CN103725796A - 一种牛病毒性腹泻病毒内标分型荧光pcr检测试剂盒及其制备 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种牛病毒性腹泻病毒内标分型荧光PCR检测试剂盒及其制备。通过引物设计，用单重PCR扩增，获得了BVDV I、BVDV II和监控内标的PCR模板，通过引物设计和PCR扩增，并对反应条件进行了优化，建立了BVDV内标分型荧光PCR检测检测体系，实现了对BVDV I和BVDV II单独检测或同步检测，并可对检测结果进行质量监测。制备的检测试剂盒由cDNA合成体系和SYBR荧光PCR反应扩增体系两部分组成。该试剂盒对三种基因的最低检测限为10²拷贝，且具有较好的特异性和可重复性，确保检测质量，具有较好的应用价值。

Description

一种牛病毒性腹泻病毒内标分型荧光PCR检测试剂盒及其制备

发明领域

本发明涉及分子生物学领域，具体的，本发明涉及一种牛病毒性腹泻病毒(BVDV)内标分型荧光PCR检测试剂盒及其制备的技术领域。

背景技术

BVDV为黄病毒科瘟病毒属成员，对养牛业的危害性较大。我国现有的检测标准中，对BVDV的检测方法有基于细胞培养技术的荧光抗体法、免疫过氧化物酶单层检测法、微量血清中和试验、抗原捕获ELISA和PCR，前三种检测方法操作复杂，且对人员和环境的要求较高，不便于大批量进出口检验检疫的应用。抗原捕获ELISA检测方法灵敏度较低。随着分子生物学技术的快速发展，已有很多采用PCR或荧光PCR法对该病进行检测的报道，这些方法有效的提高了检测方法的灵敏度和可操作性。

已有的研究表明，由于样品中存在大量复杂的未知成分，以及样品处理过程中，一些物质的残留会影响PCR扩增，或样品处理过程中核酸的丢失，均可使检测测得的灵敏度降低甚至造成假阴性结果。已有许多学者对如何监控这些影响因素，校正PCR反应的结果做过大量的工作，其中采用在PCR反应体系中加入指示假阴性的扩增内标(internal amplification control，IAC)已得到普遍认可，如在反应体系中加入看家基因或者进行人工质粒合成等。磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)广泛存在于真核和原核生物的细胞核、细胞质和生物膜中，具有高度保守性，可用来作为内标监控基因，该基因可同时参与核酸提取和RT-PCR扩增的全过程。

经检索，国内外也未见有关检测灵敏度高，特异性好，操作方便，且通过内标的添加，指示并校准假阴性结果，也未见能够同时检测牛病毒性腹泻病毒基因I型(BVDV I)和牛病毒性腹泻病毒基因II型(BVDV II)的内标分型荧光PCR方法的报道。因此，探索和研究检测灵敏度高，特异性好，操作方便且能够指示并校准假阴性结果的方法，对于及时准确有效的检测BVDV，保护畜牧业健康发展、促进我国农产品出口和保护我国在国际贸易中的良好形象等方面均具有重要意义。

发明内容

针对目前国内外未见有关检测灵敏度高，特异性好，操作方便且能够指示并校正假阴性结果，提高检测结果的准确率，也未见能够同时对BVDV分型，且可对检测结果进行质量监控的荧光PCR检测方法，本发明提供一种BVDV内标分型荧光PCR检测试剂盒，旨在于提供一种检测灵敏度高、特异性好、试验周期短，且能够指示并校正假阴性结果，同时对BVDV I和BVDV II进行检测，并提高检测结果准确性的内标分型荧光PCR检测方法。通过引物设计，用单重PCR扩增，获得了BVDV I、BVDV II和监控内标的PCR模板，并对反应条件进行了优化，建立了BVDV内标分型荧光PCR检测检测体系，实现了对BVDVI和BVDV II单独检测或同步检测，且可通过内标对检测结果进行质量监控，从而实现对牛BVDV的灵敏、高效、快速、准确检测。

