CN114958982A - 用于荧光定量pcr检测痕量人源sry基因的核酸试剂和试剂盒以及方法 - Google Patents

用于荧光定量pcr检测痕量人源sry基因的核酸试剂和试剂盒以及方法 Download PDF

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Abstract

本公开涉及一种用于荧光定量PCR检测痕量人源SRY基因的核酸试剂，所述核酸试剂包括SRY基因保守区域引物对；所述SRY基因保守区域引物对包括如SEQ ID NO.1所示的SRY基因正向引物和SEQ ID NO.2所示的SRY基因反向引物。本公开所提供的核酸试剂能特异性检测并大幅提升小鼠组织样本中痕量人源干细胞SRY基因检测的灵敏性，为开展干细胞动物模型体内代谢研究乃至医疗检测等领域提供有效的检测方法。

Description

用于荧光定量PCR检测痕量人源SRY基因的核酸试剂和试剂盒 以及方法
技术领域
本公开涉及生物技术领域，具体地，涉及一种用于荧光定量PCR检测痕量人源SRY基因的核酸试剂、一种用于荧光定量PCR检测痕量人源SRY基因的试剂盒和一种用于荧光定量PCR检测痕量人源SRY基因的方法，以及所述核酸试剂在制备用于检测痕量人源SRY基因的试剂盒中的用途。
背景技术
SRY基因是雄性的性别决定基因，指Y染色体上具体决定生物雄性性别的基因片段。人的SRY基因位于Y染色体Yp11.3，只含有一个外显子，转录产物长约1.1kb，编码一个204氨基酸的蛋白质。SRY基因在胚胎发育早期决定性别的分化和睾丸的形成，是性别分化关键基因。
小鼠动物模型研究是干细胞应用与转化过程中的重要环节之一，为研究干细胞移植后的体内代谢情况，将人男性干细胞移植到雌性小鼠中，通过检测小鼠组织样本中人男性SRY基因的丰度和比例来对干细胞的体内代谢情况进行动态监测。由于小鼠组织样本中的人源细胞数量较少，因此，建立一种高灵敏、准确的人类SRY基因检测方法是开展干细胞动物模型体内代谢研究的关键瓶颈。
目前已有一些人源SRY基因检测的技术，但检测灵敏度有限，多围绕人类不同样本进行性别诊断，对小鼠和人类混合组织样本中人源SRY基因的高灵敏、特异性检测方法有迫切需求。
发明内容
本公开提供了用于检测痕量人源SRY基因的引物、试剂盒、方法，能特异性检测并大幅提升小鼠组织样本中痕量的人源干细胞SRY基因检测的灵敏性，为开展干细胞动物模型体内代谢研究乃至医疗检测等领域提供有效的检测方法。
为了实现上述目的，本公开一方面提供一种用于荧光定量PCR检测痕量人源SRY基因的核酸试剂，其特征在于，所述核酸试剂包括SRY基因保守区域引物对；所述SRY基因保守区域引物对包括如SEQ ID NO.1所示的SRY基因正向引物和SEQ ID NO.2所示的SRY基因反向引物：
F：5'-CGCACTCTCCTTGTTTTTGACAATG-3'SEQ ID NO.1，
R：5'-TGGGTCGCTTCACTCTATCCTGG-3'SEQ ID NO.2。
本公开第二方面提供一种用于荧光定量PCR检测痕量人源SRY基因的试剂盒，其中，所述试剂盒包括第一方面所述的核酸试剂以及PCR扩增试剂。
本公开第三方面提供一种荧光定量PCR检测痕量人源SRY基因的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)提取待测样本的总DNA；
(2)以提取的总DNA为模板，使用第一方面所述的核酸试剂，进行荧光定量PCR反应；
(3)收集荧光信号，并根据所述荧光信号对所述待测样本中的痕量人源SRY基因的含量进行计算。
本公开第四方面提供一种第一方面所述的核酸试剂在制备用于检测痕量人源SRY基因的试剂盒中的用途。
通过上述技术方案，本公开提供了人源干细胞在小鼠模型中体内代谢研究中检测小鼠组织样本中痕量人男性干细胞来源SRY基因荧光定量PCR检测的引物对，引物对特异性强，不扩增雌雄小鼠基因组DNA和人女性基因组DNA。利用本公开所提供的人男性SRY基因荧光定量PCR检测的引物对，检测灵敏度高，检测下限为1.2拷贝/μl。由此，本公开为干细胞转化和应用研究领域提供一种有效的检测方法。
