CN111235312A

CN111235312A - 一种用于犬瘟热病毒基因检测的引物、探针及检测试剂盒

Info

Publication number: CN111235312A
Application number: CN202010144272.4A
Authority: CN
Inventors: 金京勋; 刘昕; 王弋; 金文�; 段巧梅; 覃柳斌; 欧海航
Original assignee: Dongguan Bosheng Biological Technology Co ltd; Dongguan Yuanhe Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Dongguan Bosheng Biological Technology Co ltd; Dongguan Yuanhe Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2020-03-04
Filing date: 2020-03-04
Publication date: 2020-06-05
Anticipated expiration: 2040-03-04
Also published as: CN111235312B

Abstract

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种用于犬瘟热病毒基因检测的引物、探针及检测试剂盒；所述检测犬瘟热病毒的引物包括有：环茎型反转录引物、在环茎型反转录引物序列上设计的上游引物及探针；与现有技术相比降低了不同基因型RNA病毒检测的引物探针设计难度，应用本发明方法使用一套引物探针系统检测6个基因型犬瘟热病毒；极大地降低了设计难度，与目前常用的多重PCR相比，降低引物和探针间影响因素，降低检测成本，最大限度保证诊断能力，方便临床使用。

Description

一种用于犬瘟热病毒基因检测的引物、探针及检测试剂盒

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种用于犬瘟热病毒基因检测的引物、探针及检测试剂盒。

背景技术

反转录PCR(RT-PCR)是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被反转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。RT-PCR的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的RNA。RT-PCR广泛应用于RNA病毒检测、遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种RNA的含量。

犬瘟热病毒是感染犬的一种最古老的、临床意义最大的病毒。感染的自然宿主为犬科动物和鼬科动物，主要通过空气和飞沫水平传播。病犬是重要的传染源，并通过尿液长期排毒，污染周围环境；不同年龄、性别和品种的犬均可感染，病犬是最重要的传染源，通过尿液长期排毒，污染周围环境。感染CDV表现症状多种多样，主要可分为超急性型、急性型、消化道症状、神经症状和皮肤症状5种特征性类型，一旦出现特征性症状，则预后极差。CDV感染病型复杂多样，临床上诊断很困难，易与上呼吸道感染、犬传染性肝炎、犬冠状病毒感染等相混淆，随着宠物数量的增加，犬瘟热病毒检测试剂的需求也越来越大，对犬瘟热病毒核酸检测试剂的特异性和敏感性也提出了更高的要求。

犬瘟热病毒(caninedistempervirus，CDV)在分类上属副黏病毒科(Paramyxoviridae)、麻疹病毒属(Morbillivirus)，是一种单链RNA病毒，单链RNA结构不稳定，同时RNA聚合酶无3′-5′端修正活性，繁殖过程中很容易出现变异，目前分为6个基因型，不同基因型同源性差异大，在同一基因型不同毒株间同源性差异也较大，设计通用型引物和探针困难，目前常规试剂盒采用设计多个引物及探针或兼并碱基方法，其特异性和敏感性较差，容易出现漏诊及误诊。

发明内容

针对现有技术检测犬瘟热病毒基因容易出现漏诊、犬瘟热病毒检测试剂-包括核酸检测试剂敏感性较差的问题，本发明的目的在于提供一种用于犬瘟热病毒基因检测的引物、探针及检测试剂盒从而解决犬瘟热病毒基因突变频率高，尤其涉及不受犬瘟热病毒基因型影响，提高特异性和敏感性的检测犬瘟热病毒的引物、探针及试剂盒。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

第一方面，本发明提供一种逆转录用环茎型引物，不同基因型只需很短的特异性保守序列，就能设计引物探针，降低引物探针设计难度，提高敏感性，减少漏诊率。

第二方面，本发明提供一种提高反转录核酸链式扩增特异性和敏感性的RT-PCR反应液，反应液添加反转录酶、taq酶、dNTP、特异性引物、缓冲液等常规成分以外，还添加了recA蛋白以及为recA蛋白提供能量的ATP。

第三方面，本发明提供一种检测犬瘟热病毒的试剂盒，包括引物对、荧光探针选择、配制RT-PCR反应体系、设置反应条件的步骤，其中，所述引物对采用上述的引物对，所述荧光探针采用上述的荧光探针。