本发明的主要技术方案：通过在双重SYBR Green I荧光PCR反应体系中引入指示假阴性的内标，通过引物设计和PCR扩增，经反应条件优化，构建了能够对BVDV I和BVDV II进行同步检测，且含有对反应体系进行监控的内标SYBR Green I荧光PCR方法，并制备了检测试剂盒，试剂盒由cDNA合成体系和SYBR荧光PCR反应体系两部分组成，cDNA合成体系包括：引物混合液(含引物BR1、BR2和GR)、cDNA合成buffer、M-MLV和RNase抑制剂；SYBR荧光PCR反应体系包括：引物混合液(含BF1、BR1、BF2、BR2、GF、GR)、2×SYBR Premix Dimer Eraser和DEPC水。从而建立了BVDV内标分型荧光PCR检测方法，采用在双重荧光PCR反应体系中引入IAC，通过引物设计和PCR扩增，经反应条件优化，成功的建立了含有内标的荧光分型PCR反应体系，可以对核酸提取和PCR扩增过程进行监测，利用该试剂盒对三种基因的最低检测限为10²拷贝，且具有较好的特异性和可重复性，并可对检测结果进行质量监控，确保检测质量，具有较好的应用价值。

本发明具体提供一种BVDV内标分型荧光PCR检测试剂盒，所述的内标分型荧光PCR检测试剂盒通过如下具体方法获得：

(1)引物的设计与合成：

根据GenBank登录号为M31182.1的BVDV I和登录号为AY149216.1的BVDV II的5′-UTR保守区，登录号为NM001034034.2牛GAPDH的mRNA保守区，各设计一对特异性引物，扩增的目的片段长度分别为127bp、169bp、152bp。

(2)模板RNA的制备与阳性重组质粒的构建：

全血、血清、组织、肛拭子生物组织材料用Trizol常规试剂进行提取；牛奶经12000rpm离心10min，取沉淀加PBS稀释后用Trizol常规方法进行提取；提取的核酸于-20℃保存备用。

本发明中，以BVDV I的RNA为模板，反转录成cDNA后，用引物BF1和BR1扩增出长度为127bp的片段；以BVDV II的RNA为模板，反转录成cDNA后，用引物BF2和BR2扩增出长度为169bp的片段；以牛GAPDH的mRNA为模板，反转录成cDNA后，用引物GF和GR扩增出长度为152bp的片段。以上扩增片段分别克隆至pMD18-T载体，构建阳性重组质粒。

(3)内标分型荧光PCR检测体系建立：

单重条件优化，以两步法进行，第一步，引物BR1、BR2和GR的浓度分别为0.6μM、0.75μM和0.4μM，RNA模板10μL，70℃水浴10min，置冰上2min；取以上反应溶液6μL，加入50u M-MLV和10u RNase抑制剂，加入dNTPs终浓度为0.5mM，补去离子水至10μL，42℃保温1h，完成cDNA制备；第二步，20μL体系，取第一步所得cDNA2-5μL，BVDV I、BVDV II和GAPDH三种基因上下游引物终浓度分别为0.05μM、0.1μM、0.15μM、0.2μM、0.25μM、0.3μM、0.35μM和0.4μM进行优化，2×SYBR Premix Dimer Eraser10μL，荧光定量PCR反应程序为：95℃预变性2min；95℃变性10s，56℃退火30s，72℃延伸30s，循环40次，在每个循环的最后一步收集荧光，并制作融解曲线。