本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：
图1是SRY基因阳性模板的实时荧光PCR扩增曲线图。
图2是SRY基因阳性模板扩增产物的熔解曲线图。
图3是利用优化引物进行荧光定量PCR反应扩增SRY基因的敏感性检测结果。
图4是利用对照引物进行荧光定量PCR反应扩增SRY基因的敏感性检测结果。
具体实施方式
以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
一方面，本公开提供一种用于荧光定量PCR检测痕量人源SRY基因的核酸试剂，其特征在于，所述核酸试剂包括SRY基因保守区域引物对；所述SRY基因保守区域引物对包括如SEQ ID NO.1所示的SRY基因正向引物和SEQ ID NO.2所示的SRY基因反向引物：
F：5'-CGCACTCTCCTTGTTTTTGACAATG-3'SEQ ID NO.1，
R：5'-TGGGTCGCTTCACTCTATCCTGG-3'SEQ ID NO.2。
其中，本公开的上述引物对，是从众多候选引物中挑选出来的特异性和灵敏性都比较优异的引物对。
另一方面，本公开提供一种用于荧光定量PCR检测痕量人源SRY基因的试剂盒，其中，所述试剂盒包括第一方面所述的核酸试剂以及PCR扩增试剂。
根据本公开，其中，所述核酸试剂中SRY基因保守区域引物对的使用终浓度为9-11μM。
根据本公开，其中，所述PCR扩增试剂含有PCR扩增酶、阳性对照和阴性对照中的至少一种。
再一方面，本公开提供一种荧光定量PCR检测痕量人源SRY基因的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)提取待测样本的总DNA；
(2)以提取的总DNA为模板，使用第一方面所述的核酸试剂，进行荧光定量PCR反应；
(3)收集荧光信号，并根据所述荧光信号对所述待测样本中的痕量人源SRY基因的含量进行计算。
根据本公开，其中，根据所述荧光信号对所述待测样本中的痕量人源SRY基因的含量进行计算的操作包括：
当阳性标准品中SRY基因检测结果的Ct值为10-40，且阴性质控品中SRY基因检测结果的Ct值>40时，所述荧光信号可以用于计算所述待测样本中的痕量人源SRY基因的含量；
根据阳性标准品的拷贝数与扩增Ct值绘制标准曲线；并将所述待测样本的Ct值代入所述标准曲线中计算所述待测样本的SRY基因拷贝数。
根据本公开，其中，所述核酸试剂中SRY基因保守区域引物对的使用终浓度为9-11μM。
根据本公开，其中，所述待测样本来源于动物。
再一方面，本公开提供了第一方面所述的核酸试剂在制备用于检测痕量人源SRY基因的试剂盒中的用途。
下面通过实施例来进一步说明本公开，但是本公开并不因此而受到任何限制。
以下实施例中所使用的溶解基因组DNA或质粒DNA的溶液都是Elution缓冲液(pH8.0，购自浙江易思得生物科技有限公司)，该缓冲液能稳定DNA，且不抑制PCR反应，对提升检测灵敏度和稳定性有益。
PCR扩增酶反应混合液TB
Figure BDA0002952904930000051
Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)购自TAKARA公司。
实施例1
干细胞小鼠模型中小鼠组织样本内痕量人男性SRY基因的荧光定量PCR检测前的样本准备。
(1)获取待测样本基因组DNA
使用天根公司的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒分别提取30mg男婴脐带组织、女婴脐带组织、雄性小鼠肝脏和雌性小鼠肝脏中的基因组DNA，提取按照说明书中的操作步骤完成，分别得到人男性基因组DNA、人女性基因组DNA、雄鼠基因组DNA和雌鼠基因组DNA。
将抽提好的DNA样本，用紫外分光光度计检测浓度和DNA质量，DNA的得量要求为10-30μg，DNA的质量OD260/280在1.8～2.0之间，于-20℃保存。
(2)溶解并稀释阳性质粒标准品
在浙江尚亚生物科技有限公司合成的SRY基因阳性质粒为粉末状，总量为2μg，12000rpm离心1分钟，用100μL的Elution缓冲液进行溶解，溶解后的浓度为20ng/μL，制作成阳性质粒标准品原液并计算其拷贝数，公式如下：
