CN108823314B - 一种检测血浆游离dna中rnf213突变基因的试剂盒及其应用 - Google Patents

一种检测血浆游离dna中rnf213突变基因的试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种检测血浆游离DNA中RNF213突变基因的试剂盒及其应用。本发明公开了血浆游离DNA中RNF213突变基因及突变位点，以及检测上述血浆游离DNA中RNF213突变基因的试剂盒，该试剂盒包括根据上述RNF213突变基因设计的特异性引物及特异性探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～24所示，以及缓冲液，dNTPs，TaqDNA聚合酶，MgCl2和DNA提取试剂盒。本发明首次揭示了RNF213基因突变在非小细胞肺癌诊断中的应用，并能很好的鉴别肿瘤良恶性。根据该发现设计出检测RNF213基因突变的试剂盒，为肺结节患者的诊断提供指导。

Description

一种检测血浆游离DNA中RNF213突变基因的试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及一种检测血浆游离DNA中RNF213突变基因的试剂盒及其应用，属于生物技术和医学领域。
背景技术
肺癌是目前世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，有数据统计显示，目前在中国到医院就诊和接受治疗的肺癌患者中，早期肺癌(I期)仅占19.10％，也就是说80％以上的肺癌患者到医院就诊时是中、晚期。早期肺癌通过手术等综合治疗，患者的5年生存率在90％以上，10年生存率接近70％。而中、晚期肺癌患者的5年生存率分别为30％和10％左右。因此，目前提高肺癌治愈率的有效方法就是：早期发现、早期诊断和早期治疗。
肺癌的初步诊断主要依靠胸部CT，从肺部阴影的影像学表现，如分叶、毛刺、胸膜皱缩征等，可以初步判断肺部阴影是恶性还是良性肿瘤。但有时肺部阴影在胸部CT的表现不典型，从影像学难以区分良恶性。而血液肿瘤标志物检测，如CEA、NSE、CYF-211的敏感性和特异性低，亦不能确诊良恶性。这些因素给肺癌的诊断带来困难。
病理诊断仍然是目前肺癌确诊的主要手段。但穿刺为有创性操作，有出血、感染、气胸等风险，且穿刺组织量较少，亦有假阴性的可能性，甚至有肿瘤细胞通过针道转移的风险。纤维支气管镜检查也是获取组织病理的方法，但纤维支气管镜检查亦有痛苦，同样存在获取组织量少、假阴性的可能。
理想的诊断方法应为操作简单、创伤较小、样本获取容易、阳性率高。血浆游离DNA(cell free DNA，cfDNA)是细胞通过细胞凋亡、坏死等途径释放至外周血中的DNA片段。健康人的cfDNA主要来自骨髓细胞、淋巴细胞以及正常的组织细胞。对于患肿瘤的病人，肿瘤细胞同样会通过该途径将肿瘤细胞的DNA片段释放至外周血，这种DNA片段称为循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)，大小约150-200bp。血浆游离的ctDNA中包含了肿瘤的遗传信息，对于疾病的诊断、治疗和监测预后有重要意义。高通量测序是目前研究ctDNA的高效手段，但检测花费较高，检测发现的突变基因是否与肺癌相关，亦难以确定。
实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质检测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。在PCR反应体系中加入引物和特异性荧光探针，将报告荧光基团和淬灭荧光基团标记在寡核苷酸探针两端。探针完整不被破坏时，5’端的报告基团发射的荧光信号会被3’端的淬灭基团吸收。而在PCR反应扩增时，Taq DNA聚合酶将与模板结合的探针酶切降解，使探针的淬灭基团与报告基团分离，发出荧光信号，实现荧光信号积累和PCR产物形成的同步。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明公开了血浆游离DNA中RNF213突变基因及突变位点，提供了一种检测血浆游离DNA中RNF213突变基因的试剂盒，该试剂盒能够快速、便捷、准确的检测血浆游离DNA中RNF213基因的突变情况。
本发明还提供了上述试剂盒在检测血浆游离DNA中RNF213突变基因的应用，以及在肺癌的诊断和鉴别诊断中的应用，能够鉴别肿瘤良恶性，提高肺癌诊断的准确率。
另外，本发明还提供了上述血浆游离DNA中RNF213突变基因在制备检测肺癌或其易感性的试剂盒中的应用。
发明概述
