CN109295228B - 一种检测血浆游离dna中肺癌相关突变基因的试剂盒及其应用 - Google Patents

一种检测血浆游离dna中肺癌相关突变基因的试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种检测血浆游离DNA中肺癌相关突变基因的试剂盒及其应用。本发明公开了血浆游离DNA中肺癌相关LRP1B、KMT2D、CSMD3突变基因及突变位点，以及检测上述血浆游离DNA中LRP1B、KMT2D、CSMD3突变基因的试剂盒，该试剂盒包括根据上述LRP1B、KMT2D、CSMD3突变基因设计的特异性引物及特异性探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～68所示，以及缓冲液，dNTPs，TaqDNA聚合酶，MgCl2和DNA提取试剂盒。本发明首次揭示了LRP1B、KMT2D、CSMD3基因突变在非小细胞肺癌诊断中的应用，并能很好的鉴别肿瘤良恶性。

Description

一种检测血浆游离DNA中肺癌相关突变基因的试剂盒及其 应用
技术领域
本发明涉及一种检测血浆游离DNA中肺癌相关突变基因的试剂盒及其应用，属于生物技术和医学领域。
背景技术
肺癌是目前世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，严重影响人们的身体健康。有研究数据统计显示，目前到医院就诊和接受治疗的肺癌患者中，80％以上到医院就诊时已为中晚期肺癌，早期肺癌(I期)仅占19.10％。早期肺癌通过手术等综合治疗，患者的5年生存率在90％以上，10年生存率接近70％。而中、晚期肺癌患者的5年生存率分别为30％和10％左右。因此，提高肺癌治愈率的有效方法就是：早期发现、早期诊断和早期治疗。
影像学检查是肺癌诊断的初步手段，胸部CT分辨率更高，目前已应用于健康查体，能发现很小的肺部病灶。从肺部病变的影像学表现，如分叶、毛刺、胸膜皱缩征等，可以初步判断肺部阴影是恶性或良性肿瘤。但有时肺部病灶在胸部CT的表现不典型，从CT表现看很难区分病灶的良恶性。而血液肿瘤标志物检测，如CEA、NSE、CYF-211的敏感性和特异性低，亦不能确诊良恶性。这些因素给肺癌的诊断带来困难。
目前肺癌确诊的主要手段仍是病理学诊断。取得病理的方法包括纤维支气管镜、经皮肺穿刺活检等。纤维支气管镜检查，在气管内可发现中心型肺癌在气管内的形态，并可取得病理，但检查有痛苦，存在获取组织量少、假阴性的可能。一些位于肺周边的病变，纤维支气管镜亦无法探查到。另一种常用的经皮肺穿刺活检，是一种有创性操作，有出血、感染、气胸等风险，且穿刺组织量较少，亦有假阴性的可能性，甚至有肿瘤细胞通过针道转移的风险。这两种方法有取得病理的可能，但亦有风险。
理想的诊断方法应为操作简单、创伤较小、样本获取容易、阳性率高。血浆游离DNA(cellfreeDNA，cfDNA)是细胞通过细胞凋亡、坏死等途径释放至外周血中的DNA片段。健康人的cfDNA主要来自骨髓细胞、淋巴细胞以及正常的组织细胞。对于患肿瘤的病人，肿瘤细胞同样会通过该途径将肿瘤细胞的DNA片段释放至外周血，这种DNA片段称为循环肿瘤DNA(circulatingtumorDNA，ctDNA)，大小约150-200bp。血浆游离的ctDNA中包含了肿瘤的遗传信息，对于疾病的诊断、治疗和监测预后有重要意义。高通量测序是目前研究ctDNA的高效手段，但检测花费较高，检测发现的突变基因是否与肺癌相关，亦难以确定。
实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质检测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。在PCR反应体系中加入引物和特异性荧光探针，将报告荧光基团和淬灭荧光基团标记在寡核苷酸探针两端。探针完整不被破坏时，5’端的报告基团发射的荧光信号会被3’端的淬灭基团吸收。而在PCR反应扩增时，Taq DNA聚合酶将与模板结合的探针酶切降解，使探针的淬灭基团与报告基团分离，发出荧光信号，实现荧光信号积累和PCR产物形成的同步。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明公开了血浆游离DNA中肺癌相关突变基因及突变位点，其中肺癌相关突变基因包括LRP1B、KMT2D、CSMD3突变基因，提供了一种检测血浆游离DNA中肺癌相关LRP1B、KMT2D、CSMD3突变基因的试剂盒，该试剂盒能够快速、便捷、准确的检测血浆游离DNA中LRP1B、KMT2D、CSMD3基因的突变情况。
本发明还提供了上述试剂盒在检测血浆游离DNA中肺癌相关LRP1B、KMT2D、CSMD3突变基因的应用，以及在肺癌的诊断和鉴别诊断中的应用，能够鉴别肺部肿瘤的良恶性，提高肺癌诊断的准确率。
另外，本发明还提供了上述血浆游离DNA中肺癌相关LRP1B、KMT2D、CSMD3突变基因在制备检测肺癌或其易感性的试剂盒中的应用。
发明概述
发明人通过高通量测序技术检测I、II期肺癌患者及肺部良性疾病患者的血浆游离DNA，发现肺癌患者血浆ctDNA中LRP1B、KMT2D、CSMD3基因频繁发生突变，与肺部良性疾病对比具有统计学意义。
胸部CT发现肺部结节且无纵隔肿大淋巴结的患者，从影像学表现及血液肿瘤指标难以诊断为肺癌或良性疾病，不能确定良性或恶性。术前采集外周静脉血，检测血浆ctDNA中基因突变，发现肺癌患者中LRP1B、KMT2D、CSMD3基因频繁发生突变，而肺良性疾病患者该组基因未发现突变，两组对比具有统计学意义。
通过高通量测序获得血浆游离DNA中LRP1B、KMT2D、CSMD3突变基因及突变位点，并利用该突变基因设计试剂盒，应用于血浆游离DNA中LRP1B、KMT2D、CSMD3突变基因的检测或肺癌的诊断和鉴别诊断，以及肺癌或其易感性的检测。
发明详述
本发明的技术方案如下：
血浆游离DNA中肺癌相关突变基因，其特征在于，所述突变基因包括LRP1B、KMT2D、CSMD3突变基因，其突变位点如下：
LRP1B:NM_018557:exon51:c.G8185A:p.A2729T，
LRP1B:NM_018557:exon83:c.A12658T:p.T4220S，
LRP1B:NM_018557:exon2:c.A125T:p.H42L，
LRP1B:NM_018557:exon16:c.G2555A:p.C852Y，
LRP1B:NM_018557:exon89:c.A13511T:p.H4504L，
LRP1B:NM_018557:exon8:c.A1141T:p.N381Y；
KMT2D:NM_003482:exon34:c.C8972T:p.P2991L，
KMT2D:NM_003482:exon34:c.C8495T:p.A2832V，
KMT2D:NM_003482:exon4:c.G487A:p.A163T，
KMT2D:NM_003482:exon41:c.G13711A:p.A4571T，
KMT2D:NM_003482:exon11:c.C3647T:p.A1216V，
KMT2D:NM_003482:exon38:c.G10607A:p.R3536H；
CSMD3:NM_052900:exon54:c.C8300T:p.P2767L，
CSMD3:NM_052900:exon20:c.A3058T:p.T1020S，
CSMD3:NM_052900:exon10:c.G1397C:p.S466T，
CSMD3:NM_052900:exon14:c.C2050T:p.L684F，
CSMD3:NM_052900:exon59:c.G9323T:p.G3108V。
一种检测上述血浆游离DNA中肺癌相关突变基因的试剂盒，包括根据上述LRP1B、KMT2D、CSMD3突变基因设计的特异性引物，其中：
检测LRP1B基因A2729T(c.G8185A)突变位点的特异性引物，所述特异性引物上游序列如SEQ ID NO.1所示，所述特异性引物下游序列如SEQ ID NO.2所示；
检测LRP1B基因T4220S(c.A12658T)突变位点的特异性引物，所述特异性引物上游序列如SEQ ID NO.5所示，所述特异性引物下游序列如SEQ ID NO.6所示；
检测LRP1B基因H42L(c.A125T)突变位点的特异性引物，所述特异性引物上游序列如SEQ ID NO.9所示，所述特异性引物下游序列如SEQ ID NO.10所示；
检测LRP1B基因C852Y(c.G2555A)突变位点的特异性引物，所述特异性引物上游序列如SEQ ID NO.13所示，所述特异性引物下游序列如SEQ ID NO.14所示；
检测LRP1B基因H4504L(c.A13511T)突变位点的特异性引物，所述特异性引物上游序列如SEQ ID NO.17所示，所述特异性引物下游序列如SEQ ID NO.18所示；
检测LRP1B基因N381Y(c.A1141T)突变位点的特异性引物，所述特异性引物上游序列如SEQ ID NO.21所示，所述特异性引物下游序列如SEQ ID NO.22所示；
检测KMT2D基因P2991L(c.C8972T)突变位点的特异性引物，所述特异性引物上游序列如SEQ ID NO.25所示，所述特异性引物下游序列如SEQ ID NO.26所示；