本发明经过二重荧光PCR条件的优化，在单重荧光PCR最佳条件基础上，固定一对引物用量，确定另一对引物的用量。

本发明经过内标分型荧光PCR条件的优化，在二重荧光PCR最佳反应条件的基础上，优化第三对引物用量，获得最佳扩增条件。

优化后的检测体系为，第一步，25μL反转录体系，引物BR1、BR2和GR的浓度分别为0.6μM、0.75μM和0.4μM，RNA模板10μL，70℃水浴10min，置冰上2min，取以上反应溶液6μL，加入50u M-MLV和10u RNase抑制剂，加入dNTPs终浓度为0.5mM，补去离子水至10μL，42℃保温1h，完成cDNA制备；第二步，20μL SYBR荧光PCR体系，BVDV I、BVDV II和GAPDH上下游引物浓度分别为0.1μM、0.35μM和0.1μM，2×SYBR Premix Dimer Eraser10μL，试剂扩增条件：95℃，2min；95℃，10s，56℃，30s，72℃，30s，40个循环，每个循环最后一步检测荧光，制备融解曲线。BVDV I、BVDV II及GAPDH的融解温度分别为84.6±0.3℃、81.4±0.3℃、87.0±0.3℃。

(4)试剂盒的制备：

根据本专业通用做法，本发明按可进行50份样品扩增量组装检测试剂盒，试剂盒由cDNA合成体系和SYBR荧光PCR反应体系两部分组成：一是cDNA合成体系：含引物BR130μM，BR237.5μM，GR20μM引物混合液250μL，cDNA合成buffer125μL，buffer含Tris-HCl200mM、KCl300mM、MgCl₂12mM、DTT40mM、dNTP2mM，200U／μL的M-MLV12.5μL，40U／μL的RNase抑制剂12.5μL；二是SYBR荧光PCR反应体系：含BF1和BR1均为0.4μM，BF2和BR2均为1.4μM，GF和GR均为0.4μM引物混合液700μL，2×SYBRPremix Dimer Eraser500μL；DEPC水1.0mL。

试剂盒反操作方法：第一步，cDNA合成，引物混合液5μL，RNA10μL，补DEPC水至25μL，70℃水浴10min，置冰上2min，取上述反应液6μL加入0.25μLM-MLV、0.25μLRNase抑制剂和cDNA合成buffer2.5μL，补DEPC水至10μL，42℃保温1h，完成cDNA制备；第二步，内标分型荧光PCR体系20μL，PCR反应混合液5μL，2×SYBR Premix Dimer Eraser10μL，cDNA2μL，扩增条件：95℃，2min；95℃，10s，56℃，30s，72℃，30s，40个循环，每个循环最后一步检测荧光，制备融解曲线。BVDV I、BVDV II及GAPDH的融解温度分别为84.6±0.3℃、81.4±0.3℃、87.0±0.3℃。

本发明通过对BVDV内标分型荧光PCR检测试剂盒的特异性、灵敏度和重复性进行确证，通过对模板提取和RT-PCR扩增过程进行监测，证明了上述步骤制备的BVDV内标分型荧光PCR检测试剂盒具有检测灵敏度高、特异性好、试验周期短，且能够指示并校正假阴性结果，确保检测结果的准确性。

进一步，对本发明制备的试剂盒进行了应用，用本发明提供的试剂盒分别对口蹄疫病毒(FMDV)、蓝舌病病毒(BTV)、边界病毒(BDV)和猪瘟病毒(CSFV)核酸反转录后进行扩增，结果表明方法具有较好的特异性。

采用本发明制备的试剂盒分别对10⁸-10⁰拷贝的三种阳性重组质粒进行扩增，内标分型荧光PCR对三种基因的最低检测限为10²拷贝；同时对已知滴度的BVDV I和BVDV II混合物进行扩增，该多重荧光PCR对两种病毒的检测灵敏度均为10^-1TCID₅₀。

采用本发明制备的试剂盒分别对BVDV I、BVDV II和GAPDH的阳性质粒进行三次重复性检测，结果表明，该方法具有很好的重复性。

通过实施本发明具体的发明内容，可以达到以下有益效果：

(1)检测时间短：采用传统方法的检测时间至少需要在5天上，常规单重PCR检测对两种病的时间至少需要1天，采用本发明提供的试剂盒检测时间包括样品前处理到获得检测结果在3小时之内，缩短了检测时间。

