3′)和4组空白对照质控(QC-4，ddH₂O)。每种探针和每组质控各并排点3份，即设置3个平行。点样后的玻片置于湿盒中室温放置4h，0.5％SDS清洗10min，超纯水洗涤2min，制作成基因芯片微阵列备用(图1)。

(6)利用基因芯片方法对多重PCR扩增产物进行检测。将Cy3标记的多重PCR扩增产物配制成杂交液，与制作好的基因芯片微阵列在47℃条件下杂交1.5h。杂交液总体积为15μl，含100％甲酰胺3.75μl，20×SSC2.25μl，10％SDS0.3μl，50×Denhardt’s1.5μl，Cy3标记的多重PCR扩增产物7.2μl。杂交结束后清洗，在晶芯芯片扫描仪(博奥生物，北京)上采集荧光信号，判断检测结果。判断标准为：表面化学质控(QC-1)有清晰的荧光信号，同时空白对照质控(QC-4)无荧光信号表示杂交结果有效，此时各病毒探针位点有荧光信号即为病毒阳性，否则为病毒阴性；表面化学质控(QC-1)无荧光信号，或者空白对照质控(QC-4)有荧光信号，表示杂交结果无效。

实施例3：多重PCR第一步PCR参数的优化

为了达到最好的检测效果，本发明人对多重PCR第一步PCR中影响扩增效果的Taq酶浓度、Mg²⁺浓度、dNTPs浓度、引物浓度和退火温度五个参数进行调整和优化。其中Taq酶终浓度分别设定为0.045、0.050和0.055U/μL，Mg²⁺终浓度分别设定为2.0、2.8和3.6mmol/L，dNTPs终浓度分别设定为0.15、0.25和0.35mmol/L，各引物终浓度分别设定为0.32、0.36和0.40μmol/L，退火温度分别设定为54、56和58℃(图2)。图2中各芯片的表面化学质控QC-1均呈阳性，空白对照质控QC-4均呈阴性，表明杂交结果有效。

综合以上多次实验结果，最终优化出最适的多重PCR第一步PCR反应体系和扩增温度为：Taq酶(2.5U/μL)1.0μL，10×PCRBuffer(含20mmol/L的Mg²⁺)5μL，dNTPs(各2.5mmol/L)5μL，引物混合物(各2μmol/L)9μL，模板1μL，ddH₂O补至50μL，退火温度为56℃。

实施例4：多重PCR检测灵敏度的测定

取1μL10倍梯度稀释(10⁴～10¹copies/μL)的含各病毒目标片段的DNA或cDNA作为模板，用本发明建立并优化的反应体系和扩增温度进行灵敏度的测定。经多重PCR扩增，杂交、清洗和扫描，反应结果如图3所示。结果表明，本研究建立的多重PCR检测方法，对7种鱼类病毒9个致病基因的检测灵敏度分别为：10¹copies/μL(RGNNV、VHSV、ISAV-NS、ISAV-MA)、10²copies/μL(LCDV、Mega、IHNV、IPNV)和10³copies/μL(TRBIV)。其灵敏度显著优于常规的多重PCR方法。

实施例5：多重PCR检测特异性的验证

取1μL的含各病毒目标片段的DNA或cDNA作为模板，用本发明建立并优化的反应体系和扩增温度进行多重PCR扩增，验证本方法的特异性。经多重PCR扩增，杂交、清洗和扫描，反应结果如图4所示。图4中各芯片的表面化学质控QC-1均呈阳性，空白对照质控QC-4均呈阴性，表明杂交结果有效。结果表明，本发明建立的多重PCR检测方法，对7种病毒的9个基因均得到了大量的特异性扩增产物，杂交信号清晰可见。因此，本发明建立的多重PCR检测体系具有良好的扩增特异性。

实施例6：多重PCR对7种病毒9个基因的同步扩增效果的验证

将含上述7种病毒9个基因片段的DNA或cDNA混合在一起，取1μL混合物作为模板，用本发明建立并优化的反应体系和扩增温度在1只反应管中进行多重PCR扩增，验证本方法对病毒基因的同步扩增效果。经多重PCR扩增，杂交、清洗和扫描，反应结果如图5所示。图5中基因芯片的表面化学质控QC-1呈阳性，空白对照质控QC-4呈阴性，表明杂交结果有效。结果表明，本发明建立的多重PCR检测方法，可以同时对7种病毒的9个基因进行特异性扩增，杂交信号清晰可见。因此，本发明建立的多重PCR检测体系对鱼类具有良好的同步扩增效果。