检测KMT2D基因A2832V(c.C8495T)突变位点的特异性引物，所述特异性引物上游序列如SEQ ID NO.29所示，所述特异性引物下游序列如SEQ ID NO.30所示；
检测KMT2D基因A163T(c.G487A)突变位点的特异性引物，所述特异性引物上游序列如SEQ ID NO.33所示，所述特异性引物下游序列如SEQ ID NO.34所示；
检测KMT2D基因A4571T(c.G13711A)突变位点的特异性引物，所述特异性引物上游序列如SEQ ID NO.37所示，所述特异性引物下游序列如SEQ ID NO.38所示；
检测KMT2D基因A1216V(c.C3647T)突变位点的特异性引物，所述特异性引物上游序列如SEQ ID NO.41所示，所述特异性引物下游序列如SEQ ID NO.42所示；
检测KMT2D基因R3536H(c.G10607A)突变位点的特异性引物，所述特异性引物上游序列如SEQ ID NO.45所示，所述特异性引物下游序列如SEQ ID NO.46所示；
检测CSMD3基因P2767L(c.C8300T)突变位点的特异性引物，所述特异性引物上游序列如SEQ ID NO.49所示，所述特异性引物下游序列如SEQ ID NO.50所示；
检测CSMD3基因T1020S(c.A3058T)突变位点的特异性引物，所述特异性引物上游序列如SEQ ID NO.53所示，所述特异性引物下游序列如SEQ ID NO.54所示；
检测CSMD3基因S466T(c.G1397C)突变位点的特异性引物，所述特异性引物上游序列如SEQ ID NO.57所示，所述特异性引物下游序列如SEQ ID NO.58所示；
检测CSMD3基因L684F(c.C2050T)突变位点的特异性引物，所述特异性引物上游序列如SEQ ID NO.61所示，所述特异性引物下游序列如SEQ ID NO.62所示；
检测CSMD3基因G3108V(c.G9323T)突变位点的特异性引物，所述特异性引物上游序列如SEQ ID NO.65所示，所述特异性引物下游序列如SEQ ID NO.66所示。
根据本发明优选的，上述检测血浆游离DNA中肺癌相关突变基因的试剂盒，还包括：
特异性识别LRP1B基因A2729T(c.G8185A)位点的Taqman探针，所述Taqman探针的野生型序列如SEQ ID NO.3所述，所述Taqman探针的突变型序列如SEQ ID NO.4所示；
特异性识别LRP1B基因T4220S(c.A12658T)位点的Taqman探针，所述Taqman探针的野生型序列如SEQ ID NO.7所述，所述Taqman探针的突变型序列如SEQ ID NO.8所示；
特异性识别LRP1B基因H42L(c.A125T)位点的Taqman探针，所述Taqman探针的野生型序列如SEQ ID NO.11所述，所述Taqman探针的突变型序列如SEQ ID NO.12所示；
特异性识别LRP1B基因C852Y(c.G2555A)位点的Taqman探针，所述Taqman探针的野生型序列如SEQ ID NO.15所述，所述Taqman探针的突变型序列如SEQ ID NO.16所示；
特异性识别LRP1B基因H4504L(c.A13511T)位点的Taqman探针，所述Taqman探针的野生型序列如SEQ ID NO.19所述，所述Taqman探针的突变型序列如SEQ ID NO.20所示；
特异性识别LRP1B基因N381Y(c.A1141T)位点的Taqman探针，所述Taqman探针的野生型序列如SEQ ID NO.23所述，所述Taqman探针的突变型序列如SEQ ID NO.24所示；
特异性识别KMT2D基因P2991L(c.C8972T)位点的Taqman探针，所述Taqman探针的野生型序列如SEQ ID NO.27所述，所述Taqman探针的突变型序列如SEQ ID NO.28所示；
特异性识别KMT2D基因A2832V(c.C8495T)位点的Taqman探针，所述Taqman探针的野生型序列如SEQ ID NO.31所述，所述Taqman探针的突变型序列如SEQ ID NO.32所示；
特异性识别KMT2D基因A163T(c.G487A)位点的Taqman探针，所述Taqman探针的野生型序列如SEQ ID NO.35所述，所述Taqman探针的突变型序列如SEQ ID NO.36所示；
特异性识别KMT2D基因A4571T(c.G13711A)位点的Taqman探针，所述Taqman探针的野生型序列如SEQ ID NO.39所述，所述Taqman探针的突变型序列如SEQ ID NO.40所示；
特异性识别KMT2D基因A1216V(c.C3647T)位点的Taqman探针，所述Taqman探针的野生型序列如SEQ ID NO.43所述，所述Taqman探针的突变型序列如SEQ ID NO.44所示；
特异性识别KMT2D基因R3536H(c.G10607A)位点的Taqman探针，所述Taqman探针的野生型序列如SEQ ID NO.47所述，所述Taqman探针的突变型序列如SEQ ID NO.48所示；
特异性识别CSMD3基因P2767L(c.C8300T)位点的Taqman探针，所述Taqman探针的野生型序列如SEQ ID NO.51所述，所述Taqman探针的突变型序列如SEQ ID NO.52所示；
特异性识别CSMD3基因T1020S(c.A3058T)位点的Taqman探针，所述Taqman探针的野生型序列如SEQ ID NO.55所述，所述Taqman探针的突变型序列如SEQ ID NO.56所示；
特异性识别CSMD3基因S466T(c.G1397C)位点的Taqman探针，所述Taqman探针的野生型序列如SEQ ID NO.59所述，所述Taqman探针的突变型序列如SEQ ID NO.60所示；
特异性识别CSMD3基因L684F(c.C2050T)位点的Taqman探针，所述Taqman探针的野生型序列如SEQ ID NO.63所述，所述Taqman探针的突变型序列如SEQ ID NO.64所示；
特异性识别CSMD3基因G3108V(c.G9323T)位点的Taqman探针，所述Taqman探针的野生型序列如SEQ ID NO.67所述，所述Taqman探针的突变型序列如SEQ ID NO.68所示。
根据本发明优选的，上述检测血浆游离DNA中肺癌相关突变基因的试剂盒，还包括：缓冲液，dNTPs，TaqDNA聚合酶，MgCl2和DNA提取试剂盒。
根据本发明优选的，上述检测血浆游离DNA中肺癌相关突变基因的试剂盒，各成分反应浓度如下：特异性引物0.2μM；Taqman探针0.1μM；dNTPs 0.25mM；TaqDNA聚合酶0.025U/μL；MgCl2 1.5mM；DNA提取试剂盒提取到的模板DNA<250ng，优选为10～200ng。
根据本发明优选的，上述检测血浆游离DNA中肺癌相关突变基因的试剂盒，所述Taqman探针的野生型的5′端连接VIC荧光标记；Taqman探针的突变型的5′端连接FAM荧光标记。
上述试剂盒在检测血浆游离DNA中肺癌相关LRP1B、KMT2D、CSMD3突变基因中的应用。
根据本发明优选的，上述应用采用实时荧光定量PCR技术完成。
上述检测血浆游离DNA中肺癌相关突变基因的试剂盒在肺癌的诊断和鉴别诊断中的应用。
上述血浆游离DNA中肺癌相关突变基因在制备检测肺癌或其易感性的试剂盒中的应用。
根据本发明优选的，上述检测肺癌或其易感性的试剂盒包括：针对一种或几种LRP1B、KMT2D、CSMD3突变基因的特异性引物，针对一种或几种LRP1B、KMT2D、CSMD3突变基因的特异性探针，针对一种或几种LRP1B、KMT2D、CSMD3突变基因的基因芯片和针对一种或几种LRP1B、KMT2D、CSMD3突变基因的转录蛋白的特异性抗体。
有益效果
1、本发明首次揭示了血浆游离DNA中LRP1B、KMT2D、CSMD3基因突变与肺癌相关，其在肺癌与肺良性肿瘤中对比具有统计学差异，并根据LRP1B、KMT2D、CSMD3突变基因及突变位点设计出检测该基因突变位点的试剂盒，胸部X线、胸部CT、胸部MRI等影像学检查发现肺部阴影，应用本试剂盒检测可为肺癌的诊断及鉴别诊断提供指导。
2、本发明所述的试剂盒采用实时荧光定量PCR技术，相比高通量基因测序技术，该试剂盒对于LRP1B、KMT2D、CSMD3基因突变位点的检测具有准确、快捷、成本相对廉价的特点，该试剂盒实用范围较广，能检测外周血中提取的游离DNA。
附图说明
图1是用本发明所述试剂盒检测LRP1B、KMT2D、CSMD3基因野生型的检测结果；
图中虚线表示野生型探针5′端VIC基团所发荧光，横坐标表示PCR扩增循环数，纵坐标表示荧光强度；
图2是用本发明所述试剂盒检测LRP1B、KMT2D、CSMD3基因突变型的检测结果；
图中实线表示突变型探针5′端FAM基团所发荧光，横坐标表示PCR扩增循环数，纵坐标表示荧光强度。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
实施例中DNA提取试剂盒为TIANampGenomicDNAKit(TIANGEN)购自天根生化科技有限公司；
TaqDNA聚合酶等其他试剂均购自大连宝生物公司。
