CN114908147A

CN114908147A - 人源间充质干细胞在小鼠体内分布的RT-qPCR检测方法及应用

Info

Publication number: CN114908147A
Application number: CN202210758200.8A
Authority: CN
Inventors: 刘甦苏; 吴勇; 范昌发; 杨远松; 熊芮; 赵皓阳; 翟世杰
Original assignee: National Institutes for Food and Drug Control
Current assignee: National Institutes for Food and Drug Control
Priority date: 2022-06-30
Filing date: 2022-06-30
Publication date: 2022-08-16

Abstract

本发明涉及一种一种人源间充质干细胞在小鼠体内分布的RT‑qPCR检测方法及应用，属于生物医药技术领域。该RT‑qPCR检测方法包括以下步骤：取样：取已注射人源间充质干细胞的小鼠器官组织，提取其总RNA，待测；检测：以实时荧光定量PCR方法检测上述总RNA中人源间充质干细胞特异性蛋白基因序列，获得人源间充质干细胞在小鼠体内的分布情况。上述检测方法可达到快速准确检测在不同时间点多种组织中体内分布的目的，为干细胞产品的遴选提供数据支持，用于干细胞在体内分布的评价工作中。

Description

人源间充质干细胞在小鼠体内分布的RT-qPCR检测方法及应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种人源间充质干细胞在大、小鼠体内分布的RT-qPCR检测方法及应用。

背景技术

新型冠状病毒肺炎(Coronavirus disease 2019，COVID-19)是由SARS-CoV-2病毒感染导致，可发生严重肺部损伤甚至死亡。截至目前，尚无针对新冠肺炎的特效治疗药物，间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一类多潜能组织干细胞，具有组织修复和免疫调节等功能，在流感病毒相关性肺炎及其他肺疾病中有一定疗效。

MSCs产品是一种“活的药物”，其活性差异及不同供体和组织来源的MSCs异质性等对于 MSCs产品的治疗关系密切。研究表明，大多数骨髓来源的MSCs(>80％)经静脉注射后能的迅速滞留在肺中，仅一部分归巢到其他组织，比如肝脏、脾脏和炎症或损伤部位。另外，MSCs进入体内后，在体内停留时间有限，随着时间的延长，会被机体清除。有研究表明，MSCs在肺部的驻留时间从7天到3个月不等，但也有研究发现MSCs注射18小时后在肺部就不能检测到MSCs的信号。此外，不同研究团队的MSCs的来源及制作方法不尽相同，会导致MSCs细胞在体内的分布及驻留时间不同，从而导致疗效差异。故研究新型冠状病毒肺炎治疗过程中间充质干细胞的体内分布及驻留时间是十分有必要的。从质量控制角度看，我们需要对不同来源、不同批次的MSCs的体内分布和作用时间进行监测。

先前文献报道多采用流式方法检测细胞在体内的分布。以肺组织为例，常见方法是取一定量肺组织，匀浆，确定合适的标志物，通过流式方法计数，确定肺组织中MSCs细胞及其它细胞的数量。

本申请所使用的新冠小鼠模型(hACE2-KI/NIFDC)是中国食品药品检定研究院在C57BL/6小鼠背景上基于CRISPR/Cas9技术将人hACE2基因cDNA插入到小鼠mACE2启动子之下获得的人源化动物模型，能很好的完成病毒的感染，可以用于国、内外科研、产品评价等实验研究。MSCs细胞的体内分布及驻留时间评价实验，主要基于本模型实施。

发明内容

本发明提供一种人源间充质干细胞在小鼠体内分布的RT-qPCR检测方法，该方法可达到快速准确检测在不同时间点多种组织中体内分布的目的，可以实现在短时间内处理大量的样品(每次运行多达384或者甚至1536个反应)，以期为细胞产品的遴选提供数据支持。

一种人源间充质干细胞在小鼠体内分布的RT-qPCR检测方法，包括以下步骤：

取样：取已注射人源间充质干细胞的小鼠器官组织，提取其中总RNA，待测；

检测：以实时荧光定量PCR方法检测上述总RNA中人源间充质干细胞特异性蛋白基因序列，获得人源间充质干细胞在小鼠体内的分布情况。

常规方法中，如需检测特定细胞含量，通常使用流式细胞仪，通过细胞表面所带有的特异性蛋白将其识别并检出，但流式法检测一般是使用动物血液，而对于动物组织样本处理比较费时费力，且存在漏检问题，以及设备成本高的问题，本方法可通过CT值快速计算出细胞的含量，优于常规的流式细胞术实验，解决其只能区分出阳性细胞的比例，不能具体到在组织中的含量的问题。同时，发明人在实践中发现，出现漏检的问题，可能是在匀浆过程部分细胞破损而导致漏检，因而，通过提取总核酸进行检测可以避免该问题。