(2)检测灵敏度高：本发明对三种阳性质粒的最低检测限为10²拷贝，对BVDV I和BVDV II的检测灵敏度均为10^-1TCID₅₀，具有较好的灵敏度。

(3)特异性好：分别对FMDV、BTV、BDV、CSFV核酸反转录后进行扩增，结果表明，各引物对各自模板具有较好的特异性。

(4)重复性好：用建立的内标分型荧光PCR方法分别对BVDV I、BVDV II和GAPDH的阳性质粒进行三次重复性检测，结果表明，该方法具有很好的重复性。

(5)污染少：与常规单重PCR检测相比，本发明提供的方法免去了电泳的过程，减少了过多操作过程造成的污染。

(6)成本低：使用的试剂为分子生物学常用试剂，价格便宜，易于采购，用量少。

(7)内标设计合理：GAPDH广泛存在于真核和原核生物的细胞核、细胞质和生物膜中，具有高度保守性，可用来作为内标监控基因，该基因可同时参与核酸提取和RT-PCR扩增的全过程。本实验通过对牛的不同组织样品提取核酸对GAPDH的mRNA经反转录后扩增，也均证明了该目的片段的稳定性。所设计的引物具有较好的特异性，经反应条件的优化，能够保证内标片段与两目的基因共扩增的进行，且内标基因的扩增不影响检测的灵敏度，从而通过内标的扩增可对模板提取和PCR扩增的全过程进行监控。

(8)实用价值高：本发明实现对试验过程实施监测，有效的解决了现有技术传统检测方法中存在的假阴性结果，可以对实验室进行质量监控，确保检测结果的准确性。

(9)应用效果好：采用本发明对临床收集的506份样品用该体系进行检测，均得到预期结果。

(10)借鉴意义大：采用本发明，为相关动物病检验检疫技术的研究提供了较好的借鉴意义，并为规范检测试剂向标准化水平的发展具有指导借鉴意义。

(11)应用前景广阔：本发明能够广泛应用于出入境检验检疫部门、畜牧兽医部门和养殖单位，为疫病的有效防控具有重要意义。

附图说明

图1所示为内标分型荧光PCR产物电泳结果，其中，A中1为BVDV I扩增片段的电泳结果，片段大小为127p，B中1为BVDV II扩增片段的电泳结果，片段大小为169bp，C中1为GAPDH扩增片段的电泳结果，片段大小为152bp；A、B、C中M均为DL2000DNA标准。

图2所示为内标分型荧光PCR的特异性试验结果，其中，1为FMDV，2为BTV，3为BDV，4为CSFV，5为空白对照。

图3所示内标多重SYBR Green I荧光PCR灵敏度检测结果，其中，左图动力学曲线(以BVDV I为例，1-8依次为10⁸-10⁰拷贝的BVDV I阳性质粒)，右图为含量为10⁸-10⁰拷贝的三种阳性质粒等量混合物扩增溶解曲线。

图4所示为内标分型荧光PCR重复性试验结果，其中，1为内标分型荧光PCR方法分别对BVDV I阳性质粒进行三次重复性检测，2为阴性对照。

具体实施方式

下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施。

本发明中参照GenBank登录号为M31182.1的BVDV I和登录号为AY149216.1的BVDV II的5′-UTR保守区，登录号为NM001034034.2牛GAPDH的mRNA保守区，各设计一对特异性引物，扩增的目的片段长度分别为127bp、169bp、152bp。

本发明中选用的阳性核酸、样品：BVDV I型Oregon C₂₄V标准毒株种毒、DH5α菌株及FMDV、BTV、BDV和CSFV核酸保存于新疆出入境检验检疫局技术中心。MDBK细胞、BVDV II279株由美国Ohio动物疾控中心张彦教授赠送；全血、血清、组织、肛拭子等样品采自南北疆不同地区的奶牛场。以上样品本领域普通技术人员也可获得。