实施例1
发明人通过高通量测序技术研究肺癌与肺良性疾病患者外周静脉血中ctDNA，检测到LRP1B、KMT2D、CSMD3基因在肺癌患者中频繁突变，而在肺良性疾病患者中，未发现LRP1B、KMT2D、CSMD3基因突变。血浆游离DNA中LRP1B、KMT2D、CSMD3突变基因在肺癌与肺良性肿瘤中的差异具有统计学意义，可以作为肺癌诊断及鉴别诊断的指导。
具体研究过程如下：
入组病例：发明人对山东大学第二医院胸外科2017年1月至2017年12月就诊的肺部结节患者进行研究，根据胸部CT及血液肺癌肿瘤指标(包括CEA、NSE、CYF21-1)检查结果，均无法确定其为肺癌还是肺良性疾病。所有患者均选择接受手术治疗，术前采外周静脉血10ml，根据肿瘤术后病理结果，将样本分为肺癌及肺良性疾病组(肺良性疾病包括炎性假瘤、硬化性血管瘤、肺结核球等)。
研究方法：应用高通量测序研究两组样本外周血ctDNA突变情况，步骤包括：
①从外周静脉血中分离血浆及白细胞；②Agilent的液相芯片对目标区域DNA进行高效富集、建库；③Illumina Hiseq平台上进行高通量、高深度测序；④数据处理、分析。
研究结果：在入组的肺癌病人中，约48.1％发现了LRP1B、KMT2D、CSMD3基因中的一种或几种突变，而在肺良性疾病患者中，未发现LRP1B、KMT2D、CSMD3基因突变。在所有检测到LRP1B、KMT2D、CSMD3基因突变的肺癌病人中，发明人通过卡方检验发现其与肺良性疾病患者有显著的统计学差异。
其中，肺癌病人中LRP1B突变基因及突变位点包括：
NM_018557:exon51:c.G8185A:p.A2729T，NM_018557:exon83:c.A12658T:p.T4220S，NM_018557:exon2:c.A125T:p.H42L，NM_018557:exon16:c.G2555A:p.C852Y，NM_018557:exon89:c.A13511T:p.H4504L，NM_018557:exon8:c.A1141T:p.N381Y。
肺癌病人中KMT2D突变基因及突变位点包括：
NM_003482:exon34:c.C8972T:p.P2991L，NM_003482:exon34:c.C8495T:p.A2832V，NM_003482:exon4:c.G487A:p.A163T，NM_003482:exon41:c.G13711A:p.A4571T，NM_003482:exon11:c.C3647T:p.A1216V，NM_003482:exon38:c.G10607A:p.R3536H。
肺癌病人中CSMD3突变基因及突变位点包括：
NM_052900:exon54:c.C8300T:p.P2767L，NM_052900:exon20:c.A3058T:p.T1020S，NM_052900:exon10:c.G1397C:p.S466T，NM_052900:exon14:c.C2050T:p.L684F，NM_052900:exon59:c.G9323T:p.G3108V。
研究结论：在肺癌患者的外周血ctDNA中发现LRP1B、KMT2D、CSMD3基因突变，突变基因包含上述突变位点，而在良性肿瘤中未发现其突变。LRP1B、KMT2D、CSMD3基因的特定位点突变，可为肺癌的诊断及鉴别诊断提供参考，对于影像学和肿瘤指标难以确诊的肺结节患者，提供更加合理有效的个体化指导。
根据上述发现，进行特异性引物和探针设计，引物设计原则如下所示：
①设计的引物序列长度一般为13～25bp之间，其中G+C含量占总碱基数目的30％～80％；②应确定引物中的碱基为随机分配；③引物的5′端可以修饰，但引物的3′端不可修饰，引物的3’端有4个碱基是完全保守的；④引物的3’端一般不设计为G或/和C，引物3’端的5个碱基不应出现2个G或/和C。
Taqman探针设计原则如下所示：
①探针的长度尽量缩短，一般数量在10～30个碱基之间；②应确定设计探针序列中碱基分布的随机性；③探针自身不能含有4个连续的互补碱基；④探针序列内碱基G的数量一般不高于碱基C的数量，且G+C数量应控制在30％～80％之间；⑤在探针5′端加上荧光发光基团，在探针3′端加荧光猝灭基团。
引物及探针设计步骤：
1、首先在Ensemble数据库中确定包含LRP1B、KMT2D、CSMD3基因突变位点的cDNA序列；
2、通过BLAST确定该cDNA序列在DNA上所对应的外显子序列；
3、根据所得外显子序列，通过GenomeBrower确定所对应的完整DNA序列(包括外显子和内含子)；
其中，LRP1B、KMT2D、CSMD3的突变位点、突变基因及对应的DNA序列如下：
(1)LRP1B:NM_018557:exon51:c.G8185A:p.A2729T
G为突变位点，突变位点对应cDNA及DNA位置如下：
Figure BDA0001833525380000071
Figure BDA0001833525380000081
(2)LRP1B:NM_018557:exon83:c.A12658T:p.T4220S
A为突变位点，突变位点对应cDNA及DNA位置如下：
Figure BDA0001833525380000082
(3)LRP1B:NM_018557:exon2:c.A125T:p.H42LA为突变位点，突变位点对应cDNA及DNA位置如下：
Figure BDA0001833525380000083
(4)LRP1B:NM_018557:exon16:c.G2555A:p.C852Y
G为突变位点，突变位点对应cDNA及DNA位置如下：
Figure BDA0001833525380000084
(5)LRP1B:NM_018557:exon89:c.A13511T:p.H4504L
A为突变位点，突变位点对应cDNA及DNA位置如下：
Figure BDA0001833525380000085
Figure BDA0001833525380000091
(6)LRP1B:NM_018557:exon8:c.A1141T:p.N381Y
A为突变位点，突变位点对应cDNA及DNA位置如下：
Figure BDA0001833525380000092
(7)KMT2D:NM_003482:exon34:c.C8972T:p.P2991L
C为突变位点，突变位点对应cDNA及DNA位置如下：
Figure BDA0001833525380000093
(8)KMT2D:NM_003482:exon34:c.C8495T:p.A2832V
C为突变位点，突变位点对应cDNA及DNA位置如下：
Figure BDA0001833525380000094
(9)KMT2D:NM_003482:exon4:c.G487A:p.A163T
G为突变位点，突变位点对应cDNA及DNA位置如下：
Figure BDA0001833525380000095
Figure BDA0001833525380000101
(10)KMT2D:NM_003482:exon41:c.G13711A:p.A4571T
G为突变位点，突变位点对应cDNA及DNA位置如下：
Figure BDA0001833525380000102
(11)KMT2D:NM_003482:exon11:c.C3647T:p.A1216V
C为突变位点，突变位点对应cDNA及DNA位置如下：
Figure BDA0001833525380000103
(12)KMT2D:NM_003482:exon38:c.G10607A:p.R3536H
G为突变位点，突变位点对应cDNA及DNA位置如下：
Figure BDA0001833525380000104
(13)CSMD3:NM_052900:exon54:c.C8300T:p.P2767L
C为突变位点，突变位点对应cDNA及DNA位置如下：
Figure BDA0001833525380000111
(14)CSMD3:NM_052900:exon20:c.A3058T:p.T1020S
A为突变位点，突变位点对应cDNA及DNA位置如下：
Figure BDA0001833525380000112
(15)CSMD3:NM_052900:exon10:c.G1397C:p.S466T
G为突变位点，突变位点对应cDNA及DNA位置如下：
Figure BDA0001833525380000113
(16)CSMD3:NM_052900:exon14:c.C2050T:p.L684F
C为突变位点，突变位点对应cDNA及DNA位置如下：
Figure BDA0001833525380000114
Figure BDA0001833525380000121
(17)CSMD3:NM_052900:exon59:c.G9323T:p.G3108V
G为突变位点，突变位点对应cDNA及DNA位置如下：
Figure BDA0001833525380000122
4、按照上述引物和探针的设计原则，以上述LRP1B、KMT2D、CSMD3突变基因对应的DNA序列为模板，用primer express 3.0.1软件设计出引物和探针；
其中所述引物：
检测LRP1B基因A2729T(c.G8185A)突变位点的特异性引物，所述特异性引物上游序列如SEQ ID NO.1所示，所述特异性引物下游序列如SEQ ID NO.2所示；