质粒拷贝数/μL＝(6.02×1023拷贝数/mol×20ng/μL×10-9)/(阳性质粒长度×660)
然后根据阳性质粒原液的拷贝数将质粒稀释到表2所示的10个拷贝数梯度，该阳性质粒标准品可以在-20℃保存6-12个月，反复冻融次数<5次。
推荐用Elution缓冲液稀释质粒DNA。
(3)阴性质控品为：无菌双蒸水。
实施例2
干细胞小鼠模型中小鼠组织样本内痕量人男性SRY基因的荧光定量PCR检测方法。
(1)引物对扩增曲线、熔解曲线和测序结果
取人男性基因组DNA，用Elution缓冲液稀释10倍后作为模板。
本发明所设计的SRY引物：SRY-F:CGCACTCTCCTTGTTTTTGACAATG(SEQ ID NO.1)，SRY-R:TGGGTCGCTTCACTCTATCCTGG(SEQ ID NO.2)为扩增引物，引物用Elution缓冲液稀释成10μM，按F/R/Elution缓冲液＝1:1:0.5的比例配置引物对混合液。
PCR扩增酶为TB
Figure BDA0002952904930000061
Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)。扩增体系如下：12.5μL的2×PCR扩增酶反应混合液，2.5μL SRY基因引物对混合液，10μL人男性基因组DNA，反应总体系为25μL。
反应程序为：(1)95℃预变性3min，循环数为1；(2)95℃变性10s，60℃退火延伸30s，循环数为40；在每个循环延伸后收集荧光信号。(3)熔解曲线分析。
图1所示为扩增效果，可见本发明所设计的引物能有效扩增人男性基因组DNA的SRY基因，且熔解曲线分析结果表明条带单一，如图2所示。将PCR产物送测浙江尚亚生物科技有限公司，测序结果表明为SRY基因，具体序列如下：
TGTCGCACTCTCCTTGTTTTTGACAATGCAATCATATGCTTCTGCTATGTTAAGCGTATTCAACAGCGATGATTACAGTCCAGCTGTGCAAGAGAATATTCCCGCTCTCCGGAGAAGCTCTTCCTTCCTTTGCACTGAAAGCTGTAACTCTAAGTATCAGTGTGAAACGGGAGAAAACAGTAAAGGCAACGTCCAGGATAGAGTGAAGCGACCCA(SEQID NO.3)
(2)灵敏度实验
以实施例1所获得的10个不同拷贝数阳性质粒、阴性质控品和阴性基质(人女性基因组DNA和雌雄鼠基因组DNA混合物)为模板，进行荧光定量PCR反应。
检测结果见表2和图3，结果显示标准品拷贝数从80-8000000copies/μL，Ct值从34.83-16.78，阴性质控品线性回归分析显示，拷贝数和Ct值之间显著相关，R2＝0.999。回归方程为y＝-3.4566x+40.909，其中y为拷贝数，x为Ct值。根据上述结果计算可知，该体系的检测下限为1.2拷贝/μL。
(3)特异性实验
取人男性基因组DNA，用Elution缓冲液稀释10倍后作为阳性模板。
取人女性基因组DNA，用Elution缓冲液稀释10倍后作为特异性实验的待检模板。
取雄鼠基因组DNA，用Elution缓冲液稀释10倍后作为特异性实验的待检模板。
取雌鼠基因组DNA，用Elution缓冲液稀释10倍后作为特异性实验的待检模板。
利用本发明所设计的SRY引物为扩增引物，引物用Elution缓冲液稀释成10μM，按F/R/Elution缓冲液＝1:1:0.5的比例配置引物对混合液。按照(1)中所述的扩增体系和反应程序进行PCR扩增，检测结果如表4所示，结果显示人男性基因组DNA模板SRY基因检测的Ct值为20.25，而人女性基因组DNA(gDNA)、雄鼠基因组DNA和雌鼠基因组DNA均未检测到SRY基因的荧光信号，其Ct值均大于40。上述结果表明，本发明所设计的SRY基因引物对在实时荧光PCR检测人体样本时具有特异性，即该引物对只能扩增人男性基因组DNA。
实施例3
干细胞输注小鼠模型中小鼠组织样本内痕量人男性SRY基因的荧光定量PCR检测