本发明中选用的主要试剂：M-MLV反转录酶、RNase抑制剂、pMD18-T载体、2×SYBR Premix Dimer Eraser购自大连宝生物工程(大连)有限公司，Trizol、DL2000DNA Maker、dNTPs Mixture、Taq酶(2.5U／μL)、高纯质粒小量制备试剂盒、DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，DEPC水购自鼎国公司。本发明中选用的所有试剂和仪器都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。

实施例一：模板的制备与阳性重组质粒的构建

1.引物和探针的设计与合成

本发明的引物信息见表1。其中，参照GenBank登录号为M31182.1的BVDVI和登录号为AY149216.1的BVDV II的5′-UTR保守区，登录号为NM001034034.2牛GAPDH的mRNA保守区，各设计一对特异性引物，扩增的目的片段长度分别为127bp、169bp、152bp。具体参见附后的基因序列表。

表1内标分型荧光PCR引物设计结果

2.模板RNA的制备与阳性重组质粒的构建

全血、血清、组织、肛拭子样品用Trizol常规试剂进行提取；牛奶经12000rpm离心10min，取沉淀加PBS稀释后用Trizol常规方法进行提取；提取的核酸于-20℃保存备用。

本发明中，以的BVDV I的RNA为模板，反转录成cDNA后，用引物BF1和BR1经单重荧光PCR扩增出长度为127bp的片段；以BVDV II的RNA为模板，反转录成cDNA后，用引物BF2和BR2经单重荧光PCR扩增出长度为169bp的片段；以牛GAPDH的mRNA为模板，反转录成cDNA后，用引物GF和GR经单重荧光PCR扩增出长度为152bp的片段。以上扩增片段分别克隆至pMD18-T载体，构建阳性重组质粒，参见附图1。

扩增出目的片段结果如下：：

BVDV I型(127bp)，如SEQ ID NO.1：：

CGAGATGCCACGTGGACGAGGGCATGCCCAAAGCACATCTTAACCTGAGCGGGGGTCGCCCAGGTAAAAGCAGTTCTAACCGACTGTTACGGATACAGCCTGATAGGGTGCTGCAGAGGCCCACTGT。

BVDV II型(169bp)，如SEQ ID NO.2：

TTGCATGGGTGAAAGCGCCATTCGTGGTGTTATGGACACAGCCTGATAGGGTGTAGCAGAGACCTGCTATTCCGCTAGAAAAAACTCTGCTGTACATGGCACATGAAGTTGTTTTCAAATGAACTTCTATACAAAACATATAAACAAAAACCAGCAGGTGTTGTGGAAC。

GAPDH(152bp)，如SEQ ID NO.3：

CTCCTGCACCACCAACTGCTTGGCCCCCCTGGCCAAGGTCATCCATGACCACTTTGGCATCGTGGAGGGACTTATGACCACCGTCCACGCCATCACTGCCACCCAGAAGACTGTGGATGGCCCCTCCGAGAAGCTGTGGCGTGACGGCCGAG。

实施例二：内标分型荧光PCR扩增体系的建立

单重条件优化，以两步法进行，第一步，引物BR1、BR2和GR的浓度分别为0.6μM、0.75μM和0.4μM，RNA模板10μL，70℃水浴10min，置冰上2min取以上反应溶液6μL，加入50uM-MLV和10u RNase抑制剂，加入dNTPs终浓度为0.5mM，补去离子水至10μL，42℃保温1h，完成cDNA制备；第二步，20μL体系，取第一步所得cDNA2-5μL，BVDV I、BVDV II和GAPDH三种基因上下游引物终浓度分别为0.05μM、0.1μM、0.15μM、0.2μM、0.25μM、0.3μM、0.35μM和0.4μM进行优化，2×SYBR Premix Dimer Eraser10μL，荧光定量PCR反应程序为：95℃预变性2min；95℃变性10s，56℃退火30s，72℃延伸30s，循环40次，在每个循环的最后一步收集荧光，并制作融解曲线。