检测LRP1B基因T4220S(c.A12658T)突变位点的特异性引物，所述特异性引物上游序列如SEQ ID NO.5所示，所述特异性引物下游序列如SEQ ID NO.6所示；
检测LRP1B基因H42L(c.A125T)突变位点的特异性引物，所述特异性引物上游序列如SEQ ID NO.9所示，所述特异性引物下游序列如SEQ ID NO.10所示；
检测LRP1B基因C852Y(c.G2555A)突变位点的特异性引物，所述特异性引物上游序列如SEQ ID NO.13所示，所述特异性引物下游序列如SEQ ID NO.14所示；
检测LRP1B基因H4504L(c.A13511T)突变位点的特异性引物，所述特异性引物上游序列如SEQ ID NO.17所示，所述特异性引物下游序列如SEQ ID NO.18所示；
检测LRP1B基因N381Y(c.A1141T)突变位点的特异性引物，所述特异性引物上游序列如SEQ ID NO.21所示，所述特异性引物下游序列如SEQ ID NO.22所示；
检测KMT2D基因P2991L(c.C8972T)突变位点的特异性引物，所述特异性引物上游序列如SEQ ID NO.25所示，所述特异性引物下游序列如SEQ ID NO.26所示；
检测KMT2D基因A2832V(c.C8495T)突变位点的特异性引物，所述特异性引物上游序列如SEQ ID NO.29所示，所述特异性引物下游序列如SEQ ID NO.30所示；
检测KMT2D基因A163T(c.G487A)突变位点的特异性引物，所述特异性引物上游序列如SEQ ID NO.33所示，所述特异性引物下游序列如SEQ ID NO.34所示；
检测KMT2D基因A4571T(c.G13711A)突变位点的特异性引物，所述特异性引物上游序列如SEQ ID NO.37所示，所述特异性引物下游序列如SEQ ID NO.38所示；
检测KMT2D基因A1216V(c.C3647T)突变位点的特异性引物，所述特异性引物上游序列如SEQ ID NO.41所示，所述特异性引物下游序列如SEQ ID NO.42所示；
检测KMT2D基因R3536H(c.G10607A)突变位点的特异性引物，所述特异性引物上游序列如SEQ ID NO.45所示，所述特异性引物下游序列如SEQ ID NO.46所示；
检测CSMD3基因P2767L(c.C8300T)突变位点的特异性引物，所述特异性引物上游序列如SEQ ID NO.49所示，所述特异性引物下游序列如SEQ ID NO.50所示；
检测CSMD3基因T1020S(c.A3058T)突变位点的特异性引物，所述特异性引物上游序列如SEQ ID NO.53所示，所述特异性引物下游序列如SEQ ID NO.54所示；
检测CSMD3基因S466T(c.G1397C)突变位点的特异性引物，所述特异性引物上游序列如SEQ ID NO.57所示，所述特异性引物下游序列如SEQ ID NO.58所示；
检测CSMD3基因L684F(c.C2050T)突变位点的特异性引物，所述特异性引物上游序列如SEQ ID NO.61所示，所述特异性引物下游序列如SEQ ID NO.62所示；
检测CSMD3基因G3108V(c.G9323T)突变位点的特异性引物，所述特异性引物上游序列如SEQ ID NO.65所示，所述特异性引物下游序列如SEQ ID NO.66所示。
所述探针：
特异性识别LRP1B基因A2729T(c.G8185A)位点的Taqman探针，所述Taqman探针的野生型序列如SEQ ID NO.3所述，所述Taqman探针的突变型序列如SEQ ID NO.4所示；
特异性识别LRP1B基因T4220S(c.A12658T)位点的Taqman探针，所述Taqman探针的野生型序列如SEQ ID NO.7所述，所述Taqman探针的突变型序列如SEQ ID NO.8所示；
特异性识别LRP1B基因H42L(c.A125T)位点的Taqman探针，所述Taqman探针的野生型序列如SEQ ID NO.11所述，所述Taqman探针的突变型序列如SEQ ID NO.12所示；
特异性识别LRP1B基因C852Y(c.G2555A)位点的Taqman探针，所述Taqman探针的野生型序列如SEQ ID NO.15所述，所述Taqman探针的突变型序列如SEQ ID NO.16所示；
特异性识别LRP1B基因H4504L(c.A13511T)位点的Taqman探针，所述Taqman探针的野生型序列如SEQ ID NO.19所述，所述Taqman探针的突变型序列如SEQ ID NO.20所示；
特异性识别LRP1B基因N381Y(c.A1141T)位点的Taqman探针，所述Taqman探针的野生型序列如SEQ ID NO.23所述，所述Taqman探针的突变型序列如SEQ ID NO.24所示；
特异性识别KMT2D基因P2991L(c.C8972T)位点的Taqman探针，所述Taqman探针的野生型序列如SEQ ID NO.27所述，所述Taqman探针的突变型序列如SEQ ID NO.28所示；
特异性识别KMT2D基因A2832V(c.C8495T)位点的Taqman探针，所述Taqman探针的野生型序列如SEQ ID NO.31所述，所述Taqman探针的突变型序列如SEQ ID NO.32所示；
特异性识别KMT2D基因A163T(c.G487A)位点的Taqman探针，所述Taqman探针的野生型序列如SEQ ID NO.35所述，所述Taqman探针的突变型序列如SEQ ID NO.36所示；
特异性识别KMT2D基因A4571T(c.G13711A)位点的Taqman探针，所述Taqman探针的野生型序列如SEQ ID NO.39所述，所述Taqman探针的突变型序列如SEQ ID NO.40所示；
特异性识别KMT2D基因A1216V(c.C3647T)位点的Taqman探针，所述Taqman探针的野生型序列如SEQ ID NO.43所述，所述Taqman探针的突变型序列如SEQ ID NO.44所示；
特异性识别KMT2D基因R3536H(c.G10607A)位点的Taqman探针，所述Taqman探针的野生型序列如SEQ ID NO.47所述，所述Taqman探针的突变型序列如SEQ ID NO.48所示；
特异性识别CSMD3基因P2767L(c.C8300T)位点的Taqman探针，所述Taqman探针的野生型序列如SEQ ID NO.51所述，所述Taqman探针的突变型序列如SEQ ID NO.52所示；
特异性识别CSMD3基因T1020S(c.A3058T)位点的Taqman探针，所述Taqman探针的野生型序列如SEQ ID NO.55所述，所述Taqman探针的突变型序列如SEQ ID NO.56所示；
特异性识别CSMD3基因S466T(c.G1397C)位点的Taqman探针，所述Taqman探针的野生型序列如SEQ ID NO.59所述，所述Taqman探针的突变型序列如SEQ ID NO.60所示；
特异性识别CSMD3基因L684F(c.C2050T)位点的Taqman探针，所述Taqman探针的野生型序列如SEQ ID NO.63所述，所述Taqman探针的突变型序列如SEQ ID NO.64所示；
特异性识别CSMD3基因G3108V(c.G9323T)位点的Taqman探针，所述Taqman探针的野生型序列如SEQ ID NO.67所述，所述Taqman探针的突变型序列如SEQ ID NO.68所示。
实施例2
检测血浆游离DNA中肺癌相关LRP1B、KMT2D、CSMD3突变基因的试剂盒，包括：
实施例1设计并合成的检测LRP1B、KMT2D、CSMD3基因突变位点的特异引物，所述特异引物的上游序列如SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.9，SEQ ID NO.13，SEQ IDNO.17，SEQ ID NO.21，SEQ ID NO.25，SEQ ID NO.29，SEQ ID NO.33，SEQ ID NO.37，SEQ IDNO.41，SEQ ID NO.45，SEQ ID NO.49，SEQ ID NO.53，SEQ ID NO.57，SEQ ID NO.61，SEQ IDNO.65所示，下游引物序列如SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.10，SEQ ID NO.14，SEQID NO.18，SEQ ID NO.22，SEQ ID NO.26，SEQ ID NO.30，SEQ ID NO.34，SEQ ID NO.38，SEQID NO.42，SEQ ID NO.46，SEQ ID NO.50，SEQ ID NO.54，SEQ ID NO.58，SEQ ID NO.62，SEQID NO.66所示；