而本发明的RT-qPCR检测方法，通过定量检测人源间充质干细胞上特异性蛋白所对应的基因序列，并设计在注射间充质干细胞后预定的时间点取不同的组织，即可获得人源间充质干细胞在小鼠体内的分布情况。方法及样本处理的操作比较简单，不需要昂贵的流式细胞仪器，只需要普通的RT-qPCR仪器就可以操作。并且RT-qPCR检测方法可以检测动物不同组织的MSC细胞含量，可以精准定位到某一组织器官(比如肝、肺)，从而扩大了检测范围。

在其中一个实施例中，所述人源间充质干细胞特异性蛋白为CD29蛋白。经过研究调查比较，CD29是MSC细胞表面中强表达的抗原，不同组织来源的MSCs都可以表达CD29，具有普适性，在不同来源的MSC中都适用，因此以此CD29蛋白作为标志物检测，具有适用范围广的优势。

在其中一个实施例中，所述人源间充质干细胞特异性蛋白基因序列为mRNA序列。由于 RNA参与遗传信息的表达过程，选用RNA检测基因的表达更为准确。可以理解的，所述RNA 基因序列可通过TRIZOL等方法进行提取。

在其中一个实施例中，所述检测步骤中，先将mRNA序列反转录合成cDNA，再通过实时荧光定量PCR方法进行测定。

例如，所述反转录合成cDNA的方法可采用如下方法：

除杂：向提取得到的总RNA中加入DNA分解酶gDNA Eraser，去除残存的基因组DNA；

反转录：加入反转录酶，将RNA反转录合成cDNA。

为了准确地进行基因表达量分析，必须满足只有cDNA作为模板检出的先决条件，但Total RNA中常常混有基因组DNA，并可以直接作为PCR反应的模板进行扩增，因此会造成解析结果不准确。为了避免这种情况发生，本发明优选分成两部分进行，首先选用具有较强DNA 分解活性的gDNA Eraser，加热反应(例如42℃，2min)以除去残存的基因组DNA，随后通过反转录酶进行反转录反应合成cDNA。

在其中一个实施例中，所述小鼠为hACE2-KI/NIFDC模型小鼠。

由于hACE2-KI/NIFDC模型小鼠是在C57BL/6小鼠背景上将人hACE2基因cDNAs插入到小鼠mACE2启动子之下的人源化动物模型，能够模拟人感染新型冠状病毒，而间充质干细胞可用于新型冠状病毒肺炎治疗，所以使用该模型可以更好的评价间充质干细胞在COVID-19中的研究及治疗效果。可以理解的，该检测方法也可以用于其它小鼠模型、大鼠模型等动物模型的评价中。

在其中一个实施例中，所述实时荧光定量PCR方法中，采用以下扩增引物对进行检测：

上游引物HCD29-F：5'-TGTAACCAACCGTAGCAAAGG-3'(SEQ ID NO.1)

下游引物HCD29-R：5'-CCCCTGATCTTAATCGCAAAACC-3'(SEQ ID NO.2)。

本发明在针对人源CD29基因进行分析研究中发现，该基因有18个外显子，而鼠源CD29 基因有16个外显子，进一步通过序列比对，将引物设计在人源基因跨外显子区域，以保证引物特异性。设计引物时需跨越至少一个外显子连接，可避免基因组的DNA被扩增而影响结果。

在其中一个实施例中，所述检测步骤中，PCR反应体系为：

在其中一个实施例中，所述检测步骤中，PCR扩增反应条件为：95℃维持30s，之后以 95℃维持5s，60℃维持30s为一个循环，进行40个循环，并在60℃收集荧光，最后以40℃维持5s；

溶解曲线的检测条件为：65℃维持60s，随后从65℃升温至95℃，每隔1s测定系统荧光强度。

在其中一个实施例中，所述检测步骤中，选取人源间充质干细胞作为阳性样本制作标准曲线，所述标准曲线中各样本中包含人源间充质干细胞的浓度为：2×10⁶、2×10⁵、2×10⁴、2×10³个细胞/mL。

