CN109295261A - 一种用于检测慢病毒rcl的引物、探针及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于慢病毒RCL检测的引物对、探针、试剂盒及其检测方法，所述引物对的序列分别包括如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，所述探针序列为如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。本发明所提供的引物对和探针序列，特异性强，灵敏度和重复性高，所述检测方法检测周期短，检测精度高，可检测出的样本浓度下限低。

Description

一种用于检测慢病毒RCL的引物、探针及检测方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测慢病毒RCL的引物、探针及检测方法。

背景技术

慢病毒(Lentivirus)载体是以HIV-1(人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体，其是目前应用最广泛的基因运载工具之一，在基因治疗研究和转基因动物的制备中已显示出其广阔的应用前景。但是，操作慢病毒载体仍有一些隐患，主要在于：(a)可能产生自我复制的有感染能力的慢病毒(RCL)；(b)肿瘤生成的潜在可能性；(c)转基因的潜在毒性。

为了改善慢病毒的生物安全，人们做出了很大的努力。其中，针对主要可获得的商品化慢病毒系统——第二和第三代慢病毒系统，采取了很多安全措施以降低风险。主要包括：通过去除辅助基因减少或消除HIV-1致病性；通过包装蛋白和酶用不同的载体表达来减少包装构建体之间的同源性，以降低同源重组的可能性。此外，由于剔除了3'LTR，慢病毒自身是无活性的，以上措施的施用减少了病毒同源重组和动员整合载体的可能性。

随着慢病毒在基因治疗和细胞治疗中的应用，慢病毒载体在医学中显示出了希望。然而，由于插入突变有产生有复制能力病毒的潜在风险，慢病毒载体的安全性和遗传毒性已成为阻碍其用于治疗的主要原因。Paul Escarpe等人使用VSV Gag基因表型假型病毒作为慢病毒RCL的标准来进行检测，该方法通过将载体样品在细胞系C8166-45暴露于7天以增加RCL感染和扩增的机会，然后将培养物定期稀释六次以允许RCL扩增，每次收集培养上清液样品，通过测量p24衣壳蛋白浓度来分析病毒的复制情况。此方法操作繁琐复杂，检测周期过长，且不能快速检测出慢病毒RCL。

因此，提供一种操作简单、检测周期短且灵敏度高的慢病毒RCL检测方法是目前亟需解决的问题。

发明内容

为了克服上述问题，本发明人进行了锐意研究，针对VSV Gag基因设计了用于检测慢病毒RCL的一对特异性引物和探针，并结合标准阳性质粒，通过荧光定量PCR方法能对慢病毒进行快速、准确的检测，从而完成了本发明。

具体来说，本发明的目的在于提供以下方面：

第一方面，提供了一种用于检测慢病毒RCL的引物对，其中，所述引物对包括正向引物和反向引物，其中，所述正向引物的序列包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述反向引物的序列包括如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

第二方面，提供了一种用于检测慢病毒RCL的探针，其中，所述探针序列为如SEQID NO.3所示的核苷酸序列。

第三方面，提供了一种用于检测慢病毒RCL的试剂盒，其中，所述试剂盒包括第一方面所述的引物对和第二方面所述的探针。

其中，所述试剂盒还包括标准阳性质粒、PCR反应体系和酶体系。

其中，所述标准阳性质粒的制备方法包括以下步骤：

步骤i，获取慢病毒RCL的靶序列片段；

步骤ii，构建包含上述靶序列片段的重组质粒；

步骤iii，测定重组质粒的浓度，并计算相应拷贝数，得到标准阳性质粒。

其中，所述PCR反应体系包括缓冲液(Buffer)、MgCl2、dNTPs；所述酶体系包括反转录酶和热启动DNA聚合酶。

其中，步骤i包括以下子步骤：

步骤i-a，获取慢病毒RCL的cDNA；

步骤i-b，以上述获取的cDNA为模板，扩增得到慢病毒RCL的靶序列片段。

其中，步骤ii包括以下子步骤：

步骤ii-a，将得到的靶序列片段与载体进行连接；

步骤ii-b，将连接好的载体转化至感受态细胞中进行表达，然后加入液体培养基进行培养，得到菌液；

步骤ii-c，将上述菌液涂布至平板培养基上培养，待形成单菌落后，挑选单菌落进行检测；

步骤ii-d，根据检测结果，选取菌落进行扩大培养，然后抽提质粒。

第四方面，提供了一种检测慢病毒RCL的方法，优选采用所述的试剂盒进行，其其中，所述方法包括以下步骤：

步骤1，对待测样本进行处理；

步骤2，对处理后的待测样本进行检测。

其中，步骤2中，所述检测优选采用荧光定量PCR方法进行，所述反应程序为：95℃下预变性30s；然后95℃变性5s，60℃退火和延伸共30s，进行40个循环，4℃保存。