在其中一个实施例中，所述设置反应条件的步骤中，反转录反应温度设为42-50℃，反应温度设为50-62℃。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明反转录引物创造性的采用环茎型结构，反转录产物序列包括了病毒和环茎型引物环茎部序列，加长特异性序列，在反转录引物序列上设计上游引物和检测用探针，降低设计难度，同时下游引物设计在病毒保守区域，所需保守区域较短，扩大可检测基因型，提高敏感性，降低漏诊率；同时在反应液中添加recA蛋白以及为其提供能量的ATP，提高了反转录产物的特异性，提高了反转录反应效率，为提高试剂盒的特异性提供了前提基础；

本发明的检测方法，基于环茎型反转录引物，以及recA蛋白的特性，与现有方法相比，只需用一套引物、探针就能检测几乎所有基因型犬瘟热病毒，与现有检测方法相比，提高了敏感性，减少漏诊率，同时优化反应液，对反转录反应产物的错配几乎减少到了最低，最终达到特异性检测的目的。

附图说明

图1环茎型反转录引物示意图；

图2为实施例3样品1～7测序序列对比图；

图3为实施例4反转录引物对照1的结构示意图；

图4为实施例4反转录引物对照2的结构示意图；

图5为实施例6的10倍稀释浓度梯度与Ct平均值的线性关系图。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

实施例1、反转录引物、上游引物及下游引物和探针设计

本实施例设计了犬瘟热病毒检测用反转录引物、上游引物以及下游引物，步骤如下：从GeneBank下载六个基因型病毒，使用DNAMAN软件进行对照分析，找到32bp完全保守区域(SEQ ID NO 1：

5′-ATATTTTATTAAAAACTTAGGGTCAATGATCC-3′)，在其3′选取8bp(SEQ ID NO2AATGATCC)为模板设计反转录引物(SEQ ID NO3：

5′-CTACTCCTCACAGCACCTACTATTTGCCAGCCGTTAAAGGAGTAG-GGAT CATT-3′)和下游引物(SEQ ID NO4 5′-TATTTTATTAAAAACTTAGG-3′),在反转录引物序列内部设计上游引物(SEQ ID NO5：

5′-GATGAGGAGTGTCGTGGATG-3′)和检测用荧光探针(SEQ ID NO6：FAM-5′-TAAACGGTCGGCAATTTCCTCATCCCT-3′-BHQ1)，合成委托广州艾基生物科技公司。

表1.6个基因型毒株和基因编号

实施例2

实时荧光反转录PCR(RT-PCR)

引物对和序列如下：

反转录引物(SEQ ID NO3)：环部由30bp人工设计序列组成，茎部由8bp互补的双链组成，尾部由8bp与模板序列互补的碱基组成。

5′-CTACTCCTCACAGCACCTACTATTTGCCAGCCGTTAAAGGAGTAG-G GATCATT-3′)

下游引物(SEQ ID No4)：5′-TATTTTATTAAAAACTTAGG-3′

上游引物(SEQ ID NO 5)：5′-GATGAGGAGTGTCGTGGATG-3′

检测用荧光探针(SEQ ID NO6FAM-5′-TAAACGGTCGGCAATTTCCTCATCCCT-3′-BHQ1)。

由于上游引物和下游引物之间距离较短，cDNA经过PCR扩增后的产物很难通过电泳确认，直接使用实时荧光RT-PCR进行检测；提取犬瘟热病毒Gi/167614365、Gi/129770825:Gi/224579344:Gi/6594288、Gi/121486033、Gi/34328597:Onderstepoort株核酸，使用宝日医生物公司PrimeScript^TM One Step RT-PCR Kit Ver.2进行一步法荧光RT-PCR，每个样品3个重复，仪器使用ABI7500实时荧光PCR仪。

反应体系如表2：

表2反应体系表

反应体系得到的结果如表3所示：

表3不同亚型毒株实时荧光RT-PCR结果

样品1：Gi/167614365、2：Gi/129770825:3：Gi/224579344:4：Gi/6594288、5：Gi/121486033、6：Gi/34328597:7：Onderstepoort。