(1)干细胞输注实验
5～6周龄NOD小鼠，尾静脉注射2×106个人男性脐带干细胞，并于注射后6h、12h、24h、72h、2周、4周取小鼠肺组织，提取基因组DNA，用于荧光定量PCR检测组织样本内痕量人男性SRY基因。
(2)待测样本基因组DNA获取和阳性质粒标准品准备
参照实施例1方法获取小鼠肺组织样本基因组DNA，以及准备阳性质粒标准品
(3)小鼠肺组织样本内内痕量人男性SRY基因荧光定量PCR检测
设置阳性质粒标准品、阴性质控品、待测样本、阴性基质(未经人男性脐带干细胞注射的小鼠肺组织基因组DNA)组。同时根据引物对将待测样本分为两组：本专利优化引物对组、对照引物对组。
PCR扩增酶为TB
Figure BDA0002952904930000081
Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)。扩增体系如下：12.5μL的2×PCR扩增酶反应混合液，2.5μL SRY基因引物对混合液，10μL模板，反应总体系为25μL。
反应程序为：(1)95℃预变性3min，循环数为1；(2)95℃变性10s，60℃退火延伸30s，循环数为40；在每个循环延伸后收集荧光信号。(3)熔解曲线分析。
(4)小鼠肺组织样本内痕量人男性SRY基因拷贝数分析
根据阳性质粒标准品所得CT值和对应拷贝数绘制标准曲线，待测样本CT值通过标准曲线换算为拷贝数，最终以拷贝数/mg组织表示肺组织中人男性SRY基因残留。结果如表1所示，干细胞注射后，小鼠肺组织中人男性SRY基因残留拷贝数随着时间推移变化，12h达到最高，其中优化引物对组检出量高于对照引物对组，另干细胞输注2周后，采用优化引物对尚能检测到少量残留，对照引物对则未能检出，表明本专利所示优化引物对具有更高灵敏度。
Figure BDA0002952904930000091
参照实施例2方法
对比例1
(1)引物对扩增曲线、熔解曲线和测序结果
与实施例采用相同的扩增方法，不同的是本对比例使用对照SRY引物对：
SRY-control-F：5'-TGTCGCACTCTCCTTGTTTTT-3'(SEQ ID NO.4)，SRY-control-R：5'-TGGGTCGCTTCACTCTATCCT-3'(SEQ ID NO.5)；
引物用Elution缓冲液稀释成10μM，按F/R/Elution缓冲液＝1:1:0.5的比例配置引物对混合液。PCR扩增酶为TB
Figure BDA0002952904930000092
Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)。扩增体系如下：12.5μL的2×PCR扩增酶反应混合液，2.5μL SRY-control基因引物对，10μL人男性基因组DNA不同拷贝数的阳性质粒或阴性质控品，反应总体系为25μL。
反应程序为：(1)95℃预变性3min，循环数为1；(2)95℃变性10s，60℃退火延伸30s，循环数为40；在每个循环延伸后收集荧光信号。(3)熔解曲线分析。
检测结果如表3和图4所示，结果显示，标准品拷贝数从500-8000000copies/μL，Ct值从37.46-22.88，阴性质控品线性回归分析显示，拷贝数和Ct值之间显著相关，R2＝0.9999。回归方程为y＝-3.3937x+46.66，其中y为拷贝数，x为Ct值。根据上述结果计算可知，该体系的检测下限为91.7拷贝/μL。
数据显示：与对照引物对相比，本发明优化后的引物对可提高对SRY基因的检测灵敏度(提升68倍)，表明用本发明所用的引物对进行荧光定量PCR检测SRY基因时，具有很高的灵敏度。
表2优化引物对扩增阳性标准品的Ct值情况
Figure BDA0002952904930000101
表3对照引物对扩增阳性标准品的Ct值情况
Figure BDA0002952904930000102
Figure BDA0002952904930000111
表4不同来源模板DNA的Ct值
Figure BDA0002952904930000112
以上详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。
