CN102851395B

CN102851395B - 一种检测传染性喉气管炎病毒的液相芯片方法

Info

Publication number: CN102851395B
Application number: CN 201210337807
Authority: CN
Inventors: 王慧煜; 韩雪清; 林祥梅; 吕继洲; 梅琳; 李志辉
Original assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Current assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Priority date: 2012-09-12
Filing date: 2012-09-12
Publication date: 2013-09-18
Anticipated expiration: 2032-09-12
Also published as: CN102851395A

Abstract

本发明提供了用于检测传染性喉气管炎病毒的液相芯片方法，通过对传染性喉气管炎病毒的TK基因组序列的比对和分析，找出保守区域，设计了传染性喉气管炎病毒的特异性引物和探针，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3所示。用上述引物对传染性喉气管炎病毒DNA进行PCR扩增，同时将探针与微球偶联；PCR扩增产物和偶联到荧光微球上的探针进行分子杂交，通过检测荧光值，建立了检测传染性喉气管炎病毒的液相芯片方法。本发明的检测方法具有检测准确，灵敏度高、特异性强，简便快速的优点。

Description

一种检测传染性喉气管炎病毒的液相芯片方法

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及用液相芯片的方法检测传染性喉气管炎病毒的方法。

背景技术

传染性喉气管炎(Infectious laryngotracheitis，ILT)是由疱疹病毒科α-疱疹病毒亚科传染性喉气管炎病毒（ILTV）引起的一种急性、接触性上呼吸道传染病，以呼吸困难、咳出血样粘液、喉部和气管黏膜水肿出血继而糜烂为主要特征。由于引起产蛋下降和鸡群死亡而造成严重的经济损失，并且该病可感染各种日龄和品种的鸡。本病通常突然暴发，并很快在鸡群中传播，感染率约为90%~100%，致死率5%~70%，一般在10~20%之间。May等1925年在美国首次报道该病，现已遍及世界许多养鸡地区。我国自50年代以来大部分地区有不断发生的报道，多呈地方流行性，并且发病的日龄有提前的趋势。最早发病可见20-40日龄，给养鸡业造成严重损失，是集约化养鸡场的重要疫病之一。

目前传染性喉气管炎的实验室诊断主要是病毒分离、血清学诊断、酶联免疫吸附试验、核酸探针、聚合酶链式反应等。病毒分离、血清学诊断和酶联免疫吸附试验这些方法虽然经典，但费时费力且敏感性差，不能检测亚临床感染，而传染性喉气管炎亚临床感染占有重要地位。PCR技术虽具有快速、特异、敏感和易于操作的特点，在畜禽传染病的检测、鉴别诊断方面得到了广泛应用但是不能进行高通量检测，不能满足高通量检疫的要求，更不利于大量通关样品的检疫和疫情暴发时大批量样品的紧急筛查，因而需要建立一套简便、快速、准确的传染性喉气管炎筛查和检验技术，以满足日常检测的要求。

液相芯片（xMAP）技术是20世纪90年代中期发展起来的高通量检测技术。它是既可进行免疫学检测也可进行核酸检测的一种集流式技术、激光、荧光微球和数字信号处理为一体的新型生物分子高通量多重检测技术。液相芯片技术最突出的优点在于仅需少量样本即可同时定性、定量检测同一样本中的多种不同目的分子，即多重检测。具体说来，与常规免疫学或核酸检测方法相比，它具有高通量、样品需求量小、操作简单、灵敏度高、检测范围广、特异性强、重复性好的显著优点。

液相芯片技术平台是既能保证信息质量，又能提供相对高通量的新一代分子诊断技术平台，这个技术平台整合了生物检测，微球荧光编码，微液体传送系统，激光实时记录，先进电脑软件和数据处理模式等多种先进技术。液相芯片的核心技术是把微小的微球分别染成上百种不同的荧光色（固相芯片是用探针在芯片上的坐标位置给基因的特异性编码；而液相芯片则是用颜色来编码）。应用时，把针对不同检测物的微球混合后再加入微量待检测标本，在悬液中与微粒进行特异性地结合。结合的结果可以在瞬间经激光判定后由电脑以数据信息的形式记录下来。因为分子杂交是在悬浮溶液中进行，检测速度极快，所以又有“液相芯片”之称。

