CN103525948A - 猪萨佩罗病毒实时荧光定量rt-pcr检测方法 - Google Patents

猪萨佩罗病毒实时荧光定量rt-pcr检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种猪萨佩罗病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法。本发明的方法是：针对萨佩罗病毒的保守基因片段设计两条引物，准备RNA样品，设置反应条件，进行荧光定量RT-PCR。通过标准曲线的制作、特异性验证，结果显示该方法的最低检出限为10拷贝数的数量级；同时该方法具有高的特异性，可以与猪捷申病毒、猪肠道病毒9、猪口蹄疫病毒、脑心肌炎病毒、猪传染性肠胃炎、猪流行性腹泻和猪繁殖与呼吸道综合症病毒分离开来。对63份猪粪便样品进行检测，检测出7分样品，阳性率为11.11%。该方法具有简单、准确、高效、快速、无污染等特点，非常适合用于猪萨佩罗病毒的检测和定量。

Description

猪萨佩罗病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，是针对猪萨佩罗病毒的一种高效快速的检测方法。
背景技术
猪萨佩罗病毒（Porcine Sapelovirus）是微RNA病毒科萨佩罗病毒属的一种猪的病毒。它可以引起猪的神经紊乱、繁殖失败、呼吸衰竭、肺炎以及腹泻等综合症状。该病毒可以同其他猪的病毒发生混合感染，给养猪业带来非常巨大的经济威胁。因此，对该种病毒的检测，是早预防、早防治以及解除猪群间相互感染的重要措施。本实验针对的是中国第一株萨佩罗病毒（PSV-Csh）（基因编号：HQ875059），该病毒的基因组全长是7502个碱基对，只有一个开放阅读框架，编码一个多聚蛋白前体，在基因组的5'端和3'端是基因组的非翻译区5'UTR和3'UTR。
目前，对于该病毒的检测手段有很多，如病毒的分离、酶联免疫吸附法、各种PCR手段。病毒分离和酶联免疫吸附法都是最基础的检测方法，但是却也是最耗时的检测手段，对于突发性的疫病的提前诊断，不能做到尽早的检测，这样可能会耽误了疫病的控制。分子生物学的检测方法已经越来越受到重视，如RT-PCR已经成为一种经典的、常规的检测手段。特别是近年来实时荧光定量PCR的发明，对于病毒等病原的检测来说，实现了快速、精准和可视化，同时实现了从定性到定量的飞跃。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效、快速、实时检测猪萨佩罗病毒的方法，可应用于各级动物预防控制中心、各级动物诊所以及企业。
为了实现上述目的，本发明提供的是一种基于SYBR实时荧光定量RT-PCR扩增技术来检测猪萨佩罗病毒。
本发明所述的SYBR实时荧光定量RT-PCR方法检测猪萨佩罗病毒的方法，技术方案如下：
（1）设计引物：
登录GenBank，获取萨佩罗病毒的基因序列，利用软件Clustal W和DNAstar筛选该病毒基因组的保守片段，借助Primer Premier6.0进行引物设计和筛选，最后利用GenBank的Blast的功能确定引物的特异性。引物序列送至生工生物工程（上海）有限责任公司进行合成。
（2）RNA样品的准备：
采用商品化的RNA/DNA提取试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司）提取RNA，提取的RNA放于-80C保存备用。
（3）反应体系的配置：
采用商品化的一步法SYBR荧光定量RT-PCR试剂盒（宝生物工程（大连）有限公司），根据试剂盒的说明书进行反应液的配置，其中，RT-PCR的缓冲液为10微升，大连宝生的Taq HS混液为1.2微升，PrimeScript PLUS RTase混液为0.4微升，ROX参比染料II为0.4ul和无RNase dH2O为4.4微升，同时加入所述的引物和RNA，引物的终浓度为0.4微升。
（4）反应和结果分析：