发明人通过高通量测序技术检测I期和II期肺癌患者血浆游离DNA，发现血浆ctDNA中RNF213基因频繁发生突变，与肺良性肿瘤对比具有统计学意义。胸部CT发现肺部结节的患者，无纵隔肿大淋巴结，从影像学表现及肿瘤指标难以确定为肺癌或良性肿瘤。术前采集外周静脉血，检测血浆ctDNA中基因突变，发现肺癌患者中RNF213基因频繁发生突变，而良性肿瘤患者该基因未发现突变，两组对比有统计学意义。
通过测序获得血浆游离DNA中RNF213突变基因及突变位点，并利用该突变基因设计试剂盒，应用于血浆游离DNA中RNF213突变基因的检测或肺癌的诊断和鉴别诊断，以及肺癌或其易感性的检测。
发明详述
本发明的技术方案如下：
血浆游离DNA中RNF213突变基因，包括以下突变基因及突变位点：NM_001256071:exon26:c.G5960A:p.G1987E，NM_001256071:exon59:c.C14226A:p.S4742R，NM_001256071:exon29:c.A8252T:p.N2751I，NM_001256071:exon24:c.G4615A:p.A1539T，NM_001256071:exon26:c.C5171T:p.A1724V，NM_020954:exon17:c.A3101T:p.K1034M。
一种检测血浆游离DNA中RNF213突变基因的试剂盒，包括根据上述RNF213突变基因设计的特异性引物，其中：
检测RNF213基因G1987E(c.G5960A)突变位点的特异性引物，所述特异性引物上游序列如SEQ ID NO.1所示，所述特异性引物下游序列如SEQ ID NO.2所示；
检测RNF213基因S4742R(c.C14226A)突变位点的特异性引物，所述特异性引物上游序列如SEQ ID NO.5所示，所述特异性引物下游序列如SEQ ID NO.6所示；
检测RNF213基因N2751I(c.A8252T)突变位点的特异性引物，所述特异性引物上游序列如SEQ ID NO.9所示，所述特异性引物下游序列如SEQ ID NO.10所示；
检测RNF213基因A1539T(c.G4615A)突变位点的特异性引物，所述特异性引物上游序列如SEQ ID NO.13所示，所述特异性引物下游序列如SEQ ID NO.14所示；
检测RNF213基因A1724V(c.C5171T)突变位点的特异性引物，所述特异性引物上游序列如SEQ ID NO.17所示，所述特异性引物下游序列如SEQ ID NO.18所示；
检测RNF213基因K1034M(c.A3101T)突变位点的特异性引物，所述特异性引物上游序列如SEQ ID NO.21所示，所述特异性引物下游序列如SEQ ID NO.22所示。
根据本发明优选的，上述检测血浆游离DNA中RNF213突变基因的试剂盒，还包括：
特异性识别RNF213基因G1987E(c.G5960A)位点的Taqman探针，所述Taqman探针的野生型序列如SEQ ID NO.3所述，所述Taqman探针的突变型序列如SEQ ID NO.4所示；
特异性识别RNF213基因S4742R(c.C14226A)位点的Taqman探针，所述Taqman探针的野生型序列如SEQ ID NO.7所述，所述Taqman探针的突变型序列如SEQ ID NO.8所示；
特异性识别RNF213基因N2751I(c.A8252T)位点的Taqman探针，所述Taqman探针的野生型序列如SEQ ID NO.11所述，所述Taqman探针的突变型序列如SEQ ID NO.12所示；
特异性识别RNF213基因A1539T(c.G4615A)位点的Taqman探针，所述Taqman探针的野生型序列如SEQ ID NO.15所述，所述Taqman探针的突变型序列如SEQ ID NO.16所示；
特异性识别RNF213基因A1724V(c.C5171T)位点的Taqman探针，所述Taqman探针的野生型序列如SEQ ID NO.19所述，所述Taqman探针的突变型序列如SEQ ID NO.20所示；
特异性识别RNF213基因K1034M(c.A3101T)位点的Taqman探针，所述Taqman探针的野生型序列如SEQ ID NO.23所述，所述Taqman探针的突变型序列如SEQ ID NO.24所示。
根据本发明优选的，上述检测血浆游离DNA中RNF213突变基因的试剂盒，还包括：缓冲液，dNTPs，TaqDNA聚合酶，MgCl2和DNA提取试剂盒。
根据本发明优选的，上述检测血浆游离DNA中RNF213突变基因的试剂盒，各成分反应浓度如下：特异性引物0.2μM；Taqman探针0.1μM；dNTPs 0.25mM；TaqDNA聚合酶0.025U/μL；MgCl2 1.5mM；DNA提取试剂盒提取到的模板DNA<250ng，优选为10～200ng。
根据本发明优选的，上述检测血浆游离DNA中RNF213突变基因的试剂盒，所述Taqman探针的野生型的5′端连接VIC荧光标记；Taqman探针的突变型的5′端连接FAM荧光标记。