本发明所具有的有益效果包括：

(1)本发明所提供的引物对和探针序列，特异性强，灵敏度和重复性高；

(2)本发明所提供的试剂盒，使用方便，操作简单，成本低；

(3)本发明所提供的检测方法，对检测仪器的要求低，检测周期短，检测精度高，可检测出的样本浓度下限低。

附图说明

图1示出了本发明实施例1中重组载体的蓝白斑菌落生长情况；

图2示出了本发明实施例1中琼脂糖凝胶电泳检测结果图；

图3示出了本发明实施例2中六个梯度浓度的重组质粒的荧光定量PCR扩增结果图。

具体实施方式

下面通过优选实施方式和实施例对本发明进一步详细说明。通过这些说明，本发明的特点和优点将变得更为清楚明确。

第一方面，本发明提供了一种用于检测慢病毒RCL的引物对，其中，所述正向引物的序列包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述反向引物的序列包括如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

优选地，所述正向引物序列为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述反向引物序列为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

在本发明中，优选将GeneBank中所有的Gag基因的序列进行比对，得到相对保守的靶序列片段，所述靶序列包括如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。

其中，Gag基因编码HIV-1(人类免疫缺陷I型病毒)的核心蛋白。

在本发明中，针对上述保守的靶标序列，应用Primer Express 3.0软件对其进行生物信息学分析，设计得到所述的引物序列。

其中，在引物设计的过程中应避免出现发夹结构和引物二聚体等情况。

第二方面，本发明提供了一种用于检测慢病毒RCL的探针，所述探针序列为如SEQID NO.3所示的核苷酸序列。

在本发明中，针对所述相对保守的靶序列，应用Primer Express 3.0软件对其进行生物信息学分析，设计得到所述探针序列。

优选地，所述探针序列的5'端带荧光基团FAM，3'端带有淬灭基团TAMRA。

第三方面，本发明提供了一种用于检测慢病毒RCL的试剂盒，所述试剂盒包括如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列组成的引物对，以及如SEQ ID NO.3所示的探针。

根据本发明一种优选的实施方式，所述如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列组成的引物对的浓度为10μM，所述如SEQ ID NO.3所示的探针的浓度为10μM。

根据本发明一种优选的实施方式，所述试剂盒还包括标准阳性质粒、PCR反应体系和酶体系。

其中，所述PCR反应体系包括缓冲液(Buffer)、MgCl₂、dNTPs；所述酶体系包括反转录酶和热启动DNA聚合酶。

其中，所述dNTPs指的是脱氧核糖核苷酸，包括dATP，dTTP，dCTP和dGTP，在生物DNA合成中以及各种PCR反应中起原料作用。

根据本发明一种优选的实施方式，所述标准阳性质粒是指用于检测慢病毒RCL的阳性对照，以检验反应体系和反应条件能否正常进行。

根据本发明一种优选的实施方式，所述标准阳性质粒的制备方法包括以下步骤：

步骤i，获取慢病毒RCL的靶序列片段。

其中，所述步骤i包括以下子步骤：

步骤i-a，获取慢病毒RCL的cDNA。

在本发明中，先提取慢病毒RCL的RNA，然后将RNA反转录为cDNA。

其中，所述待测样本的RNA采用病毒基因组RNA提取试剂盒进行抽提提取，如TaKaRaMiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0。

根据本发明一种优选的实施方式，将RNA反转录为cDNA所采用的反应体系包括如下配比的组分：

其中，在上述体系中补加双蒸水(ddH₂O)至总体系为10μL。

其中，所述随机六聚体引物(Random 6mers)为非特异引物，是在当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，用来拷贝全长mRNA的，应用此引物合成的cDNA中96％来源于rRNA。

