CN110904270A

CN110904270A - 猪δ冠状病毒、猪流行性腹泻病毒和猪萨佩罗病毒的多重RT-PCR检测方法及应用

Info

Publication number: CN110904270A
Application number: CN201911179585.7A
Authority: CN
Inventors: 胡慧; 魏战勇; 丁庆文; 张红垒; 郑兰兰; 夏璐; 张云飞; 李倩; 李林姣; 单法
Original assignee: Henan Agricultural University
Current assignee: Henan Agricultural University
Priority date: 2019-11-27
Filing date: 2019-11-27
Publication date: 2020-03-24

Abstract

本发明属于病毒检测领域，特别是指猪δ冠状病毒、猪流行性腹泻病毒和猪萨佩罗病毒的多重RT‑PCR检测方法及应用。设计合成PEDV M基因、PDCoV N基因和PSV 2C基因的保守序列的3对特异性引物，然后对RT‑PCR反应条件进行优化，建立了能同时检测猪δ冠状病毒、猪流行性腹泻病毒和猪萨佩罗病毒的多重RT‑PCR诊断方法，并对所建立的方法进行特异性、敏感性和重复性分析；结果表明，本申请方法具有很好的特异性和较高的灵敏性，PDCoV的最低检测限量是1.40×10²copies/µL、PEDV的最低检测量是1.53×10²copies/µL和PSV的最低检测量是1.57×10³copies/µL。

Description

猪δ冠状病毒、猪流行性腹泻病毒和猪萨佩罗病毒的多重RT- PCR检测方法及应用

技术领域

本发明属于病毒检测领域，特别是指猪δ冠状病毒、猪流行性腹泻病毒和猪萨佩罗病毒的多重RT-PCR检测方法及应用。

背景技术

近些年来，猪病毒性疾病对于全球养猪行业造成了严重的危害，疾病的发生和流行日益严重，发病率逐年升高，多种病原混合感染和继发感染的情况也越来越普遍。猪δ冠状病毒（PDCoV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）和猪萨佩罗病毒（PSV）三种病毒均可以引起仔猪发生严重脱水、腹泻等相似的临床症状，且临床上混合感染现象比较普遍，给疾病的诊断以及防控带来了诸多困难。传统的动物病毒病诊断方法如在细胞上进行病毒分离、免疫学和血清学等检测方法虽然可以对三者进行诊断，但是存在其检测周期长、灵敏度低、耗时费力、检测成本高昂等的缺陷，不适宜用于大规模临床诊断，更重要的是，这些常规诊断方法一次只能诊断一种疾病，且需要特异性诊断试剂（如特异性的抗体），不能解决临床上的这几种疾病混合感染的鉴别诊断。随着分子生物学技术的快速发展，多重RT-PCR对多种疾病可以进行鉴别诊断，并且有着方便快捷、高通量等优点使得该技术成为临床确诊病原的简捷可靠的方法，在动物疫病诊断以及防控中发挥着不可替代的作用。

猪δ冠状病毒（Porcine deltacoronavirus，PDCoV）、猪流行性腹泻病毒（Porcineepidemic diarrhea virus，PEDV）均属于冠状病毒，其引起仔猪呕吐、腹泻的临床症状相似，难以区分。PDCoV最早于2012年Woo等在169份猪粪便样品中检测，2014年初，美国俄亥俄州首次检测报道一种新的冠状病毒PDCoV，截止2014年底美国发现PDCoV感染病例达17个州。2014年我国从腹泻仔猪的临床样品中检测到PDCoV，并且国内的一些流行病学调查结果表明PDCoV在我国的流行较普遍。PEDV属于α群冠状病毒，经典株PEDV最早在1971初在欧洲被发现，随后传播到亚洲。从2010年起，全国开始大规模爆发变异株PEDV，这次爆发中仔猪病死率高达90%。猪萨佩罗病毒(porcine sapelovirus，PSV)在上世纪60年代由英国LamontP等在腹泻猪的粪便样品中分离得到，随后在巴西、西班牙、中国等其他国家相继报道。

