CN108842003A - 用于鉴别犬瘟热病毒野毒株与疫苗株的Taqman探针荧光定量PCR检测试剂盒及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于鉴别犬瘟热病毒野毒株与疫苗株的Taqman探针荧光定量PCR检测试剂盒及应用。所述的试剂盒中含有用于扩增犬瘟热病毒野毒株以及疫苗株H基因保守区域的通用引物以及分别用于鉴别犬瘟热病毒野毒株或疫苗株的特异性探针。实验证明，使用本发明建立的Taqman探针荧光定量PCR检测试剂盒检测鉴别CDV野毒株和疫苗株，灵敏度可达1个拷贝，能检测出的病毒量低至1TCID₅₀/mL，高于常规PCR方法的10³和10²个拷贝，且与5种其他病原核酸检测均呈阴性。因此，使用本发明建立的试剂盒鉴别CDV野毒株和疫苗株具有特异性强、灵敏度高和稳定性好的特点，能够快速鉴别出犬瘟热病毒野毒株和疫苗株感染。

Description

用于鉴别犬瘟热病毒野毒株与疫苗株的Taqman探针荧光定量 PCR检测试剂盒及应用

技术领域

本发明涉及一种荧光定量PCR检测试剂盒及其应用，特别涉及一种用于鉴别犬瘟热病毒野毒株与疫苗株的Taqman探针荧光定量PCR检测试剂盒及其应用。本发明属于医药技术领域。

背景技术

犬瘟热(Canine Distemper)是由犬瘟热病毒(Canine Distemper Virus)感染犬、狐貉和水貂等食肉动物而引起的一种急性热性、高度接触性传染病。该病发病率高，临床症状多样，感染后期容易继发混合感染，死亡率高达30％-100％。近年来CDV自然感染宿主不断增多，随着人类对犬猫等宠物拥有数量的增多，犬瘟热病毒在给动物养殖业、生物多样化带来了极大损失和危害的同时，还威胁着社会公共安全。CDV是副黏病毒科麻疹病毒属成员，其基因组为单股负链不分节段RNA。从3’到5’端依次是3’端前导序列、核蛋白(N)基因、磷蛋白(P)基因、基质蛋白(M)基因、融合蛋白(F)基因、血凝素蛋白(H)基因、聚合酶蛋白(F)基因和5’尾随序列。其中，H基因是变异率最高的，是CDV野毒株分子流行病学调查的主要靶基因。基于H基因的多样性，CDV可分为Asia 1、Asia 2、Europe、European wildlife、America-2、Arctic和America-1型(又称疫苗型)。我国流行毒株主要是Asia 1，目前，对CDV的控制，主要采取弱毒活疫苗免疫措施，但疫苗免疫失败的现象却时有发生，甚至引起一定范围疫情暴发。CDV弱毒活疫苗的大规模应用使得CDV野毒感染和疫苗接种的区分变得异常困难，因此，准确、快速鉴别CDV野毒和疫苗毒对控制CDV流行和防止CDV感染蔓延至关重要。

传统的实验室诊断CDV方法有：病毒分离、PCR、免疫荧光和ELISA等方法。这些方法要么操作复杂，费时费力，要么敏感度不高。后来学者们建立的鉴别CDV野毒株和疫苗株方法有：复合反转录-套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)(Wei,S.,et al.,A multiplex reversetranscription-nested polymerase chain reaction for detection anddifferentiation of wild-type and vaccine strains of canine distempervirus.Virology Journal,2010.7(1):p.86-86.)，联合RT-PCR方法(Dong,X.Y.,et al.,Detection and differentiation of wild-type and vaccine strains of caninedistemper virus by a duplex reverse transcription polymerase chainreaction.Iranian Journal of Veterinary Research,2015.16(2):p.172-175.Yi,L.,etal.,Development of a combined canine distemper virus specific RT-PCR protocolfor the differentiation of infected and vaccinated animals(DIVA)and geneticcharacterization of the hemagglutinin gene of seven Chinese strainsdemonstrated in dogs.Journal of Virological Methods,2012.179(1):p.281-287.)，RT-LAMP方法(Liu,D.F.,et al.,Establishment of reverse transcription loop-mediated isothermal amplification for rapid detection and differentiation ofcanine distemper virus infected and vaccinated animals.Infection Genetics&Evolution,2015.32:p.102-106.)，SYBR Green I荧光定量RT-PCR方法(由丛华,et al.,鉴别犬瘟热病毒强弱毒株SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法的建立.中国兽医杂志,2017(3):p.23-25.曾杨茹,et al.,鉴别犬瘟热病毒野毒株与疫苗株的SYBR Green Ⅰreal-time PCR方法的建立.中国兽医科学,2017(4):p.435-441.)。这些方法都需要多次PCR，使用不方便。目前尚没有利用TaqMan探针鉴别诊断CDV的报道。