所述寡聚胸腺嘧啶引物(Oligo dT Primer)具有较高的特异性，只能与RNA具有3'端Poly(A)尾相结合，对于5'端部分降解的RNA序列不能完成反转录。

在本发明中，优选采用上述两种反转录引物对病毒的RNA进行反转录，能够提升获取cDNA的效率。在本发明中，上述反转录反应体系的配置应在冰上进行，而且，上述的反应体系为1个反应的配方量，为了保证反应液配置的准确性，优选先按反应数+2配置总反应体系，再进行分装。

在进一步优选的实施方式中，所述反应体系混匀后立即进行反转录反应，所述反应条件为在37℃下反应10～20min，优选为15min。

其中，所述反转录酶在37℃下的活性最高。

在更进一步优选的实施方式中，所述反转录反应的终止反应条件为在85℃下反应5sec。

其中，在85℃下反应5sec使得反转录酶失活，反转录终止。

在本发明中，反转录得到的cDNA置于-70℃下备用。

步骤i-b，以上述获取的cDNA为模板，扩增得到慢病毒RCL的靶序列片段。

其中，以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的正向引物和反向引物为扩增引物，通过普通PCR扩增反应获取慢病毒RCL的靶序列片段。

根据本发明一种优选的实施方式，所述普通PCR的反应体系包括如下配比的组分：

其中，所述2倍预混体系(Primistarhs(premix)2X)包括进行普通PCR扩增反应所必需的缓冲液、MgCl₂、dNTPs及DNA聚合酶，在本发明中，采用预混体系，一方面节省了实验操作的时间，一方面提高了体系中各组分混合的均匀度，尤其适用于反应数较少的实验检测。

在本方明中，上述反应体系指的是一个反应数的组分添加量。

在进一步优选的实施方式中，所述普通PCR反应的扩增条件为：94℃下预变性2min；然后94℃变性15s，60℃退火和延伸共30s，进行30个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。

根据本发明一种优选的实施方式，将上述扩增得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测目的片段扩增效果并回收。

其中，所述目的片段为靶序列片段SEQ ID NO.4，大小为163bp，查看电泳结果中是否含有长度为163bp的目的片段；若含有，则对目的片段进行切胶回收，所述回收采用琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒回收，回收后的目的片段置于-20℃保存备用。

