CN103789447A - 一种5’端tRNA半分子检测方法 - Google Patents

Abstract

本项发明是一种涉及检测生物或医学样品中5′端tRNA半分子的方法。该检测方法的特征在于其是基于poly(A)加尾、DNA探针杂交、RNase H消化、反转录反应和PCR扩增技术检测5′端tRNA半分子。本方法可用于生物或医学样品中5′端tRNA半分子的检测分析。

Description

一种5’端tRNA半分子检测方法

技术领域本发明涉及一种tRNA半分子(half-tRNA)的检测方法，本方法可用于tRNA半分子的检测分析以及临床标本检测。 

背景技术tRNA将DNA的遗传密码翻译成蛋白质，tRNA在蛋白质生物合成过程中发挥着关键性的作用。近年来研究发现tRNA分子还有许多其他的重要生物学功能，特别是在基因表达调控中发挥作用(李盛等.tRNA核质动态分布与细胞命运.生物化学与生物物理进展，2009，36(3)：265-268)。我们在哺乳动物细胞中研究发现血管生成素(angiogenin)是细胞应激状态下切割生成tRNA半分子的核酸酶，其在tRNA的反密码子环处对tRNA分子进行切割，生成tRNA半分子，证实了tRNA半分子的生成参与细胞应激反应过程(Fu H，et al.Stress induces tRNA cleavage by angiogenin in mammalian cells.Febs Lett，2009,583(2)：437-442)。越来越多的研究已经表明tRNA半分子存在的普遍性，并具有多种潜在的生物学功能(Thompson DM，et al.Stressing out overtRNA cleavage.Cell，2009,138(2)：215-219)。特别是在血清中发现了tRNA半分子的广泛存在(Dhahbi JM，et al.5′tRNA halves are present as abundant complexes in serum，concentrated in blood cells，and modulated by aging and calorie restriction.BMC Genomics，2013，14：298)，这表明tRNA半分子可能作为新的信号分子参与生物学过程，并在疾病的发生和发展中发挥重要作用。tRNA半分子将是极有价值的新型疾病检测的生物标志物分子。因此，建立一种快速、简便的检测方法对tRNA半分子的功能研究和临床检测均具有重要价值。 

由于tRNA半分子只有30nt左右大小，同时细胞和组织中含有大量的全长的tRNA分子，检测比较困难。目前主要是采用Northern blot杂交和测序的方法进行检测，方法繁琐，耗时长，需要放射性同位素，且不易成功，尤其是不适于临床大样本的检测分析。 

发明内容本发明的目的是建立一种检测5′端tRNA半分子的简便方法，用于5′端tRNA半分子的检测，避免放射性同位素的使用。本发明的5′端tRNA半分子检测方法，其特征在于其是基于分离纯化的细胞和组织总RNA，经多核苷酸聚合酶在RNA分子3′端进行Poly(A)加尾，再与DNA探针杂交，后经RNase H消化与DNA探针互补的RNA序列，再由oligo(dT)_12-30-锚定引物进行反转录获得cDNA，以5′端tRNA半分子和锚定引物的序列为PCR反应的上下游引物，扩增检测5′端tRNA半分子。 

5′端tRNA半分子检测方法包括五个主要步骤：(1)tRNA半分子的poly(A)加尾；(2)DNA探针与tRNA分子杂交；(3)RNase H消化与DNA探针杂交的tRNA序列；(4)由oligo(dT)_12-30-锚定引物进行反转录反应；(5)PCR扩增反应。DNA探针的长度为13-30个碱基的与待检测的tRNA分子的3′端序列互补的寡聚DNA分子，其3′端的羟基被修饰，修饰基团可以是磷酸基团或甲氧基等。在反转录反应所用引物反转录oligo(dT)_12-30-锚定引物长度为40-60nt，5′端为20-30nt的锚定序列，3′端为12-30nt的dT，在3′末端加上两个碱基的(A、G或C)/(A、G、C或T)，最后两个碱基起锚定作用。PCR扩增使用的上游引物是待检测5′端tRNA半分子序列的寡聚DNA片段，下游引物是与反转录引物的锚定引物片段序列相同的寡聚DNA片段。 

为了进行实时定量PCR分析，检测反应中使用的PCR扩增引物可以进行包括荧光分子、生物素和地高辛等分子的修饰，也可以在PCR反应体系中可以加入荧光染料或分子信标进行实时定量PCR反应。 

为了检测使用方便，可依据本方法组装成试剂盒使用，试剂盒由RNA加Poly(A)尾反应系统、RNase H消化系统、反转录系统和PCR扩增系统和对应的引物组成，该试剂盒包括：1)多聚核苷酸聚合酶，及其 反应缓冲液；2)RNase H，杂交用DNA探针，反应缓冲液；3)反转录酶，及其反应缓冲液；4)Taq酶，及其反应缓冲液；5)反转录oligo(dT)n锚定引物、锚定引物和5′端tRNA半分子扩增用引物。 

由于5′端tRNA半分子扩增后DNA片段较小，可用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析PCR反应产物。电泳结束后，可以用EB染色和银染的方法染色观察。在PCR反应体系中还可以加入内对照引物进行半定量PCR反应，或对PCR引物进行荧光分子标记或加入荧光染料进行实时定量PCR反应分析。 