本发明还公开了上述的RT-qPCR检测方法在评价间充质干细胞在生物体内的分布时的应用。

在其中一个实施例中，所述评价为间充质干细胞在体内的分布情况评价。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的人源间充质干细胞在小鼠体内分布的RT-qPCR检测方法，通过定量检测人源间充质干细胞上特异性蛋白(如CD29蛋白)所对应的基因序列，并设计在注射间充质干细胞后预定的时间点取不同的组织，即可获得人源间充质干细胞在小鼠体内的分布情况。且该检测方法及样本处理的操作比较简单，不需要昂贵的流式细胞仪器，只需要普通的RT-qPCR仪器就可以操作。同时还具有快速、准确的优势。另外该方法可实现多样本的快速筛选验证，不仅节约成本，而且节约实验时间，可通过普通数学方法获得细胞分布的数量，获得快速结果，立即用于下一步这方面的研究和药物开发中。

本发明建立的人源间充质干细胞在小鼠体内分布的RT-qPCR检测方法，可达到快速准确检测在不同时间点多种组织中体内分布的目的，为干细胞产品的遴选提供数据支持，用于干细胞在体内分布的评价工作中。

附图说明

图1为实施例1中1号引物对扩增曲线图；

图2为实施例1中2号引物对扩增曲线图；

图3为实施例1中3号引物对扩增曲线图；

图4为1号引物对用于小鼠2h、24h肺组织RT-qPCR检测扩增曲线图；

图5为实施例1中定量检测标准曲线示意图；

图6为实施例2中给药后2h、24h动物肺组织流式细胞术实验散点图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

以下实施例中所用试剂，如非特别说明，均为市售可得；以下实施例中所用方法，如非特别说明，均为常规方法可实现。

主要仪器设备与试剂：

罗氏LC480Ⅱ荧光定量PCR仪，Thermo超微量分光光度计Nano Drop，Mettler电子天平ME104E，ABI的Veriti PCR扩增仪，京立BL-10D低速离心机，Sigma3-18KS冷冻离心机。RT-PCR试剂盒、TB Premix Ex TaqⅡ、荧光定量PCR试剂盒均购置于大连宝生物。

实施例1

RT-qPCR检测方法建立。

1、引物设计

经过调研和比较，人间充质干细胞(hu-MSC)的生物标志物可为CD29，且CD29是MSC细胞表面中强表达的抗原，不同组织来源的MSCs都可以表达CD29，具有普适性。故根据人源CD29蛋白的基因序列设计RT-qPCR引物，并进一步比较其人源和鼠源相对应mRNA差异。分析研究中发现，人源CD29蛋白基因(NCBI中的Gene ID：3688)有18个外显子，而鼠源CD29基因(NCBI中的Gene ID：16412)有16个外显子，二者之间无法简单直接借鉴，本发明人进一步通过实验进行研究筛选，并结合序列比对后，发现将引物设计在人源基因跨外显子区域，可保证引物特异性。

且考虑到用来做RT的RNA大部分都是通过Trizol抽提法分离出来的，为了避免基因组的DNA也有可能被扩增出来，设计引物时需跨越至少一个外显子连接。且对于RT-qPCR来说，一般设定引物的Tm值(引物的熔解温度)为50-70℃，且扩增片段长度为70-200bp较为合适。

2、引物筛选

设计系列引物组并进行引物筛选，并交由上海生物工程有限公司合成，以下仅以部分引物筛选过程进行说明。上游引物HCD29-F下游引物HCD29-R，目标片段长度为98bp；上游引物HCD29-F01下游引物HCD29-R01，目标片段长度为208bp；上游引物HCD29-F02下游引物HCD29-R02，目标片段长度为68bp。

表1.引物对

上述引物对1-3所扩增的目标序列如下述SEQ ID NO.7-9所示。

SEQ ID NO.7：TGTAACCAACCGTAGCAAAGGAACAGCAG AGAAGCTCAAGCCAGA GGATATTACTCAGATCCAACCACAGCAGTTGGTTTTGCGATTAAGATCAGGGG；

SEQ ID NO.8：

CAGCGGGAGTCGCGGAACAGCAGGCCCGAGCCCACCGCGCCGGGCCCCGGACGCCGC GCGGAAAAGATGAATTTACAACCAATTTTCTGGATTGGACTGATCAGTTCAGTTTGCTGT GTGTTTGCTCAAACAGATGAAAATAGATGTTTAAAAGCAAATGCCAAATCATGTGGAGA ATGTATACAAGCAGGGCCAAATTGTGGGTGGT；