步骤ii，构建包含上述靶序列片段的重组质粒。

在本发明中，需要将上述回收得到的目的片段——靶序列片段进行克隆，以进行后续试验检测，本发明中优选采用TA克隆。

其中，所述TA克隆是把PCR片段与一个具有3'-T突出的载体DNA连接起来的方法。

其中，所述步骤ii包括以下子步骤：

步骤ii-a，将得到的靶序列片段与载体进行连接。

根据本发明一种优选的实施方式，所述载体为pMD-18T载体。

在进一步优选的实施方式中，在进行连接时，先加入载体、靶序列片段和双蒸水，所述三者的加入量为：

载体 1μL

靶序列片段 1μL

双蒸水 3μL。

其中，所述加入的量为一个反应数的量，可根据实际需要按比例添加。

在更进一步优选的实施方式中，在上述加入载体、靶序列片段和双蒸水的混合体系中加入连接液，所述连接液的加入量为5μL/反应数。

其中，所述连接液包括反应缓冲液和连接酶，所述连接酶为T4DNA连接酶，例如：所述连接液为Solution I。

根据本发明一种优选的实施方式，将连接体系混合均匀后，进行连接反应，所述连接温度为14～18℃，优选为16℃，和/或

所述连接时间为20～40min，优选为25～35min，更优选为30min。

在本发明中，将连接体系轻轻混合均匀，以防止破坏DNA片段。

步骤ii-b，将连接好的载体转化至感受态细胞中进行表达，然后加入液体培养基进行培养，得到菌液。

在本发明中，将构建好的载体转化至感受态细胞进行表达，不仅可以检验重组载体是否构建成功，还能够将感受态细胞作为重组载体的宿主进行后续实验。

在本发明中，优选将连接好的体系，全部转入大肠杆菌感受态细胞中，即每个反应数10μL的连接体系全部转入大肠杆菌感受态中。

根据本发明一种优选的实施方式，所述大肠杆菌感受态细胞选自JM109、DH5α、BL21或TOP10感受态细胞中的一种或多种。

其中，所述JM109、DH5α、BL21及TOP10均为菌株编号。

在进一步优选的实施方式中，所述大肠杆菌感受态细胞选自JM109、DH5α或TOP10感受态细胞中的一种或多种。

在更进一步优选的实施方式中，所述大肠杆菌感受态细胞为JM109感受态细胞。

其中，利用JM109感受态细胞很容易鉴别重组体菌株。

优选地，所述感受态细胞加入量与连接体系的体积比为(80～120)：10，优选为(90～110)：10，更优选为100:10。

根据本发明一种优选的实施方式，所述转化包括以下步骤：

步骤a，将连接体系加入感受态细胞中，轻轻混匀后立即置于冰中放置一段时间。

在本发明中，采用的是热激法将重组载体转化至大肠杆菌感受态细胞中，将混合好的体系置于冰上放置一段时间是因为：大肠杆菌在0℃的氯化钙低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，体系中的载体形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物黏附于细胞表面，待后续高温热冲击后，进入感受态细胞。

根据本发明一种优选的实施方式，所述冰上放置的时间为20～40min，优选为25～35min，更优选为30min。

步骤b，将上述体系取出，置于一定温度下进行热激处理，然后置于冰中放置。

根据本发明一种优选的实施方式，所述热激处理为在42℃下热处理40～50s，优选在42℃下热处理45s。

在进一步优选的实施方式中，在热激处理后于冰上放置1min。

其中，热激处理后冰上放置，是为了使感受态细胞复原，使得重组载体完全进入。

根据本发明一种优选的实施方式，所述加入的液体培养基为LB液体培养基，所述转化后的混合体系与加入的液体培养基的体积比为110：(800～1000)，优选为110：(850～950)，更优选为110:890。

其中，所述LB培养基为Luria-Bertani培养基，分为液体培养基和固体培养基，用来与培养菌种，使菌种成倍扩增。

在进一步优选的实施方式中，将加入液体培养基的体系置于37℃下振荡培养，所述培养时间为45～90min，优选为50～70min，更优选为60min。

本发明人经过研究发现，当振荡培养的时间少于45min时，培养基溶液较为澄清，溶液中产生的菌体较少，在涂布培养时菌落较少，不易检测；当振荡培养的时间多于90min时，溶液较为浑浊，培养基溶液中菌体较多，后期涂布培养时，菌落易连接成片，形不成单菌落。因此，本发明选择的振荡培养时间为45～90min，优选为50～70min，更优选为60min，使得形成的单菌落形态、直径和密度适于检测。

步骤ii-c，将上述菌液涂布至平板培养基上培养，待形成单菌落后，挑选单菌落进行检测。

其中，所述平板培养基优选为BL琼脂平板培养基。

根据本发明一种优选的实施方式中，在所述平板培养基中添加有X-Gal、IPTG和Amp，所述添加浓度分别为40μg/ml、0.5mM和100μg/ml。

其中，所述X-Gal是β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)的显色底物，在β-半乳糖苷酶的催化下会产生蓝色产物，常用于β-半乳糖苷酶的原位染色检测以及蓝白斑筛选；所述IPTG(异丙基硫代半乳糖苷，Isopropylβ-D-Thiogalactoside)是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定。在平板培养基中加入X-Gal和IPTG，由于β-半乳糖苷酶的α-互补性，可以根据是否呈现白色菌落(或噬菌斑)而挑选出重组载体。

所述Amp指的是氨苄青霉素，在平板培养基中加入是为了防止非重组菌生长，使目的重组菌能够大量生长、表达。

在进一步优选的实施方式中，所述在平板培养基上涂布的菌液为50～200μL。

在更进一步优选的实施方式中，将所述涂布后的平板培养基倒置于37℃中培养12～20h，优选为14～18h，如16h，形成白色和蓝色菌落。

其中，形成的白色菌落为目的菌落。

根据本发明一种优选的实施方式，选取3～5个白色菌落，挑菌，进行PCR扩增检测。

在进一步优选的实施方式中，所述PCR扩增检测体系为包括如下配比的组分：

模板挑取菌落少许部分。

在更进一步优选的实施方式中，所述PCR扩增检测的条件为：94℃下预变性2min；然后94℃变性15s，60℃退火和延伸共30s，进行30个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。