液相芯片技术平台具有高效性：因为上百种颜色的微球可以在同一个反应体系内，所以一小份标本（血，或其它体液，组织）可以被用来同时检测上百个生理或病理指标。液相芯片技术平台具有高敏感性：每个乳胶微球上都可以满满地（以共价键牢固结合的方式）包被上抗原、抗体、或核酸。因为探针密度高，产生的信号强，加上使用荧光检测，所以敏感性大大高于任何现有分析、诊断方法，也高于其它芯片法。液相芯片技术平台是一种快速检测方法：因为杂交在悬浮的液相中进行，所以反应需要时间短，杂交后常不用清洗就可以直接读数，且检测效率大大高于固相杂交，所用时间从几小时缩短到十几分钟。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测传染性喉气管炎病毒的液相芯片方法；本发明的目的还在于提供一种检测传染性喉气管炎病毒的液相芯片试剂盒。

查阅相关文献疱疹病毒的TK基因是高度保守的，ILTV不同毒株之间更加保守，英国株(Throne)和美国株(632株)TK基因仅相差3个连续的核苷酸。从GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）中收集传染性喉气管炎TK基因序列，利用Bioedit分子生物学分析软件对大量收集的序列进行分析比较，根据实验目的筛选传染性喉气管炎的特异性保守序列。

本发明在对序列分析的基础上，根据筛选的每个亚型的保守序列，参照GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中发表的传染性喉气管炎TK基因序列组序列（登录号：EF552574），应用DNAStar、Primer5.0、和Bioedit软件分别对其进行初步分析筛选，设计了传染性喉气管炎的特异性引物和探针，分别对下游引物进行生物素标记，对探针进行氨基修饰。

本发明提供了一对用于检测传染性喉气管炎病毒的引物，其核苷酸序列为：

ILTV-F:5’-AAAACTTGAATGTCGGGAGG-3’，

ILTV-R:5’-ATGTTGGAGTGTGTTGGAATGTCA-3’，在ILTV-R引物的5’端用生物素标记。

本发明提供了与上述引物配合使用的检测传染性喉气管炎病毒的探针，其核苷酸序列为：

5’-GCCCCACTAAGAATAATGAACCACG-3’，在其5’端用氨基修饰。

本发明提供了一种用于检测传染性喉气管炎病毒的液相芯片，是将上述检测探针与荧光标记微球偶联制成的特异性检测微球。

进一步地，所述液相芯片中，每6.25×10⁵个荧光微球加入浓度为0.1nmol/μL的探针2μL。

本发明提供了一种用液相芯片检测传染性喉气管炎病毒的方法，其特征在于，用本发明提供的引物，对样品DNA进行PCR扩增，PCR产物与偶联在荧光微球上的探针分子杂交后，检测荧光值，确定样品中是否含有传染性喉气管炎病毒。

具体地，包括下列步骤：

1）提取样本中传染性喉气管炎病毒DNA;

2）以步骤1）提取的样本DNA为模板，以上述引物（ILTV-F和ILTV-R）进行PCR反应；

3）将上述氨基修饰的探针与荧光标记微球偶联；

4）杂交：将带有生物素标记的步骤2）中的PCR产物与步骤3）中偶联到荧光微球上的探针在PCR仪上杂交；

5）检测荧光值，以平均荧光值大于200且为阴性对照3倍以上荧光值所对应的检测标本为阳性。

本发明提供了一种用于检测传染性喉气管炎病毒的液相芯片检测试剂盒，含有一对引物和本发明提供的上述液相芯片，所述引物核苷酸序列为：

ILTV-F:5’-AAAACTTGAATGTCGGGAGG-3’，

本发明提供的液相芯片检测试剂盒中，使用上述引物进行PCR扩增的25μL工作体系为：10xbuffer 2.5μL，10mmol/L dNTP 2.0μL，taq DNA聚合酶0.5μL，DNA模板2.0μL，10μmol/L上游引物ILTV-F 0.5μL，10μmol/L下游引物ILTV-R 1.0μL，不含RNA酶的ddH₂O 16.5μL。