实施例3、荧光PCR产物测序

本实施例使用实施例2中的PCR产物进行测序，测序委托广州艾基生物技术有限公司进行，测序结果7个样品序列完全相同(SEQ ID No 7：ATATTTTATTAAAAACTTAGGGTCAATGATCCCTACTCCTTTAACGGCTGGC AAATAGTAGGTGCTGTGAGGAGTAG)。

实施例4、不同环茎长度的反转录引物对照实验

本实施例设计了不同长度环部和茎部的环茎型反转录引物，同时在环部设计上游引物和检测用荧光探针，引物和探针委托广州艾基生物科技有限公司合成。

反转录引物对照1：环部由35bp人工序列碱基组成，茎部由15bp互补的双链组成，结构见图3。

SEQ ID No8：

5-GAAGCTCTACTCCTCACAGCATCACTACTATCTCTGACACAGCCGTTAAA GGAGTAGAGCTTC-GGATCATT-3′

上游引物对照1(SEQ ID No 9：5′-GATGAGGAGTGTCGTAGTGATGA-3′)

检测用荧光探针(SEQ ID No10：

FAM-5′-AGAGACTGTGTCGGCAATTTCCTCATCTCG-3′-BHQ1)

反转录引物对照2：反转录对照引物2环部由38bp人工序列组成，茎部由10bp互补双链组成。

SEQ ID No 11：

5′-CTCTACTCCTCACAGCATCACTATATCTACATCTGACACAGCCGTTAAAG GAGTAGAG-GGATCATT-3′

上游引物对照2SEQ ID No 12:5′-AGGAGTGTCGTAGTGATATA-3′

检测用荧光探针对照2SEQ ID No 13：

5′-FAM-ATGTAGACTGTGTCGGCAATTTCCTCATC-BHQ1-3′

两组对照组下游引物与实施例1合成下游引物相同，反应液组份和反应体系与实施例1相同，配制反应液进行实时荧光RT-PCR检测，样品使用疫苗株Onderstepoort株，每个对照组重复三个孔，结果如表4所示：

表4不同反转录引物和上游引物、探针实时荧光RT-PCR结果

样品1为对照引物1，样品2为对照引物2，cont为实施例1所设计、实施例2所用的引物探针，反应液配制与反应程序与实施例2相同，对照组1的Ct值与对照组2和实施例2引物探针相比灵敏度明显降低，考虑为茎部过长，影响PCR反应降温过程中形成的互补链过多，影响灵敏度，但是茎部过短，对维持结构影响大，由此其长度以8～12bp为优。

实施例5

不同环茎长度引物的反转录PCR及产物测序

本实施例使用实施例4中引物对照2进行不同毒株的实时荧光反转录PCR，同时进行测序，测序委托广州艾基生物科技有限公司进行，反转录PCR结果及测序结果如下表5：

表5不同环茎长度引物的反转录PCR

样品1：Gi/167614365、2：Gi/129770825:3：Gi/224579344:4：Gi/6594288、5：Gi/121486033、6：Gi/34328597:7：Onderstepoort

测序结果7个样品测序结果相同，序列为SEQ ID No 14：

ATATTTTATTAAAAACTTAGGGTCAATGATCCCTACTCCGAGATGAGGAAAT TGCCGACACAGTCTACATCTATATCACTACGACACTCCT

实施例6

用于检测犬瘟热病毒的试剂盒及验证

本实施例针对犬瘟热病毒设计了含有实施例1引物对和探针的试剂盒以及验证，对照组为某公司犬瘟热病毒核酸检测试剂。

实验组反应体系如下表6：

表6

最终反应体系25ul。

对照组按照试剂说明书进行配液及添加模板，最终反应体系20ul。

模板使用临床分离培养鉴定的犬瘟热病毒。

2、反应程序按照对照组试剂反应程序设定如下。

42度45分；

95度3分钟-1个循环；

95度2秒，60度30秒-45循环。

3、反应结果

反应结果请参见表1：1-CPIV为实验组，2-CPIV为对照组，从表7结果可看出实验组空白对照未见阳性，特异性良好；实验组Ct值比对照组提前2～3个循环左右，敏感性明显提高，每个浓度间Ct值线性关系良好，如图5所示。

表7

本发明上述实施例，采用环茎型反转录引物进行反转录反应，可在极短的保守序列设计反转录引物，并进行实时荧光RT-PCR检测，进而降低了引物探针是难度，提高反应敏感性，可实现不同基因型犬瘟热病毒使用一套引物、探针进行检测目的，最终达到同时保证特异性和敏感性。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 东莞源和生物科技有限公司东莞博盛生物科技有限公司