上述反应液可以由ABI实时定量系统进行RT-PCR反应条件是：逆转录反应：42C，5分钟；95C，10秒；PCR反应：95C，5秒；60C，34秒；40个循环。如果出现扩增曲线、Ct值小于35个循环且Tm值为85.62±0.11范围内可判断结果为阳性，否则即为阴性。
（5）RNA标准品制备和标准曲线的制作
1）扩增片段标准品构建的引物设计；
2）重组片段的调取；
3）PCR产物精制；
4）体外转录RNA标准品（以调取目的基因PCR产物为模板，进行RNA标
准品转录）；
5）标准曲线的制作。
根据以上技术方案，本发明提供了一种猪萨佩罗病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法，包括如下步骤：
（1）样品预处理
样品采用1%的磷酸缓冲液处理后，采用RNA/DNA提取试剂盒提取RNA；
（2）配制反应体系
采用SYBR荧光定量RT-PCR试剂盒，配置反应液，其中，RT-PCR的缓冲液为10微升，大连宝生的Taq HS混液为1.2微升，PrimeScript PLUS RTase混液为0.4微升，ROX参比燃料II为0.4微升和无RNase dH2O为4.4微升，同时加入引物和待检样品RNA；
上游引物（5’-3’）为：GGATGGACACAAGGACTT；
下游引物（5’-3’）为：GTTCACTGCCTACTCTCC；
优选地，加入上下游引物的量均为0.4微升；
优选地，加入待检样品RNA的量均为2微升；
（3）反应和结果分析
上述反应体系由ABI实时定量系统进行RT-PCR；根据反应的曲线、Ct值和溶解曲线判断结果的阴性和阳性；
优选地，上述反应体系在Applied Biosystems7500/7500Fast Real-Time PCRsystem进行。
优选地，反应条件是：逆转录反应：42C，5分钟；95C，10秒；
PCR反应：95C，5秒；60C，34秒；
优选地，结果判断方法为，现扩增曲线、Ct值小于35个循环且Tm值为85.62±0.11范围内可判断结果为阳性，否则即为阴性。
进一步地，本发明的方法还包括步骤4），RNA标准品制备和标准曲线的制作：
1）扩增片段标准品构建的引物设计；
2）重组片段的调取；
3）PCR产物精制；
4）体外转录RNA标准品，以调取目的基因PCR产物为模板，进行RNA标
准品转录；
5）标准曲线的制作。
附图说明
图1是对RNA标准品进行系列稀释后的扩增曲线，曲线从左至右依次为5×107拷贝每微升，5×106拷贝每微升，5×105拷贝每微升，5×104拷贝每微升，5×103拷贝每微升，5×102拷贝每微升，5×101拷贝每微升；5×100拷贝每微升和阴性对照为水平直线。
图2为RNA标准品系列稀释后的溶解曲线，Tm值在85.62±0.11范围内。
图3为RNA标准品的标准曲线，标准曲线显示线性关系良好（R2=0.999，R2>0.98），扩增效率较好（E=93.9%，80%﹤E﹤120%）。
图4为猪萨佩罗病毒SYBR实时荧光定量RT-PCR的特异性实验。从图中显示，只有萨佩罗病毒出现扩增，猪捷申病毒、猪肠道病毒9、猪口蹄疫病毒、脑心肌炎病毒、猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻和猪繁殖与呼吸道综合症病毒均未出现扩增。说明引物的特异性较好。
图5为图4结果的溶解曲线图。
具体实施方式
本发明中生化材料包括生化试剂和核酸标准品均可通过市售渠道获得，如无特殊说明，均购自宝生物工程（大连）有限公司，其中核酸标准品中的猪口蹄疫病毒核酸标准品购买于中国中牧实业股份有限公司。
实施例1标准曲线的制作
1）扩增片段标准品构建的引物设计
在目的基因上设计构建引物，并在构建的上游引物的5’端加上T7启动子，构建的下游引物的3’端加上25个T，使构建的目的基因标准品RNA有Poly(A)尾。T7启动子序列如下：ACTAATACGACTCACTATAGGG
具体引物设计的位置关系如下序列显示（间隔线部分为构建引物区，下划线部分为荧光定量RT-PCR引物区，波浪线部分分别为T7启动子和Poly(A)尾，箭头表示转录起始位置）。