在我国引起猪腹泻的诸多病原中，PDCoV、PEDV和PSV在猪的腹泻粪便中检出率较高，可到达30%以上，而且混合感染现象较普遍，这些病毒引起的疾病的临床症状相似，想要快速准确地诊断病原比较困难。鉴别这三种疾病的传统方法有临床观察、病理切片观察、病毒分离、荧光抗体检测、免疫组织化学法等。但临床观察和显微病变观察不能有效区分是具体是PDCoV感染、PEDV感染还是PSV感染；而免疫组化法和荧光抗体法需要特定的抗体，具有较强的非特异性；病毒分离周期长耗时多，且这3种病毒只能感染一些特殊的细胞。RT-PCR方法有较好的特异性和敏感性，目前广泛应用于动物传染病的诊断中。现有的研究进展为：逢凤娇等建立的RT-PCR方法对PDCoV的最低检测浓度为4.05×10³copies/µL；韦学雷等建立的多重RT-PCR检测方法中对PEDV的最低检测浓度均为3.88×10⁴copies/µL；孟丽等建立的RT-PCR方法对PSV的最低检测浓度为6×10⁴copies/µL；本试验拟建立针对PDCoV、PEDV和PSV这三种病原的多重RT-PCR检测方法，可以在一个反应管中对这三种疾病同时鉴别诊断，并对此方法进行特异性、敏感性和重复性分析。利用建立的方法对92份河南部分地区养猪场的送检样品进行检测，验证该方法的可靠性。该方法的建立对PDCoV、PEDV和PSV的流行病学调查具有重要作用。

发明内容

本发明提出一种猪δ冠状病毒、猪流行性腹泻病毒和猪萨佩罗病毒的多重RT-PCR检测方法及应用，解决了快速、灵敏、适合推广应用的检测猪δ冠状病毒、猪流行性腹泻病毒和猪萨佩罗病毒的技术问题。

本发明的技术方案是这样实现的：

猪δ冠状病毒、猪流行性腹泻病毒和猪萨佩罗病毒的多重RT-PCR检测方法，步骤如下：

（1）分别设计猪δ冠状病毒毒株的N基因、猪流行性腹泻病毒的M基因和猪萨佩罗病毒的2C基因的引物对；

（2）从待测样本的细胞液中提取病毒核酸，反转录制备cDNA作为模板，以步骤（1）得到的三组引物对为引物，进行多重RT-PCR反应；

（3）回收步骤（2）的多重RT-PCR反应的产物进行凝胶电泳检测。

所述步骤（1）中猪δ冠状病毒的N基因的引物对序列如SEQ ID No.1/SEQ ID No.2所示；猪流行性腹泻病毒的M基因的引物对序列如SEQ ID No.3/SEQ ID No.4所示；猪萨佩罗病毒的2C基因的引物对序列如SEQ ID No.5/SEQ ID No.6所示。

所述步骤（2）中多重RT-PCR反应体系为：2×TaqDNAMaster Mix 15µL、浓度为12.5µmol/L的上下游引物各0.5µL、cDNA模板2µL、用灭菌ddH2O补足25µL。

所述步骤（2）中多重RT-PCR反应扩增参数为：95℃ 5min，95℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 30s，35个循环，72℃延伸10min。

所述的多重RT-PCR检测方法在特异、准确检测猪δ冠状病毒、猪流行性腹泻病毒和猪萨佩罗病毒中的应用。

所述猪δ冠状病毒的最低检测量是1.40×10²copies/µL、猪流行性腹泻病毒的最低检测量是1.53×10² copies/µL和猪萨佩罗病毒的最低检测量是1.57×10³copies/µL。