本方法可用于5′端tRNA半分子检测分析，以及临床标本的检验。 

本发明用下列实施例进行解释，这些实施例的目的只是为了解释而不是以任何方式限制本发明。 

结合附图说明本发明的具体实施方法。 

图1：5′端tRNA半分子检测方法原理示意图 

实施例

实施例一 

检测细胞中5′端tRNA半分子 

以检测HeLa细胞中5′half-tRNA-Gly-GCC为例。 

1.相关引物设计 

(1)5′half-tRNA-Gly-GCC片段：5′-GCATTGGTGGTTCAGTGGTAG-3′，为5′端PCR引物。 

(2)tRNA-Gly-GCC的DNA杂交探针：5′-ATTGGCCAGGAATCGAAGCCCGGCCGCCCGC-3′，3′末端磷酸化修饰，用于与tRNA-Gly-GCC3′端杂交。 

(3)反转录oligo(dT)n-锚定引物：5′-GCGAGCACAGAATTAATACGACTCACTATAGG(T)18VN-3′，其中V为A、G或C，N为A、G、C或T。 

(4)锚定引物：5′-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3′，为3′端PCR引物。 

2.RNA3′端加Poly(A)尾 

以HeLa细胞为材料，用Trizol试剂(Invitrogen公司)提取总RNA。取总RNA10μg，分别加入5μl10×Poly(A)聚合酶缓冲液，0.5μl ATP(10mmol/L)，0.5μl Poly(A)聚合酶(5000U/ml)(NEB公司)，DEPC水补至50μl，于37℃水浴1小时。然后采用酚-氯仿和乙醇沉淀法纯化回收RNA，加入20μl水充分溶解RNA沉淀。 

3.特异DNA探针杂交及RNase H消化 

取5μg加尾RNA，即10μl上述RNA产物，加入2.5μl20μmol/L tRNA-Gly-GCC的DNA杂交特异探针，1.5μl5×反应缓冲液。于70℃5min，后室温放置5min。再加入1μl RNase H(60u/μl，TaKaRa公司)，于30℃反应30min。消化全长的tRNA-Gly-GCC分子。 

4.5′half-tRNA反转录 

使用ImProm-II^TM反转录试剂盒(promega公司)进行反转录反应。取3μl上述反应液，加入1μg反转录oligo(dT)n-锚定引物，加水补至5μl。于70℃加热5min，冰浴5min。分别加入4μl5×反转录反应缓冲液，2.5μl MgCl₂(2.5mmol/l)，lμl dNTP(10mmol/L)，0.5μl RNase抑制剂，0.5μl反转录酶，以及6.5μl水，混匀。于25℃放置15min，于42℃反应30min，之后于70℃温浴15min。 

5.PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 

于20μlPCR反应体系中分别加入5′half-tRNA-Gly-GCC引物，以及3′端锚定引物各0.5μl(10μmol/L)，1μl cDNA，8μl水，再加入10μl2×Taq Mix(GenStar)。按下列条件进行PCR扩增：94℃2分，94℃10 秒、58℃10秒、72℃30秒，25个循环。取1oμl PCR产物行10％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染后进行结果分析。在约83bp处可见扩增条带，即为扩增得到的5′half-tRNA-Gly-GCC片段。 

Claims (8)

1.一种5′端tRNA半分子检测方法，该检测方法的特征在于其是基于分离纯化的细胞和组织总RNA，经多核苷酸聚合酶在RNA分子3′端进行Poly(A)加尾，再与DNA探针杂交，后经RNase H消化与DNA探针互补的RNA序列，再由oligo(dT)_12-30-锚定引物进行反转录获得cDNA，以5′端tRNA半分子和锚定引物的序列为PCR反应的上下游引物，扩增检测5′端tRNA半分子。

2.权利要求1中所述方法包括五个主要步骤：(1)tRNA半分子的poly(A)加尾；(2)DNA探针与tRNA分子杂交；(3)RNase H消化与DNA探针杂交的tRNA序列；(4)反转录反应；(5)PCR扩增反应。

3.权利要求1中所述的DNA探针的特征在于长度为13-30个碱基的与待检测的tRNA分子的3′端序列互补的寡聚DNA分子，其3′端的羟基被修饰，修饰基团可以是磷酸基团或甲氧基等。

4.权利要求1中所述的反转录反应所用引物的特征在于反转录oligo(dT)_12-30-锚定引物长度为40-60nt，5′端为20-30nt的锚定序列，3′端为12-30nt的dT，在3′末端加上两个碱基的(A、G或C)/(A、G、C或T)，最后两个碱基起锚定作用。

5.权利要求1中所述的PCR扩增引物特征在于上游引物是待检测5′端tRNA半分子序列的寡聚DNA片段，下游引物是与反转录引物的锚定引物片段序列相同的寡聚DNA片段。

6.权利要求1中所述的5′端tRNA半分子检测反应中所使用的PCR扩增引物可以进行包括荧光分子、生物素和地高辛等分子的修饰。

7.权利要求1中所述的PCR反应体系中可以加入荧光染料或分子信标进行实时定量PCR反应。

8.权利要求1-7中所述的检测方法在5′端tRNA半分子检测分析中的应用。

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