在本发明中，对PCR扩增检测的体系进行琼脂糖凝胶电泳检测，以确认重组载体中插入的片段大小。

步骤ii-d，根据检测结果，选取菌落进行扩大培养，然后抽提质粒。

在本发明中，根据电泳检测结果，选取扩增出的产物含有靶序列片段的菌落进行扩大培养。

根据本发明一种优选的实施方式，所述扩大培养为：先对单菌落进行划线培养，然后对长出的线条状菌进行收集，再加入LB液体培养基中振荡培养。

在本发明中，对振荡培养后的菌体进行质粒提取，优选采用质粒抽提试剂盒，如：AxyPrep质粒DNA小量试剂盒。

步骤iii，测定重组质粒的浓度，并计算相应拷贝数，得到标准阳性质粒。

测定重组质粒的浓度，并计算相应拷贝数。

在本发明中，所述拷贝数＝6.02×10²³×重组质粒的浓度/重组质粒的平均分子量，其中，

所述拷贝数的单位为copies/ml，所述重组质粒的浓度单位为g/ml，所述重组质粒的平均分子量＝(重组质粒碱基数)×(660道尔顿/碱基)。

第四方面，本发明还提供了一种检测慢病毒RCL的方法，优选采用上述的试剂盒进行检测，所述方法包括以下步骤：

步骤1，对待测样本进行处理；

步骤2，对处理后的待测样本进行检测。

以下详细描述本发明所述的检测方法：

步骤1，对待测样本进行处理。

在本发明中，对待测样本进行处理包括提取待测样本的RNA和将RNA反转录为cDNA。

其中，所述待测样本的RNA采用病毒基因组RNA提取试剂盒进行抽提提取，如Takara MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0。

根据本发明一种优选的实施方式，将RNA反转录为cDNA所采用的反应体系包括如下配比的组分：

其中，在上述体系中补加双蒸水(ddH₂O)至总体系为10μL。

在本发明中，优选采用上述两种反转录引物对病毒的RNA进行反转录，能够提升获取cDNA的效率。

在本发明中，上述反转录反应体系的配置应在冰上进行，而且，上述的反应体系为1个反应的配方量，为了保证反应液配置的准确性，优选先按反应数+2配置总反应体系，再进行分装。

在进一步优选的实施方式中，所述反应体系混匀后立即进行反转录反应，所述反应条件为在37℃下反应10～20min，优选为15min。

其中，所述反转录酶在37℃下的活性最高。

在更进一步优选的实施方式中，所述反转录反应的终止反应条件为在85℃下反应5sec。

其中，在85℃下反应5sec使得反转录酶失活，反转录终止。

步骤2，对待测样本进行检测。

在本发明中，优选采用荧光定量(Real-time)PCR技术对待测样本进行检测。所述荧光定量PCR是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时检测整个PCR过程，最后通过标准曲线对未知模板进行总量分析或通过Ct值对模板进行相对定量。与常规PCR相比，荧光定量PCR无需取出PCR产物进行分离，具有特异性更强、自动化程度高及能有效解决PCR污染等优点。

根据本发明一种优选的实施方式，所述荧光定量PCR的反应体系包括如下配比的组分：

其中，上述反应体系指的是一个反应数的组分添加量，所述正向引物的序列如SEQID NO.1所示，所述反向引物的序列如SEQ ID NO.2所示，所述探针的序列如SEQ ID NO.3所示。

在本发明中，所述预混体系包括缓冲液、MgCl₂、dNTPs及DNA聚合酶。

在本发明中，在荧光定量PCR的过程中，探针一端具有荧光报告基团以发出荧光信号，一端具有淬灭基团以吸收荧光信号。当探针完整时，报告基团发出的荧光信号被淬灭基团吸收，从而不被检测出来；当PCR扩增至探针所在位置时，Taq DNA聚合酶具有的核酸外切酶活性会将探针的荧光基团切断，使其远离探针，此时产生的荧光信号就不能被淬灭基团吸收，从而被仪器检测出来。每扩增一条DNA链就会有一个荧光分子产生，通过荧光信号的积累量实时监测整个PCR反应中每一个循环扩增产物量的变化，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。