序列表
<110> 杭州易文赛生物技术有限公司
<120> 用于荧光定量PCR检测痕量人源SRY基因的核酸试剂和试剂盒以及方法
<130> 19580YWS
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgcactctcc ttgtttttga caatg 25
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgggtcgctt cactctatcc tgg 23
<210> 3
<211> 215
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgtcgcactc tccttgtttt tgacaatgca atcatatgct tctgctatgt taagcgtatt 60
caacagcgat gattacagtc cagctgtgca agagaatatt cccgctctcc ggagaagctc 120
ttccttcctt tgcactgaaa gctgtaactc taagtatcag tgtgaaacgg gagaaaacag 180
taaaggcaac gtccaggata gagtgaagcg accca 215
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgtcgcactc tccttgtttt t 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tgggtcgctt cactctatcc t 21

Claims (9)

1.一种用于荧光定量PCR检测痕量人源SRY基因的核酸试剂，其特征在于，所述核酸试剂包括SRY基因保守区域引物对；所述SRY基因保守区域引物对包括如SEQ ID NO.1所示的SRY基因正向引物和SEQ ID NO.2所示的SRY基因反向引物：
F：5'-CGCACTCTCCTTGTTTTTGACAATG-3'SEQ ID NO.1，
R：5'-TGGGTCGCTTCACTCTATCCTGG-3'SEQ ID NO.2。
2.一种用于荧光定量PCR检测痕量人源SRY基因的试剂盒，其中，所述试剂盒包括权利要求1所述的核酸试剂以及PCR扩增试剂。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其中，所述核酸试剂中SRY基因保守区域引物对的使用终浓度为9-11μM。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其中，所述PCR扩增试剂含有PCR扩增酶、阳性对照和阴性对照中的至少一种。
5.一种荧光定量PCR检测痕量人源SRY基因的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)提取待测样本的总DNA；
(2)以提取的总DNA为模板，使用权利要求1所述的核酸试剂，进行荧光定量PCR反应；
(3)收集荧光信号，并根据所述荧光信号对所述待测样本中的痕量人源SRY基因的含量进行计算。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，根据所述荧光信号对所述待测样本中的痕量人源SRY基因的含量进行计算的操作包括：
当阳性标准品中SRY基因检测结果的Ct值为10-40，且阴性质控品中SRY基因检测结果的Ct值>40时，所述荧光信号可以用于计算所述待测样本中的痕量人源SRY基因的含量；
根据阳性标准品的拷贝数与扩增Ct值绘制标准曲线；并将所述待测样本的Ct值代入所述标准曲线中计算所述待测样本的SRY基因拷贝数。
7.根据权利要求5所述的方法，其中，所述核酸试剂中SRY基因保守区域引物对的使用终浓度为9-11μM。
8.根据权利要求5所述的方法，其中，所述待测样本来源于动物。
9.权利要求1所述的核酸试剂在制备用于检测痕量人源SRY基因的试剂盒中的用途。
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