其中，PCR扩增的工作条件为：95℃预变性5min；94℃变性40s，58℃退火40s，72℃延伸40s，共35个循环；72℃延伸10min。

其中，PCR扩增产物与液相芯片杂交的工作条件为：95℃变性5min后，54℃杂交30min。

本发明提供了引物在制备传染性喉气管炎病毒液相芯片检测试剂盒中的应用，所述引物核苷酸序列为：

ILTV-F:5’-AAAACTTGAATGTCGGGAGG-3’，

本发明提供了探针在制备传染性喉气管炎病毒液相芯片检测试剂盒中的应用，所述探针的核苷酸序列为：

5’-GCCCCACTAAGAATAATGAACCACG-3’，且在其5’端用氨基修饰。

本发明提供了用于检测传染性喉气管炎病毒的生物素标记引物和特异性探针，利用该引物和探针建立一种检测传染性喉气管炎病毒的液相芯片方法，该方法具有速度快，操作简单、敏感性高、特异性好等优点，适合于临床标本中传染性喉气管炎病毒的检测。

附图说明

图1为ILT病毒TK基因PCR扩增电泳结果，其中泳道1-6分别为传染性喉气管炎病毒阳性样品，7为阴性对照，M为DL2000DNA Marker。

图2为样品检测柱状图，其中X1-5分别代表感染ILTV样品DNA。

图3为PCR方法对传染性喉气管炎病毒不同浓度模板的TK基因敏感性电泳图，其中M为DL2000DNA Marker，泳道1-4分别为传染性喉气管炎病毒模板浓度1ng/μL，0.1ng/μL，0.01ng/μL，0.001ng/μL，5为阴性对照。

图4为ILTV病毒液相芯片敏感性柱状图，其中X1-X6对应模板浓度分别为1ng/μL，0.1ng/μL，0.01ng/μL，0.001ng/μL，0.0001ng/μL，0.00001ng/μL，C为阴性对照，B为空白对照。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；若未特别指明，实施例中所用试剂均为市售。实施例1探针和引物的设计与修饰

从GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）中收集传染性喉气管炎病毒TK基因序列，利用Bioedit分子生物学分析软件对大量收集的序列进行分析比较，根据实验目的筛选传染性喉气管炎病毒特异性保守序列。

在对序列分析的基础上，根据筛选的每个亚型的保守序列，参照GenBank中发表的传染性喉气管炎病毒的TK基因组序列（登录号：EF552574），应用DNAStar、Primer5.0和Bioedit软件分别对其进行初步分析筛选。

本发明经过反复研究，多次试验，设计了一对传染性喉气管炎病毒的特异性引物以及特异性探针，分别对下游引物进行生物素标记，对探针进行氨基（NH₂）修饰。引物和探针的序列如下表所示：

表1传染性喉气管炎病毒液相芯片引物和探针

实施例2传染性喉气管炎病毒DNA的提取和扩增

1、ILT病毒DNA的提取参照购自QIAGEN公司的商品化试剂盒(DNAeasy Blood and Tissue kit)说明书进行，具体步骤如下：

(1)取180μL病毒尿囊液于1.5mL EP管中，蛋白酶K 20μL，混匀，瞬时离心。

(2)在样品中加入BufferAL 200μL，涡旋混匀，瞬时离心，于56℃孵育10min。

(3)待白色沉淀溶解后在样品中加入200μL无水乙醇，涡旋混匀，瞬时离心。

(4)将试剂盒中的DNeasy Mini Spin Column安装于收集管(2mL)上，将步骤(3)中的溶液转移至DNeasy Mini Spin Column中，常温条件下以≥6000g（8000rpm）离心1min，弃去收集管和滤液。

(5)将DNeasy Mini Spin Column置于新的收集管（2mL）上，加入500μL Buffer AW1，常温条件下以≥6000g（8000rpm）离心1min，弃去收集管和滤液。

(6)将DNeasy Mini Spin Column置于新的收集管（2mL）上，加入500μL Buffer AW2，常温条件下以≥20,000g（14,000rpm）离心3min，弃去收集管和滤液。