本发明具有以下有益效果：

1、本试验基于PDCoV，PEDV和PSV的保守基因设计合成三对特异性引物通过对单重RT-PCR引物浓度以及退火温度的优化，逐步筛选并优化了多重RT-PCR的引物浓度和退火温度，提高多重RT-PCR扩增效率，从而成功建立可以同时检测PDCoV、PEDV和PSV的多重RT-PCR诊断方法。特异性试验结果表明，多重RT-PCR能对PDCoV，PEDV和PSV阳性质粒检测为阳性，而对其他病原体如PBoV、PRRSV、PRV、CSFV和PCV检测均为阴性，说明该方法具有良好的特异性。

2、本试验具有良好的敏感性，PDCoV的最低检测量是1.40×10²copies/µL、PEDV的最低检测量是1.53×10² copies/µL和PSV的最低检测量是1.57×10³copies/µL。利用所建立的三重RT-PCR方法对河南省不同地区的92份临床样品进行检测，结果显示PDCoV阳性率为40.22%，PEDV阳性率为58.70%，PSV阳性率为22.83%，PDCoV、PEDV和PSV混合感染阳性样品3份，阳性率为3.26%，其中PEDV的检出率明显高于PDCoV和PSV，在一定程度上说明当前造成河南部分地区仔猪腹泻的主要病原是PEDV，同时存在PDCoV和PSV或混合感染。

3、本试验建立的多重RT-PCR方法对于PDCoV、PEDV和PSV这三种病原敏感率高，特异性强，实现了3种疾病的鉴别诊断，能快速准确地对临床样品检测，可应用于临床鉴别诊断，对于三种疫病的流行病学调查以及防控等具有重要的意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为单一RT-PCR退火温度优化图，其中M：DM2000DNAMarker；1,2,3,4,的退火温度分别为49,50,51,52,53,54℃。

图2为单一RT-PCR引物浓度优化图，其中M.DM2000DNAMarke；1,4,7的引物浓度分别为6.25µmol/L；2,5,8引物浓度为12.5µmol/L；3,6,9引物浓度25µmol/L。

图3为多重RT-PCR退火温度的优化图，M.DM2000DNAMarker；1,2,3,4,5,6的退火温度分别为49,50,51,52,53,54℃。

图4为多重RT-PCR特异性试验图，其中M:DM2000DNAMarker;1:PDCoV、PEDV、PSV多重RT-PCR产物；2-9分别是:PEDV、PDCoV、PSV、PBoV、PRRSV、CSFV、PRV和PCV的RT-PCR产物；10:阴性对照。

图5为多重RT-PCR的敏感性试验图，其中M为DL1000DNAMarker；1-8分别为10⁰-10⁷倍稀释；N.阴性对照。

图6为多重RT-PCR重复性试验图，其中M为DM2000DNAMarker；1为混合质粒；2,3,4.分别为PDCoV、PEDV和PSV单一质粒。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例

一、实验材料

猪δ冠状病毒（PDCoV,CH-01株）、猪萨佩罗病毒（PSV）阳性病料、猪流行性腹泻病毒（PEDV）阳性病料、猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV）、猪博卡病毒（PorcineBocavirus，PBoV）、猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）和猪圆环病毒（Porcine circovirus，PCV）阳性病料均由河南省动物性食品安全重点实验室保存，猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine respiratory and reproductive syndrome virus，RRRSV）疫苗购自哈尔滨维科生物技术公司。病料来源于2017-2019年河南省部分地市发生腹泻死亡仔猪的小肠以及腹泻仔猪的粪便92份。

二、主要试剂

反转录试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司生物技术公司；DNA -Marker、pMD18-T载体、感受态细胞DH5α、PCR相关试剂、DNA凝胶回收试剂盒均购自宝日医生物技术(北京)有限公司；TransZol试剂购自全氏金生物公司；DMEM培养液购自武汉博士德生物工程有限公司；质粒抽提纯化试剂盒购自美国OMEGA生物技术公司。