二重荧光PCR条件的优化，在单重荧光PCR最佳条件基础上，固定一对引物使用量，确定另一对引物的使用量。

内标分型荧光PCR条件的优化，在二重荧光PCR最佳反应条件的基础上，优化第三对引物用量，获取最佳扩增条件。

优化后的检测体系为，第一步，25μL反转录体系，引物BR1、BR2和GR的浓度分别为0.6μM、0.75μM和0.4μM，RNA模板10μL，70℃水浴10min，置冰上2min，取以上反应溶液6μL，加入50u M-MLV和10u RNase抑制剂，加入dNTPs终浓度为0.5mM，补去离子水至10μL，42℃保温1h，完成cDNA制备；第二步，20μLSYBR荧光PCR体系，BVDV I、BVDV II和GAPDH上下游引物浓度分别为0.1μM、0.35μM和0.1μM，2×SYBR Premix Dimer Eraser10μL，试剂扩增条件：95℃，2min；95℃，10s，56℃，30s，72℃，30s，40个循环，每个循环最后一步检测荧光，制备融解曲线。BVDV I、BVDV II及GAPDH的融解温度分别为84.6±0.3℃、81.4±0.3℃、87.0±0.3℃。

实施例三：特异性检测

以实施例一构建的试剂盒分别扩增了BVDV I、BVDV II、FMDV、BTV、BDV、CSFV等阳性核酸样品，除BVDV I、BVDV II和GAPDH有扩增外，其余被测样品均为阴性，说明方法具有较好的特异性，参见附图2。

实施例四：灵敏度检测

以实施例一构建的试剂盒分别对10⁸-10⁰拷贝的三种阳性重组质粒进行扩增，内标分型荧光PCR对三种基因的最低检测限为10²拷贝；同时对已知滴度的BVDV I和BVDV II混合物进行扩增该多重荧光PCR的检测灵敏度均为10^-1TCID₅₀。该方法具有较高的灵敏度。对阳性质粒的扩增曲线参见附图3。

实施例五：重复性检测

以实施例一构建的试剂盒分别对BVDV I、BVDV II和GAPDH三种阳性质粒进行三次重复性检测，参见附图4，结果表明该方法具有很好的重复性和稳定性。

实施例六：试剂盒的制备

经上述反应体系和扩增条件优化后，组装检测试剂盒，根据本专业通用做法，本发明按可进行50份样品扩增量组装检测试剂盒，依据实施例二中一个反应体系的浓度，组装的试剂盒反应体系包括cDNA合成体系和SYBR荧光PCR反应体系两部分组成：

(1)cDNA合成体系：含引物BR130μM，BR237.5μM，GR20μM的引物混合液250μL，cDNA合成buffer125μL，buffer含Tris-HCl200mM、KCl300mM、MgCl₂12mM、DTT40mM、dNTP2mM，200U／μL的M-MLV12.5μL，40U／μL的RNase抑制剂12.5μL。

(2)SYBR荧光PCR反应体系：含BF1和BR1均为0.4μM、BF2和BR2均为1.4μM、GF和GR均为0.4μM引物混合液700μL，2×SYBR Premix DimerEraser500μL。DEPC水1.0mL。

依据实施例二，试剂盒反操作方法为：cDNA合成引物混合液5μL，RNA10μL，补DEPC水至25μL，70℃水浴10min，置冰上2min，取上述反应液6μL加入0.25μL M-MLV、0.25μLRNase抑制剂和cDNA合成buffer2.5μL，补DEPC水至10μL，42℃保温1h，完成cDNA制备；第二步内标分型荧光PCR体系为20μL，PCR反应混合液5μL，2×SYBR Premix Dimer Eraser10μL，cDNA2μL，扩增条件：95℃，2min；95℃，10s，56℃，30s，72℃，30s，40个循环，每个循环最后一步检测荧光，制备融解曲线。BVDV I、BVDV II及GAPDH的融解温度分别为84.6±0.3℃、81.4±0.3℃、87.0±0.3℃。