鉴于此，本发明根据CDV野毒株和疫苗株H基因的不同设计了特异性探针，以及一对通用引物，建立了一种灵敏度高、特异性强的用于鉴别CDV野毒株和疫苗株的TaqMan探针荧光定量检测方法及试剂盒，建立的犬瘟热病毒野毒株和疫苗株鉴别诊断TaqMan探针荧光定量PCR方法具有特异、灵敏和稳定的特点，能够快速鉴别出犬瘟热病毒野毒株和疫苗株感染。

发明内容

本发明的目的在于用于鉴别犬瘟热病毒野毒株和疫苗株的Taqman探针荧光定量PCR检测试剂盒及其应用。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明分析比对了GeneBank中已公布的24个犬瘟热病毒H基因序列，针对CDV H基因保守区域设计了1对通用引物和特异性探针，用于鉴别CDV野毒和疫苗毒。通过矩阵法优化反应体系和反应条件，以10倍系列稀释的pBlunt-QH和pBlunt-RH质粒为标准品，进行了实时荧光定量PCR扩增，绘制出标准曲线，并进行了特异性、灵敏性和稳定性检验。实验证明，使用本发明的方法检测犬瘟热病毒野毒株与疫苗株的标准曲线相关系数均达到1.00，灵敏度可达1个拷贝，能检测出的病毒量低至1TCID₅₀/mL，高于常规PCR方法的10³和10²个拷贝，且5种其他病原核酸检测均呈阴性。

在上述研究的基础上，本发明提出了一种用于鉴别犬瘟热病毒野毒株与疫苗株的Taqman探针荧光定量PCR检测试剂盒，所述的试剂盒中含有用于扩增犬瘟热病毒野毒株以及疫苗株H基因保守区域的通用引物以及分别用于鉴别犬瘟热病毒野毒株或疫苗株的特异性探针，其中，所述的通用引物由上游引物和下游引物组成，所述的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，用于鉴别犬瘟热病毒野毒株的特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，用于鉴别犬瘟热病毒疫苗株的特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述的探针的5’端添加荧光基团，3’端添加淬灭基团。

其中，优选的，所述的探针的5’端添加荧光基团FAM，3’端添加淬灭基团TAMRA。

其中，优选的，所述的试剂盒中还包括用于逆转录反应的试剂以及用于荧光定量PCR检测的试剂。

其中，优选的，所述的试剂盒中还包括阳性对照以及阴性对照。

其中，优选的，所述的阳性对照包括分别含有犬瘟热病毒野毒株或疫苗株H基因的质粒，所述的阴性对照为无RNA酶水。

其中，优选的，使用本发明所述的试剂盒用于犬瘟热病毒野毒株与疫苗株鉴别时，按照以下步骤进行：

(1)cDNA的合成

提取待测病毒株的总RNA，以提取的RNA为模板，通过逆转录反应合成cDNA；

(2)配制qPCR反应体系

配制反应体系20μL，包括：2×qPCR混合液10μL，上下游引物各0.4μM，用于鉴别犬瘟热病毒野毒株或疫苗株的特异性探针0.2μM，步骤(1)合成的cDNA 1μL，用PCR级水补足至20μL；