<120> 一种用于犬瘟热病毒基因检测的引物、探针及检测试剂盒

<130> /

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

atattttatt aaaaacttag ggtcaatgat cc 32

<210> 2

<211> 8

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

aatgatcc 8

<210> 3

<211> 53

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

ctactcctca cagcacctac tatttgccag ccgttaaagg agtagggatc att 53

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

tattttatta aaaacttagg 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

gatgaggagt gtcgtggatg 20

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

taaacggtcg gcaatttcct catccct 27

<210> 7

<211> 77

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

atattttatt aaaaacttag ggtcaatgat ccctactcct ttaacggctg gcaaatagta 60

ggtgctgtga ggagtag 77

<210> 8

<211> 71

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

gaagctctac tcctcacagc atcactacta tctctgacac agccgttaaa ggagtagagc 60

ttcggatcat t 71

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

gatgaggagt gtcgtagtga tga 23

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

agagactgtg tcggcaattt cctcatctcg 30

<210> 11

<211> 66

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

ctctactcct cacagcatca ctatatctac atctgacaca gccgttaaag gagtagaggg 60

atcatt 66

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

aggagtgtcg tagtgatata 20

<210> 13

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 13

atgtagactg tgtcggcaat ttcctcatc 29

<210> 14

<211> 91

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 14

atattttatt aaaaacttag ggtcaatgat ccctactccg agatgaggaa attgccgaca 60

cagtctacat ctatatcact acgacactcc t 91

Claims

1.一种用于犬瘟热病毒基因检测的引物、探针及检测试剂盒，其特征在于，引物、探针为反转录用引物、以及扩增引物和检测用荧光探针，试剂盒采用的检测方法为反转录聚合酶链式扩增方法，其反应液含有反转录酶、脱氧核糖核苷三磷酸、脱氧核核酸聚合酶。

2.权利要求1所述的检测犬瘟热病毒的反转录引物、以及扩增引物和检测用荧光探针，其特征为只需要一套引物、探针，检测所有基因型的犬瘟热病毒。

3.权利要求1所述的检测犬瘟热病毒的反转录引物、以及扩增引物和检测用荧光探针，其特征为反转录引物为环茎型引物，上游扩增引物和检测用荧光探针序列与反转录引物互补，下游扩增引物包含部分反转录引物序列。

4.权利要求3所述的环茎型引物其特征为：包含环部、茎部以及尾部，环部由约25~35bp碱基组成，茎部由约8~12bp左右互补链组成，尾部由6~10bp左右碱基序列组成，尾部碱基序列与犬瘟热病毒保守序列互补。

5.权利要求3所述的上游扩增引物，其特征为：其序列与反转录引物环部序列互补。

6.权利要求3所述的下游扩增引物，其特征为：其序列与病毒保守序列互补。

7.权利要求3所述的检测用探针，其特征为：探针碱基序列与反转录引物环部序列互补，5´端修饰有荧光基团，3´端具有淬灭基团。

8.根据权利要求4所述的环茎型反转录用引物，反转录反应时依靠与犬瘟热病毒保守序列互补的碱基序列进行反转录，形成序列互补DNA。

9.根据权利要求5所述的上游扩增引物，其特征在于，由于序列与反转录引物环部互补，反转录引物维持环茎型结构时不参与反应，反转录反应后进入扩增阶段，cDNA经高温变性，形成线性DNA后参与反应。

10.权利要求1所述的用于检测犬瘟热病毒基因的犬瘟热病毒检测试剂盒，包括引物对、荧光探针选择、配制RT-PCR反应体系、设置反应条件的步骤，其特征在于，所述反转录引物采用权利要求4所述的环茎型引物，所述扩增用上游引物采用权利要求5所述引物，所述扩增用下游引物使用权利要求6所述引物，检测用荧光探针采用权利要求7所述的荧光探针。

11.根据权利要求10所述的检测犬瘟热病毒基因的犬瘟热病毒检测试剂盒，其特征在于，所述设置反应条件的步骤中，反转录反应温度为42-50℃，PCR反应为两步法，反应温度设为变性温度95℃，扩增延伸温度55-60℃。