三、实验方法

1、应用PrimerPremier6.0基因分析软件，参照Genbank中登录的PDCoV-CHJXNI2/2015毒株（登录号：KR131621）N基因、PEDV JS-A毒株（登录号MH748550.1）M基因、PSV USA/IA33375/2015（登录号：KX574284.1）2C基因设计3对引物（表1），分别扩增564bp，298bp，206bp的目的片段，上述引物由北京擎科新业生物技术有限公司合成。

表1 多重RT-PCR引物信息

2、病毒核酸的提取

2.1 病毒RNA的提取及反转录

接毒后的细胞液和临床样品反复冻融3次后提取病毒核酸。按照Trizol法提取上述制备的病毒悬液中的总RNA，按照Vazyme反转录试剂盒（HiScript®Ⅱ1st Strand cDNASynthesis kit）说明书进行反转录合成cDNA，反应体系总体积为20µL，得到产物cDNA在-80℃保存。

2.2 病毒DNA的提取

采用常规的苯酚/氯仿抽提法提取猪伪狂犬病毒(PRV）、猪博卡病毒（PBoV）和猪圆环2型病毒（PCV-2）阳性病料中的DNA，-80℃保存。

3、单重RT-PCR扩增及反应条件的优化

3.1 单重RT-PCR扩增cDNA

PCR反应体系为25µL体系，包括2×TaqDNAMaster Mix13µL，上下游引物各0.5µL（12.5µmol/L），cDNA模板2µL，灭菌ddH₂O补足25µL。RT-PCR反应扩增参数为：95℃ 5min，95℃ 30s，54℃ 30s，72℃ 30s，35个循环，72℃延伸10min。

3.2 单重RT-PCR退火温度和引物浓度的确定

采用不同的退火温度（49、50、51、52、53、54℃），上下游引物分别取0.25µL（6.25µM）、0.5µL（12.5µM）和1µL（25µM），以PDCoV、PEDV和PSV的cDNA为模板进行PCR反应。

3.3 RT-PCR产物的验证以及重组质粒的构建

取上述3种病毒RT-PCR产物5µL在1.0%的琼脂糖凝胶上电泳，对扩増产物进行验证。扩增条带与目的片段相符，则进行切胶，用胶回收试剂盒对切胶产物进行回收纯化后，将3种病毒的目的基因分别与pMD18-T载体16℃连接过夜后，将连接产物转化至 DH5α感受态细胞，经挑斑、摇菌扩大培养，菌液PCR验证后，按OMEGA快速质粒小提取试剂盒说明书进行质粒的提取，质粒送北京擎科新业生物技术有限公司进行测序。

4、多重RT-PCR扩增及反应条件优化

4.1 多重RT-PCR反应退火温度和引物浓度的确定

在RT-PCR确定的退火温度及引物浓度的基础上，筛选出多重RT-PCR反应体系的退火温度及引物浓度。反应体系中3对引物浓度均为12.5µmol/L，不同的退火温度下进行反应，即49、50、51、52、53、54℃（图3）。图中52℃时三条条带扩增效果均较好，所以确定最佳退火温度为52℃。

4.2 多重RT-PCR特异性试验

以PDCoV、PEDV和PSV的单一和混合质粒为模板，PBoV、PRV、PCV的DNA，PRRSV、CSFV的cDNA为模板用建立的多重RT-PCR方法进行扩增，并选择ddH₂O做阴性对照，验证所建立多重RT-PCR方法的特异性。

4.3多重RT-PCR敏感性试验

将测序验证正确的阳性质粒作为标准品，用Nano Drop2000超微量分光光度计测定浓度后将三种质粒等量混匀，用ddH₂O进行10倍倍比系列稀释，取稀释后质粒2µL作为模板，然后评价其敏感性。