Figure BDA0000392511590000041
TCCCTTCCAAAGCGGATGGACACAAGGACTTGGACTCACGGCAAGTGCACATGGTATGATTTTGGATACACCTTAACGGCAGTAGCGTGGCGAGCTATGGAAAAATCGCAATTGTCGATAGCCATGTTAGTGACGCGCTTCGGCGTGCTCCTTTGGTGATTCGGCGACTGGTTACAGGAGAGTAGGCAGTGAACTATGGGCAAACCTCTGCAGTATTACTC
Figure BDA0000392511590000043
2）重组片段的调取
以提取的RNA样品为模板进行RT-PCR反应，获得重组目的基因PCR产物。首先去除RNA基因组中的DNA，因此需要配置如下反应液：5×gDNAEraser Buffer，2微升；gDNA Eraser，1微升；RNA(45ng/微升)，2ul；无RNasedH2O，5ul；反应条件为42C，2分钟。然后进行的是RT反应，反应液是由上述反应液和5×PrimerScript缓冲液2(荧光定量PCR)，4微升；PrimeScriptRT酶混液I，1微升；RT引物混合物，1微升；无RNase dH2O，4微升组成，反应条件为37℃，15分钟；85℃，5秒。最后进行的是PCR反应，反应液的配置：10×Ex Taq缓冲液，5微升；2.5mM dNTP混合液，5微升；构建的PrimerF(10μM)和Primer R(10μM)，1微升TaKaRa Ex Taq HS(5U/微升)，0.25微升；RT的产物，2微升；无RNase dH2O，35.75微升。反应条件为：94℃，1分钟；94℃30秒；55℃，30秒；72℃，30秒；30个循环。
3）PCR产物精制
a)向100毫升的PCR产物中加入1/10体积3摩尔醋酸钠，250毫升100％乙醇混匀后?80℃放置10分钟，4℃13500rpm离心15分钟。
b)倒掉上清，向沉淀中加入800毫升75%乙醇，轻轻颠倒几次后4℃，13500rpm5分钟离心。
c)倒掉上清，沉淀干燥。
d)加入20毫升TE缓冲液溶解，取1毫升电泳确认。
4）体外转录RNA标准品(以调取目的基因PCR产物为模板，进行RNA标准
品转录)
a)转录反应液组成：10×转录缓冲液，2毫升；ATP溶液(50mM)，2毫升；GTP溶液(50mM)，2毫升；CTP溶液(50mM)，2毫升；UTP溶液(50mM)，2毫升；RNase抑制剂(40U/微升)，0.5毫升；T7RNA聚合酶(50U/微升)，2毫升；目的基因PCR产物，1毫升；无RNase dH2O，6.5毫升。转录反应条件为：42℃，60分钟；42℃，60分钟；42℃，30分钟；一个循环。
b)体外转录RNA的获得：DNase I处理（处理两次），具体操作步骤请参见TaKaRa Code.D2270说明书。DNase I处理后的RNA样品乙醇精制后，无RNaseH2O溶解测定OD值。
5）标准曲线的制作
将构建好的RNA标准品，核酸浓度5×107拷贝每微升，用EASY DilutionBuffer按10倍梯度稀释至5×100拷贝每微升作为模板，制作猪萨佩罗病毒(PSV)基因的标准曲线。按照如下配方配置反应液：RT-PCR的缓冲液为10微升，TaKaRa的Taq HS混液为1.2微升，PrimeScript PLUS RTase混液为0.4微升，ROX参比染料II为0.4微升，0.8微升该病毒的特异引物Primer F和R(10μM)，无RNase dH2O为4.4微升，2微升RNA标准品。阴性对照不加RNA模板，用无RNase dH2O来代替。SYBR实时荧光定量RT-PCR的反应可以在Applied Biosystems7500/7500Fast Real-Time PCR system进行。
反应条件是：逆转录反应：42C，5分钟；95C，10秒；