在进一步优选的实施方式中，所述荧光定量PCR的反应程序为：95℃下预变性30s；然后95℃变性5s，60℃退火和延伸共30s，进行40个循环，4℃保存。

在本发明中，对待测样本进行检测时，需要添加标准阳性质粒对照和空白对照(无菌双蒸水)，以确保检测的准确性。

实施例

本发明实施例中所述试剂的来源如下：

5×Prime Script Buffer：Takara货号为RR037A；

Random 6mers：Takara货号为RR037A；

Oligo dT Primer：Takara货号为RR037A；

Prime Script RT Enzyme Mix I：Takara货号为RR037A；

Primistarhs(premix)2X：Takara货号为R040A；

JM109感受态细胞：Solarbio货号为C1300；

pMD-18T载体：Takara货号为D101A；

Solution I:Takara货号为D101A；

Premix Ex Taq^TM：Takara货号为DRR390A；

引物对序列：分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，由南京金斯瑞生物科技有限公司公司合成；

探针序列：如SEQ ID NO.3所示，由南京金斯瑞生物科技有限公司公司合成。

实施例1慢病毒RCL标准阳性质粒的制备

1、采用病毒RNA提取试剂盒(Takara MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction KitVer.5.0)提取慢病毒RCL的RNA，然后按照下列组分配置反转录体系：

将上述体系在37℃下反应15min，再于85℃下反应5sec，制得慢病毒RCL的cDNA。

2、以cDNA为模板，以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的序列为正反向引物，进行普通PCR扩增，按照以下组分配比配置：

所述普通PCR反应的扩增条件为：94℃下预变性2min；然后94℃变性15s，60℃退火和延伸共30s，进行30个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存；

将上述扩增得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测大小为163bp的目的片段扩增效果并回收。

3、将pMD18-T载体与目的片段连接，连接体系如下：

将连接体系混合均匀后，进行连接反应，所述连接温度为16℃，连接时间为30min；

然后将全部连接体系入至100μL JM109感受态细胞中，冰中放置30分钟，42℃加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟；

加入890μL LB培养基，37℃振荡培养60分钟；

在X-Gal、IPTG、Amp的浓度分别为40μg/ml、0.5mM和100μg/ml的琼脂平板培养基上涂布100μL的菌液，倒置于37℃中培养16h形成白色、蓝色单菌落，结果如图1所示；挑选4个白色菌落，进行PCR扩增，体系为：2倍预混体系10μL、双蒸水7μL、正向引物1μL、反向引物1μL；扩增程序为：94℃下预变性2min；然后94℃变性15s，60℃退火和延伸共30s，进行30个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存；采用琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果如图2所示，由图2可知，所述4个单菌落中均含有163bp左右的片段，即慢病毒RCL的靶序列片段；对检测的单菌落进行扩大培养，得到菌液；

采用质粒抽提试剂盒(AxyPrep质粒DNA小量试剂盒)提取菌液中的质粒，为标准阳性质粒，采用超微量分光光度计(OD-1000)测定质粒的浓度为2.66×10^-4g/ml，重组质粒的长度为2855bp(pMD18-T载体与目的基因的长度之和)，根据质粒浓度和分子量，计算相应的拷贝数，计算公式为：拷贝数＝6.02×10²³×核酸浓度÷(DNA length×660)＝8.5×10¹³copies/ml。

拷贝数的单位为copies/ml，核酸浓度单位为g/ml。

实施例2检测方法的验证

将实施例1中提取得到的质粒进行梯度稀释，分别稀释为1×10¹¹copies/ml、1×10¹⁰copies/ml、1×10⁹copies/ml、1×10⁸copies/ml、1×10⁷copies/ml、1×10⁶copies/ml，每个梯度进行两个平行实验，按照下述反应体系配置，分别进行荧光定量PCR扩增：

其中，所述正向引物、反向引物和探针的序列分别如序列SEQ ID NO.1～SEQ IDNO.3所示。

在荧光定量PCR仪上(Roche96实时荧光定量PCR仪)按照以下程序进行扩增：95℃下预变性30s；然后95℃变性5s，60℃退火和延伸共30s，进行40个循环，4℃保存。