上述试剂盒在检测血浆游离DNA中RNF213突变基因中的应用。
根据本发明优选的，上述应用采用实时荧光定量PCR技术完成。
上述检测血浆游离DNA中RNF213突变基因的试剂盒在肺癌的诊断和鉴别诊断中的应用。
上述血浆游离DNA中RNF213突变基因在制备检测肺癌或其易感性的试剂盒中的应用。
根据本发明优选的，上述检测肺癌或其易感性的试剂盒包括：针对一种或几种RNF213突变基因的特异性引物，针对一种或几种RNF213突变基因的特异性探针，针对一种或几种RNF213突变基因的基因芯片和针对一种或几种RNF213突变基因的转录蛋白的特异性抗体。
有益效果
1、本发明首次揭示了血浆游离DNA中RNF213基因突变与肺癌相关，其在肺癌与良性肿瘤中对比具有统计学差异，并根据RNF213突变基因及突变位点设计出检测该基因突变位点的试剂盒，胸部X线、胸部CT、胸部MRI等影像学检查发现肺部阴影，应用本试剂盒检测可为肺癌的诊断及鉴别诊断提供指导。
2、本发明所述的试剂盒采用实时荧光定量PCR技术，相比高通量基因测序技术，该试剂盒对于RNF213基因突变位点的检测具有准确、快捷、成本相对廉价的特点，该试剂盒实用范围较广，能检测外周血中提取的游离DNA。
附图说明
图1是突变基因RNF213:NM_001256071:exon26:c.G5960A:p.G1987E中突变位点在cDNA和DNA中的相对位置，其中方框内为突变位点；
图2是突变基因RNF213:NM_001256071:exon26:c.G5960A:p.G1987E对应的完整DNA序列，其中方框内为突变位点；
图3是突变基因RNF213:NM_001256071:exon59:c.C14226A:p.S4742R中突变位点在cDNA和DNA中的相对位置，其中方框内为突变位点；
图4是突变基因RNF213:NM_001256071:exon59:c.C14226A:p.S4742R对应的完整DNA序列，其中方框内为突变位点；
图5是突变基因RNF213:NM_001256071:exon29:c.A8252T:p.N2751I中突变位点在cDNA和DNA中的相对位置，其中方框内为突变位点；
图6是突变基因RNF213:NM_001256071:exon29:c.A8252T:p.N2751I对应的完整DNA序列，其中方框内为突变位点；
图7是突变基因RNF213:NM_001256071:exon24:c.G4615A:p.A1539T中突变位点在cDNA和DNA中的相对位置，其中方框内为突变位点；
图8是突变基因RNF213:NM_001256071:exon24:c.G4615A:p.A1539T对应的完整DNA序列，其中方框内为突变位点；
图9是突变基因RNF213:NM_001256071:exon26:c.C5171T:p.A1724V中突变位点在cDNA和DNA中的相对位置，其中方框内为突变位点；
图10是突变基因RNF213:NM_001256071:exon26:c.C5171T:p.A1724V对应的完整DNA序列，其中方框内为突变位点；
图11是突变基因RNF213:NM_020954:exon17:c.A3101T:p.K1034M中突变位点在cDNA和DNA中的相对位置，其中方框内为突变位点；
图12是突变基因RNF213:NM_020954:exon17:c.A3101T:p.K1034M对应的完整DNA序列，其中方框内为突变位点；
图13是用本发明所述试剂盒检测RNF213基因野生型的检测结果；
图中虚线表示野生型探针5′端VIC基团所发荧光；
图14是用本发明所述试剂盒检测RNF213基因突变型的检测结果；
图中实线表示突变型探针5′端FAM基团所发荧光。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
实施例中DNA提取试剂盒为TIANamp Genomic DNA Kit(TIANGEN)购自天根生化科技有限公司；
TaqDNA聚合酶等其他试剂均购自大连宝生物公司。
实施例1
发明人通过高通量测序技术研究肺癌与肺良性肿瘤患者外周静脉血中ctDNA，检测到RNF213基因在肺癌患者中频繁突变，而在肺良性肿瘤患者中，未发现RNF213基因突变。血浆游离DNA中RNF213突变基因在肺癌与肺良性肿瘤中的差异具有统计学意义，可以作为肺癌诊断及鉴别诊断的指导。
具体研究过程如下：
入组病例：发明人对山东大学第二医院胸外科2017年1月至2017年12月就诊的肺结节患者进行研究，根据胸部CT及肺癌肿瘤指标(包括CEA、NSE、CYF21-1)检查结果，均无法确定为肺癌还是肺良性疾病。所有患者均选择接受手术治疗，术前采外周静脉血，根据术后病理结果将样本分为肺癌及良性肿瘤组。