4.4多重RT-PCR重复性试验

利用建立的多重RT-PCR检测方法对不同批次制备的PDCoV、PEDV、PSV混合重组质粒及单一质粒为模板进行检测，重复检测3次，以验证检测方法的重复性。

5、结果

5.1 单一RT-PCR引物浓度和退火温度的确定

分别以PDCoV，PEDV和PSV的cDNA为模板，采用不同的退火温度（49,50,51,52,53,54℃）以及不同的引物浓度进行扩增（图1，2）。图中可见大约有564bp，298bp和206bp的条带，与目的条带大小相符，并且当退火温度为52℃，引物浓度为12.5µmol/L时，扩增效果最好，所以最终确定退火温度为52℃，引物浓度为12.5µmol/L。

5.2 多重RT-PCR反应退火温度的优化

反应体系中3对引物浓度均为12.5µmol/L，不同的退火温度下进行反应，即49、50、51、52、53、54℃（图3）。图中52℃时三条条带扩增效果均较好，所以确定最佳退火温度为52℃。

5.3 多重RT-PCR方法的特异性确定

PDCoV、PEDV、PSV的混合及单一质粒为模板，PRV、PBoV、PCV的DNA，PRRSV、CSFV的cDNA为模板，分别应用建立的多重RT-PCR方法进行扩增（图4）。结果表明，只有PDCoV、PEDV、PSV单一和混合质粒模板扩增出与相应目的片段大小符合的条带，而其它病毒均无条带。

5.4多重RT-PCR的敏感性确定

以PDCoV、PEDV和PSV的混合质粒10倍倍比稀释，选取10¹~10⁷稀释后的质粒作为模板，用建立好的多重RT-PCR方法进行扩增（图5）。结果显示，PDCoV的最低检测量是1.40×10²copies/µL、PEDV的最低检测量是1.53×10²copies/µL和PSV的最低检测量是1.57×10³copies/µL

5.5多重RT-PCR的重复性验证

以PDCoV、PEDV和PSV混合及单一质粒为模板，用优化后的反应条件重复检测3次（图6），可见本试验的多重RT-PCR方法重复性较好。

5.6多重RT-PCR方法的建立

在单重RT-PCR方法反应条件确定后，优化出三重 PCR方法反应条件，反应采用单一模板和混合模板,同时设定阴性对照(ddH₂O) 。RT-PCR反应体系：2×TaqDNAMaster Mix 15µL，上下游引物各0.5µL（12.5µmol/L），cDNA模板2µL，灭菌ddH₂O补足25µL 。RT-PCR反应扩增参数为：95℃ 5min，95℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 30s，35个循环，72℃延伸10min。

5.7 多重RT-PCR临床样品检测结果

用建立的多重RT-PCR和单一RT-PCR对采集自河南不同地区的92份样品进行检测（表2）。PDCoV阳性样品数36份，阳性率为39.13%；PEDV阳性样品53份，阳性率为57.61%；PSV阳性样品21份，阳性率为22.83 %。PDCoV，PEDV和PSV混合感染阳性样品3份，阳性率为3.26%。

表2 临床样品检测结果

实施效果例

在应用多重RT-PCR方法进行临床诊断时，由于样品的核酸背景复杂，使RT-PCR扩增极易出现非特异性条带，因此，在建立多重RT-PCR方法时，引物设计是多重RT-PCR试验的重中之重，同时还需要注意对PCR反应体系、退火温度以及引物浓度等条件进行优化。本试验基于PDCoV，PEDV和PSV的保守基因设计合成三对特异性引物通过对单重RT-PCR引物浓度以及退火温度的优化，逐步筛选并优化了多重RT-PCR的引物浓度和退火温度，提高多重RT-PCR扩增效率，从而成功建立可以同时检测PDCoV、PEDV和PSV的多重RT-PCR诊断方法。特异性试验结果表明，多重RT-PCR能对PDCoV，PEDV和PSV阳性质粒检测为阳性，而对其他病原体如PBoV、PRRSV、PRV、CSFV和PCV检测均为阴性，说明该方法具有良好的特异性。此外本试验具有良好的敏感性，PDCoV的最低检测量是1.40×10²copies/µL、PEDV的最低检测量是1.53×10²copies/µL和PSV的最低检测量是1.57×10³copies/µL，而逢凤娇等建立的RT-PCR方法对PDCoV的最低检测浓度为4.05×10³copies/µL；韦学雷等建立的多重RT-PCR检测方法中对PEDV的最低检测浓度均为3.88×10⁴copies/µL；孟丽等建立的RT-PCR方法对PSV的最低检测浓度为6×10⁴copies/µL, 此外，以PDCoV，PEDV和PSV重组的单一以及混合质粒为模板进行重复性实验，3次重复试验的结果一致，说明该方法具有良好的重复性。