SEQ ID NO.9：

GAGAGGCCCAGCGGGAGTCGCGGAACAGCAGGCCCGAGCCCACCGCGCCGGGCCCCGGACGCCGCGCGGAAAAGAT。

2.1溶解曲线和溶解温度验证

序号1-3的引物对的溶解曲线结果分别如图1-3所示。

判断引物特异性优劣，首先是可以看溶解曲线波峰是否单一，其次是看Tm值，SYBRGreen法的目的基因Tm值一般需在80～90℃之间。根据这些原则，可见1号的引物对为单峰(图1)，峰窄而尖，未出现杂峰，说明引物特异性好，二聚体也较少，引物设计特异性符合实验要求。2号的引物对为双峰(图2)，双峰说明产物不特异，可能存在引物二聚体或非特异性扩增。3号的引物对虽为单峰(图3)，但是扩增曲线不完整，不符合实验要求。

这三对引物的熔解温度为：1号：82.1℃，2号：83℃和93℃，3号：93.1℃，其中1号为82.1℃，符合SYBR Green法的溶解曲线判断指标。

2.2样本组织扩增验证

分别选用人源间充质干细胞和小鼠组织样本引物筛选，进一步检测HCD29这对引物特异性。

实验结果如图4所示，结果显示，引物扩增曲线均为“S”型，可见明显的4个时期，且复孔的CT值一致，相差不超过1个CT值。

2.3引物特异性实验验证

该对引物在人源细胞样本中均有扩增，但在小鼠组织中无扩增，说明引物特异性较好，符合实验要求，具体见下表。

表2.引物不同样本特异性比较

综合溶解曲线结果，该引物对为单峰，未出现其他峰，说明引物二聚体较少，溶解温度符合要求，选择1号引物对进行正式实验。

3、标准品及标准曲线的制定

首先对hu-MSC细胞的活力、数量、细胞状态等进行质控检测，细胞计数结果为2×10⁶个细胞/mL，取1mL，提取细胞RNA并反转录成cDNA定量后作为标准品，进行l0倍梯度稀释，分别稀释到2×10⁶、2×10⁵、2×10⁴、2×10³共4个浓度梯度，每个梯度做3个重复，反应体系为10μL，进行荧光定量扩增。

结果如图5所示，标准曲线中拷贝数与ct值呈线性反比关系，回归方程为Y＝ -3.448x+11.39(R²>0.99)，并通过标准曲线计算回归方程通过软件计算得出扩增效率为97.5％。

上述结果表明，本发明建立的RT-qPCR检测方法，引物对的溶解曲线为单峰，未出现其他峰且溶解温度为82.1℃，特异性符合实验要求。且该对引物在人源间充质干细胞样本中均有扩增，但在小鼠组织中无扩增，表明特异性较好，扩增条件可靠。

实施例2

人源间充质干细胞在小鼠体内分布的RT-qPCR检测方法，取小鼠各器官组织(大脑、脊髓(颈段)、骨骼肌、生殖腺(子宫及卵巢)、骨髓(大腿骨)、肝、肾、脾、心、肺10个样本，组织<100mg)进行检测。包括以下步骤：

1、细胞注射

取人脐带间充质干细胞，通过尾静脉注射的方式注射到hACE2-KI/NIFDC小鼠(文献： A Mouse Model of SARS-CoV-2 Infection andPathogenesis，Cell Host&Microbe，2020,28,1-10) 体内，随后解剖2H的小鼠并取小鼠各器官组织(大脑、脊髓(颈段)、骨骼肌、生殖腺(子宫及卵巢)、骨髓(大腿骨)、肝、肾、脾、心、肺10个样本，组织<100mg)，备用。

2、取样

应用TRIZOL法提取上述各组织中基因组RNA并检测RNA含量及纯度，方法如下：

2.1将用RNA later浸泡过的动物新鲜组织称重后，加入RNA快速提取试剂Trizol中(100mg/ml)，进一步用组织匀浆器破碎直至无肉眼可见的大块组织。