(3)PCR扩增

将步骤(2)配制好的反应体系放混匀后置Real-Time PCR仪上进行自动化扩增，反应条件为：95℃10min，95℃5s、60℃30s，45个循环；

(4)结果分析

根据扩增结果判定：在阴性对照没有Ct或Cq值的情况下，Ct或Cq值≤40判为阳性；Ct值或Cq>40为阴性。

进一步的，本发明还提出了所述的试剂盒在制备用于鉴别犬瘟热病毒野毒株与疫苗株的试剂中的应用。

实验证明，本发明建立的犬瘟热病毒野毒株和疫苗株鉴别诊断TaqMan探针荧光定量PCR方法具有特异、灵敏和稳定的特点，能够快速鉴别出犬瘟热病毒野毒株和疫苗株感染。

附图说明

图1为限制性内切酶Kpn Ⅰ以及Not Ⅰ双切质粒pBlunt-QH以及pBlunt-RH的鉴定结果；

M：DNA Marker 15000，1：pBlunt-QH，2：pBlunt-RH；

图2为引物和探针浓度的优化；

图3为标准品pBlunt-RH的扩增曲线(A)和pBlunt-QH的扩增曲线(B)；

6-1:10⁶-10¹拷贝数的标准品pBlunt-RH(A)和pBlunt-QH(B)的定量PCR扩增曲线；

图4为标准品的标准曲线pBlunt-RH(A)和pBlunt-QH(B)；

图5为标准品pBlunt-QH(A)和pBlunt-RH(B)普通PCR扩增灵敏度；

M：DL100bp ladder：泳道1-7：10⁷-10¹拷贝的模板pBlunt-QH(A)/pBlunt-RH(B)用pfu聚合酶PCR扩增产物；

图6为标准品pBlunt-RH(A)和pBlunt-RH(B)的扩增重复性。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明创造的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明创造的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明创造的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改的替换均落入本发明创造的保护范围内。

实施例1犬瘟热病毒野毒株和疫苗株鉴别方法的建立

1材料与方法

1.1毒株

CDV强毒HBF-1株和SD14(7)株、疫苗毒CDV3株和CDV-OR12株、犬副流感病毒(CPIV)、狂犬病病毒(RABV)、犬冠状病毒(CcOV)、犬细小病毒(CPV)、Ⅰ型犬腺病毒(CAV-Ⅰ)和Ⅱ型犬腺病毒(CAV-Ⅱ)，均由中国农业科学院特产研究所疫病防控研究室保存。

1.2主要试剂和仪器

实时荧光定量PCR仪Light Cycler○R96购自Roche；普通PCR扩增仪GeneAmp PCRSystem 2700和分光光度计Nanodrop 2000购自Thermo；质粒小量提取试剂盒购自Axygen；荧光定量PCR试剂盒Faststart Essential DNA Probes Master购自Roche；普通PCR试剂盒FastPfu PCR SuperMix购自TransGen。

1.3阳性标准品的制备

取CDV强毒HBF-1株和疫苗毒CDV3株病毒液200μL，按照RNeasy Mini Kit说明书,分别提取CDV HBF-1株和CDV3株病毒液的总RNA。按照SuperScript Ⅲ First-StrandSynthesis SuperMix操作说明，合成cDNA。利用软件Primer Premier 5.0设计特异性引物H-F和H-R(序列见表1)，送上海生工公司合成。以合成cDNA为模板，PCR扩增CDV HBF-1和CDV3的H基因，纯化目的产物后连接至pEASY-Blunt Vector上，挑取阳性重组子，小量提取质粒pBlunt-QH和pBlunt-RH，作为阳性对照。用分光光度计测定质粒在260nm与280nm波长下吸光度(A)值，判断质粒纯度(1.8>A260/A280<2.0)，测定质粒浓度，计算拷贝数/μL＝质粒浓度×6.02×10²³/660×质粒总长度(其中，6.02×10²³是阿伏加德罗常数，660是碱基对平均分子质量)。最后，标准品质粒保存-20℃待用。

表1 H基因扩增引物

1.4引物设计与合成

参照GeneBank中已公布的CDV疫苗株H基因序列和我国流行野毒株H基因序列，选取保守区域设计1对通用引物qPCR-HF(SEQ ID NO.1)以及qPCR-HR(SEQ ID NO.2所示)和分别用于鉴别犬瘟热病毒野毒株和疫苗株的特异性探针，用于鉴别犬瘟热病毒野毒株的特异性探针(QH probes)的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，用于鉴别犬瘟热病毒疫苗株的特异性探针(RH probes)的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，探针5’端添加荧光基团FAM，3’端添加淬灭基团TAMRA，引物和探针送上海生工公司合成(序列见表2)。

表2 Real-Time PCR用引物和探针序列

1.5引物和探针的鉴定

采用Roche公司的Faststart Essential DNA Probes Master内含有FastStartTaqDNA polymerase，reaction buffer,dNTP mix(dUTP替换dTTP)和MgCl₂的试剂盒操作说明进行操作，反应体系20μL：2×qPCR混合液10μL，qPCR-HF/qPCR-HR引物各10nM，QH probes或RH probes探针5nM，pBlunt-QH或pBlunt-RH质粒1μL，用PCR级水(Water PCR Grade，试剂盒提供)补足至20μL。反应体系混匀后置Real-Time PCR仪上进行自动化扩增，反应条件：95℃10min，95℃5s、60℃30s，45个循环。扩增结束后对荧光信号和数据进行分析。