研究方法：通过高通量测序研究两组样本外周血ctDNA突变情况，步骤包括：
①从外周静脉血中分离血浆及白细胞；②Agilent的液相芯片对目标区域DNA进行高效富集、建库；③Illumina Hiseq平台上进行高通量、高深度测序；④数据处理、分析。
研究结果：在31％入组的肺癌病人中发现了RNF213基因突变，而在肺良性肿瘤患者中，未发现RNF213基因突变。在所有检测到RNF213基因突变的肺癌病人中，发明人通过卡方检验发现其与良性肿瘤患者有显著的统计学差异。
其中，肺癌病人中RNF213突变基因及突变位点包括：NM_001256071:exon26:c.G5960A:p.G1987E，NM_001256071:exon59:c.C14226A:p.S4742R，NM_001256071:exon29:c.A8252T:p.N2751I，NM_001256071:exon24:c.G4615A:p.A1539T，NM_001256071:exon26:c.C5171T:p.A1724V，NM_020954:exon17:c.A3101T:p.K1034M。
研究结论：在肺癌患者的外周血ctDNA中发现RNF213基因突变，突变基因包含上述突变位点，而在良性肿瘤中未发现其突变。RNF213基因的特定位点突变，可为肺癌的诊断及鉴别诊断提供参考，对于影像学和肿瘤指标难以确诊的肺结节患者，提供更加合理有效的个体化指导。
根据上述发现，进行特异性引物和探针设计，引物设计原则如下所示：
①设计的引物序列长度一般为18～25bp之间，其中G+C含量占总碱基数目的40％～60％；②应确定引物中的碱基为随机分配；③引物的5′端可以修饰，但引物的3′端不可修饰，引物的3’端有4个碱基是完全保守的；④引物的3’端一般不设计为G或/和C，引物3’端的5个碱基不应出现2个G或/和C。
Taqman探针设计原则如下所示：
①探针的长度尽量缩短，一般数量在10～30个碱基之间；②应确定设计探针序列中碱基分布的随机性；③探针自身不能含有4个连续的互补碱基；④探针序列内碱基G的数量不能高于碱基C的数量，且G+C数量应控制在40％～60％之间；⑤在探针5′端加上荧光发光基团，在探针3′端加荧光猝灭基团。
引物及探针设计步骤：
1、首先在Ensemble数据库中确定包含RNF213基因突变位点的cDNA序列；
2、通过BLAST确定该cDNA序列在DNA上所对应的外显子序列；
3、根据所得外显子序列，通过GenomeBrower确定所对应的完整DNA序列(包括外显子和内含子)；
其中：①RNF213:NM_001256071:exon26:c.G5960A:p.G1987E
如图1所示，突变位点对应cDNA位置为：6110，对应DNA位置为：78314127，G为突变位点，所对应的完整DNA序列如图2所示；
②RNF213:NM_001256071:exon59:c.C14226A:p.S4742R
如图3所示，突变位点对应cDNA位置为：14376，对应DNA位置为：78357632，C为突变位点，所对应的完整DNA序列如图4所示；
③RNF213:NM_001256071:exon29:c.A8252T:p.N2751I
如图5所示，突变位点对应cDNA位置为：8402，对应DNA位置为：78320387，A为突变位点，所对应的完整DNA序列如图6所示；
④RNF213:NM_001256071:exon24:c.G4615A:p.A1539T
如图7所示，突变位点对应cDNA位置为：4765，对应DNA位置为：78311473，G为突变位点，所对应的完整DNA序列如图8所示；
⑤RNF213:NM_001256071:exon26:c.C5171T:p.A1724V
如图9所示，突变位点对应cDNA位置为：5321，对应DNA位置为：78313338，C为突变位点，所对应的完整DNA序列如图10所示；
⑥RNF213:NM_020954:exon17:c.A3101T:p.K1034M
如图11所示，突变位点对应cDNA位置为：3251，对应DNA位置为：78293189，A为突变位点，所对应的完整DNA序列如图12所示；
4、按照上述引物和探针的设计原则，以上述RNF213突变基因的完整DNA序列为模板，用primer express 3.0.1软件设计出引物和探针；
其中所述引物：检测RNF213基因G1987E(c.G5960A)突变位点的特异性引物，所述特异性引物上游序列如SEQ ID NO.1所示，所述特异性引物下游序列如SEQ ID NO.2所示；
检测RNF213基因S4742R(c.C14226A)突变位点的特异性引物，所述特异性引物上游序列如SEQ ID NO.5所示，所述特异性引物下游序列如SEQ ID NO.6所示；
检测RNF213基因N2751I(c.A8252T)突变位点的特异性引物，所述特异性引物上游序列如SEQ ID NO.9所示，所述特异性引物下游序列如SEQ ID NO.10所示；