上述六个梯度质粒的荧光定量PCR检测结果如图3中的曲线a～f所示(a～f分别对应于质粒浓度1×10¹¹copies/ml、1×10¹⁰copies/ml、1×10⁹copies/ml、1×10⁸copies/ml、1×10⁷copies/ml、1×10⁶copies/ml)，由图3可知，本发明所述慢病毒RCL检测方法中采用的引物对、探针均具有较好的扩增效率和特异性，可以用于待测样本的RCL检测。

实施例3慢病毒感染的细胞样本的处理

1、以慢病毒感染的嵌合抗原受体T细胞作为样本，采用病毒RNA提取试剂盒(Takara MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0)提取样本的RNA。

2、按照下列组分配置反转录体系：

将上述体系在37℃下反应15min，再于85℃下反应5sec，制得样本的cDNA，置于-70℃下备用。

实施例4对慢病毒感染的细胞样本的检测

以无菌双蒸水作为阴性对照，平行测定3个待测样本进行荧光定量PCR扩增，所述扩增体系和程序与实施例2中相同，PCR结果显示：待测样本具有扩增曲线，说明利用本发明所述方法能够检测出待测样本中的慢病毒RCL。

以上结合具体实施方式和范例性实例对本发明进行了详细说明，不过这些说明并不能理解为对本发明的限制。本领域技术人员理解，在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进，这些均落入本发明的范围内。

序列表

<110> 温州医科大学附属第一医院

<120> 一种用于检测慢病毒RCL的引物、探针及检测方法

<130> 2018

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 正向引物(Lentivirus)

<400> 1

gctgttggaa atgtggaaag g 21

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 反向引物(Lentivirus)

<400> 2

tctggtctgc tctgaagaaa tg 22

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 探针(Lentivirus)

<400> 3

ttcagagcag accagagcca acag 24

<210> 4

<211> 163

<212> DNA

<213> 靶序列(Lentivirus)

<400> 4

gctgttggaa atgtggaaag gaaggacacc aaatgaaaga ttgtactgag agacaggcta 60

attttttagg gaagatctgg ccttcctaca agggaaggcc agggaatttt cttcagagca 120

gaccagagcc aacagcccca ccatttcttc agagcagacc aga 163

Claims (10)

1.一种用于检测慢病毒RCL的引物对，其特征在于，所述引物对包括正向引物和反向引物，其中，所述正向引物的序列包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述反向引物的序列包括如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

2.一种用于检测慢病毒RCL的探针，其特征在于，所述探针序列为如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

3.一种用于检测慢病毒RCL的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物对和权利要求2所述的探针。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准阳性质粒、PCR反应体系和酶体系。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述标准阳性质粒的制备方法包括以下步骤：

步骤i，获取慢病毒RCL的靶序列片段；

步骤ii，构建包含上述靶序列片段的重组质粒；

步骤iii，测定重组质粒的浓度，并计算相应拷贝数，得到标准阳性质粒。

6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应体系包括缓冲液(Buffer)、MgCl2、dNTPs；所述酶体系包括反转录酶和热启动DNA聚合酶。

7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，步骤i包括以下子步骤：

步骤i-a，获取慢病毒RCL的cDNA；

步骤i-b，以上述获取的cDNA为模板，扩增得到慢病毒RCL的靶序列片段。

8.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，步骤ii包括以下子步骤：

步骤ii-a，将得到的靶序列片段与载体进行连接；

步骤ii-b，将连接好的载体转化至感受态细胞中进行表达，然后加入液体培养基进行培养，得到菌液；

步骤ii-c，将上述菌液涂布至平板培养基上培养，待形成单菌落后，挑选单菌落进行检测；

步骤ii-d，根据检测结果，选取菌落进行扩大培养，然后抽提质粒。

9.一种检测慢病毒RCL的方法，优选采用权利要求3至8之一所述的试剂盒进行，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

步骤1，对待测样本进行处理；

步骤2，对处理后的待测样本进行检测。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤2中，所述检测优选采用荧光定量PCR方法进行，所述反应程序为：95℃下预变性30s；然后95℃变性5s，60℃退火和延伸共30s，进行40个循环，4℃保存。