1.6标准曲线的绘制

用灭菌蒸馏水10倍系列稀释标准品质粒pBlunt-QH或pBlunt-RH，获得含有1.0×10⁶，1.0×10⁵，1.0×10⁴，1.0×10³，1.0×10²，1.0×10¹拷贝/μL的系列标准模板，采用优化好的反应体系和反应条件进行Real-Time PCR扩增，得到各自的Cq值，以Cq值为纵坐标，以起始模板浓度的对数为横坐标，绘制标准曲线。

1.7特异性和灵敏性试验

利用建立的鉴别CDV野毒株和疫苗株TaqMan探针荧光定量PCR方法，对本室保存的CDV野毒HBF-1株、SD(14)7株和疫苗毒CDV3株、OR12株，及其他6种病毒：犬副流感病毒、狂犬病病毒、犬冠状病毒、犬细小病毒、Ⅰ型犬腺病毒和Ⅱ型犬腺病毒的基因组进行检测。其中，RNA病毒基因组需要进行cDNA合成。在相同条件下，将以上6种病毒基因组做为对照，验证该方法的特异性。同时以RH探针对pBlunt-QH模板、以QH探针对pBlunt-RH模板，进行Real-Time PCR，验证该鉴别诊断方法的有无交叉反应。根据扩增结果判定：在阴性对照没有Ct或Cq值的情况下，Ct或Cq值≤40判为阳性；Ct值或Cq>40为阴性。

选取含有1.0×10⁶，1.0×10⁵，1.0×10⁴，1.0×10³，1.0×10²，1.0×10¹，1.0×10⁰拷贝/μL的标准品pBlunt-QH或pBlunt-RH为模板，以优化后的反应体系以及反应条件分别进行Real-Time PCR，同时进行常规PCR检测，比较两者的灵敏度。常规鉴定PCR反应体系20μL：2×Mix 10μL，上下游引物各1μL，模板1μL，灭菌水补齐至20μL。混匀后进行PCR扩增，1％琼脂糖凝胶电泳检测目的条带。

1.8重复性试验

选取含有1.0×10⁶，1.0×10⁵，1.0×10⁴拷贝/μL的标准品pBlunt-RH或pBlunt-QH为模板，分别做3个重复，进行Real-Time PCR扩增。获得的Cq值，采用软件SPSS 16.0计算变异系数CV，验证反应体系的准确性和稳定性。

2结果

2.1CDV H基因重组质粒的构建

分别克隆CDV强毒HBF-1株和疫苗毒CDV3株的H基因，连接至pEASY-Blunt载体上。重组质粒pBlunt-QH和pBlunt-RH经Kpn Ⅰ和Not Ⅰ双酶切后，经1％琼脂糖凝胶电泳，均获得大小约为2000bp(H基因)和3800bp(pEASY-Blunt载体)的两个片段(如图1)。测序鉴定完成正确。分光光度计测定质粒pBlunt-QH和pBlunt-RH的浓度和纯度。pBlunt-QH浓度为69.8ng/μL，pBlunt-RH浓度为67.6ng/μL，A260/A280比值分别为1.85和1.82，均符合纯度要求。根据拷贝数公式，计算出pBlunt-QH质粒溶液中DNA拷贝数为1.0×10¹⁰/μL，pBlunt-RH中DNA拷贝数为1.0×10¹⁰/μL。

2.2引物与探针工作浓度及扩增反应条件的优化

采用矩阵法确定引物和探针的最佳浓度。结果证实，引物工作浓度为0.4μM探针工作浓度为0.2μM时，对质粒标准品的检测可获得标准“S”的扩增曲线，及合理的Cq值和较大的ΔRn(绝对荧光强度与背景荧光强毒的差值)(如图2)。

因此，优化后的反应体系20μL，包括：2×PCR mix 10μL，qPCR-HF/qPCR-HR引物各0.4μM，QH probes或RH probes探针0.2μM，模板1μL，用PCR级水(Water PCR Grade，试剂盒提供)补足至20μL。反应体系混匀后置Real-Time PCR仪上进行自动化扩增，反应条件：95℃10min，95℃5s、60℃30s，45个循环。扩增结束后对荧光信号和数据进行分析。

2.3标准曲线的绘制

用含有1.0×10⁶，1.0×10⁵，1.0×10⁴，1.0×10³，1.0×10²，1.0×10¹拷贝/μL的系列稀释标准品为模板，以优化后的反应体系以及反应条件进行Real-Time PCR扩增(图3A和图3B)，绘制出相应的标准曲线(图4A和图4B)。可以看到，设定拷贝数与相应的Cq值具有良好的相关性，相关系数R²达到1.00。说明各个稀释度的标准品浓度相关性良好。