利用所建立的三重RT-PCR方法对河南省不同地区的92份临床样品进行检测，结果显示PDCoV阳性率为40.22%，PEDV阳性率为58.70%，PSV阳性率为22.83%，PDCoV、PEDV和PSV混合感染阳性样品3份，阳性率为3.26%，其中PEDV的检出率明显高于PDCoV和PSV，在一定程度上说明当前造成河南部分地区仔猪腹泻的主要病原是PEDV，同时存在PDCoV和PSV或混合感染。

综上所述，本试验建立的多重RT-PCR方法对于PDCoV、PEDV和PSV这三种病原敏感率高，特异性强，实现了3种疾病的鉴别诊断，能快速准确地对临床样品检测，可应用于临床鉴别诊断，对于三种疫病的流行病学调查以及防控等具有重要的意义

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

<110>河南农业大学

<120>猪δ冠状病毒、猪流行性腹泻病毒和猪萨佩罗病毒的多重RT-PCR检测方法及应用

<160>6

<210> 1

<211>715

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_difference

<222> (1)...(22)

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Claims

1.猪δ冠状病毒、猪流行性腹泻病毒和猪萨佩罗病毒的多重RT-PCR检测方法，其特征在于，步骤如下：

（2）从猪δ冠状病毒、猪流行性腹泻病毒和猪萨佩罗病毒的细胞培养物中提取病毒核酸，反转录制备cDNA作为模板，以步骤（1）得到的三组引物对为引物，进行多重RT-PCR反应；

2.根据权利要求1所述的猪δ冠状病毒、猪流行性腹泻病毒和猪萨佩罗病毒多重RT-PCR检测方法，其特征在于：所述步骤（1）中猪δ冠状病毒的N基因的引物对序列如SEQ ID No.1/SEQ ID No.2所示；猪流行性腹泻病毒的M基因的引物对序列如SEQ ID No.3/SEQ ID No.4所示；猪萨佩罗病毒的2C基因的引物对序列如SEQ ID No.5/SEQ ID No.6所示。

3.根据权利要求1所述的猪δ冠状病毒、猪流行性腹泻病毒和猪萨佩罗病毒多重RT-PCR检测方法，其特征在于，所述步骤（2）中多重RT-PCR反应体系为：2×TaqDNAMaster Mix 15µL、浓度为12.5µmol/L的上下游引物各0.5µL、cDNA模板2µL、用灭菌ddH2O补足25µL。

4.根据权利要求1所述的猪δ冠状病毒、猪流行性腹泻病毒和猪萨佩罗病毒多重RT-PCR检测方法，其特征在于，所述步骤（2）中多重RT-PCR反应扩增参数为：95℃ 5min，95℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 30s，35个循环，72℃延伸10min。

5.权利要求1-4任一项所述的多重RT-PCR检测方法在特异、准确检测猪δ冠状病毒、猪流行性腹泻病毒和猪萨佩罗病毒中的应用。

6.权利要求5所述的应用，其特征在于：所述猪δ冠状病毒的最低检测量是1.40×10²copies/µL、猪流行性腹泻病毒的最低检测量是1.53×10² copies/µL和猪萨佩罗病毒的最低检测量是1.57×10³copies/µL。