检测RNF213基因A1539T(c.G4615A)突变位点的特异性引物，所述特异性引物上游序列如SEQ ID NO.13所示，所述特异性引物下游序列如SEQ ID NO.14所示；
检测RNF213基因A1724V(c.C5171T)突变位点的特异性引物，所述特异性引物上游序列如SEQ ID NO.17所示，所述特异性引物下游序列如SEQ ID NO.18所示；
检测RNF213基因K1034M(c.A3101T)突变位点的特异性引物，所述特异性引物上游序列如SEQ ID NO.21所示，所述特异性引物下游序列如SEQ ID NO.22所示；
所述探针：特异性识别RNF213基因G1987E(c.G5960A)位点的Taqman探针，所述Taqman探针的野生型序列如SEQ ID NO.3所述，所述Taqman探针的突变型序列如SEQ IDNO.4所示；
特异性识别RNF213基因S4742R(c.C14226A)位点的Taqman探针，所述Taqman探针的野生型序列如SEQ ID NO.7所述，所述Taqman探针的突变型序列如SEQ ID NO.8所示；
特异性识别RNF213基因N2751I(c.A8252T)位点的Taqman探针，所述Taqman探针的野生型序列如SEQ ID NO.11所述，所述Taqman探针的突变型序列如SEQ ID NO.12所示；
特异性识别RNF213基因A1539T(c.G4615A)位点的Taqman探针，所述Taqman探针的野生型序列如SEQ ID NO.15所述，所述Taqman探针的突变型序列如SEQ ID NO.16所示；
特异性识别RNF213基因A1724V(c.C5171T)位点的Taqman探针，所述Taqman探针的野生型序列如SEQ ID NO.19所述，所述Taqman探针的突变型序列如SEQ ID NO.20所示；
特异性识别RNF213基因K1034M(c.A3101T)位点的Taqman探针，所述Taqman探针的野生型序列如SEQ ID NO.23所述，所述Taqman探针的突变型序列如SEQ ID NO.24所示。
实施例2
检测血浆游离DNA中RNF213突变基因的试剂盒，包括：
实施例1设计并合成的检测RNF213基因突变位点的特异引物，所述特异引物的上游序列如SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.9，SEQ ID NO.13，SEQ ID NO.17，SEQ IDNO.21所示，下游引物序列如SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.10，SEQ ID NO.14，SEQID NO.18，SEQ ID NO.22所示；
实施例1设计并合成的特异性识别RNF213基因突变位点的Taqman探针，所述野生型Taqman探针5′端连接VIC荧光标记，序列如SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.7，SEQ ID NO.11，SEQ ID NO.15，SEQ ID NO.19，SEQ ID NO.23所示；突变型探针5′端连接FAM荧光标记，序列如SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.8，SEQ ID NO.12，SEQ ID NO.16，SEQ ID NO.20，SEQ ID NO.24所示；
另外，还包括缓冲液，TaqDNA聚合酶，dNTPs，MgCl2和DNA提取试剂盒。
上述各成分反应浓度如下：
引物0.2μM；Taqman探针0.1μM；TaqDNA聚合酶0.025U/μL；dNTPs 0.25mM；MgCl21.5mM；DNA提取试剂盒提取到的模板DNA 10～50ng。
实施例3
选取10例术前病理诊断为非小细胞肺癌的患者，所有患者均接受手术治疗，术前采外周静脉血15ml，分离血浆，应用TIANamp Genomic DNA Kit(TIANGEN)试剂盒从血浆样本中提取DNA。
应用实施例2所述检测血浆游离DNA中RNF213突变基因的试剂盒，对10例血浆样本中RNF213基因突变情况进行检测。
应用罗氏LC96实时荧光PCR仪在20μL反应体系中进行实时荧光定量PCR反应；
反应条件为：94℃预变性180sec，94℃变性5sec，60℃退火和延伸30sec，共进行50个循环。
经试剂盒检测，10例血浆样本中，有6例血浆样本检测结果如图13所示，该样本RNF213基因为野生型；有4例样本检测结果如图14所示，2例样本RNF213基因A1724V(c.C5171T)位点为突变型，1例样本N2751I(c.A8252T)位点为突变型，1例样本S4742R(c.C14226A)位点为突变型。