2.4特异性试验

用建立的鉴别CDV野毒株和疫苗株TaqMan探针实时荧光定量PCR方法，对2种CDV野毒株、3种CDV疫苗毒和6种其他相关病原进行检测，结果显示野毒株TaqMan探针仅对CDV野毒株显示为阳性扩增，疫苗毒TaqMan探针仅对CDV疫苗毒显示为阳性扩增，野毒株和疫苗株无交叉反应。CDV野毒株和疫苗株探针对其他病原检测均为阴性结果。

2.5灵敏性试验

选取10倍系列稀释的含有1.0×10⁷～1.0×10⁰拷贝/μL的标准品pBlunt-QH或pBlunt-RH为模板，以优化后的反应体系以及反应条件分别进行Real-Time PCR检测，同时进行常规PCR。结果可见：普通PCR的最小检测量10³。而本发明建立的实时荧光定量PCR的最小检测量为1个拷贝(图5)。

2.6重复性试验

对3个浓度的标准品pBlunt-RH和pBlunt-QH分别进行Real-Time PCR扩增，其中每个浓度做3个重复，扩增曲线见图6A和6B。得到的Cq值，采用软件SPSS 16.0计算出的变异系数CV％都不到1％，验证了反应体系的准确性和稳定性。

实施例2用于鉴别犬瘟热病毒野毒株与疫苗株的Taqman探针荧光定量PCR检测试剂盒的组装

1、引物和探针

用于扩增犬瘟热病毒野毒株以及疫苗株H基因保守区域的通用引物，所述的通用引物由上游引物和下游引物组成，所述的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

用于鉴别犬瘟热病毒野毒株的特异性探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述的探针的5’端添加荧光基团FAM，3’端添加淬灭基团TAMRA；

用于鉴别犬瘟热病毒疫苗株的特异性探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述的探针的5’端添加荧光基团FAM，3’端添加淬灭基团TAMRA。

2、用于逆转录反应的试剂

3、用于荧光定量PCR检测的试剂

4、阳性对照：pBlunt-RH以及pBlunt-QH质粒，按照实施例1方法制备

5、阴性对照：无RNA酶水。

序列表

<110> 中国农业科学院特产研究所

<120>用于鉴别犬瘟热病毒野毒株与疫苗株的Taqman探针荧光定量PCR检测试剂盒及应用

<130> KLPI180463

<160> 4

<170> Patent In version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

aatacatata acaaaycacc gtg 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

catvgggtag gwttttctkt gac 23

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

cagactccag acagtttttt tgctcc 26

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

ccagccaacc tttttgttct tctt 24

Claims (7)

1.用于鉴别犬瘟热病毒野毒株与疫苗株的Taqman探针荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有用于扩增犬瘟热病毒野毒株以及疫苗株H基因保守区域的通用引物以及分别用于鉴别犬瘟热病毒野毒株或疫苗株的特异性探针，其中，所述的通用引物由上游引物和下游引物组成，所述的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，用于鉴别犬瘟热病毒野毒株的特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，用于鉴别犬瘟热病毒疫苗株的特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述的探针的5’端添加荧光基团，3’端添加淬灭基团。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的探针的5’端添加荧光基团FAM，3’端添加淬灭基团TAMRA。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括用于逆转录反应的试剂以及用于荧光定量PCR检测的试剂。

4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括阳性对照以及阴性对照。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的阳性对照包括分别含有犬瘟热病毒野毒株或疫苗株H基因的质粒，所述的阴性对照为无RNA酶水。

6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，用于犬瘟热病毒野毒株与疫苗株鉴别时，按照以下步骤进行：

(1)cDNA的合成

提取待测病毒株的总RNA，以提取的RNA为模板，通过逆转录反应合成cDNA；

(2)配制qPCR反应体系

配制反应体系20μL，包括：2×qPCR混合液10μL，上下游引物各0.4μM，用于鉴别犬瘟热病毒野毒株或疫苗株的特异性探针0.2μM，步骤(1)合成的cDNA1μL，用PCR级水补足至20μL；

(3)PCR扩增

将步骤(2)配制好的反应体系放混匀后置Real-Time PCR仪上进行自动化扩增，反应条件为：95℃10min，95℃5s、60℃30s，45个循环；

(4)结果分析

根据扩增结果判定：在阴性对照没有Ct或Cq值的情况下，Ct或Cq值≤40判为阳性；Ct值或Cq>40为阴性。

7.权利要求1-6任一项所述的试剂盒在制备用于鉴别犬瘟热病毒野毒株与疫苗株的试剂中的应用。