2.2加入0.2ml氯仿，颠倒混匀数次，冰上静置5min、12，000转/分，4℃离心5min。

2.3吸取上层水相约0.5ml于新管中，加入0.5ml冷的异丙醇，颠倒混匀后冰上静置10min， 12，0000转/分，4℃离心10min。

2.4弃上清，加入0.5ml的75％乙醇(用DEPC水配制)洗涤沉淀，7,500转/分离心，4℃， 5min，倾去乙醇，室温干燥，用40μl DEPC水溶解RNA，紫外分光光度计检测纯度和完整性， -80℃保存。

2.5细胞RNA的提取，取人源间充质干细胞，离心后直接采用Trizol法进行提取溶解后直接-80℃保存。

2.6.用NanoDrop-2000测定样本的纯度和浓度。

3、检测

3.1反转录

3.1.1除杂：去除基因组DNA反应

于冰上配制反应混合液，分装到每个反应管中，最后加入RNA样品，反应体系如下表所示。

表3.去除基因组DNA反应体系

试剂	使用量
		5x gDNA Eraser Buffer	2.0ul
gDNA Eraser	1.0ul
		Total RNA	*1
RNase Free dH<sub>2</sub>0	up to 10ul

*指10μl反转录反应体系中，反应体系中最多可使用1μg的Total RNA。

配置好反应体系后，42℃保持2min，随后转入4℃维持。

3.1.2.反转录反应

于冰上配制反应混合液，然后再分装10μl到每个反应管中，反转录反应体系如下表所示，轻柔混匀后立即进行反转录反应。反应条件为：37℃维持15min，升温至85℃，维持5s，随后转入4℃维持。

表4.反转录反应

试剂	使用量
		步骤1的反应液	10.0ul
PrimeScript RT Enzyme Mix	1.0ul
		RT Primer Mix	1.0ul
5x PrimeScript Buffer 2(for Real Time)	4.0ul
		RNase Free dH<sub>2</sub>0	4.0ul
Total	20ul

3.2 RT-qPCR

反应体系：

测定cDNA浓度并稀释至50ng/μL。按照以下qRT-PCR反应体系配制：SYBR PremixEx Tag Il(Tli RNase H Plus)(2x)10.0μL，上下游引物(10wmol/L)各0.3μL，cDNA模板2 μL，加ddH₂0至20μL。

反应条件：

95℃维持30s；之后以95℃维持5s，60℃维持30s为一个循环，进行40个循环，其中在60℃收集荧光，最后以40℃维持5s。

反应体系在96孔板(MJ Research HSP29655)中混匀并用超净光盖(MJ ResearchTCS20803)封口后进行反应。

反应结果使用LC480软件收集、分析。所有的样品都在同一块板中做3次重复，数值以 mean±SD表示。

4、结果

4.1 RT-qPCR检测结果

RT-qPCR检测数据显示，小鼠给药后2小时均在不同的组织脏器中有分布，在肺脏中分布最高，具体结果见表5。

表5.试验组10个组织2小时RT-qPCR检测数据

注：上述细胞数为以Ct值的平均值计算得到。

在肺部脏器分布最高的情况下，进一步进行不同时间点不同小鼠的肺脏的表达检测验证，这样不仅节约成本还能快速获得实验结果。

RT-qPCR检测显示，小鼠给予hu-MSC细胞后2h、24h均在肺组织中有检出。

具体如图4所示，图4为应用引物HCD29-F和HCD29-F(1号引物对)对给药后2H和24H的二个时间点的6只小鼠肺组织样品实时荧光PCR扩增的结果示意图。分别命名为 2H-01，2H-02，24H-03，24H-01，24H-02，24H-03。RT-qPCR检测数据显示在肺脏中具体的结果见表6，可通过CT值快速计算出细胞的含量，优于常规的流式细胞术实验，克服其只能区分出阳性细胞的比例，不能具体到在组织中的含量的问题。

表6.肺脏中RT-qPCR检测数据

4.2验证结果

初步实验结果显示干细胞注射后在肺组织中分布最高，所以取上述小鼠肺组织样品，按照酶消化加上适当的物理研磨方法处理，通过流式细胞仪统计分析小鼠中2H和24H的二个时间点占总白细胞的比例，从而与RT-qPCR检测数据做定性对比。

查询hu-MSC细胞特异性标志物发现，CD45及HLA-DR为阴性表达，CD29为阳性表达，圈定所有细胞，排除细胞碎片及黏连细胞；圈定CD45-HLA-DR-细胞，再分析其中CD29⁺细胞，统计分析其占总白细胞的比例。实验加入抗人CD29、CD45荧光标记抗体，每个样本获取100万个细胞颗粒进行流式测定。