PCR反应：95C，5秒；60C，34秒；
溶解曲线，使用系统自设的反应条件。
实施例2特异性实验
选取不含有萨佩罗病毒的猪捷申病毒、猪肠道病毒9、猪口蹄疫病毒、脑心肌炎病毒、猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪繁殖与呼吸道综合症病毒的核酸标准品，按照如上的方法配置反应液，设置反应条件，在Applied Biosystems7500/7500Fast Real-Time PCR system进行反应。根据扩增曲线只有猪萨佩罗病毒出现扩增，说明该引物的具有良好的特异性。
实施例3临床验证
我们在上海闵行区的正义猪场和上海交通大学七宝校区猪场采得63份粪便样品。1%的磷酸缓冲液处理后，采用商品化的RNA/DNA提取试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司）提取RNA。按照上述方法的配置反应液，设置反应条件，在Applied Biosystems7500/7500Fast Real-Time PCR system进行反应。结果显示有7份样品出现扩增，且满足Ct值小于35，Tm值在85.62±0.11范围内，被认为是阳性样本，阳性率为11.11%。对相同的样品用普通RT-PCR进行验证，RT-PCR结果显示有5份样品出现扩增，阳性率为7.93%。说明SYBR实时荧光定量RT-PCR比RT-PCR方法灵敏度更加敏锐，可以检测到样品中低含量的病毒。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
Figure IDA0000392511690000011
Figure IDA0000392511690000021

Claims (8)

1.一种猪萨佩罗病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法，包括如下步骤：
1)样品预处理
样品采用1%的磷酸缓冲液处理后，采用RNA/DNA提取试剂盒提取RNA；
2)配制反应体系
采用SYBR荧光定量RT-PCR试剂盒，配置反应液，其中，RT-PCR的缓冲液为10微升，大连宝生的Taq HS混液为1.2微升，PrimeScript PLUS RTase混液为0.4微升，ROX参比染料II为0.4微升和无RNase dH2O为4.4微升，同时加入引物和待检样品RNA；
3)反应和结果分析
上述反应体系由ABI实时定量系统进行RT-PCR；根据反应的曲线、Ct值和溶解曲线判断结果的阴性和阳性。
2.如权利要求1所述的方法，其中步骤2）中，引物具体序列如下：
上游引物（5’-3’）为：GGATGGACACAAGGACTT；
下游引物（5’-3’）为：GTTCACTGCCTACTCTCC。
3.如权利要求2所述的方法，其中步骤2）中，加入上下游引物的量均为0.4微升。
4.如权利要求2所述的方法，其中步骤2）中，加入待检样品RNA的量为2微升。
5.如权利要求1所述的方法，其中步骤3）中，所述反应体系在Applied Biosystems7500/7500Fast Real-Time PCR system进行。
6.如权利要求1所述的方法，其中步骤3）中，
反应条件是：逆转录反应：42C，5分钟；95C，10秒；
PCR反应：95C，5秒；60C，34秒。
7.如权利要求1所述的方法，其中步骤3）中，结果判断方法为，出现扩增曲线、Ct值小于35个循环且Tm值为85.62±0.11范围内可判断结果为阳性，否则即为阴性。
8.如权利要求1所述的方法，其中还包括步骤4）RNA标准品制备和标准曲线的制作：
（1）扩增片段标准品构建的引物设计；
（2）重组片段的调取；
（3）PCR产物精制；
（4）体外转录RNA标准品，以调取目的基因PCR产物为模板，进行RNA标准品转录；
（5）标准曲线的制作。
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