实施例1设计并合成的特异性识别LRP1B、KMT2D、CSMD3基因突变位点的Taqman探针，所述野生型Taqman探针5′端连接VIC荧光标记，序列如SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.7，SEQID NO.11，SEQ ID NO.15，SEQ ID NO.19，SEQ ID NO.23，SEQ ID NO.27，SEQ ID NO.31，SEQID NO.35，SEQ ID NO.39，SEQ ID NO.43，SEQ ID NO.47，SEQ ID NO.51，SEQ ID NO.55，SEQID NO.59，SEQ ID NO.63，SEQ ID NO.67所示；突变型探针5′端连接FAM荧光标记，序列如SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.8，SEQ ID NO.12，SEQ ID NO.16，SEQ ID NO.20，SEQ ID NO.24，SEQ ID NO.28，SEQ ID NO.32，SEQ ID NO.36，SEQ ID NO.40，SEQ ID NO.44，SEQ IDNO.48，SEQ ID NO.52，SEQ ID NO.56，SEQ ID NO.60，SEQ ID NO.64，SEQ ID NO.68所示；
另外，还包括缓冲液，TaqDNA聚合酶，dNTPs，MgCl2和DNA提取试剂盒。
上述各成分反应浓度如下：
引物0.2μM；Taqman探针0.1μM；TaqDNA聚合酶0.025U/μL；dNTPs 0.25mM；MgCl21.5mM；DNA提取试剂盒提取到的模板DNA 10～50ng。
实施例3
选取20例胸部CT发现肺部结节的患者，术前病理诊断为非小细胞肺癌，且为早期肺癌。所有患者均接受手术治疗，术前采外周静脉血15mL，分离血浆，应用TIANampGenomicDNAKit(TIANGEN)试剂盒从血浆样本中提取DNA。
应用实施例2所述检测血浆游离DNA中LRP1B、KMT2D、CSMD3突变基因的试剂盒，对20例血浆样本中LRP1B、KMT2D、CSMD3基因突变情况进行检测。
应用罗氏LC96实时荧光PCR仪在20μL反应体系中进行实时荧光定量PCR反应；
反应条件为：94℃预变性180sec，94℃变性5sec，60℃退火和延伸30sec，共进行50个循环。
经试剂盒检测，20例血浆样本中，有11例血浆样本检测结果如图1所示，这些样本的LRP1B、KMT2D、CSMD3基因为野生型；有9例样本检测结果如图2所示，1例样本LRP1B基因A2729T(c.G8185A)位点、KMT2D基因A2832V(c.C8495T)位点为突变型，1例样本LRP1B基因N381Y(c.A1141T)位点为突变型，2例样本LRP1B基因H42L(c.A125T)位点为突变型，1例样本KMT2D基因A2832V(c.C8495T)位点为突变型，1例样本KMT2D基因P2991L(c.C8972T)位点为突变型，1例样本KMT2D基因A163T(c.G487A)位点为突变型，1例样本KMT2D基因A1216V(c.C3647T)位点、CSMD3基因S466T(c.G1397C)位点为突变型，1例样本CSMD3基因T1020S(c.A3058T)位点为突变型。
应用高通量测序技术对上述20例血浆样本提取DNA的LRP1B、KMT2D、CSMD3基因进行测序，检测结果经生物信息技术分析，11例样本LRP1B、KMT2D、CSMD3基因为野生型，9例样本LRP1B、KMT2D、CSMD3基因发生突变，检测结果及突变位点与应用本发明所述试剂盒检测结果完全一致。
实施例4
选取15例胸部CT发现肺部占位性病灶的患者，病理诊断为非小细胞肺癌。所有患者均为晚期肺癌，无法手术治疗。进行化疗、放疗等治疗前，采外周静脉血15ml，分离血浆，应用TIANampGenomicDNAKit(TIANGEN)试剂盒从血浆样本中提取DNA。
应用实施例2所述检测血浆游离DNA中LRP1B、KMT2D、CSMD3突变基因的试剂盒，对15例血浆样本中LRP1B、KMT2D、CSMD3基因突变情况进行检测。
荧光定量PCR反应体系、反应条件、各组分反应时终浓度以及结果判定方法同实施例3。
经试剂盒检测，15例血浆样本中，有7例血浆样本检测结果如图1所示，该样本LRP1B、KMT2D、CSMD3基因为野生型；有8例样本检测结果如图2所示，其中：1例样本LRP1B基因H42L(c.A125T)位点、CSMD3基因L684F(c.C2050T)位点为突变型，1例样本LRP1B基因C852Y(c.G2555A)位点、KMT2D基因A2832V(c.C8495T)位点为突变型，1例样本LRP1B基因T4220S(c.A12658T)位点为突变型，1例样本LRP1B基因C852Y(c.G2555A)位点为突变型，1例样本KMT2D基因A163T(c.G487A)位点为突变型，1例样本KMT2D基因R3536H(c.G10607A)位点为突变型，1例样本CSMD3基因L684F(c.C2050T)位点为突变型，1例样本CSMD3基因G3108V(c.G9323T)位点为突变型。
应用高通量测序技术对上述15例血浆样本提取DNA的LRP1B、KMT2D、CSMD3基因进行测序，检测结果经生物信息技术分析，7例样本LRP1B、KMT2D、CSMD3基因为野生型，8例样本LRP1B、KMT2D、CSMD3基因发生突变，检测结果及突变位点与应用本发明所述试剂盒检测结果完全一致。
实施例5
随机选取10例胸部CT诊断为肺结节的患者，肺部结节不能确定为恶性肿瘤或肺良性疾病。胸部CT所见肺结节最大直径均＜3cm，未见纵隔淋巴结肿大。经胸部CT、肿瘤标志物(CEA、NSE、CYF-211)检查均难以鉴别其为肺癌或肺良性疾病，所有患者均选择接受手术治疗。术前采外周静脉血15ml，分离血浆样本，应用TIANampGenomicDNAKit(TIANGEN)试剂盒从血浆样本中提取DNA。
应用实施例2所述检测血浆游离DNA中LRP1B、KMT2D、CSMD3突变基因的试剂盒，对10例血浆样本中LRP1B、KMT2D、CSMD3基因突变情况进行检测。
荧光定量PCR反应体系、反应条件、各组分反应时终浓度以及结果判定方法同实施例3。
10例血浆样本中，5例检测结果如图2所示，其中：1例样本LRP1B基因N381Y(c.A1141T)位点为突变型，1例样本KMT2D基因P2991L(c.C8972T)位点为突变型，1例样本KMT2D基因A2832V(c.C8495T)位点为突变型，1例样本KMT2D基因A1216V(c.C3647T)位点为突变型，1例样本CSMD3基因L684F(c.C2050T)位点为突变型；5例检测结果如图1所示，检测样本LRP1B、KMT2D、CSMD3基因均为野生型。
经高通量测序技术对上述10例肺结节患者外周血血浆样本提取DNA的LRP1B、KMT2D、CSMD3基因进行测序，检测结果经生物信息技术分析，5例样本中，LRP1B基因发生突变1例、KMT2D基因发生突变3例、CSMD3基因发生突变1例；5例样本LRP1B、KMT2D、CSMD3基因均为野生型。检测结果及突变位点与应用本发明所述试剂盒检测结果完全一致。
经过手术后肿瘤组织病理学证实，5例血浆样本试剂盒检测LRP1B、KMT2D、CSMD3基因突变型的患者为非小细胞肺癌，3例血浆样本试剂盒检测LRP1B、KMT2D、CSMD3基因野生型的患者为非小细胞肺癌，2例血浆样本试剂盒检测LRP1B、KMT2D、CSMD3基因野生型的患者为肺良性疾病。
实施例6
随机选取10例胸部CT诊断为肺部占位性病变的患者，肺部阴影不能确定为恶性肿瘤或肺良性疾病。胸部CT所见肺部肿块最大直径均＞3cm，未见纵隔淋巴结肿大。经胸部CT、肿瘤标志物(CEA、NSE、CYF-211)检查均难以鉴别其为肺癌或良性疾病，所有患者均选择接受手术治疗。术前采外周静脉血15ml，分离血浆样本，应用TIANampGenomicDNAKit(TIANGEN)试剂盒从血浆样本中提取DNA。
应用实施例2所述检测血浆游离DNA中LRP1B、KMT2D、CSMD3突变基因的试剂盒，对10例血浆样本中LRP1B、KMT2D、CSMD3基因突变情况进行检测。
荧光定量PCR反应体系、反应条件、各组分反应时终浓度以及结果判定方法同实施例3。
10例血浆样本中，6例检测结果如图2所示，其中1例样本LRP1B基因T4220S(c.A12658T)位点、CSMD3基因S466T(c.G1397C)位点为突变型，1例样本LRP1B基因C852Y(c.G2555A)位点为突变型，1例样本KMT2D基因A2832V(c.C8495T)位点为突变型，1例样本KMT2D基因A163T(c.G487A)位点为突变型，1例样本CSMD3基因L684F(c.C2050T)位点为突变型，1例样本CSMD3基因T1020S(c.A3058T)位点为突变型。4例检测结果如图1所示，检测样本LRP1B、KMT2D、CSMD3基因均为野生型。
经高通量测序技术对上述10例肺部肿块患者外周血血浆样本提取DNA的LRP1B、KMT2D、CSMD3基因进行测序，检测结果经生物信息技术分析，6例样本LRP1B、KMT2D、CSMD3基因分别发生突变，4例样本LRP1B、KMT2D、CSMD3基因为野生型，检测结果及突变位点与应用本发明所述试剂盒检测结果完全一致。
经过手术后肿瘤组织病理证实，6例血浆样本经试剂盒检测LRP1B、KMT2D、CSMD3基因突变型的患者为非小细胞肺癌，3例血浆样本经试剂盒检测LRP1B、KMT2D、CSMD3基因野生型的患者为非小细胞肺癌，1例血浆样本经试剂盒检测LRP1B、KMT2D、CSMD3基因野生型的患者为肺良性疾病。