并按照实施例三、四和五，分别对试剂盒的特异性、灵敏度和重复性进行验证，结果同实施例三、四和五。

实施例七：对临床样品的检测

利用所研制的检测试剂盒对新疆不同地区采集的506份牛全血、血清、牛奶和精液样品进行检测，检测结果为阳性的样品23份，其中1份为BVDV II型，其余22份均为BVDV I型，结果见表2。

表2临床样品检测结果

Claims (3)

1.一种牛病毒性腹泻病毒(BVDV)内标分型荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒由cDNA合成体系和SYBR荧光PCR反应扩增体系两部分组成：

(1)cDNA合成体系：引物混合液250μL，引物混合液含引物BR130μM，BR237.5μM，GR20μM，cDNA合成buffer125μL，buffer含Tris-HCl200mM、KCl300mM、MgCl₂12mM、DTT40mM、dNTP2mM，200U／μL的M-MLV12.5μL，40U／μL的RNase抑制剂12.5μL；

(2)SYBR荧光PCR反应体系：引物混合液700μL，引物混合液含BF1和BR1均为0.4μM、BF2和BR2均为1.4μM、GF和GR均为0.4μM，2×SYBRPremix Dimer Eraser500μL；DEPC水1.0mL。

2.如权利要求1所述BVDV内标分型荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所用的检测引物为：

(1)BVDV I检测引物

上游引物(BF1)：CGAGATGCCACGTGGACG；

下游引物(BR1)：TACAGTGGGCCTCTGCAGC；

可以扩增GeneBank登录号为M31182.1，226-352位BVDV I5′-UTR区的保守序列；

(2)BVDV II检测引物

上游引物(BF2)：TTGCATGGGTGAAAGCGC；

下游引物(BR2)：GTTCCACAACACCTGCTGG；

可以扩增GeneBank登录号为AY149216.1，283-451位BVDV25′-UTR区的保守序列；

(3)GAPDH内标检测引物

上游引物(GF)：TCAGCAAAGTATAAACCGATAGC；

下游引物(GR)：CAATCTCTATGGCCCTCGA；

可以扩增GeneBank登录号为NM001034034.2，514-665位牛GAPDH的mRNA特异性核苷酸序列。

3.如权利要求1所述BVDV内标分型荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，BVDV内标分型荧光PCR检测试剂盒具体检测方法为：

(1)内标多重PCR扩增

第一步：cDNA合成引物混合液5μL，RNA10μL，补DEPC水至25μL，70℃水浴10min，置冰上2min，取上述反应液6μL加入0.25μL M-MLV、0.25μLRNase抑制剂和cDNA合成buffer2.5μL，补DEPC水至10μL，42℃保温1h，完成cDNA制备；第二步：SYBR荧光PCR体系为20μL，引物混合液5μL，2×SYBR PremixDimer Eraser10μL，cDNA2μL，扩增条件：95℃，2min；95℃，10s，56℃，30s，72℃，30s，40个循环，每个循环最后一步检测荧光，制备融解曲线。BVDV1、BVDV2及GAPDH的融解温度分别为84.6±0.3℃、81.4±0.3℃、87.0±0.3℃；

(2)检测结果分析

如果目标模板和内标模板均能得到目的溶解曲线，表明反应体系正常，被检样品为阳性；

如果仅有内标溶解曲线，表明被检样品为阴性；

如果目的基因和内标基因均无扩增溶解曲线，表明反应体系中有抑制成分或核酸丢失，需要重新提取或进一步纯化核酸后再进行PCR反应。

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