实施例7：应用本发明建立的多重PCR方法检测死亡的病鱼样品

采用本发明建立的多重PCR方法对收集到的20尾死亡病鱼样品进行了7种病毒的同步检测。结果显示，有1尾牙鲆样品检出LCDV，2尾大菱鲆样品检出TRBIV，1尾半滑舌鳎和1尾珍珠龙胆石斑鱼样品检出RGNNV，1尾棕点石斑鱼、1尾卵圆鲳鯵样品、1尾斑石鲷样品检出Mega(图6)。图6中各芯片的表面化学质控QC-1均呈阳性，空白对照质控QC-4均呈阴性，表明杂交结果有效。由此证明本发明建立的检测7种鱼类病毒的多重PCR方法具有很强的实用性。

Claims (10)

1.一种多重PCR的引物组，其特征在于，所述的引物组中引物的序列分别为SEQIDNO:1-36。

2.权利要求1所述的引物组在制备检测淋巴囊肿病毒LCDV、细胞肿大病毒属虹彩病毒Mega、赤点石斑鱼神经坏死病毒RGNNV、传染性造血器官坏死病毒IHNV、传染性胰脏坏死病毒IPNV、病毒性出血败血症病毒VHSV、传染性鲑鱼贫血症病毒ISAV的制品中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的制品为基因芯片。

4.一种基因芯片，其特征在于，所述的芯片在玻璃片基上固定有用于检测权利要求1所述的引物组扩增获得的核酸片段的探针。

5.如权利要求4所述的基因芯片，其特征在于，所述的探针的序列分别为SEQIDNO:37-46。

6.如权利要求4或5所述的基因芯片，其特征在于，所述的基因芯片上还设置有表面化学质控和空白对照质控；所述的表面化学质控为荧光素标记的寡核苷酸序列，其序列为SEQIDNO:47；空白对照质控为ddH₂O。

7.权利要求1所述的引物组和权利要求6所述的基因芯片用于非疾病诊断治疗目的病毒检测，所述病毒为淋巴囊肿病毒LCDV、细胞肿大病毒属虹彩病毒Mega、赤点石斑鱼神经坏死病毒RGNNV、传染性造血器官坏死病毒IHNV、传染性胰脏坏死病毒IPNV、病毒性出血败血症病毒VHSV、传染性鲑鱼贫血症病毒ISAV中的任一种或几种。

8.一种不以疾病诊断治疗为目的的检测淋巴囊肿病毒LCDV、细胞肿大病毒属虹彩病毒Mega、赤点石斑鱼神经坏死病毒RGNNV、传染性造血器官坏死病毒IHNV、传染性胰脏坏死病毒IPNV、病毒性出血败血症病毒VHSV、传染性鲑鱼贫血症病毒ISAV的方法，包括如下的步骤：

1)提取待检测样品的DNA和RNA；

2)将提取的RNA反转录制备cDNA；

3)进行多重PCR扩增和产物标记；

首先进行第一步PCR扩增：在PCR扩增液中添加引物组、提取的DNA和制备的cDNA进行扩增反应，获得预扩增产物；

其中PCR扩增液中，在50μL反应体系中含有0.05U/μL的Taq酶、Mg²⁺浓度为2mmol/L的10×PCRBuffer，0.25mmol/L的dNTPs，0.36μmol/L的权利要求1所述的引物组中各引物的混合物；

第一步PCR扩增的反应程序如下：94℃5min；94℃15s，56℃15s，72℃15s，15个循环；94℃15s，70℃15s，6个循环；72℃3min；4℃保存备用；

将预扩增产物进行过滤，取洗脱液作为第二步PCR扩增的模板，其中所使用的正向通用引物Fs的序列为SEQIDNO:48、反向通用引物Rs的序列为SEQIDNO:49；反向通用引物Rs的5′端用荧光素标记；

第二步PCR扩增的反应程序：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，30个循环；72℃3min；4℃保存备用；

4)将Cy3标记的第二步扩增产物配制成杂交液，与预先制作好的基因芯片杂交；杂交结束后清洗，在基因芯片扫描仪上采集荧光信号，判断检测结果。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的荧光素标记为Cy3标记。

10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的判断检测结果的判断标准如下：表面化学质控有清晰的荧光信号，同时空白对照质控无荧光信号表示杂交结果有效，此时各病毒探针位点有荧光信号即为病毒阳性，否则为病毒阴性；表面化学质控无荧光信号，或者空白对照质控有荧光信号，表示杂交结果无效。