以上所述实施例仅为本发明优选的具体实施方案，并不用来限制本发明，凡是在本发明精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换以及改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东大学第二医院
<120> 一种检测血浆游离DNA中肺癌相关突变基因的试剂盒及其应用
<160> 68
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tcttcttgct cttggaacca att 23
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<212> DNA
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tccatcacaa atccaatgct taga 24
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cttgttccgc acaaaa 16
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tgttccacac aaaa 14
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ccctgaaaac atgctaattt gtaca 25
<210> 6
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<212> DNA
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<400> 6
tcatttaaaa tgcatcttcc tcca 24
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<400> 7
gattcatgta agttaacttg 20
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gattcatgta agttatcttg 20
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gtgatcctgg tgaatttctt tgc 23
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tcagggtccc catcacaca 19
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
acgatcacgt gacttg 16
<210> 12
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<212> DNA
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acgatctcgt gacttg 16
<210> 13
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
ggagaagcac tacctcacat atgtaaa 27
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
ccgagcttgg atacagtgtc tgt 23
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<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
tggagagttt cgctgca 17
<210> 16
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
agagtttcgc tacaaa 16
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<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
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tggcaatcca tcttataaca tgtatg 26
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<211> 25
<212> DNA
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tcataaagcc aggatctaaa agacc 25
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
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tcatgatcac aacgat 16
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<212> DNA
<213> 人工序列
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tcatgatctc aacgat 16
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
ccagctgcac tggcactaga 20
<210> 22
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
ccactactcc cacatagtcc aagtaa 26
<210> 23
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
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ctagtcaaca aattgg 16
<210> 24
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
ctagtctaca aattgg 16
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
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cctctggccc tggaagct 18
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<211> 21
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gtgggcatca aaatcgtcat c 21
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<211> 14
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<213> 人工序列
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ctgtgaggat cccg 14
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ctgtgaggat ctcg 14
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
tgggtccctg cccttacag 19
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
aggtccagga gttgatggaa ag 22
<210> 31
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ccatgcgatt tgccat 16
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<400> 32
tccatgcgat ttgtcat 17
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ggagggccca gaactatgtg 20
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<212> DNA
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ccacctgtga gatccctgag a 21
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ctttgtcatc ttgccccttg tag 23