结果如下表7和图6所示，给药后2小时和24小时可见试验组小鼠中HCD29+占总白细胞比值均值为6.29％±0.02％和1.55％±0.01％(表7)，流式细胞散点图结果见(图6)，从实验结果可知，能重复干细胞注射后在肺组织中分布和作用时间，且特异性较好，进一步验证了RT-qPCR的实验结果。

表7.给药后2h、24h动物肺组织流式细胞术实验检测数据

上表中可以看出，采用本发明的RT-qPCR检测方法，与流式细胞仪测定的结果一致，流式细胞术分析显示，给药2h后，HCD29为阳性表达，在给药后2h、24h均能检出HCD90 标志物，即检测到hu-MSC细胞，且随着时间的延长，给药24h后细胞的含量较2h后有所降低，与本发明建立的RT-qPCR检测方法的结果一致，可见本发明方法准确度高，可靠性好，可以用于研究新型冠状病毒肺炎治疗过程中间充质干细胞的体内分布和停留时间。

综上，上述结果表明，本发明建立的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法是一种快速、准确的检测人源间充质干细胞在hACE2-KI纯合人源化小鼠体内分布及作用时间的方法。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 中国食品药品检定研究院

<120> 人源间充质干细胞在小鼠体内分布的RT-qPCR检测方法及应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgtaaccaac cgtagcaaag g 21

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cccctgatct taatcgcaaa acc 23

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cagcgggagt cgcggaacag 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

accacccaca atttggccct g 21

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gagaggccca gcgggagtcg 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atcttttccg cgcggcgtcc 20

<210> 7

<211> 98

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tgtaaccaac cgtagcaaag gaacagcaga gaagctcaag ccagaggata ttactcagat 60

ccaaccacag cagttggttt tgcgattaag atcagggg 98

<210> 8

<211> 208

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cagcgggagt cgcggaacag caggcccgag cccaccgcgc cgggccccgg acgccgcgcg 60

gaaaagatga atttacaacc aattttctgg attggactga tcagttcagt ttgctgtgtg 120

tttgctcaaa cagatgaaaa tagatgttta aaagcaaatg ccaaatcatg tggagaatgt 180

atacaagcag ggccaaattg tgggtggt 208

<210> 9

<211> 76

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gagaggccca gcgggagtcg cggaacagca ggcccgagcc caccgcgccg ggccccggac 60

gccgcgcgga aaagat 76

Claims

1.一种人源间充质干细胞在小鼠体内分布的RT-qPCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

取样：取已注射人源间充质干细胞的小鼠器官组织，提取其总RNA，待测；

2.根据权利要求1所述的RT-qPCR检测方法，其特征在于，所述人源间充质干细胞特异性蛋白为CD29蛋白。

3.根据权利要求1所述的RT-qPCR检测方法，其特征在于，所述人源间充质干细胞特异性蛋白基因序列为mRNA序列。

4.根据权利要求3所述的RT-qPCR检测方法，其特征在于，所述检测步骤中，先将mRNA序列反转录合成cDNA，再通过实时荧光定量PCR方法进行测定。

5.根据权利要求4所述的RT-qPCR检测方法，其特征在于，所述小鼠为hACE2-KI/NIFDC模型小鼠。

6.根据权利要求5所述的RT-qPCR检测方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR方法中，采用以下扩增引物对进行检测：

上游引物HCD29-F：5'-TGTAACCAACCGTAGCAAAGG-3'(SEQ ID NO.1)

下游引物HCD29-R：5'-CCCCTGATCTTAATCGCAAAACC-3'(SEQ ID NO.2)。

7.根据权利要求6所述的RT-qPCR检测方法，其特征在于，所述检测步骤中，PCR反应体系为：

8.根据权利要求7所述的RT-qPCR检测方法，其特征在于，所述检测步骤中，PCR扩增反应条件为：95℃维持30s；之后以95℃维持5s，60℃维持30s为一个循环，进行40个循环，并在60℃收集荧光，最后以40℃维持5s；

9.根据权利要求1所述的RT-qPCR检测方法，其特征在于，所述检测步骤中，选取人源间充质干细胞作为阳性样本制作标准曲线，所述标准曲线中各样本中包含人源间充质干细胞的浓度为：2×10⁶、2×10⁵、2×10⁴、2×10³个细胞/mL。

10.权利要求1-9任一项所述的RT-qPCR检测方法在评价间充质干细胞在生物体内的分布时的应用。