应用高通量测序技术对上述10例血浆样本提取DNA的RNF213基因进行测序，检测结果经生物信息技术分析，6例样本RNF213基因为野生型，4例样本RNF213基因发生突变，检测结果及突变位点与应用本发明所述试剂盒检测结果完全一致。
实施例4
选取15例病理诊断为非小细胞肺癌的患者，所有患者均为晚期肺癌，无法手术治疗。进行化疗、放疗等治疗前，采外周静脉血15ml，分离血浆，应用TIANamp Genomic DNAKit(TIANGEN)试剂盒从血浆样本中提取DNA。
应用实施例2所述检测血浆游离DNA中RNF213突变基因的试剂盒，对15例血浆样本中RNF213基因突变情况进行检测。
荧光定量PCR反应体系、反应条件、各组分反应时终浓度以及结果判定方法同实施例3。
经试剂盒检测，15例血浆样本中，有9例血浆样本检测结果如图13所示，该样本RNF213基因为野生型；有6例样本检测结果如图14所示，其中：2例样本RNF213基因A1724V(c.C5171T)位点为突变型，2例样本N2751I(c.A8252T)位点为突变型，1例样本S4742R(c.C14226A)位点为突变型，1例样本A1539T(c.G4615A)位点为突变型。
应用高通量测序技术对上述15例血浆样本提取DNA的RNF213基因进行测序，检测结果经生物信息技术分析，9例样本RNF213基因为野生型，6例样本RNF213基因发生突变，检测结果及突变位点与应用本发明所述试剂盒检测结果完全一致。
实施例5
随机选取10例诊断为肺结节的患者，胸部CT所见肺结节最大直径均＜3cm，未见纵隔淋巴结肿大。经胸部CT、肿瘤标志物(CEA、NSE、CYF-211)检查均难以鉴别肺部结节为肺癌或良性肿瘤，所有患者均选择接受手术治疗。术前采外周静脉血15ml，分离血浆样本，应用TIANamp Genomic DNA Kit(TIANGEN)试剂盒从血浆样本中提取DNA。
应用实施例2所述检测血浆游离DNA中RNF213突变基因的试剂盒，对10例血浆样本中RNF213基因突变情况进行检测。
荧光定量PCR反应体系、反应条件、各组分反应时终浓度以及结果判定方法同实施例3。
10例血浆样本中，3例检测结果如图14所示，其中：1例样本RNF213基因A1724V(c.C5171T)位点为突变型，1例样本G1987E(c.G5960A)位点为突变型，1例样本K1034M(c.A3101T)位点为突变型；7例检测结果如图13所示，检测样本RNF213基因均为野生型。
经高通量测序技术对上述10例肺结节患者外周血血浆样本提取DNA的RNF213基因进行测序，检测结果经生物信息技术分析，3例样本RNF213基因发生突变，7例样本RNF213基因为野生型，检测结果及突变位点与应用本发明所述试剂盒检测结果完全一致。
经过手术后肿瘤组织病理证实，3例血浆样本试剂盒检测RNF213基因突变型的患者为非小细胞肺癌，5例血浆样本试剂盒检测RNF213基因野生型的患者为非小细胞肺癌，2例血浆样本试剂盒检测RNF213基因野生型的患者为肺良性肿瘤。
实施例6
随机选取10例诊断为肺部阴影的患者，胸部CT所见肺部肿块最大直径均＞3cm，未见纵隔淋巴结肿大。经胸部CT、肿瘤标志物(CEA、NSE、CYF-211)检查均难以鉴别肺部阴影为肺癌或良性肿瘤，所有患者均选择接受手术治疗。术前采外周静脉血15ml，分离血浆样本，应用TIANamp Genomic DNA Kit(TIANGEN)试剂盒从血浆样本中提取DNA。
应用实施例2所述检测血浆游离DNA中RNF213突变基因的试剂盒，对10例血浆样本中RNF213基因突变情况进行检测。
荧光定量PCR反应体系、反应条件、各组分反应时终浓度以及结果判定方法同实施例3。
10例血浆样本中，4例检测结果如图14所示，其中1例样本RNF213基因A1724V(c.C5171T)位点为突变型，1例样本G1987E(c.G5960A)位点为突变型，1例样本K1034M(c.A3101T)位点为突变型，1例样本S4742R(c.C14226A)位点为突变型；6例检测结果如图13所示，检测样本RNF213基因均为野生型。
经高通量测序技术对上述10例肺部肿块患者外周血血浆样本提取DNA的RNF213基因进行测序，检测结果经生物信息技术分析，4例样本RNF213基因发生突变，6例样本RNF213基因为野生型，检测结果及突变位点与应用本发明所述试剂盒检测结果完全一致。
经过手术后肿瘤组织病理证实，4例血浆样本经试剂盒检测RNF213基因突变型的患者为非小细胞肺癌，5例血浆样本经试剂盒检测RNF213基因野生型的患者为非小细胞肺癌，1例血浆样本经试剂盒检测RNF213基因野生型的患者为肺良性肿瘤。