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<213> 人工序列
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gctggctctg cccattga 18
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<212> DNA
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cctgctatca ccgcca 16
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<212> DNA
<213> 人工序列
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cctgctatca ccacc 15
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ctcatcaaat ccgacatcgt taac 24
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
agacccccaa ctccatgga 19
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<213> 人工序列
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ccagggtgat gcca 14
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ccagggtgat gtca 14
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gaaggtgcta gaggagcaga ttg 23
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 46
cgctgcttgg cacacaga 18
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tgtacaccgc aagtc 15
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<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
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tgtacaccac aagtc 15
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tttgtcattt gtttagtggt caactg 26
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<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 50
gccgtaagta aaatttccat gttcta 26
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atcctggaat tcca 14
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<400> 52
atcttggaat tcca 14
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tcatttggaa gaccatcatg actac 25
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<212> DNA
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gccagtggtt gggtaaaact g 21
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<212> DNA
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tactgatcac agagaat 17
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actgatctca gagaat 16
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tctcccaact ttccgttcca 20
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tgctgtgatg acccagacac a 21
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tatgacagca atgcaca 17
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tatgacacca atgcaca 17
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<212> DNA
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ccttgctgtt aaagatggtg actct 25
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cacctcagcc ccagtaaagg t 21
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aatccccaat tctt 14
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 64
atccccaatt ttt 13
<210> 65
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 65
tccctgctgt tttgacctgt g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
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agcactgcgg tacttcacca 20
<210> 67
<211> 16
<212> DNA
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<400> 67
agggaatggt acctgg 16
<210> 68
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 68
agggaatgtt acctgga 17

Claims (6)

1.血浆游离DNA中肺癌相关突变基因，其特征在于，所述突变基因包括LRP1B、KMT2D、CSMD3突变基因，其突变位点如下：
LRP1B:NM_018557:exon51:c.G8185A:p.A2729T，
LRP1B:NM_018557:exon83:c.A12658T:p.T4220S，
LRP1B:NM_018557:exon2:c.A125T:p.H42L，
LRP1B:NM_018557:exon16:c.G2555A:p.C852Y，
LRP1B:NM_018557:exon89:c.A13511T:p.H4504L，
LRP1B:NM_018557:exon8:c.A1141T:p.N381Y；
KMT2D:NM_003482:exon34:c.C8972T:p.P2991L，
KMT2D:NM_003482:exon34:c.C8495T:p.A2832V，
KMT2D:NM_003482:exon4:c.G487A:p.A163T，
KMT2D:NM_003482:exon41:c.G13711A:p.A4571T，
KMT2D:NM_003482:exon11:c.C3647T:p.A1216V，
KMT2D:NM_003482:exon38:c.G10607A:p.R3536H；
CSMD3:NM_052900:exon54:c.C8300T:p.P2767L,
CSMD3:NM_052900:exon20:c.A3058T:p.T1020S，
CSMD3:NM_052900:exon10:c.G1397C:p.S466T，
CSMD3:NM_052900:exon14:c.C2050T:p.L684F，
CSMD3:NM_052900:exon59:c.G9323T:p.G3108V。
2.一种检测权利要求1所述的血浆游离DNA中肺癌相关突变基因的试剂盒，其特征在于，包括根据权利要求1所述的LRP1B、KMT2D、CSMD3突变基因设计的特异性引物，其中：