(7)将DNeasy Mini Spin Column置于新的收集管（1.5mL）上，吸取50μL Buffer AE直接加到DNeasy膜上，常温孵育1min，常温条件下以≥6000g（8000rpm）离心1min以洗脱DNA。

(8)重复操作(7)1次，合并洗脱液，共50μL DNA洗脱液，于－20℃保存备用。

2、病毒DNA的扩增

PCR反应体系(25ul)如下表

PCR反应条件：95℃预变性5min；94℃变性40s，58℃退火40s，72℃延伸40s，扩增35个循环；最后72℃补充延伸10min。每次反应均设立不含DNA模板的阴性对照。

PCR反应结束后取5μL扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳分析。预期目的条带为284bp，电泳结果显示泳道1-6阳性样品的扩增条带大小约为280bp，结果见图1，扩增出与预期大小相同的目的条带，测序结果说明，扩增产物序列与预期ILTV的TK基因序列一致，说明本实施例所用的传染性喉气管炎病毒的特异性引物能有效扩增出ILTV的TK基因的目的条带。

实施例3液相芯片检测方法的建立

1、探针与微球偶联

涡旋仪上以转速2800r/min的速度悬浮荧光编码微球，然后在超声清洗仪上常温超声微球30s。取50μL（含6.25×10⁵个）微球到离心管中，12000g离心2min。弃上清，用10μL 0.1M pH4.5的MES（2-吗啉乙磺酸）重悬微球，涡旋仪上以转速2800r/min涡旋30s，使微球分散。加入2μL实施例1中表1的（0.1nmol/μL）探针ILTV-P。制备新鲜的EDC【1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺】溶液(10mg/mL)，加2μL EDC溶液至微球中，混匀。室温黑暗条件下孵育30min。再次制备新鲜的EDC溶液(10mg/mL)，加2μL EDC溶液至微球中，混匀。室温黑暗条件下孵育30min。加入1mL 0.02%Tween20（吐温-20），稍微涡旋混匀。12000g离心2min。弃上清，用0.1%SDS重悬沉淀40s。12000g离心2min。用20μL pH8.0TE buffer重悬沉淀。涡旋仪上2800r/min漩涡30s。混合偶联探针的微球于4℃黑暗条件下储存。以上步骤所需体积如下表：

表2探针微球偶联用量表（μL）

2、扩增产物的液相杂交

在标准PCR管中，加入33μL实施例3制得的微球的混合物。在每个管中分别加入PCR产物5μL，加入TE补充至50μL。反复吸打每个管，充分混匀。在PCR仪上杂交，杂交条件：95℃变性5min，54℃杂交30min。

准备新鲜制备的用1xTMAC溶解的3μg/mL的SAPE（链霉亲和素-藻红蛋白购自Invitrogen公司），3mL 1xTMAC中加入9μL1mg/mL的SAPE。需要事先把滤板（96孔可拆卸酶标板）预热到退火温度。把样品加入到滤板中（96孔可拆卸酶标板每8个孔为一列，每孔分别为A、B、C、D、E、F、G、H，每个样品重复一次，以A1、A2表示，即两孔加的样是一样的。以此类推）。加入100μLSAPE（避光）到每个孔中，反复吸打混匀。50℃烘箱中孵育5min。使用Bio-Plex 200悬浮芯片系统分析荧光值：以平均荧光值大于200且数值为空白对照3倍以上为阳性判断标准。

检测荧光值所使用的仪器是Bio-Plex 200悬浮芯片系统，参数设置为每区域为100个微球，gate value设定为5000～25000。

传染性喉气管炎病毒液相芯片杂交结果见图2，表3。可知空白对照（B）的荧光值较小，而ILTV样品的荧光值都大于200，且数值均为空白对照荧光值3倍以上，说明传染性喉气管炎病毒液相芯片检测方法能有效的检测出ILTV。