以上所述实施例仅为本发明优选的具体实施方案，并不用来限制本发明，凡是在本发明精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换以及改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东大学第二医院
<120> 一种检测血浆游离DNA中RNF213突变基因的试剂盒及其应用
<160> 24
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cggcagccgt gttcaatg 18
<210> 2
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ctcgctccga ggccac 16
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ccggctgtgt gttgggat 18
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ccggctgtgt gttgagat 18
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ccggaaaagt gtggtccatt 20
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
aatgtgctgg aggtactcaa ctgtaa 26
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ctctaagatt tggagctgc 19
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tctaagattt ggagatgc 18
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gcgtacctct gaggaaaacc at 22
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
cgatgcagac gaccatcatg 20
<210> 11
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
ccttgaagga gaacg 15
<210> 12
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ccttgaagga gatcg 15
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
ctgtggaacg ctcatccctg 20
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
tggatcacat agatgcctct ttg 23
<210> 15
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
ctggccacgg ccatca 16
<210> 16
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
ctggccacga ccatca 16
<210> 17
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
cggcagagca gctggttta 19
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
gcagttgctt ttgatgaagg atag 24
<210> 19
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
tgatgccgcc ctaa 14
<210> 20
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
ccgagtgatg tcgc 14
<210> 21
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
tgccatgacc cagctaagg 19
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
cccacttccc aatctctgag tt 22
<210> 23
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
ctatgaagca cccgct 16
<210> 24