检测LRP1B基因A2729T(c.G8185A)突变位点的特异性引物，所述特异性引物上游序列如SEQ ID NO.1所示，所述特异性引物下游序列如SEQ ID NO.2所示；
检测LRP1B基因T4220S(c.A12658T)突变位点的特异性引物，所述特异性引物上游序列如SEQ ID NO.5所示，所述特异性引物下游序列如SEQ ID NO.6所示；
检测LRP1B基因H42L(c.A125T)突变位点的特异性引物，所述特异性引物上游序列如SEQ ID NO.9所示，所述特异性引物下游序列如SEQ ID NO.10所示；
检测LRP1B基因C852Y(c.G2555A)突变位点的特异性引物，所述特异性引物上游序列如SEQ ID NO.13所示，所述特异性引物下游序列如SEQ ID NO.14所示；
检测LRP1B基因H4504L(c.A13511T)突变位点的特异性引物，所述特异性引物上游序列如SEQ ID NO.17所示，所述特异性引物下游序列如SEQ ID NO.18所示；
检测LRP1B基因N381Y(c.A1141T)突变位点的特异性引物，所述特异性引物上游序列如SEQ ID NO.21所示，所述特异性引物下游序列如SEQ ID NO.22所示；
检测KMT2D基因P2991L(c.C8972T)突变位点的特异性引物，所述特异性引物上游序列如SEQ ID NO.25所示，所述特异性引物下游序列如SEQ ID NO.26所示；
检测KMT2D基因A2832V(c.C8495T)突变位点的特异性引物，所述特异性引物上游序列如SEQ ID NO.29所示，所述特异性引物下游序列如SEQ ID NO.30所示；
检测KMT2D基因A163T(c.G487A)突变位点的特异性引物，所述特异性引物上游序列如SEQ ID NO.33所示，所述特异性引物下游序列如SEQ ID NO.34所示；
检测KMT2D基因A4571T(c.G13711A)突变位点的特异性引物，所述特异性引物上游序列如SEQ ID NO.37所示，所述特异性引物下游序列如SEQ ID NO.38所示；
检测KMT2D基因A1216V(c.C3647T)突变位点的特异性引物，所述特异性引物上游序列如SEQ ID NO.41所示，所述特异性引物下游序列如SEQ ID NO.42所示；
检测KMT2D基因R3536H(c.G10607A)突变位点的特异性引物，所述特异性引物上游序列如SEQ ID NO.45所示，所述特异性引物下游序列如SEQ ID NO.46所示；
检测CSMD3基因P2767L(c.C8300T)突变位点的特异性引物，所述特异性引物上游序列如SEQ ID NO.49所示，所述特异性引物下游序列如SEQ ID NO.50所示；
检测CSMD3基因T1020S(c.A3058T)突变位点的特异性引物，所述特异性引物上游序列如SEQ ID NO.53所示，所述特异性引物下游序列如SEQ ID NO.54所示；
检测CSMD3基因S466T(c.G1397C)突变位点的特异性引物，所述特异性引物上游序列如SEQ ID NO.57所示，所述特异性引物下游序列如SEQ ID NO.58所示；
检测CSMD3基因L684F(c.C2050T)突变位点的特异性引物，所述特异性引物上游序列如SEQ ID NO.61所示，所述特异性引物下游序列如SEQ ID NO.62所示；
检测CSMD3基因G3108V(c.G9323T)突变位点的特异性引物，所述特异性引物上游序列如SEQ ID NO.65所示，所述特异性引物下游序列如SEQ ID NO.66所示；
还包括：
特异性识别LRP1B基因A2729T(c.G8185A)位点的Taqman探针，所述Taqman探针的野生型序列如SEQ ID NO.3所述，所述Taqman探针的突变型序列如SEQ ID NO.4所示；
特异性识别LRP1B基因T4220S(c.A12658T)位点的Taqman探针，所述Taqman探针的野生型序列如SEQ ID NO.7所述，所述Taqman探针的突变型序列如SEQ ID NO.8所示；
特异性识别LRP1B基因H42L(c.A125T)位点的Taqman探针，所述Taqman探针的野生型序列如SEQ ID NO.11所述，所述Taqman探针的突变型序列如SEQ ID NO.12所示；
特异性识别LRP1B基因C852Y(c.G2555A)位点的Taqman探针，所述Taqman探针的野生型序列如SEQ ID NO.15所述，所述Taqman探针的突变型序列如SEQ ID NO.16所示；
特异性识别LRP1B基因H4504L(c.A13511T)位点的Taqman探针，所述Taqman探针的野生型序列如SEQ ID NO.19所述，所述Taqman探针的突变型序列如SEQ ID NO.20所示；
特异性识别LRP1B基因N381Y(c.A1141T)位点的Taqman探针，所述Taqman探针的野生型序列如SEQ ID NO.23所述，所述Taqman探针的突变型序列如SEQ ID NO.24所示；
特异性识别KMT2D基因P2991L(c.C8972T)位点的Taqman探针，所述Taqman探针的野生型序列如SEQ ID NO.27所述，所述Taqman探针的突变型序列如SEQ ID NO.28所示；
特异性识别KMT2D基因A2832V(c.C8495T)位点的Taqman探针，所述Taqman探针的野生型序列如SEQ ID NO.31所述，所述Taqman探针的突变型序列如SEQ ID NO.32所示；
特异性识别KMT2D基因A163T(c.G487A)位点的Taqman探针，所述Taqman探针的野生型序列如SEQ ID NO.35所述，所述Taqman探针的突变型序列如SEQ ID NO.36所示；
特异性识别KMT2D基因A4571T(c.G13711A)位点的Taqman探针，所述Taqman探针的野生型序列如SEQ ID NO.39所述，所述Taqman探针的突变型序列如SEQ ID NO.40所示；
特异性识别KMT2D基因A1216V(c.C3647T)位点的Taqman探针，所述Taqman探针的野生型序列如SEQ ID NO.43所述，所述Taqman探针的突变型序列如SEQ ID NO.44所示；
特异性识别KMT2D基因R3536H(c.G10607A)位点的Taqman探针，所述Taqman探针的野生型序列如SEQ ID NO.47所述，所述Taqman探针的突变型序列如SEQ ID NO.48所示；
特异性识别CSMD3基因P2767L(c.C8300T)位点的Taqman探针，所述Taqman探针的野生型序列如SEQ ID NO.51所述，所述Taqman探针的突变型序列如SEQ ID NO.52所示；
特异性识别CSMD3基因T1020S(c.A3058T)位点的Taqman探针，所述Taqman探针的野生型序列如SEQ ID NO.55所述，所述Taqman探针的突变型序列如SEQ ID NO.56所示；
特异性识别CSMD3基因S466T(c.G1397C)位点的Taqman探针，所述Taqman探针的野生型序列如SEQ ID NO.59所述，所述Taqman探针的突变型序列如SEQ ID NO.60所示；
特异性识别CSMD3基因L684F(c.C2050T)位点的Taqman探针，所述Taqman探针的野生型序列如SEQ ID NO.63所述，所述Taqman探针的突变型序列如SEQ ID NO.64所示；
特异性识别CSMD3基因G3108V(c.G9323T)位点的Taqman探针，所述Taqman探针的野生型序列如SEQ ID NO.67所述，所述Taqman探针的突变型序列如SEQ ID NO.68所示；
所述Taqman探针的野生型的5′端连接VIC荧光标记；Taqman探针的突变型的5′端连接FAM荧光标记。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括：缓冲液，dNTPs，TaqDNA聚合酶，MgCl2和DNA提取试剂盒。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，各成分反应浓度如下：特异性引物0.2μM；Taqman探针0.1μM；dNTPs 0.25mM；TaqDNA聚合酶0.025U/μL；MgCl2 1.5mM；DNA提取试剂盒提取到的模板DNA<250ng。
5.权利要求1所述血浆游离DNA中肺癌相关突变基因的检测试剂在制备检测肺癌或其易感性的试剂盒中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述检测肺癌或其易感性的试剂盒包括：针对一种或几种权利要求1所述的LRP1B、KMT2D、CSMD3突变基因的特异性引物，针对一种或几种权利要求1所述的LRP1B、KMT2D、CSMD3突变基因的特异性探针，针对一种或几种权利要求1所述的LRP1B、KMT2D、CSMD3突变基因的基因芯片和针对一种或几种权利要求1所述的LRP1B、KMT2D、CSMD3突变基因的转录蛋白的特异性抗体。
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