表3传染性喉气管炎病毒液相芯片杂交结果

注：B：空白对照；C：阴性对照；X1-X5：检测样品。ILTV(65)：65号荧光微球偶联ILTV探针

实施例4本发明ILTV液相芯片方法的特性检测

1、特异性试验结果

采用本研究建立的液相芯片检测方法分别对购自中国兽医药品监察所的禽传染性支气管炎病毒（IBV）AV10、禽流感病毒亚型H5N1、H7N1、H9N2和新城疫病毒（NDV）等常见病毒核酸进行检测，每个样品重复2次。结果如表4所示，IBV、NDV、AIV H5N1、AIV H9N2和AIV H7N1等病原的液相芯片检测结果荧光值与空白对照差异不大，小于空白对照荧光值的3倍，表明检测结果均为阴性，而ILTV的荧光值均大于200，并且大于空白对照荧光值的3倍。表明该液相芯片方法与禽类常见呼吸道病毒无交叉反应，具有良好的特异性

表4传染性喉气管炎病毒液相芯片特异性试验结果（I LTV探针：65号微球）

2、敏感性试验结果

提取ILTV的DNA，测定浓度后对其进行10倍系列稀释，同时采用PCR方法（参见实施例1、2方法）和本研究建立的液相芯片方法进行敏感性检测。

电泳检测结果见图3，PCR方法可见最低可检测到10^-1ng/μL的病毒量，而液相芯片最低可检测到10^-3ng/μL，荧光值为354.5，大于200，并且大于空白对照荧光值（112.5）的3倍，敏感性柱状图见图4。说明本发明建立的液相芯片方法检测传染性喉气管炎病毒具有很高的灵敏度。

表5传染性喉气管炎病毒灵敏度杂交结果

注：C为阴性对照，X1,X2,X3,X4,X5,X6对应模板浓度1ng/μL，10^-1ng/μL,10^-2ng/μL,10^-3ng/μL，10^-4ng/μL，10^-5ng/μL

实施例5用本发明方法对实际标本进行大通量检测

用本发明建立的传染性喉气管炎病毒液相芯片检测方法对临床采集的54份田间样品进行检测，结果见表6，其中检测得到阳性样品15份，阴性样品39份。

表6传染性喉气管炎病毒液相芯片对田间样品的检测结果

B空白对照，PC阳性对照，NC为阴性对照。

采用传统的病毒分离方法同时对临床采集的54份田间样品进行检测。检测结果得到15份阳性样品，39份阴性样品，且检测的15份阳性样品与本发明建立的液相芯片方法检测得到15份阳性样品一致。说明本发明建立的液相芯片检测传染性喉气管炎病毒的方法准确、可靠，且操作简便。

Claims

1.一种检测传染性喉气管炎病毒的引物，其核苷酸序列为：

ILTV-F:5’-AAAACTTGAATGTCGGGAGG-3’，

2.一种与权利要求1所述引物配合使用的检测传染性喉气管炎病毒的探针，其核苷酸序列为：

5’-GCCCCACTAAGAATAATGAACCACG-3’，在其5’端用氨基修饰。

3.一种用于检测传染性喉气管炎病毒的液相芯片，其特征在于，是权利要求2所述的探针与荧光标记微球偶联制成的特异性检测微球。

4.如权利要求3所述的液相芯片，其特征在于，每6.25×10⁵个荧光微球加入浓度为0.1nmol/μL的探针2μL。

5.一种用于检测传染性喉气管炎病毒的液相芯片检测试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的引物和权利要求3或4所述的液相芯片。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其中权利要求1所述的引物进行PCR扩增的25μL工作体系为：10×buffer2.5μL，10mmol/L dNTP2.0μL，taq DNA聚合酶0.5μL，DNA模板2.0μL，10μmol/L上游引物ILTV-F0.5μL，10μmol/L下游引物ILTV-R1.0μL，不含RNA酶的ddH₂O16.5μL。

7.如权利要求5所述的试剂盒，其中权利要求1所述的引物进行PCR扩增的工作条件为：95℃预变性5min；94℃变性40s，58℃退火40s，72℃延伸40s，共35个循环；72℃延伸10min。

8.如权利要求5所述的试剂盒，其中权利要求1所述的引物的PCR扩增产物与液相芯片杂交的工作条件为：95℃变性5min后， 54℃杂交30min。

9.权利要求1所述的引物在制备传染性喉气管炎病毒液相芯片检测试剂盒中的应用。

10.权利要求2所述的探针在制备传染性喉气管炎病毒液相芯片检测试剂盒中的应用。