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
ctatgatgca cccgc 15

Claims (5)

1.血浆游离DNA中RNF213突变基因，其特征在于，包括以下6个位点的突变：NM_001256071:exon26:c.G5960A:p.G1987E，NM_001256071:exon59:c.C14226A:p.S4742R，NM_001256071:exon29:c.A8252T:p.N2751I，NM_001256071:exon24:c.G4615A:p.A1539T，NM_001256071:exon26:c.C5171T:p.A1724V，NM_020954:exon17:c.A3101T:p.K1034M。
2.一种检测权利要求1所述的血浆游离DNA中RNF213突变基因的试剂盒，其特征在于，包括根据权利要求1所述的RNF213突变基因设计的特异性引物，其中：
检测RNF213基因G1987E(c.G5960A)突变位点的特异性引物，所述特异性引物上游序列如SEQ ID NO.1所示，所述特异性引物下游序列如SEQ ID NO.2所示；
检测RNF213基因S4742R(c.C14226A)突变位点的特异性引物，所述特异性引物上游序列如SEQ ID NO.5所示，所述特异性引物下游序列如SEQ ID NO.6所示；
检测RNF213基因N2751I(c.A8252T)突变位点的特异性引物，所述特异性引物上游序列如SEQ ID NO.9所示，所述特异性引物下游序列如SEQ ID NO.10所示；
检测RNF213基因A1539T(c.G4615A)突变位点的特异性引物，所述特异性引物上游序列如SEQ ID NO.13所示，所述特异性引物下游序列如SEQ ID NO.14所示；
检测RNF213基因A1724V(c.C5171T)突变位点的特异性引物，所述特异性引物上游序列如SEQ ID NO.17所示，所述特异性引物下游序列如SEQ ID NO.18所示；
检测RNF213基因K1034M(c.A3101T)突变位点的特异性引物，所述特异性引物上游序列如SEQ ID NO.21所示，所述特异性引物下游序列如SEQ ID NO.22所示；
还包括：
特异性识别RNF213基因G1987E(c.G5960A)位点的Taqman探针，所述Taqman探针的野生型序列如SEQ ID NO.3所述，所述Taqman探针的突变型序列如SEQ ID NO.4所示；
特异性识别RNF213基因S4742R(c.C14226A)位点的Taqman探针，所述Taqman探针的野生型序列如SEQ ID NO.7所述，所述Taqman探针的突变型序列如SEQ ID NO.8所示；
特异性识别RNF213基因N2751I(c.A8252T)位点的Taqman探针，所述Taqman探针的野生型序列如SEQ ID NO.11所述，所述Taqman探针的突变型序列如SEQ ID NO.12所示；
特异性识别RNF213基因A1539T(c.G4615A)位点的Taqman探针，所述Taqman探针的野生型序列如SEQ ID NO.15所述，所述Taqman探针的突变型序列如SEQ ID NO.16所示；
特异性识别RNF213基因A1724V(c.C5171T)位点的Taqman探针，所述Taqman探针的野生型序列如SEQ ID NO.19所述，所述Taqman探针的突变型序列如SEQ ID NO.20所示；
特异性识别RNF213基因K1034M(c.A3101T)位点的Taqman探针，所述Taqman探针的野生型序列如SEQ ID NO.23所述，所述Taqman探针的突变型序列如SEQ ID NO.24所示。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括：缓冲液，dNTPs，TaqDNA聚合酶，MgCl2和DNA提取试剂盒。
4.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述Taqman探针的野生型的5′端连接VIC荧光标记；Taqman探针的突变型的5′端连接FAM荧光标记。
5.权利要求1所述血浆游离DNA中RNF213突变基因的检测试剂在制备检测肺癌或其易感性的试剂盒中的应用，其特征在于，所述检测肺癌或其易感性的试剂盒包括：针对一种或几种权利要求1所述的RNF213突变基因突变位点的特异性引物，针对一种或几种权利要求1所述的RNF213突变基因突变位点的特异性探针，针对一种或几种权利要求1所述的RNF213突变基因突变位点的基因芯片和针对一种或几种权利要求1所述的RNF213突变基因突变位点的转录蛋白的特异性抗体。
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